KR20040023526A

KR20040023526A - 말라리아 진단용 키트

Info

Publication number: KR20040023526A
Application number: KR1020030061665A
Authority: KR
Inventors: 신형순; 신광순; 정홍근; 임종문
Original assignee: 주식회사 벤다이아 테크
Priority date: 2002-09-10
Filing date: 2003-09-04
Publication date: 2004-03-18

Abstract

본 발명은 말라리아 진단용 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 플라스모디움의 젖산 탈수소효소 (pLDH)의 NADH (또는 NAD⁺) 결합 부위에 대하여 NADH (또는 NAD⁺)와 경쟁적 결합을 하는 항말라리아 작용제 및 상기 항말라리아 작용제에 공유 결합된 비인간-유래의 담체 단백질을 포함하는 말라리아 진단용 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 키트는 높은 민감도 및 특이도를 나타내면서도 동시에 신속하고 편리하게 말라리아 진단을 할 수 있는 장점을 갖는다.

Description

말라리아 진단용 키트{Diagnostic Kit for Malaria}

본 발명은 말라리아 진단용 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신속하고 간편하게 말라리아를 진단할 수 있는 키트에 관한 것이다.

말라리아는 플라스모디움 (Plasmodium)이라 불리는 혈액 기생충 질환으로서, 암모기에 의한 흡혈을 통해 전염된다. 사람에서는 주로 4종류의 말라리아가 존재하는 데, 우리나라에서는 현재 유행중인 삼일열 말라리아가 주로 나타나며, 이외에 사일열, 열대열 및 난원형 말라리아가 있으며, 각각 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모디움 팔시파룸 (P. falciparum), 플라스모디움 오발레 (P. ovale) 및 플라스모디움 말라리애 (P. malariae)에 의해 발병된다. 말라리아는 현재 지구상에서 가장 인류를 위협하는 질환중 하나로서, 매년 2 억에서 3 억명이 감염되고 250 만에서 300 만명이 사망하고 있으며, 확산되는 경향에 있다.

때문에, 말라리아 원충의 감염에 대한 높은 민감도 및 특이성을 갖는 진단방법이 요구된다. 현재까지 다양한 진단방법이 개발 및 실시되고 있으며, 예컨대다음과 같은 방법이 있다.

진단 방법 중 하나인 후층 도말법은, 혈액 도말 검체를 라이트 (Wright), 김자 (Giema) 또는 필드 (Field) 염색액으로 염색하여 현미경 하에서 판독하는 방법이다. 이 진단 방법은 후막 도말이 다른 불필요한 인위물 (artifact)를 포함하는 경우가 많기 때문에, 정확도가 크게 떨어지는 문제점을 갖고 있다. 다른 진단 방법은 혈액 검체의 박층을 이용한 도말법으로서, 검사하기에 용의하다는 장점이 있으나 박층의 세포의 희소성은 진단의 오류를 초래하는 경향이 크다는 문제점이 있다.

한편, 말라리아 항원은 플라스모디움에 의해 감염된 인간의 혈청 내에서 출현하며 (McGregor, I.A. et al.,Lancet1:881-884(1968)), 적혈구의 파괴 및 재침입 동안에 감염된 적혈구로부터 분비되는 것으로 알려져 있다 (Winchell, E.J. et al.,Molecular Biochemistry and Parasitology, 10:287-296(1984)). 이와 관련하여, Makler et al.,Am. J. Trop. Med. Hyg., 48(2):205-210(1993)은 플라스모디움의 젖산 탈수소효소 (이하, "pLDH"라 한다)가P. falciparum의 검출에 이용될 수 있음을 보고 하였고, 이어 pLDH에 대한 항체를 이용한 말라리아 진단 방법이 계속적으로 연구되고 있다.

상술한 진단 방법 이외에도, 말라리아 항원에 대한 분자 생물학적 접근 (예: 항원 유전자의 분석)을 통하여 다양한 진단 방법들이 개발되어 있다.

