JP2011041577A - ルシフェラーゼ発現カセットおよび使用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、細菌ルシフェラーゼ発現カセットに関する。ここで、このような細菌ルシフェラーゼ発現カセットは、グラム陽性細菌に、生物発光特性を付与するのに適している。本発明はまた、このような細菌ルシフェラーゼ発現カセットを用いて形質転換された細胞に関する。本発明は、さらに、このような細菌ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法に関する。本発明はまた、このような細菌ルシフェラーゼ発現カセットを使用する方法に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、ルシフェラーゼ発現ベクター、それを作製する方法およびその使用の方法に関する。
生物発光細菌は、海洋および陸上環境の両方で広く見出される。興味深いことに、天然に存在する海洋および陸上生物発光細菌のすべての同定された種はグラム陰性である。現在まで、以下の4つのグラム陰性の属で少なくとも11種が記載されている:Vibrio、Photobacterium、Shewanella(Altermonas)、およびPhotorhabdus(Xenorhabdus)。これら種のすべてにおいて、生物発光に対応する5つの遺伝子がluxオペロンでクラスターとなっている(luxCDABE)。
1つの局面で、本発明は、luxA、luxB、luxC、luxDおよびluxE遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、ここで、(a)これら遺伝子産物のコード配列の配置は以下の相対的順序5’−luxA−luxB−luxC−luxD−luxE−3’であり;(b)このポリヌクレオチドの転写はすべての遺伝子産物をコードするポリシストロン性RNAを生じ;そして(c)luxA、luxB、luxC、luxDおよびluxE遺伝子産物の各々は、個々のポリペプチドとして発現される。1つの実施形態では、この発現カセットは、luxAコード配列の5’末端に隣接して位置する複数挿入部位を含む。別の実施形態では、この発現カセットは、luxA、luxB、luxC、luxDおよびluxE遺伝子産物の各々をコードするこのポリヌクレオチド配列の各々の上流に少なくとも1つのグラム陽性リボソーム結合部位配列(配列番号1)をさらに含む。これら遺伝子産物のコード配列は、好ましくは、Photorhabdus luminescensのルシフェラーゼのような、37℃で安定であるルシフェラーゼをコードする。従って、好ましくは、ルシフェラーゼのヌクレオチドコード配列は、このような生物由来である。実施形態の1つのシリーズでは、このポリヌクレオチドの転写は、Sa2またはSa4のようなSa1〜Sa6からなる群から選択される発現増強配列(Expression Enhancing Sequence)中に含まれるプロモーターにより媒介される。実施形態の関連するシリーズでは、このポリヌクレオチドの転写は、Sp1、Sp5、Sp6、Sp9、Sp16およびSp17からなる群から選択される発現増強配列(例えばSp16)中に含まれるプロモーターにより媒介される。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
(項目1) 発現カセットであって、
luxA、luxB、luxC、luxD、およびluxEの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含み、
ここで、(a)該遺伝子産物についてのコード配列の配置が、以下の相対順序:
5’−luxA−luxB−luxC−luxD−luxE−3’
であり;(b)該ポリヌクレオチドの転写は、全ての該遺伝子産物をコードするポリシストロン性RNAを生じ;そして(c)該luxA、luxB、luxC、luxD、およびluxEの遺伝子産物の各々が、個々のポリペプチドとして発現される、発現カセット。
(項目2) 複数挿入部位が、luxAコード配列の5’末端に隣接して配置される、項目1に記載の発現カセット。
(項目3) 前記luxA、luxB、luxC、luxD、およびluxEの遺伝子産物の各々をコードするポリヌクレオチド配列の各々の上流に、少なくとも1つのグラム陽性リボゾーム結合部位配列(配列番号1)をさらに含む、項目1に記載の発現カセット。
(項目4) 前記遺伝子産物のコード配列が、Photorhadus luminescensに由来する、項目1に記載の発現カセット。
(項目5) 項目5に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sa1〜Sa6からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目6) 項目5に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sa2およびSa4からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目7) 項目1に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sp1、Sp5、Sp6、Sp9、Sp16、およびSp17からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目8) 前記ポリヌクレオチドの転写が、発現増強配列Sp16に含まれるプロモーターにより媒介される、項目7に記載の発現カセット。
(項目9) 発現カセットであって、
luxA、およびluxBの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含み、
