JPS60501028A - 螢光による細胞膜タンパク質依存性細胞エンドサイト−シスの検知及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 螢光による細胞膜タンパク質依存性細胞エンドサイト−シスの検知及び測定方法 本発明は螢光による細胞膜タンパク質依存性細胞エンドサイト−シスの検知及び 測定方法に係り、格別には該細胞エンドサイト−シスの定量的測定が可能な方法 に係る。

輸送タンパク及びホルモン受容体、免疫グロブリントＣ受容体、表面免疫グロブ リンあるいは強組織適合性（ｍａｊｅｕｒ　ｄ’旧ｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌ ｉｔ６．　ＨＨＣ）複合体によッテ］−ドされた抗原に属する細胞表面分子は、 エンドサイト−シス現象を起こす細胞においてその原因となり得、別の言葉でい えば、前記分子とその分子を特異的に判別できる分子との反応による前記分子の 前記細胞内への移動あるいは前記細胞への異なる分子の侵入を生起づることがで きることが知られている。

上記の種類の分子は数多くのタイプのタンパク質、より一般的には細胞膜上、特 にその表面に存在する分子で、エントリイト−シス現象を生起できるものの例で しかない。用語の便宜上、これ等の分子を合わせたものについて、これ等が他の 種類の分子即ち「リガンド」と結合するのに適したものであり、この結合が少な くとも大多数の場合において細胞エンドサイト−シスの誘起の原因となるもので ある限りにおいて、以後「決定基」という用語を使用する。

モノクローナル抗体はリガンドの特別な種類であり、特に決定基−リガント間の 反応試験、例えば細胞表面の対応する決定基定量の目的で使用される。この試験 は、共有結合でプ［１テインＡに結合しており、対応するモノクローナル抗体の 仲介により関連する決定因子に特異的に結合し得るようになった改変リポソーム を使用することによって、その相互反応を“視覚化′。

できることにより、より容易にされる。細胞エンドサイト−シスが起ると、リポ ソームの“インターナリゼーション″が見られ、言い換えると前記細胞内部への リポソームの侵入が見られる。

このような改変リポソームの利用は受容体−リガント結合測定のためのエンドサ イト−シス反応の相対的定量評価方法の分野で既に注目されていた。これは例え ば、Ｐ、Ｈａｃｈｙ及びＣ０１１（”Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳ＾”　、ｖｏｌ、７９．ｐ、４１４８−４１５２　ｊｕｌｙ、１９８２　） により、決定基を特異的に判別する抗体の持つ螢光リポソームおよび含有メトト レキサートを使用した、リンパ球Ｔ及び８表面の決定基のエンドサイト−シス変 化の研究において実現されている。改変リポソームの決定基への固定は螢光測定 により検知され、同時にメトトレキサートと２つのタイプのリンパ球内で放射活 性標識されたデオキシウリジンによる阻害によって測定される改変リポソームの インターナリゼーションの変化によりエンドサイト−シス変化が評価される。リ ポソームを介して２つのタイプのリンパ球内に移入したメトトレキサートによる 阻害効果は、前記細胞及び対応する目標膜受容体の性質により判別できることが 確認されたが、その表面に固定されたリポソームの多数には相関しない。前述の 方法による変化分析の使用の可能性は、放射活性標識の感度の弱さ、放射活性に よる危険性のために依然としてかなり制限されている。

本発明の目的は、より敏感で放射活性の危険性のない、対応するりガントの判別 において試験細胞の特異的決定基を使用する細胞エンドサイト−シスの検知及び 定量方法を提供することにある。

本発明の目的はまた、同じリガンドを保持し得る異なるタイプの細胞の場合にお いて、決定基−リガント間の同じ反応により生起されるエンドサイト−シス変化 の定量評価を容易に行なうことができる方法を提供することにもある。

試験細胞の検知リガンドあるいは任意に前記リガンドを判別可能な決定基を保持 する検知リガンド及び前記リガンドに結合適応性のある分子あるいはりガントそ のものに共有結合し、螢光色素溶液をカプセル化して保持した改変リポソームと 接触させる、本発明の細胞エンドサイト−シス検知方法は、カプセル化された螢 光色素溶液濃度をその螢光が自己消滅（ａｕｔｏ−ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）する ように当初に充分高くすることを特徴とする。

上記の接触は、細胞が生物学的に機能するのに適した温度、例えばヒト由来の細 胞であれば３７℃程度の温度で行なわなければならないことを強調しておかなけ ればならない。