WO 0161032는 말라리아 프로토조아의 항원을 이용한 혈액 내 말라리아-특이 항체를 검출하여 말라리아를 면역적으로 진단하는 방법을 개시하고 있고, WO9724141는 플라스모디움-특이 젖산 탈수소효소 (LDH)에 대한 단세포군 항체를 이용하여 플라스모디움의 존부를 검출하는 방법을 개시하고 있다. 한편, 대한민국 특허출원 제 2000-14123 호는 MSP (merozite surface protein)를 포함하는 말라리아 항체진단 시약 조성물을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 높은 민감도 및 특이도를 나타내면서도 동시에 신속하고 편리하게 말라리아를 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 플라스모디움의 젖산 탈수소효소 (pLDH)에 작용하는 항말라리아 작용제의 특이적 결합 특성을 이용하여 말라리아 진단용 키트를 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 말라리아 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 플라스모디움 (Plasmodium)의 젖산 탈수소효소 (pLDH)의 NADH (또는 NAD⁺) 결합 부위에 대하여 NADH (또는 NAD⁺)와 경쟁적 결합을 하는 항말라리아 작용제 및 상기 항말라리아 작용제에 공유 결합된 비인간-유래의 담체 단백질을 포함하는 말라리아 진단용 키트를 제공한다.

기본적으로, 본 발명의 키트는 플라스모디움-유래 젖산 탈수소효소 (pLDH)의 NADH (또는 NAD⁺) 결합 부위에 대하여 NADH (또는 NAD⁺)와 경쟁적 결합을 하는 항말라리아 작용제의 특성을 이용한 것이다. pLDH는 플라스모디움의 세포질에서 발견되는 대사성 효소 (해당 과정의 최종 단계를 촉매함)로서 각각의 플라스모디움은 1-2 nUnits 정도의 pLDH를 포함한다. pLDH에 대하여 많은 연구가 있었고, 이에 대한 항체를 이용하여 말라리아 진단을 하는 것도 WO 9724141에 개시되어 있다.

한편, 다수의 항말라리아 작용제는 pLDH에 작용하는 것으로 알려져 있는 데, 특히, 클로로퀸 (chloroquine)에 대한 연구가 많이 이루어져 있다. 클로로퀸은 인간의 LDH에는 작용하지 않고, pLDH만 특이적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한, 클로로퀸은 플라스모디움 팔시파룸 (P. falciparum)의 pLDH에 결합하여 항말라리아 효과를 나타내는 것으로 규명되어 있다. 더욱이, 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모디움 오발레 (P. ovale) 및 플라스모디움 말라리애 (P. malariae)도 클로로퀸에 의해 치료가 가능한 것으로 알려져 있어, 클로로퀸은4가지 플라스모디움의 pLDH에 공통적으로 결합하는 것으로 추측된다.

클로로퀸은 플라스모디움, 예컨대, 플라스모디움 팔시파룸의 pLDH의 조인자 (cofactor), 즉 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) 또는 NAD⁺의 결합 부위에 결합하여 항말라리아 작용을 나타내며, 보다 상세하게는 조인자의 아데닐 고리가 위치하는 결합 부위에 경쟁적 억제자 (competitive inhibitor)의 역할을 하여 결합함으로써 항말라리아 작용을 하는 것으로 알려져 있다 (Read J. A. et al.,J Biol Chem., Apr 9;274(15):10213-8(1999); 및 Surolia I.,Parasitol Today, 16(3):133(2000)).

클로로퀸이 조인자의 아데닐 고리가 위치하는 부위에 결합할 수 있는 것은 클로로퀸 구조 자체가 아데닐 고리와 유사한 고리 구조를 갖고 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 항말라리아 작용제는 pLDH의 NADH (또는 NAD⁺) 결합 부위에 대하여 NADH (또는 NAD⁺)와 경쟁적 결합을 할 수 있는 아데닐 고리-유사 구조를 갖는 항말라리아 작용제이다. 예를 들면, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 퀴닌, 퀴닌 비설페이트, 퀴닌 카보네이트, 퀴닌 디히드로브로마이드, 퀴닌 디히드로클로라이드, 퀴닌 에틸카보네이트, 퀴닌 포르메이트, 퀴닌 글루코네이트, 퀴닌 히드리오다이드, 퀴닌 히드로클로라이드, 퀴닌 살리실레이트, 퀴닌 설페이트, 퀴닌 타네이트, 퀴닌 우레아 히드로클로라이드, 퀴노사이드, 퀴놀린, 아모디아퀸, 파마퀸, 플라스모시드 또는 프리마퀸을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 항말라리아작용제는 클로로퀸이다.

