CN103865881B - 可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可快速简便的应用于甲型肝炎检测的可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞、其分泌的单克隆抗体及在检测甲型肝炎领域的应用。该杂交瘤细胞，保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心（即中国典型培养物保藏中心），保藏号是CCTCC No：C2013131。上述杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在甲型肝炎的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势。

Description

可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞及应用

技术领域

本发明涉及甲型肝炎免疫检测领域及蛋白纯化领域，尤其是涉及一种可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞及应用。

背景技术

甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒（甲肝病毒，Hepatitis AVirus，HAV）引起的一种肠道性疾病。甲型肝炎病毒（HAV）是正单链RNA病毒，属微小RNA病毒科。人类感染甲肝病毒后，大多表现为亚临床或隐性感染，仅少数人表现为急性甲型肝炎。甲肝病毒主要通过粪-口途径传播，潜伏期为15～45天，病毒常在患者转氨酸升高前的5～6天就存在于患者的血液和粪便中。发病2～3周后，随着血清中特异性抗体的产生，血液和粪便的传染性也逐渐消失，长期携带病毒者极罕见。其致病机制是肝炎病毒在肝脏复制，造成肝细胞损害而引起的一系列症状：如发热、厌油、厌食、腹痛、腹泻、黄疸等。甲型肝炎不仅危害人们的身心健康，对社会和家庭也会带来一定的经济损失。

单克隆抗体（单抗）可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系。生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体，可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原。由单克隆抗体制备的试剂可用于临床诊断和治疗。

发明内容

基于此，有必要提供一种可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用。

此外，还有必要提供上述杂交瘤细胞或其分泌的单克隆抗体在医学检测领域的应用。

一种可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2013131。

上述杂交瘤细胞可应用在制备诊断甲型肝炎检测试剂或检测设备领域中。

上述杂交瘤细胞可用于纯化重组甲型肝炎抗原。

一种由上述可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

上述单克隆抗体在制备诊断甲型肝炎检测试剂或检测设备领域的应用。

上述单克隆抗体在纯化重组甲型肝炎抗原中的应用。

一种甲型肝炎病毒检测试纸，其特征在于，包括上述单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述检测试纸包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有所述单克隆单体包附胶体金颗粒形成胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为亲和纯化的抗甲型肝炎病毒蛋白兔多抗，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。

一种检测试剂盒，包括上述任一实施例所述的甲型肝炎病毒检测试纸。

上述杂交瘤细胞，命名为HAV-3A2，于2013年8月28日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心（即中国典型培养物保藏中心），保藏号是CCTCC No：C2013131。

上述杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在甲型肝炎的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势。

该杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可应用在重组甲型肝炎抗原的筛选纯化过程中，纯化得到的重组甲型肝炎抗原具有亲和力好、特异性强、纯度高、活性接近天然抗原的活性蛋白等优点，对于甲型肝炎的诊断和防止工作有着重要的意义。

附图说明

图1为一实施方式的检测试纸的正面示意图。

图2为图1中检测试纸的纵截面示意图。

图3为检测试剂盒示意图。

图4为实施例5中将免疫亲和纯化出的重组抗原经CsCl梯度分离后，将收集的各管悬液经放射免疫测定的浮密度测定结果图。

具体实施方式

以下组要结合附图及具体实施例对可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞及其应用作进一步详细的说明。

本实施方式的可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC No：C2013131。该杂交瘤细胞可分泌出抗甲型肝炎病毒蛋白的单克隆抗体。该杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可用于制备甲型肝炎病毒蛋白的检测试剂或设备领域中。

一实施方式的甲型肝炎病毒蛋白的检测试剂盒包括壳体、检测试纸和其他检测试剂。

如图1和图2所示，本实施方式的检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠，金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠，硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜上，且检测线160设在靠近金标垫130的一端，质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。单克隆抗体包附胶体金颗粒形成胶体金标记的单克隆抗体均匀涂覆在金标垫130上。检测线160为亲和纯化的抗甲型肝炎病毒蛋白的兔多抗，质控线170为羊抗鼠IgG抗体。