螢光色素物質あるいは螢光物質は、一般的に濃度が高い場合非常にはつきりした 自己消滅を生起することがよく知られている。特に効果の高い螢光色素はカルボ キシフルオレセインより成るもので、それは濃ゝ度が高い場合非常に強い自己消 滅を生起する。他の全ての螢光色素を使用することができるが、これは螢光測定 あるいは比色測定により検知可能な色調あるいはそれに類するものの変化により 消滅を示すものの中の好適例である。

フルオレセインの例としてはフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）あ るいは゛′ルシフエールイエｏ−（Ｌｕｃｉｆｅｒ−ｙｅｌｌｏｗ）”と呼ばれ る螢光色素が挙げられる。

本発明によればエンドサイト−シス活性は、リポソームのインターナリゼーショ ンとその細胞内区画内での特に酸の輸送の結果である、リポソーム中にカプセル 化された螢光色素の細胞質中での遊離により検知、測定される。しかるに、エン ドサイト−シスの測定は細胞中での螢光色素の当初螢光の消滅の減少に直接相関 しており、従って細胞の細胞質内における螢光色素の希釈の結果であり量子化で きる細胞関連の紛争光の消滅の増加に相関する。

従って本方法は下記の測定が可能である。

−細胞表面の成分、あるいは逆に細胞成分の１つを特異的に判別できるリガンド 成分の相対密度 御名成分のエンドサイト−シス可能速度本発明はリガンドあるいは決定基の生成 の測定、すなわちそれらを生成した細胞によるエンドサイト−シスの測定という 新規で付加的な可能性を示している。この情報は従来のあるいは自動化された螢 光測定により細胞集団について、あるいは細胞螢光測定により集団の奥に分離さ れた細胞について得られる。

本発明による方法はとにかく非常に高い感度を有している。

本方法により変化の分析、特に決定基及び受容体を発現する細胞の決定基及び受 容体に依るリポソームのインターナリゼーションの運動力学の変化の測定が可能 である。

本発明による方法によれば、リガンド−決定基の結合の判別も可能である。これ はそれ等の相互反応の場合であり、エンドサイト−シス反応は生起しない。これ はりガント−決定基結合の場合であり、膜表面に厳格に制限された反応だけを使 用する。

このような場合、リポソームのインターナリゼーションがないために、螢光の消 滅の抑制は見られない。

リポソームは公知の方法により調製する。それは脂質、特に細胞膜の対応する成 分の少なくとも一部分と置き換えることができるリン脂質を基とする。それ等は 通常の方法、特に選択された脂質及び選択された螢光色素の濃溶液の混合物の超 音波処理により調製される。生成されたリポソームは引き続き共有結合により選 択されたリガンドとの結合を目的とする分子に結合あるいは連結できる。その分 子は例えばプロティンＡであり、その場合リガンドは抗体である。この結合は全 ての方法においてリポソームに大きな影響を与えることなく行なえる。この結合 は例えばＮ−ヒドロキシス、クシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プ ロピオナート（ＳＰＤＰ）のような網状化試薬を介してり、　Ｄ、　ＬＥＳＥＲ ＨＡＮ及びＣｏｔ　ｌ　（Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、　２８８．　Ｎｏ５７９１ 　、　ｐ、　６０２−６０４．１１．　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９８０）あるいはＪ 、　ＢＡＲＢＥＴ及びＣｏ１１（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＳｕｐｒａｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、　１６：２４３−２５８（１９８１）、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｏ ｎｉｔｉｏｎ、　２３７−２５２）により記述された方法により達成される。

前記リガンドに結合でき、リポソームに結合又は連結される分子はさらにリガン ドそのものであってもよく、このようにして得られる反応体は、試験細胞上で同 じリガンドにより判別可能な対応する決定基あるいは受容体の検知への使用にの み適する。

本発明では、リポソーム及び試験細胞の容量の有意な差を利用している。リポソ ームの大きさは一般に４０００オングトローム以下、好ましくは１０００オング ストローム以下、より好ましくは６００オングストローム以下である。もし試験 細胞が哺乳動物由来のもので通常の１０〜１５ミクロンの大きさであれば、１０ ００オングストローム（０，１ミクロン）の大きさを持つリポソームを使用する のが好ましく、それらの大きさのものであれば容量において１０６オーダーの大 きさの差があり、本発明の方゛法を利用したエンドサイト−シスを受けた細胞内 でのリポソームのインターナリゼーション時に前記細胞質内での遊離螢光色素希 釈現象の原因となる。