본 발명의 키트에 포함되는 항말라리아 작용제는 분자량이 작기 때문에 (생물학적 물질, 특히, 단백질과 비교하여), 본 발명의 면역 진단 키트에 그대로 (per se) 이용하는 것은 여러 가지 측면에서 문제가 있다. 따라서, 본 발명의 진단 키트에서 항말라리아 작용제는 담체 (carrier) 단백질에 결합된 상태로 이용된다. 본 발명에 이용되는 담체 단백질은 특별히 제한적이지 않으며, (a) 인간으로부터 유래되지 않은 것, (b) 3차원 구조 형성을 할 수 있는 것, (c) 분자량이 대략 10,000 이상인 것이면 어떠한 단백질도 담체 단백질로 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 담체 단백질은 비-인간 유래의 알부민 (예컨대, 소 혈청 알부민 (BSA)), 카제인, 비-인간 유래의 시토크롬 c, 페투인 (fetuin), 스킴 밀크, 티로글로불린 (thyroglobulin), 아시알로페투인 (asialfetuin) 또는 소의 서브맥실러리 뮤신 (bovine submaxillary mucin)이다.

본 발명의 진단 키트에서 항말라리아 작용제 및 담체 단백질은 공유 결합되어 있으며, 이는 직접 공유 결합 또는 간접 공유 결합을 포함하고, 바람직하게는, 간접 공유 결합이다. 간접 공유 결합은 결합체 제조의 용이성 및 결합체 구조의 유연성 등이 직접 공유 결합 보다 우수하기 때문이다.

항말라리아 작용제 및 담체 단백질 사이의 간접 공유 결합은 당업계에 공지된 링커 (linker)를 이용하여 용이하게 제조될 수 있으며, 항말라리아 작용제의 작용기 종류에 따라 적합한 링커를 선택할 수 있다. 상기 링커는 헤테로이중작용기 링커 (heterobifunctional linker) 및 호모이중작용기 링커 (homobifunctionallinker)를 포함하며, 바람직하게는 헤테로이중작용기 링커이다.

본 발명, 특히, 항말라리아 작용제로서 아민기를 갖는 것을 이용하는 경우에 적합한 헤테로이중작용기 링커는 N-숙시니미딜 요오도아세테이드 (N-succinimidyl iodoacetate), N-히드록시숙시니미딜 브로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르 (N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester), (N-Maleimidobutyryloxysulfosuccinamide ester), E-말레이미도카프로산 히드라지드ㆍHCl (E-Maleimidocaproic acid hydrazideㆍHCl), [N-말레이디도카프로일옥시-숙신아미드] ([N-(E-maleimidocaproyloxy)-succinamide]), [N-말레이미도카프로일옥시)-설포숙신아미드] ([N-(E-maleimidocaproyloxy)-sulfosuccinamide]), 말레이미도프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysulfosuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 히드라지드ㆍHCl (Maleimidopropionic Acid HydrazideㆍHCl), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), N-숙시니미딜-4-(요오도아세틸)아미노벤조에이트 (N-Succinimidyl-(4-iodoacetyl) aminobenzoate), 숙시니미딜-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Succinimidyl-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate), 숙시니미딜-4-(말레이미도페닐)부틸레이트 (Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), 설포숙시니미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (Sulfosuccinimidyl-(4-iodoacetyl)aminobenzoate), 설포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 설포숙시니미딜-4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), m-말레이미도벤조산 히드라지드ㆍHCl (m-Maleimidobenzoic acid hydrazideㆍHCl), 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 히드라지드ㆍHCl (4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylic acid hydrazideㆍHCl), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드ㆍHCl (4-(4-N-maleimidophenyl)butyric acid hydrazideㆍHCl) 또는 N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에서 호모이중작용기 링커로서 이용될 수 있는 것은, 비스(설포숙시니미딜)수베레이트(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), 1,2-디[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도] 부탄 (1,2-Di[3'-(2'pyridyldithio)propionamido] Butane), 디숙시니디밀 수베레이트 (Dissuccinimidyl Suberate), 디숙시니미딜 타르타레이트 (Dissuccinimidyl Tartarate), 디설포숙시니미딜 타르타레이트 (Disulfosuccinimdiyl Tartarate), 디티오-비스-(숙시니미딜 프로피오네이트) (Dithio-bis-(succinimidyl propionate)), 3,3'-디티오-비스-(설포숙시니미딜-프로피오네이트) (3,3'-Dithio-bis-(sulfosuccinimidyl-propionate)), 에틸렌 글리콜 비스(숙시니미딜숙시네이트 (Ethylene Glycol bis(Succinimidylsuccinate)) 또는 에틸렌 글리콜 비스(설포숙시니미딜숙시네이트) (Ethylene Glycol bis(Sulfosuccinimidylsuccinate)) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 진단용 키트는 크게 두 가지 면역 진단 포맷으로 구체화될 수 있다.