如图3所示，检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线170裸露于观察窗220中，方便观察。

其他检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。

上述检测试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中的甲型肝炎病毒蛋白。检测时，样品中所有的甲型肝炎病毒蛋白分子先和金标记抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体结合，由于毛细管作用，反应复合物沿硝酸纤维素膜140向前泳动，若样品中有甲型肝炎病毒蛋白分子，到达检测线160时，遇到包被在硝酸纤维素膜140上的抗甲型肝炎病毒蛋白的兔多抗，就会形成兔多抗-甲型肝炎病毒蛋白-金标记单克隆抗体复合物，从而富集在检测线160上，形成红色沉淀线；未结合甲型肝炎病毒蛋白分子的金标记单克隆抗体则通过检测线160，被羊抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控线170上，形成红色沉淀线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有甲型肝炎病毒蛋白分子，反应复合物到达检测线160时，遇到捕获多抗就不会形成兔多抗-甲型肝炎病毒蛋白分子-金标记单克隆抗体复合物，反应复合物通过检测线160，仅富集在质控线170上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。

此外，在其他实施方式中，该检测试剂盒的结构不限于上文描述。上述单克隆抗体除应用在上述胶体金标记的单抗检测试剂盒外，还可以用于其他甲型肝炎病毒蛋白检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团（如磁性微球、辣根过氧化酶等），或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体（例如ELISA），则可用于其他形式的甲型肝炎病毒蛋白检测试剂或设备。故本实施方式所制备得到的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可广泛适用于制备甲型肝炎病毒蛋白检测试剂或设备。

以下为具体实施例部分：

实施例1杂交瘤细胞的建立与抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体的制备

1.抗原免疫

将甲型肝炎天然抗原（1.8mg/ml，深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号GRNHAVN101）与等体积的弗氏完全佐剂(SIGMA公司产品，货号F5881)混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2ml的剂量皮下施给BALB/c小鼠（广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只）背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫（抗原与等量弗氏不完全佐剂（SIGMA公司产品，货号F5506）混合），增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。

融合前3天，用相同剂量抗原与等体积0.9wt%氯化钠注射液混合腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。

2.杂交瘤细胞的制备

（1）饲养细胞的制备

以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，将BALB/c鼠拉颈处死并用75%酒精全身浸泡，在超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基础培养液5ml，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液（含HAT的RPMI1640完全培养液中）重悬，调整细胞浓度1×10⁵个/ml，加入96孔板，150μl/孔，在37℃、5%CO₂环境中培养过夜。

（2）免疫脾细胞的制备

小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI1640基础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。

（3）骨髓瘤细胞的制备

将小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0（深圳市菲鹏生物股份有限公司保存）经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。

（4）细胞融合及HAT选择杂交瘤

将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10的细胞数量比例混合，在50ml塑胶离心管内用RPMI1640基础培养液洗1次，在1200rpm下离心8分钟，弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1ml50%的PEG1500融合，融合1分钟后加入15ml的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5分钟，弃上清，用50ml的RPMI1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板，50μl/孔，在37℃、5%CO₂环境中培养。培养至第六天，换HT培养液（含HT的RPMI1640完全培养液）两次。

（5）抗体的检测

用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释甲型肝炎天然抗原（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号GRNHAVN101），使其终浓度为5μg/ml。加入96孔聚苯乙烯板，每孔0.1ml，37℃2小时或4℃过夜。次日，用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS，0.15ml/孔，37℃封闭2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上

清0.1ml于上述96孔检测板中，37℃30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号GRCGAMS001），37℃30分钟同上洗后，每孔加入100μl含0.1%（M/V）邻苯二胺，0.1%（V/V）双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，测450nm吸收值。RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。

分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10%DMSO的培养液冻存，细胞密度为10⁶个/ml。细胞融合一次共获得1株能稳定分泌抗体的细胞株，即可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞，命名为HAV-3A2杂交瘤细胞，于2013年8月28日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心（即中国典型培养物保藏中心），保藏号是CCTCC No：C2013131。

3．单克隆抗体的制备

选6～8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml的降植烷；10天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。

取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1ml/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱（购自Amersham Biosciences公司）。然后用PBS以1ml/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸附值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液（pH2.5）洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M TRIS（pH8.8）中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，-20℃分装冻存。

4．效价测定

用0.05M pH9.5碳酸缓冲溶液稀释天然甲型肝炎病毒抗原，使其终浓度为2μg/ml。每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时或4℃过夜。后用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS，0.12ml/孔，37℃孵育2小时，用于检测。