螢光色素のカプセル化溶液の当初濃度は、同じ螢光色素のより稀薄な溶液で観察 され得る最大の螢光強度に対して少なくとも７０％、好ましくは９０％、より好 ましくは９５％であり、上記の自己消滅効果を可能にするこの最大強度及び最小 濃度は開始に使用したそれぞれの螢光色素につぎ実験的にめることができる。好 ましい螢光色素、カルボキシフルオレセインの場合、その最小濃度は少なくとも １０ｍＭ、好ましくは少なくとも１００ｍＭである。

溶解度や実施上の問題を考慮しなければ、螢光色素の濃度（ｊいくら高くしても 制限されφことはない。リポソームと試験細胞との間の容量的比率が大きいこと 、即ち既により高い状態にあることを考慮すると、希釈は全ての場合においで充 分に自己消滅を生起する。螢光色素の自己消滅の抑制の相対的測定はいくつかの パラメーター、中でも下記の３つのパラメーターの複合関係によるものである。

１）リポソームのインターナリゼーションの結果による細胞表面決定基のエンド サイト−シス率あるいは速度。

２）リポソームにより細胞質中に最初にカプセル化された螢光色素の遊離速度及 び進行段階。

３）細胞内へ遊離され、細胞外へ輸送された螢光色素の排出。

第１と第２のパラメーターの試験の結果から、エンドサイト−シスの進行相関関 係の試験結果により、本発明による方法はリポソームのインターナリゼーション の運動力学変化の測定が可能である。また第３のパラメーターは重要な役割を果 しており、単離細胞レベルでのエンドサイト−シスの差異試験の可能性を制限し 得る。観察した場合においては第３のパラメーターは第２のものに対して優位に あると言え、すなわち細胞外に輸送された螢光色素の排出は、細胞質内でリポソ ームにより最初にカプセル化された螢光色素の遊離速度あるいは進行段階を超え ようとするものである。この場合、変化の測定は全９体的なレベルで達成し得（ 細胞及びその中にある細胞を合わせたレベルでの螢光消滅の減少）、さもなけれ ば単離された細胞レベルで達成し得る。

本発明の他の特徴は、本発明に依る方法を利用した実施例に続く説明、特に下記 のような図表による説明によりさらに記述する。

一第１図は、本発明に従って標識したネズミフィブロブラストＬ細胞約１０，０ ００個から４℃と３７℃においてそれぞれ測定した相対螢光強度（ＩＲＦ）と細 胞数（ＮＣ）の関係を示した螢光分布図である。

〜第２図は、本発明による条件とそうでない条件における標識リポソームによる インターナリゼーションに従う、時間数（Ｈ）に対する使用した標識の螢光（Ｆ ）の変化をそれぞれ示したものである。

一第３図は、エンドサイトルシスが観察された決定基−リガントシステムと、逆 に観察されなかったシステムに従った同様の螢光の変化を表す曲線である。

本実施例の範囲では、コンカナバリンＡで刺激したＣＢＡ／Ｊネズミ由来のリン パ球Ｔ及びフィブロブラスト［細胞を使用した。ＬＥＨＫＥ及びＣｏ１ｔにより 記述されたＩｇＧ２ｂ　Ｉｑ　（Ｅｄ、Ｈａｍｍｃｒｌｉｎｇ、Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｒｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　Ａｍ ｓｔｅｒｄａｍ。