첫 번째 포맷에 따르면, 상기 담체 단백질은 고상의 지지체 표면에 결합되어 있고 상기 항말라리아 작용제는 상기 담체 단백질에 결합되어 있다. 이렇게 고상의 지지체 표면에 결합되어 있는 담체 단백질-항말라리아 작용제에 검체를 처리하면, 검체 내의 pLDH가 항말라리아 작용제에 결합하게 된다. 이어, pLDH의 존재 여부는 다양한 방법으로 측정될 수 있으며, 바람직하게는, pLDH의 촉매 반응에 관여하는 기질을 포함하는 반응 시약을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 반응 시약은 예컨대, (a) 젖산염 또는 젖산, (b) 3-아세틸 피리딘 아데닌 디뉴클레오타이드 (APAD), 및 (c) 완충액을 포함한다. APAD를 이용한 pLDH의 존부 분석은 미합중국 특허 제 5,124,141 호에 상세하게 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. pLDH에 의해 환원된 APAD는 다양한 방법으로 검출할 수 있으며, 예컨대, 스펙트로포토미터로 용이하게 검출할 수 있다 (흡수 피크, 363-365 nm). 상기 완충액은 반응 혼합물의 pH를 약 8.0-10.0으로 유지시켜 주는 역할을 하며, 상기한 pH 범위 내의 pKa 값을 갖는 어떠한 완충액도 사용될 수 있다. 예컨대, 완충액은 AMPSO ((3-[(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid); CHES (2N-cyclohexylaminoethane sulfonic acid); BIS TRIS PROPANE (1,3 bistrishydroxymethyl methylaminopropane), AMP (2-amino-2-methyl-1-propanol) 및 TRIS (trishydroxymethylaminomethane)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

두 번째 포맷에 따르면, 본 발명의 진단용 키트는 면역크로마토그래피 키트로 구체화된다. 면역크로마토그래피 방법은 특히, 검사 속도의 신속성의 측면에서 매우 유리한 방법이다.

본 발명의 면역크로마토그래피 키트는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르는 경우에는, 상기 담체 단백질은 금 입자 (gold particle)에 결합되어 있고 상기 항말라리아 작용제는 상기 담체 단백질에 결합되어 있는 형태를 갖게 된다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 면역크로마토그래피 키트는 (a) 금 입자-담체 단백질-항말라리아 작용제로 구성된 컨쥬게이트를 포함하는 유리 섬유가 구비되어 있고, 검체 (sample)가 투입되는 검체 투입구; 및 (b) 항말리아 작용제, 담체 단백질-항말라리아 작용제 또는 항-pLDH 항체가 결합되어 있는 검사선을 포함하는 니트로셀룰로오스 (NC) 막이 구비된 스트립을 포함한다.

검체 투입구에 검체를 첨가하면 유리 섬유 필터에 건조 상태로 보관되어 있는 금 입자-담체 단백질-항말라리아 작용제가 다시 수화되고, 검체 중의 pLDH와 결합하면서 동시에 모세관 현상에 의하여 NC 막에 있는 미세구멍을 통하여 이동한다. 이어, 검사선에 고정되어 있는 항말리아 작용제, 담체 단백질-항말라리아 작용제또는 항-pLDH 항체가, 금 입자-담체 단백질-항말라리아 작용제로 구성된 컨쥬게이트에 결합된 pLDH와 반응하면 검사선이 적색을 띠게 되며, 검체 내의 pLDH의 존재를 눈 (naked eye)으로 확인할 수 있게 된다. 본 발명의 바람직한 면역크로마토그래피 키트에 따르면, 상기 NC 막이 구비된 스트립은 항-담체 단백질 항체가 결합되어 있는 대조선을 추가적으로 포함한다. 항-담체 단백질 항체는 검체 내에 pLDH가 없더라도 금 입자-담체 단백질-항말라리아 작용제 컨쥬게이트와 반응할 수 있으므로 매 검사마다 반드시 나타나야 하며 이것으로 검사가 적절하게 수행되었는 지를 확인할 수 있다. 즉, pLDH가 있으면 그 키트의 검사선에 고정된 항말리아 작용제, 담체 단백질-항말라리아 작용제 또는 항-pLDH 항체와 반응하여 검사선과 대조선이 동시에 나타나고, pLDH가 없으면 검사선이 나타나지 않고 대조선만 나타난다.