ここで、(a)該ポリヌクレオチドの転写は、両方の該遺伝子産物をコードするポリシストロン性RNAを生じ、そして(b)グラム陽性リボゾーム結合部位配列を含むポリヌクレオチド配列が、該luxAコード配列の5’末端に隣接して、そして該luxBコード配列の5’末端に隣接して配置される、発現カセット。
(項目10) 前記luxAまたはluxBコード配列のいずれか少なくとも一方の5’側に挿入部位をさらに含む、項目9に記載の発現カセット。
(項目11) 前記挿入部位がさらに複数挿入部位を含む、項目10に記載の発現カセット。
(項目12) 前記複数挿入部位が、前記luxAコード配列に対して5’側に配置される、項目11に記載の発現カセット。
(項目13) 前記ポリヌクレオチドが、luxC、luxD、およびluxEの遺伝子産物をさらにコードする、項目9に記載の発現カセット。
(項目14) 前記lux遺伝子産物についてのコード配列の配置が、以下の相対順序:
5’−luxA−luxB−luxC−luxD−luxE−3’
である、項目12に記載の発現カセット。
(項目15) グラム陽性細菌Shine−Dalgarno配列が、全ての前記luxコード配列の5’側に配置される、項目12に記載の発現カセット。
(項目16) 項目12に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sa1〜Sa6からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目17) 項目16に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sa2およびSa4からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目18) 項目12に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sp1、Sp5、Sp6、Sp9、Sp16、およびSp17からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目19) 前記ポリヌクレオチドの転写が、発現増強配列Sp16に含まれるプロモーターにより媒介される、項目18に記載の発現カセット。
(項目20) 前記luxAおよびluxBについてのコード配列が、Photorhadus luminescensから得られる、項目9に記載の発現カセット。
(項目21) 発現カセットであって、
luxA、luxB、およびlucの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含み、
ここで、(a)該ポリヌクレオチドの転写は、3つ全ての該遺伝子産物をコードするポリシストロン性RNAを生じ、そして(b)グラム陽性細菌Shine−Dalgarno配列を含むポリヌクレオチド配列が、該luxAコード配列の5’末端に隣接して、該luxBコード配列の5’末端に隣接して、そして該lucコード配列の5’末端に隣接して配置される、発現カセット。
(項目22) 前記ポリヌクレオチドが、luxC、luxD、およびluxEの遺伝子産物をさらにコードする、項目21に記載の発現カセット。
(項目23) グラム陽性細菌Shine−Dalgarno配列が、全ての前記luxコード配列の5’側に配置される、項目22に記載の発現カセット。
(項目24) 項目21に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sa1〜Sa6からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目25) 項目24に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sa2およびSa4からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目26) 項目21に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチドの転写は、Sp1、Sp5、Sp6、Sp9、Sp16、およびSp17からなる群から選択される、発現増強配列に含まれるプロモーターにより媒介される、発現カセット。
(項目27) 前記ポリヌクレオチドの転写が、発現増強配列Sp16に含まれるプロモーターにより媒介される、項目26に記載の発現カセット。
(項目28) 複数挿入部位が、前記luxAコード配列の5’末端に隣接して配置される、項目21に記載の発現カセット。
(項目29) 前記luxAおよびluxBについてのコード配列が、Photorhadus luminescensから得られる、項目21に記載の発現カセット。
(項目30) 発現カセットであって、
luxA、およびluxBの遺伝子産物のインフレームでの融合物をコードするポリヌクレオチドを含み、
ここで、(a)グラム陽性細菌Shine−Dalgarno配列を含むポリヌクレオチド配列が、該luxAコード配列の5’末端に隣接して配置され、そして(b)挿入部位が、該luxAコード配列と該luxBコード配列との間に配置される、発現カセット。
(項目31) 前記挿入部位がさらに複数挿入部位を含む、項目30に記載の発現カセット。
(項目32) 前記ポリヌクレオチドが、luxC、luxD、およびluxEの遺伝子産物をさらにコードし、そして、該遺伝子産物についてのコード配列の配置が、以下の相対順序:
5’−luxA/luxB−luxC−luxD−luxE−3’
である、項目30に記載の発現カセット。
(項目33) グラム陽性細菌Shine−Dalgarno配列が、前記luxA/luxB融合コード配列、ならびに、全ての前記luxC、luxDおよびluxEコード配列に対して5’側にある、項目32に記載の発現カセット。