（1）细胞上清效价的检测：用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS稀释细胞培养上清依次至10倍、20倍、40倍、80倍、160倍和320倍。向已包被抗原的96孔板中每孔依次加入0.1ml的不同稀释倍数的细胞培养上清，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号GRCGAMS001），37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μl含0.1%（M/V）邻苯二胺，0.1%（V/V）双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，测450nm吸收值。在320倍稀释细胞培养上清时，吸收大于0.5。细胞培养上清效价可达到320倍。

（2）小鼠腹水效价的检测：上述可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清效价1.28×10³，腹水抗体效价2.43×10⁶。

实施例2甲型肝炎病毒蛋白胶体金检测试纸的制备

1.硝酸纤维素膜的制备

包被缓冲液的配制：含6%甲醇、0.01M pH7.2PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000ml6%甲醇的0.01M pH7.2PBS缓冲液配方：NaCl8g、KCl0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、KH₂PO₄0.2g、甲醇60ml，双蒸去离子水定容至1000ml。

硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液将抗甲型肝炎病毒蛋白兔多克隆抗体（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BRJHAVN101）稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm；用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号GRCGAMS001）稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5～8mm，均匀。37℃烘干，封装备用。

2.胶体金、金标记单克隆抗体的制备

（1）溶液的配制

①氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000ml1%氯金酸溶液配方：10g氯金酸：双蒸去离子水定容至1000ml。

②柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1%溶液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期容至1000ml。

③0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。

④2%PEG-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml2%PEG-20000溶液配方：20g PEG-20000；双蒸去离子水定容至1000ml。

⑤标记洗涤保存液的配制：2%牛血清白蛋白（BSA），0.05%叠氮钠（NaN₃），0.01MpH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml标记洗涤保存液配方：20gBSA，0.5g NaN₃、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000ml。

(2)胶体金的制备：

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%，置电炉煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入2ml1%柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。

(3)胶体金标记单克隆抗体的制备：

用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8～10μg抗体/ml胶体金加入实施例1中制备得到的抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1%静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。

3.金标垫的制备

(1)封闭液的配制：

2%BSA，0.1%TritonX-100、0.05%NaN₃，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN₃、1ml TritonX-100、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。

(2)金标垫的制备：

将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。

4.试纸条样品垫的制备

(1)封闭液的配制：

2%BSA，0.1%TrtionX-100、0.05%NaN₃，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN₃、1ml TrtionX-100、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。

(2)样品垫的制备：

将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。

5.检测试纸的组装

将吸收垫（购自Millipore公司）、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到所述检测试纸。

实施例3检测甲型肝炎病毒蛋白的试剂盒

1.快速检测甲型肝炎病毒蛋白的试剂盒包括：实施例2制作的检测试纸及样品稀释液。

其中，样品稀释液为8%NaCl溶液。配制方法：80gNaCl，加蒸馏水定容至1000ml。

2.胶体金法甲型肝炎病毒蛋白的检测

（1）直接将采集好的静脉全血20μl置于含有200μl稀释液的塑料试管中，充分混匀，取120μl溶解好的样品加入到是试纸卡片的加样孔中，等待15min后即可观察结果。

（2）结果判定：当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，同时也出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阳性。检测线颜色越深说明被检测样品的甲型肝炎病毒蛋白水平越高。当试纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果都判为检测试纸条失效，应废弃。

实施例4快速诊断甲型肝炎病毒试剂盒的应用

88例血清标本经甲型肝炎病毒核酸检测为阳性样本，500例检出阴性样本，分别采用目前市售的甲型肝炎病毒试剂盒A与实施例3试剂盒B进行检测，20分钟内观察结果。结果见表1。结果表明，试剂盒A的灵敏度为80.68%，试剂盒B灵敏度为86.36%，特异性试剂盒A为87.40%，试剂盒B为91.6%。说明实施例3的检测试剂盒在灵敏度和特异性两项指标上均优于现有的产品，完全可以用于常规的甲型肝炎的快速诊断。