본 발명의 진단 키트에 있어서, 상술한 첫 번째 및 두 번째 포맷에 불문하고, 적용되는 검체는 체액이며, 예컨대, 혈액, 오줌, 타액 등을 포함한다. 바람직하게는 검체는 혈액이며, 보다 바람직하게는 전혈, 용혈된 적혈구 세포, 혈장 및 혈청이다. 전혈 내의 pLDH의 양은 대체적으로 매우 낮기 때문에, 가장 바람직하게는 용혈된 적혈구 세포를 포함하는 혈청을 이용하여 진단하는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 혈액 검체 내의 적혈구 세포를 용혈시키는 용혈제를 포함하는 용액을 추가적으로 포함한다. 이러한 용혈제의 예로서, 저장액 (hypotonic solution), 독소 (예: 뱀독, Santanaria, A. et al.,Toxicology, 173(3):221(2002), Yamamoto C. et al.,Pharmacol. Toxicol., 89(4):188(2001), 우산버섯독, 벌독 등), 산화제 (NaOCl, Ginsburg, I. et al.,Free Radic. Res., 36(6):607(2002)), 산성 용액, 염기성 용액, 계면활성제류 (surfactant), 세정제 (detergent) 등이 있으며, 상기한 독소의 예로서는 스트렙토라이신 O (streptolysin O), 옥시오피닌 (oxyopinin, Corzo G., et al.,J. Biol. Chem.28;277(26):23627(2002)), LM-PLA2-Ⅱ (Fuly AL., et al.,Biochem. Pharmacol., 1;63(9):1589(2002)), 메리딘 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 용혈은 특별한 용혈제의 처리 없이, 혈액을 얼림/녹임 (freezing/thawing) 처리를 하여 실시할 수도 있다.

본 발명의 진단 키트 중 두 번재 포맷, 즉 면역크로마토그래피 키트는 검사의 신속ㆍ간편성 때문에 오래전부터 이용되어 왔다. 종래의 면역크로마토그래피 진단 키트에서의 검체로서 일반적으로 적혈구가 제거된 맑은 혈청을 이용하고 있는 데, 이는 신속ㆍ간편하다는 면역크로마토그래피 측정법의 장점을 구현화하는 데 병목이 되고 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역크로마토그래피 키트는 과산화수소, 차아염소산염, 과망간산염, 중크롬산염 및 아질산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 산화제를 포함하는 혈액 탈색 용액을 포함하는 혈액 탈색용 웰을 추가적으로 포함한다. 상술한 혈액 탈색 용액은 혈액을 탈색시키기 때문에, 전혈 또는 용혈된 적혈구를 포함하는 혈청을 검체로 하여 면역크로마토그래피 분석을 수행할 수 있게 한다. 이러한 혈액 탈색 용액은 본 발명자에 의해 개발된 것으로서, 그 내용은 대한민국 특허출원 제 2000-5447 호에 개시되어 있다.

상술한 혈액 탈색 용액에서, 산화제로서 가장 바람직한 것은 과산화수소이다. 본 발명에서 과산화수소가 산화제로서 가장 바람직한 이유는 과산화수소가 비교적 용이하게 적혈구의 세포막을 통과할 수 있고 적혈구내에는 과산화수소를 분해하는 효소인 카탈라제가 존재하여 과산화수소의 분해를 촉진시켜 주기 때문이다. 또한, 과산화수소는 탈색작용 이외에도 소독작용을 하기 때문에 혈액을 취급하는 도중 발생할 수 있는 부주의 감염으로부터 보호되고, 혈액 취급 단계가 대폭 생략되기 때문에 다른 방법에 비하여 상대적으로 안전하다. 혈액 검체에 상기 과산화수소를 첨가하면 과산화수소의 분해시 중간생성물인 히드록시 라디칼이 발생하여 적혈구내의 헤모글로빈 분자의 포르피린링을 파괴하여 철 이온을 헤모글로빈으로부터 분리시키므로 적혈구가 탈색된다. 상기 과산화수소의 양은 30 내지 0.01%가 바람직하고, 0.01% 미만인 경우에는 산화력이 약하여 혈구의 탈색 정도가 너무 미약하다는 문제점이 있고, 시판중인 과산화수소의 농도가 30%이기 때문에 이 농도를 초과할 수 없다.

한편, 산화제로서 과산화수소가 이용되는 경우에는 과산화수소가 분해될 때 생성되는 산소에 의한 거품을 억제하기 위하여 거품억제제를 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용되는 거품억제제는 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르 등과 같은 실리콘 계열류; 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 등과 같은 다가알코올류; Tween 80과 같은 계면활성제류 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 거품억제제로서 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물 또는 실리콘 오일과 메톡시기로 치환된 히드록시프로필 메틸셀룰로스의 혼합물을 이용하는 것이다. 상기 거품억제제의 양은 0.001 내지 1%가 바람직하고, 0.001% 미만인 경우에는 거품억제력이 너무 약하고, 1%를 초과하는 경우에는 스트립에 결합된 항원 또는 항체가 워쉬-아웃 (wash-out) 되어서 최종적인 검출 시그널이 약해지는 문제점이 있다.