１０２−１０９．１９８１）　（Ｄ力ｙハ抗−Ｈ−２Ｋ　（Ｈｌｏｏ−３０／３ ３）抗体テする。抗ＭＨＣ（Ｈ−’２）Ｅツクローナル抗体、及びＲＡＦＦ及び Ｃｏ　Ｉ　Ｉ　（ＢＲＡＩＮ　ＲＥＳ、　１７４．２８３−３０８．１９７９） モＬ　＜　ハＧＨＡＮＤＯＬＩＲ及ヒｃｏｌ　ｌ（Ｊ、ＨＩＳＴＯＣＨＥＨ，Ｃ ＹＴＯＣＨＥＨ，，３０，１６５−１７０，１９８２）　ニより記述された方法 に従い調製されたウザギ抗フィブロネクチンの抗血清を介して、プロティンＡと リポソームのＴ及びし細胞への連結の結合を達成した。プロティンＡとリポソー ムの結合はＬＥＳＥＲＨＡＮ及びＣｏ１１の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２８８．６ ０２−６０４．１９８０）により調製した。超音波処理により得られた小リポソ ームと、ジパルミトイルホスファチジルコリンをベースとした（６５モル％）コ レステロール（３４％）及び５ＰＤＰ改変ホスフアチジルエタノールアミン（１ ％）の混合物であって４０ｍＭのカルボキシフルオレセインを含有するものを、 ５ＰＤＰ改変プロテインＡ（１モルプロティンΔに対し１０モル５ＰＤＰによる ）とともに１６時間、プロティンＡの最終濃度が２００ｕ’ｊ／雇−１までイａ ｏ／３３　）抗体あるいは抗フィブロネクチンと前もってインキュベートしたリ ンパ芽球Ｔ及びＬ細胞への連結における特異的結合試験 ＣＢＡ／Ｊネズミから得た丁細胞を２０ｍの１６４０ＲＰＨＩ培地（ＧＩＢＣＯ ）とともに組織培養フラスコ内でインキュベートした（３０Ｘ１０　細胞、３７ ℃、７　％　Ｃ０２）　。該培地には５％の熱不活性化子つシ胎膜血清（Ｆｅ２ ．ＧＩＢＣＯ）　、２ｍＭグルタミン、０．０５Ｍペニシリン及びストレプトマ イシン中の２メルカ″ブトエタノール及び増殖を誘起するための２μ９／ｒｉｄ のコンカナバリンＡを添加した。４０時間後に、細胞を収集し８×１０６細胞／ ｄの濃度で有糸分裂剤を含まない完全培地中に懸濁した。

Ｆｅ２を７％添加したＲＰＨＩ培地中で培養したし一細胞は、細胞付着物を除去 するためのＰＢＳバッファー中１．５ｍＭのＥＤＴＡを用いた処理（５分間、３ ７℃）により収集し、洗浄した再び同一濃度に懸濁した。５０μｐの細胞試料を マイクロ滴定プレートの９６の円錐形穴に入れ、最終濃度４０μｇ／ｄの１−１ １００−（３０／３３）の１０μρあるいは最終希釈度１／１００の抗血清拭フ ィブロネクチンを適当な穴に加えた。４℃における１／２一時間のインキュベー トの後、細胞を１回洗浄し、冷却した培地中に再び懸濁した。２２０ピコモルの カルボキシフルオレセインを示すプロティンＡ−リポソーム連結物の１０μρを 試料を含む全ての穴に加え、１．５時間４℃でインキユベートを続けた。遊離プ ロティンＡ　（８０μｇ’／ｄ）をリポソームの数分前に対応する穴に加えた。

細胞をリポソーム用バッファー（ＮａｃＪ　１４５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ　１０＋ｙ ＋Ｈ，ｐＨ７，４）中で３回洗浄し、それぞれの螢光をＡｍ１ｎＣＯＳＰＦ分光 分光計光計り測定した（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４８８μｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ：５２０ｍｎ）　。その後、０，５％ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００により細胞溶解 した。計算は２０％Ｍのカルボキシフルオレセインを基準とした対照により行っ た。

得られた結果を次表に示す。

表中に示した結果は、前記の細胞上へのリポソームの固定を立証するものである 。

図表に示した結果を得た実験は下記のようにして行った。

リンパ芽球Ｔ及びＬｌｌｌ胞を前記条件にて収集し、ＲＰＨＩ培地に再懸濁して Ｆｅ２（４Ｘ１０７１胞／ｄ）を加え、４℃で１時間、プラスチック使い捨て試 験管中で抗体を含むものと含まないものにについてインキュベートした。洗浄後 、プロティンＡ−リポソーム連結物（４０μ３リン脂質／１ｏ６細胞当量）が、 ＦＩＴＣ−プロフィンへ連結物（２０μｇ／ｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の存在 下で再びインキュベートしく４℃、１．５時間）、結合されていない物質を除去 するために２回洗浄した。