表1快速诊断甲型肝炎试剂盒的比较

实施例5抗甲型肝炎病毒蛋白单克隆抗体在纯化重组甲型肝炎抗原中的应用。

（1）抗体的准备：

本实施例所用的抗体是通过免疫甲型肝炎天然抗原获得，含有氨基，经过纯化后即可使用。

（2）重组抗原混合液的准备：

大肠杆菌诱导时菌液浓度OD0.6～0.8，温度在25±1℃，诱导转速为160±10rpm，诱导的IPTG浓度为0.250±0.05mM。

（3）固相载体的准备：

固相载体在偶联前，一般需要先用每次不小于10倍固相载体体积的0.01M PB(pH7.4)的缓冲液离心洗涤三次，用以除去悬浮液中的杂物。

（4）固相载体和抗体的连接：

将固相载体和抗体共同混合于0.01M PB(pH7.4)的缓冲液中，再加入EDC的水溶液，于室温下震荡反应过夜，由于固相载体上含有羧基，羧基在EDC的作用下可与抗体上的氨基共价连接，从而使固相载体与抗体产生稳定的共价键形成免疫吸附剂。之后对免疫吸附剂离心洗涤，洗涤完后免疫吸附剂用等体积左右的0.01M PB(pH7.4)的缓冲液悬浮。

（5）免疫吸附剂与抗原的结合：

取一定体积的待纯化抗原直接加入到免疫吸附剂悬浮液中，4℃放置过夜。次日，离心，沉淀物即为抗原-免疫吸附剂，除去上清，之后对抗原-免疫吸附剂离心洗涤。

（6）抗原免疫吸附剂的解离：

取抗原—免疫吸附剂沉淀物，加入pH值为2.7的甘氨酸-盐酸缓冲液，混匀，放置五分钟后离心，分离出上清后立即用氢氧化钠溶液调整上清的pH值至7.0左右。此解离的上清即为纯化的抗原溶液。

（7）抗原纯化后的处理：

将解离的上清用透析袋对0.01M PB(pH7.4)的缓冲液透析，透析后用紫外分光光度计测蛋白浓度。

（8）免疫吸附剂的保存和重复使用：

将纯化抗原后的免疫吸附剂离心洗涤至上清A280nm小于0.02，然后悬浮于免疫吸附剂保存液中，4℃保存，可重复用于纯化抗原。

（9）抗原效价测定：

用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液分别稀释免疫亲和纯化出的重组抗原及天然抗原使其终浓度为5μg/ml。每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯板，37℃2小时或4℃过夜。次日，用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS，0.15ml/孔，37℃2小时，用于检测。5份甲肝阳性血清及两份甲肝阴性血清各0.1ml于上述96孔检测板中，37℃30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号GRCGAHS001），37℃30分钟同上洗后，每孔加入100μl含0.1%（M/V）邻苯二胺，0.1%（V/V）双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，测450nm吸收值。如表2所以，结果显示筛选纯化的重组抗原活性与天然抗原活性相当，本底无明显差异。

表2

	重组抗原	天然抗原
			阳性血清1OD值	1.911	2.012
阳性血清2OD值	2.335	2.314
			阳性血清3OD值	2.157	2.168
阳性血清4OD值	2.321	2.356
			阳性血清5OD值	1.945	2.133
阴性血清1OD值	0.038	0.035
			阴性血清2OD值	0.034	0.032

（10）重组抗原CsCl梯度离心分析

将免疫亲和纯化出的重组抗原经CsCl梯度分离后，将收集的各管悬液经放射免疫测定，看到三个病毒抗原活性峰，如图4所示，从浮密度测定结果来看，纯化的重组甲肝抗原在CsCl梯度中浮密度范围在1.30-1.34克/cm³之间，主峰在1.338克/cm³。Feinstone等人曾认为甲肝病毒颗粒在CsCl中的浮密度为1.41克/cm³，而Provost的结果指出其浮密度为1.34克/cm³。实验结果主峰在1.338克/cm³与之接近，符合典型的甲肝病毒在CsCl的浮密度范围，这说明免疫亲和纯化出的重组抗原含甲肝病毒蛋白的聚体或病毒颗粒。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2013131。

2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞在制备诊断甲型肝炎检测试剂或检测设备中的应用。

3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞在纯化重组甲型肝炎抗原中的应用。

4.一种由如权利要求1所述的可分泌抗甲型肝炎病毒蛋白单抗的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的单克隆抗体在制备诊断甲型肝炎检测试剂或检测设备中的应用。

6.如权利要求4所述的单克隆抗体在纯化重组甲型肝炎抗原中的应用。

7.一种甲型肝炎病毒检测试纸，其特征在于，包括如权利要求4所述的单克隆抗体。

8.如权利要求7所述的甲型肝炎病毒检测试纸，其特征在于，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有所述单克隆抗体包附胶体金颗粒形成胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为亲和纯化的抗甲型肝炎病毒蛋白兔多抗，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。

9.一种检测试剂盒，包括如权利要求7或8所述的甲型肝炎病毒检测试纸。