또한, 과산화수소는 혈구내의 카탈라제에 의하여 물과 산소로 분해되므로 반응 초기에 과량으로 발생하는 거품의 원인인 산소의 발생을 억제하기 위하여 효소저해제를 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용되는 효소저해제는 시안아미드, 아미노트리아졸, 아지드화 나트륨 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 효소 저해제의 양은 0.0001 내지 0.1%가 바람직하고, 0.0001% 미만인 경우에는 효과적으로 효소를 저해하지 못하므로 거품의 발생이 많고, 0.1%를 초과하는 경우에는 효소를 거의 완전하게 저해하기 때문에 히드록시 라디칼 발생이 지연되어 탈색반응도 대단히 천천히 일어난다.

상기한 바와 같이 거품억제제와 효소저해제를 첨가하여 거품을 효과적으로 억제하는 이유는 탈색반응 중에 발생하는 기포가 NC막의 미세구멍을 막아 검체의 이동을 방해하는 것을 억제하기 위해서이다.

본 발명에는 탈색반응을 촉진시키기 위하여 킬레이트제를 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하며, 킬레이트제는 혈액의 탈색 시에 헤모글로빈으로부터 분리되는 철 이온과 신속하게 착화물을 형성하여, 본 발명 탈색반응을 촉진하는 역할을 한다. 또한, 상기 킬레이트제는 채혈시 발생되는 혈액 응고를 방지하는 항응고제의 역할도 수행한다. 본 발명에서 이용되는 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산, 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 면역크로마토그래피 키트에 있어서, 상기 혈액 탈색용 웰은 상기 검체 투입구 및 상기 NC 막이 구비된 스트립에 대하여 분리되거나 결합되어 설치될 수 있다. 또한, 본 발명 진단 키트는 사용자의 편의를 고려하여 검체를 취급할 운반 수단을 추가적으로 포함할 수 있다.

혈액 탈색 용액을 이용하는 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 혈액을 응고시키고 원심분리하여야 하는 불편함을 제거하고, 전혈 자체를 이용할 수 있기 때문에 사용이 매우 간편하고, 개인이 스스로 진단할 수 있다. 더불어, 용혈된 적혈구 세포를 포함하는 혈청을 이용하는 경우에도, 혈액 탈색 용액을 이용하는 본 발명의 장점이 더욱 강조된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 말라리아 진단용 키트의 제조

본 발명의 면역크로마토그래피 키트는 두 부분으로 이루어진 카세트형으로제작하였는 데, 그 외에도 혈액 탈색 용액이 들어 있는 에펜도르프 튜브와 검체를 취급할 때 사용되는 드롭퍼 (dropper)로 구성하였다. 첫 번째 스트립 부분에는 미세 구멍의 크기가 8 ㎛인 NC 막을 설치하고, 상기 NC 막의 중간부에 클로로퀸, 소혈청 알부민(BSA)-클로로퀸 또는 항-pLDH 항체가 고정화된 검사선을 만들고, 항-BSA 항체 (Sigma)가 고정화된 대조선을 상기 NC 막의 상단부에 만들었다.

두 번째의 검체 투입구의 밑에 장착되는 금입자-BSA-클로로퀸 컨쥬게이트는 다음과 같이 제조하였다: BSA 4.5 ㎎을 금 입자 (BBI사, 영국) 현탁액 10 ㎖에 첨가한 다음, 30분 동안 교반하였다. 이어, 금 입자-BSA에 N-숙시니미딜요오도아세테이트 (Pierce) 0.13 ㎎을 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응을 진행시킨 다음, Sephadex G-25가 충진된 유리관을 이용하여 결합하지 않은 N-숙시니미딜요오도아세테이트를 제거하고, 클로로퀸 (Sigma) 18 ㎎을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시, Sephadex G-25가 충진된 유리관을 이용하여 결합되지 않는 클로로퀸을 제거하고, L-시스테인 (Sigma, 최종 농도 5 mM)을 가하여 반응을 종결시켰다. 이 반응액을 11,000 g에서 1 시간 동안 4℃에서 원심분리로 수집하여 0.84% NaCl을 포함하는 인산염 완충액 (pH 7.4)으로 2회 세척하고 난 후, 컨쥬게이트를 동일 완충액에 현탁시켰다.