インターナリゼーションの運動力学を調べるために、細胞を３７℃の温浴中でイ ンキュベートし、異なる時刻に試験管から試料を取って水浴中の試験管中に移し た。この試験管中には各試料の３倍容量の培地を含む。細胞が急冷され、酵素工 程及びエネルギー蓄積依存代謝工程の停止がもたらされた。引き続き、アルゴン イオン１５４（４Ｗ）レーザーモデルを使用してＥＰＩＣ３Ｖ細胞選別の検出に ついて試料を分析した。励起レーザーは２００ｍ　Ｌ　４８８μｍにおける５ｃ ｈｏｔｔ　ＳＡＬ　５３０フイルターと５３０μｍにおける外部ガラスフィルタ ーの組合せである。光学回速機は６００Ｖに調整し、細胞流量は毎秒１ｏｏｏ個 に調整した。光の回折測定に基づいた選別により死細胞を取り除いた後、それぞ れの試料からの１００００の細胞について螢光強度を分析した。細胞に付随しな いカルボキシフルオレセインはこの測定を阻害することはない。これは細胞外で の発光はほんのわずかのものであるからである。

第１図は、旧００−３０／３３（１００μｇ／ｄ）及びプロティンＡ−リポソー ム（ＣＦ４ｈ＋Ｈ）により４℃で着色されたし細胞（曲線ａ）と３７℃で２時間 インキュベートした後のもの（曲線ｂ）の螢光の分布図である。

Ｔ細胞の螢光（Ｆ）の時間による変化を第２図に示した。

１００ｍＭのカルボキシフルオレセインを包むリポソームを接触させたちのく曲 線Ｃ）、１０ｍＭのものく曲線ｄ）あるいはＦＩＴＣ−プロティンＡ連結物と接 触させたちのく曲線ｅ）である。

得られた値は、時間Ｏの時点で着色した細胞の９０％が螢光のベースとして排除 されるように、最小の螢光強度に対応する螢光の窓に基づいたものである。螢光 強度は３７℃で種々の時間　−インキュベートした後測定し、最初に測定したも のと比較した。

第３図は、抗体の存在下及びプロティンＡ−リポソーム連結物の存在下でインキ ュベートした細胞につき得られた螢光（Ｆ）の変化を示す曲線を表わしている。

曲線ｑは旧００−３０／３３抗体との関係から得られたものであり、曲線りは抗 血清−抗フイブロネクチンとの関係から得られたものである。

以下の観察は上記の表及び図を考察することにより導かれる。

リンパ球Ｔ及びし細胞はどちらも、旧００−３０／３３の存在下で４℃でインキ ュベートするとプロティンＡ−リポソーム連結物に固定されるが、非存在下では 固定されない。その結合はし細胞を抗血清拭フィブロネクチンと前もってインキ ュベートした時も起る。プロティンＡ−リポソーム連結物と２つのタイプの細胞 間の結合は遊離プロティンＡにより阻害され得る。

抗１−１−２に’を介してプロティンＡ−リポソーム連結体で標識された１００ ００のＬ細胞についての螢光の分布図は、はとんどのものが弱い螢光しか示さな いとしても、それ等の９８％が標識されたことを示している。４℃において４時 間までは、プーロフィルは大きくは変らない（何も示さない）。

細胞が３７℃で２時間保持された場合、螢光強度がより高く変化するのが観察さ れる（第１図）。この現象は最初に高い濃度であったカルボキシフルオレセイン の自己消滅の抑制によるものである。第２図に示される結梁を得た実験において 、抗日−２ＫＫモノクローナル抗体により前処理した−［細胞芽球は、１００ｍ Ｍと１０ｍＭの２つの濃度のカルボキシフルオレセインの存在下で３７℃でイン キュベートした。ただし形態、脂肪組成物、結合プロティンＡは同一である。こ れ等の図は、１００ｍＭカルボキシフルオレセインを含有するリポソームは螢光 に関し最初に測定下後４時間後までさらに増加しつづけるという重要な螢光の増 加を明らかにしている（第２図）。１０ｍＭのカルボキシフルオレセインを含有 するリポソームとインキュベートした細胞は、同様な螢光の増加は示さない。こ れ当２つのタイプのリポソームの自己消滅値はそれぞれ９６％及び７４％であっ た。従って、１００ｍＭのカルボキシフルオレセインを含有するリポソームは螢 光信号を最初の値の２５倍まで増幅し得る能力を有し、自己消滅を超えるのに対 し、１０ｍＭのもののリポソームはこの信号を３〜４倍にしか増幅できない。

第２図は、リポソーム内の結合されていないカルボキシフルオレセインの代りに 共有結合でプロティンＡに結合されたフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩ ＴＣ）を使用した時、螢光の増加は見られないことを示している。