(項目34) 前記発現カセットが、細菌トランスポゾン内に含まれる、項目1〜33のいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目35) 前記発現カセットが、細菌ミニトランスポゾン内に含まれる、項目1〜33のいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目36) 前記遺伝子産物のコード配列が、前記発現カセットが導入される宿主系における該遺伝子産物の発現に最適であるコドンを含む、項目30に記載の発現カセット。
(項目37) 選択された細胞型において使用するための光生成発現カセットを選択する方法であって、該方法は、以下:
該選択された細胞型から単離したゲノムDNAのフラグメントを調製する工程、
該フラグメントを、項目30〜36のいずれかに記載の発現カセットの挿入部位に挿入する工程であって、該発現カセットは、該選択された細胞型において前記遺伝子産物を発現させ得る、工程、
該フラグメントを有する該発現カセットを、該選択された細胞型の細胞に導入する工程、および
光を生成する細胞をスクリーニングする工程であって、該光生成は、該発現カセットによって媒介される、工程
を包含する、方法。
(項目38) 前記フラグメントが、ゲノムDNAの酵素消化によって生成される、項目37に記載の方法。
(項目39) 前記フラグメントが、選択された制限エンドヌクレアーゼを用いる部分的消化によって生成される、項目38に記載の方法。
(項目40) 前記フラグメントが、前記ゲノムDNAの機械的フラグメント化によって生成される、項目37に記載の方法。
(項目41) 前記lux遺伝子の転写が、前記選択された細胞型から得られるプロモーターによって媒介される、項目37に記載の方法。
(項目42) 前記選択された細胞型が、Staphylococcus、Streptococcus、Actinomyces、Lactobacillus、Corynebacterium、Mycobacterium、Clostridium、Propionibacterium、Enterococcus、およびBacillusからなる群より選択される、項目37に記載の方法。
(項目43) 前記スクリーニングが、37℃より高い温度で実施される、項目37に記載の方法。
(項目44) ルシフェラーゼ発現カセットであって、該カセットは、以下:
a)lucをコードするポリヌクレオチド;および
b)該lucをコードするポリヌクレオチドの5’側にグラム陽性細菌から得られた発現増強配列を含む、ポリヌクレオチド配列、
を含む、発現カセット。
(項目45) 前記発現増強配列が、グラム陽性Shine−Dalgarno配列である、項目44に記載の発現カセット。
(項目46) 前記発現増強配列が、グラム陽性プロモーター配列である、項目44または45に記載の発現カセット。
(項目47) 項目44または45のいずれかに記載の発現カセットであって、小DNAフラグメントがlucと前記プロモーターとの間に存在し、ここで、該小DNAフラグメントは、Stapholococcusの鉄輸送タンパク質のオープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド、アラニンラチナーゼオペロンのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド、およびBacillusタンパク質に対する相同性を有するタンパク質のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、発現カセット。
(項目48) pCMOR G+1 Sa1−6およびpCMOR G+2 Sp1、Sp5、Sp6、Sp9、Sp16、およびSp17と命名されたプラスミド。
(項目49) シャトルベクターであって、以下:
a)項目1〜36、44〜84のいずれか1項に記載の発現カセット;
b)選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチド;
c)グラム陽性の複製起点;および
d)グラム陰性の複製起点、
を含む、シャトルベクター。
(項目50) グラム陽性細菌においてルシフェラーゼの発現を得るのに有用な発現増強配列をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下:
a)グラム陽性細菌ゲノム由来のDNAフラグメントを、以下:
(i)luxA、luxB、luxC、luxDおよびluxEの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下の相対順序:5’−luxABCDEである、ポリヌクレオチド;
(ii)該luxをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つに対して5’側にある、グラム陽性細菌から得られた発現増強配列を含むポリヌクレオチド配列;および
(iii)該luxをコードするポリヌクレオチドのうち少なくとも1つに対して5’側にある挿入部位
を含む発現カセットに導入する工程;
b)工程(a)の該発現カセットを、グラム陽性細菌宿主細胞に形質転換する工程;ならびに
c)該宿主細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、それによって、グラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るのに有用なグラム陽性発現増強DNA配列を同定する工程
を包含する、方法。
(項目51) グラム陽性細菌においてルシフェラーゼの発現を得るのに有用な発現増強配列をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下:
a)グラム陽性細菌ゲノム由来のDNAフラグメントを、以下:
(i)luxA、luxBの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド;