이렇게 하여 제조된 금 입자-BSA-클로로퀸 컨쥬게이트 현탁액으로 유리 섬유 (Milipore사, 미국)를 적시고, 37℃에서 3 시간 동안 건조시켰다.

혈액 탈색용액은 1.5% H₂O₂, 0.016% Sag 471 (OSi Specialties사, 미국),0.003% NaN₃및 5 mM EDTA를 포함하는 PBS용액 160 ㎕로 구성되어 있는데, 진단 키트의 보관 및 운반시 상기 용액이 누출되지 않도록 에펜도르프 튜브에 첨가하고 덮개를 설치하였다.

실시예 2: 말라리아 진단용 키트를 이용한 진단

상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 진단 키트를 이용하여 플라스모디움-유래 pLDH를 검출하고, 검출 결과가 말라리아 진단에 대하여 유의성을 갖는지 여부를 다음과 같이 실시하였다:

먼저, 혈액원에서 말라리아에 대하여 검사하여 음성인지 혹은 양성인지가 확인된 혈청 검체를 각각 5가지씩 입수하였다. 한편, 혈액검체는 입수하기가 곤란하기 때문에 상기의 혈청에 O형의 정상인 혈구를 동량으로 섞어 만든 혼합혈액으로 대체하여 사용하였다. 혈청을 검체로 이용하는 경우에는 상기 실시예 1에서 제작된 진단 키트의 검체 투입구에 혈청을 직접 첨가하고, 전혈을 이용하는 경우에는 얼렸다 다시 녹여서 용혈을 유도시킨 후, 실시예 1의 혈액 탈색용액이 든 에펜도르프 튜브에 용혈된 혈액 1 방울 (약 30 ㎕)을 첨가하여 약 1 분간 탈색반응 시켜서 탈색된 혈액 3-4 방울 (약 100 ㎕)을 검체 투입구에 투입하여 검사선 및 대조선의 발색 양상을 관찰하였다.

투입 후 약 3 분 경과한 후부터 검사선이 나타나기 시작하여 시간이 경과함에 따라 색이 짙어졌으며 5 분이 경과하자 대조선이 나타났으나 붉은 색 입자가 이동하는 것으로 보아 반응이 완결되지 않았음을 알 수 있었고, 이 현상은 약 10 분 경과 후까지 계속 되었지만 그 후에도 색깔이 계속 짙어져 반응이 계속되고 있음을 볼 수 있었다. 그러나 전체적으로 양성 반응은 3 분 내에 시작되어 10 분 정도면 확인할 수 있었다. 또한 혈액원에서 확인된 음성혈청 5가지 및 양성혈청 5가지를, 실시예 1에서 제작된 본 발명의 진단 키트를 이용하여 시험하였을 때 검체가 혈청이냐 혹은 혈액이냐에 상관없이 그 결과가 일치하였다.

이러한 실험으로부터 얻은 데이터를 기초로 하여 본 발명의 진단 키트의 말라리아 검사에 대한 민감도 및 특이도를 다음 수학식에 따라 계산하였다.

민감도 = [(진양성)/(진양성 + 위음성)] x 100

특이도 = [(진음성)/(진음성 + 위양성)] x 100

실험 결과, 본 발명의 말라리아 진단용 키트는 100%의 민감도 및 100%의 특이도를 나타내어 말라리아 진단에 매우 효율적임을 알 수 있었다.

본 발명은 말라리아 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 높은 민감도 및 특이도를 나타내면서도 동시에 신속하고 편리하게 말라리아에 대하여 진단할 수 있는 장점을 갖는다.