当初の自己消滅抑制は目的細胞表面決定基に依存する。

Ｈ−２Ｋｋに対する抗体を介してリポソームを保持するＬ細胞とフィブロネクチ ンに対する抗体との比較により、Ｈ−２ＫＫ決定基のみが細胞螢光増加に関与す ることが明らかになり（第３図）、従ってフィブロネクチンは関与しない。フィ ブロネクチンは膜表面から得られる構造タンパク質で以前からエンドサイト−シ スを誘起できないことが知られている。

以前は、試験決定基を保持する細胞を対応するりガント及び周辺物を該リガンド に結合し得る分子（あるいは分子連結物）を保持するリポソームに別々に接触さ せるという考えが採用されていた。

前もって形成された複合体（リポソーム−結合分子−リガント）例えばリポソー ム−プロティンへ−抗体のような複合体と任意に細胞を同様に接触させることが できる。

今まで特に抗体の場合においてそうであったが、当然本発明は抗体以外のりガン ト、例えば細胞上の対応する決定基を判別し得るホルモンあるいは輸送タンパク 質等と細胞とを接触させる細胞エンドサイト−シスの試験に拡張することができ る。

さらに一般的な方法においては、リガンドは細胞膜構成物質に対して親和性゛を 待った全ての分子であり得る。

本発明の方法は全ての形のｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断に適用可能である。

例えば、何らかのりガント−決定基の結合により誘起されるエンドサイト−シス 速度の測定、及びその速度と各通常細胞内での同種の結合により誘起されるエン ドサイト−シスの速度との比較を目的とした、例えば静脈採取により得た血液細 胞の定型試験に使用できる。他の適用ではこのエンドサイト−シスを考慮した薬 理活性物質の効果の試験、特に薬理活性物質が使用される螢光色素とともにリポ ソームにカプセル化されている場合の試験が可能である。その場合薬物の作用は 、標識リポソームのインターナリゼーションの運動力学即ち螢光色素の当初自己 消滅の抑制の運動力学のレベルで確認される変化により検知され得る。

ＩＲＦ 国際副食報告　１４表”ＲＧＯ−５０１０２８（７）第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号０発　明　者　トルネー、アルム セジド　フ＠発明者　バルベ、ジャック　フ ぢ ■発明者　マツシー、パトリック、シモ　：ン、ジャック　− 〇出頭人　アンステイテユ・ナシオナル・　フドウ・う・サンナ・工・ドウ・　 ℃ うＯルシエルシュ・メディカル ト フランス国、１３２６０＠カシス、アヴニュ・モーリス・ジェルミニ、・グラフ ・ラルジュ（番地なし） フランス国、１３００９−マルセーユ、アウ゛ニュ・ドウ・マツトル・ドウ・タ シニー、７人レジダンス・モンモランシーフランス国、１３６００・う・シタオ 、プロヴアンス・４、リス・ジョワンヴイル、１１ フランス国、７５６５４・パリ・セデクス・１本リス・ドウ・トルビアツク、１ ０１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　検討する細胞の所定のリガンドと接触させることによって細胞エンドサイ ト−シスを検出および測定する方法であり、自身が前記リガンドに固定され得る 分子と共有結合することによって改変されておりかつカプセル化により螢光色素 の溶液を内包しているリポソームに、前記細胞および前記リガンドを接触させる ことからなり、カプセル化された溶液の螢光色素濃度が最初その螢光の自己消滅 を確保づるに充分なほど高いことと、次いで前記改変リポソームのインターナリ ゼーションの結果起こる螢光の自己消滅の少なくとも部分的な抑制を測定す−る ことを特徴とする前記方法。 ２、　螢光色素１度を、観察される自己消滅が同じ螢光色素のより稀薄な溶液で 観察され得る最大の螢光の少なくとも７０％に等しいことを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の方法。 ３、　自己消滅のパーセンテージが、同じ螢光色素のより稀薄な溶液で観察され 得る最大の螢光強度に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％ であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、　リポソームの大きざが、好ましくは４０００人未満−好ましくは１０００ 人未満、更に６００人であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のい ずれかに記載の方法。 ５、　螢光色素がカルボキシフルオレセインからなることを特徴とする請求の範 囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の方法。 ６、　カプセル化されたカルボキシフルオレセインの濃度が少なくとも１０ｍＭ 、好ましくは少なくとも１００ｍＭであることを特徴とする請求の範囲第５項に 記載の方法。 ７、　リガンドがモノクローナル抗体であり、リポソームに共有結合した分子が プロティンＡであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに 記載の方法。