Claims

플라스모디움의 젖산 탈수소효소 (pLDH)의 NADH (또는 NAD⁺) 결합 부위에 대하여 NADH (또는 NAD⁺)와 경쟁적 결합을 하는 항말라리아 작용제 및 상기 항말라리아 작용제에 공유 결합된 비인간-유래의 담체 단백질을 포함하는 말라리아 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 항말라리아 작용제는 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 퀴닌, 퀴닌 비설페이트, 퀴닌 카보네이트, 퀴닌 디히드로브로마이드, 퀴닌 디히드로클로라이드, 퀴닌 에틸카보네이트, 퀴닌 포르메이트, 퀴닌 글루코네이트, 퀴닌 히드리오다이드, 퀴닌 히드로클로라이드, 퀴닌 살리실레이트, 퀴닌 설페이트, 퀴닌 타네이트, 퀴닌 우레아 히드로클로라이드, 퀴노사이드, 퀴놀린, 아모디아퀸, 파마퀸, 플라스모시드 및 프리마퀸으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 비-인간 유래의 알부민, 카제인, 비-인간 유래의 시토크롬 c, 페투인, 스킴 밀크, 티로글로불린, 아시알로페투인 및소의 서브맥실러리 뮤신로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 항말라리아 작용제 및 상기 담체 단백질 사이의 결합은 직접 공유 결합 또는 간접 공유 결합인 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 4 항에 있어서, 상기 간접 공유 결합은 헤테로이중작용기 링커 또는 호모이중작용기 링커에 의해 이루어짐을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 5 항에 있어서, 상기 헤테로이중작용기 링커는 N-숙시니미딜 요오도아세테이드, N-히드록시숙시니미딜 브로모아세테이트, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르, m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 , N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르, E-말레이미도카프로산 히드라지드ㆍHCl, [N-말레이디도카프로일옥시-숙신아미드], [N-말레이미도카프로일옥시)-설포숙신아미드], 말레이미도프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 말레이미도프로피온산 N-히드록시설포숙신이미드 에스테르, 말레이미도프로피온산 히드라지드ㆍHCl, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, N-숙시니미딜-4-(요오도아세틸)아미노벤조에이트, 숙시니미딜-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 숙시니미딜-4-(말레이미도페닐)부틸레이트, 설포숙시니미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트, 설포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 설포숙시니미딜-4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트, m-말레이미도벤조산 히드라지드ㆍHCl, 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 히드라지드ㆍHCl, 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드ㆍHCl 또는 N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate)이고, 상기 호모이중작용기 링커는 비스(설포숙시니미딜)수베레이트, 1,2-디[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도] 부탄, 디숙시니디밀 수베레이트, 디숙시니미딜 타르타레이트, 디설포숙시니미딜 타르타레이트, 디티오-비스-(숙시니미딜 프로피오네이트) , 3,3'-디티오-비스-(설포숙시니미딜-프로피오네이트), 에틸렌 글리콜 비스(숙시니미딜숙시네이트 또는 에틸렌 글리콜 비스(설포숙시니미딜숙시네이트)인 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 고상의 지지체 표면에 결합되어 있고 상기 항말라리아 작용제는 상기 담체 단백질에 결합된 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 키트는 플라스모디움의 젖산 탈수소효소의 촉매 반응에 관여하는 기질을 포함하는 반응 시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 반응 시약은 (a) 젖산염 또는 젖산, (b) 3-아세틸 피리딘 아데닌 디뉴클레오타이드, 및 (c) 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 금 입자에 결합되어 있고 상기 항말라리아 작용제는 상기 담체 단백질에 결합된 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 10 항에 있어서, 상기 키트는 (a) 금 입자-담체 단백질-항말라리아 작용제로 구성된 컨쥬게이트를 포함하는 유리 섬유가 구비되어 있고, 검체가 투입되는 검체 투입구; 및 (b) 항말리아 작용제, 담체 단백질-항말라리아 작용제 또는 항-pLDH 항체가 결합되어 있는 검사선을 포함하는 니트로셀룰로오스 막이 구비된 스트립을 포함하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 니트로셀룰로오스 막이 구비된 스트립은 항-담체 단백질 항체가 결합되어 있는 대조선을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 키트는 과산화수소, 차아염소산염, 과망간산염, 중크롬산염 및 아질산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 산화제를 포함하는 혈액 탈색 용액을 포함하는 혈액 탈색용 웰을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 13 항에 있어서, 상기 산화제는 과산화수소임을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 13 항에 있어서, 상기 혈액 탈색 용액은 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르, 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 및 Tween 80으로 구성된 군으로부터 선택되는 거품억제제가 추가적으로 포함됨을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물은 실리콘 오일과 그라피트의 혼합물 또는 실리콘 오일과 메톡시기로 치환된 히드록시프로필 메틸셀룰로스의 혼합물임을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 혈액 탈색 용액은 시안아미드, 아미노트리아졸 및 아지드화 나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 효소 저해제가 추가적으로 포함됨을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 혈액 탈색 용액은 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산 및 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 킬레이트제가 추가적으로 포함됨을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 12 항에 있어서, 상기 혈액 탈색용 웰은 상기 검체 투입구 및 상기 니트로셀룰로오스 막이 구비된 스트립에 대하여 분리되어 있거나 결합되어 설치됨을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 키트는 혈액 운반 수단을 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 혈액 검체 내의 적혈구를 용혈시키는 용액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.
제 10 항에 있어서, 상기 키트는 혈액 검체 내의 적혈구를 용혈시키는 용액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단용 키트.