(ii)該luxをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つに対して5’側にある、グラム陽性細菌から得られた発現増強配列を含むポリヌクレオチド配列;および
(iii)該luxをコードするポリヌクレオチドのうち少なくとも1つに対して5’側にある挿入部位
を含む発現カセットに導入する工程;
b)工程(a)の該発現カセットを、グラム陽性細菌宿主細胞に形質転換する工程;ならびに
c)該宿主細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、それによって、グラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るのに有用なグラム陽性発現増強DNA配列を同定する工程
を包含する、方法。
(項目52) グラム陽性細菌においてルシフェラーゼの発現を得るのに有用な発現増強配列をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下:
a)グラム陽性細菌ゲノム由来のDNAフラグメントを、以下:
(i)lucをコードするポリヌクレオチド;
(ii)該lucをコードするポリヌクレオチドに対して5’側にある、グラム陽性細菌から得られた発現増強配列を含むポリヌクレオチド配列;および
(iii)該lucをコードするポリヌクレオチドのうち少なくとも1つに対して5’側にある挿入部位
を含む発現カセットに導入する工程;
b)工程(a)の前記発現カセットを、グラム陽性細菌宿主細胞に形質転換する工程;ならびに
c)該宿主細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、それによって、グラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るのに有用なグラム陽性発現増強DNA配列を同定する工程
を包含する、方法。
(項目53) ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)5’−3’の方向にluxA、luxB、luxC、luxDおよびluxEの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと、該luxをコードするポリヌクレオチドのうち1以上に対して作動可能に連結されたグラム陽性Shine−Dalgarnoヌクレオチド配列を調製する工程;ならびに
(b)該lux遺伝子産物をコードする1つ以上のポリヌクレオチドの間に、小さな核酸配列を挿入する工程
を包含する、方法。
(項目54) ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)luxAおよびluxBの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと、該luxをコードするポリヌクレオチドのうち1以上に対して作動可能に連結されたグラム陽性Shine−Dalgarnoヌクレオチド配列を調製する工程;ならびに
(b)該lux遺伝子産物をコードする1つ以上のポリヌクレオチドの間に、小さな核酸配列を挿入する工程
を包含する、方法。
(項目55) ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)luc遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと、該lucをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたグラム陽性Shine−Dalgarnoヌクレオチド配列を調製する工程;および
(b)該lucをコードするポリヌクレオチドの5’側に、小さな核酸配列を挿入する工程
を包含する、方法。
(項目56) 光を生成するようにグラム陽性生物を改変する方法であって、該方法は、項目1〜36、44〜48のいずれか1項に記載の発現カセットを用いて該グラム陽性生物を形質転換する工程を包含する、方法。
(項目57) 必要な場合、ルシフェラーゼ活性に必要とされる基質を提供する工程をさらに含む、項目56に記載の方法。
(項目58) レポーターマーカーの発現に影響する分析物の能力について、該分析物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下:
(a)項目1〜36、44〜48のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ発現カセットを用いてグラム陽性細菌を形質転換する工程;
(b)該細菌に該分析物を提供する工程;
(c)必要な場合、ルシフェラーゼの光生成に必要とされる基質を提供する工程;および
(d)該グラム陽性細菌の光を生成する能力に対する該分析物の効果をモニタリングして、それにより、該分析物が、グラム陽性菌における該レポーターの発現に影響するか否かを確認する工程、
を包含する、方法。
(項目59) 前記基質が、アルデヒドであり、そして該基質が、蒸気として提供される、項目58に記載の方法。
(項目60) 完全な動物におけるレポーターマーカーの発現に影響する分析物の能力について、該分析物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下:
(a)項目1〜36、44〜48のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ発現カセットを用いてグラム陽性細菌を形質転換する工程;
(b)該細菌を完全な動物に導入する工程;
(c)該分析物を該動物に提供する工程;
(d)必要な場合、ルシフェラーゼの光生成に必要とされる基質を提供する工程;および
(e)光を生成する該グラム陽性細菌の能力に対する該分析物の効果をモニタリングして、それにより、該分析物が、グラム陽性細菌における該レポーターの発現に影響するか否かを確認する工程、
を包含する、方法。
(項目61) 前記基質がアルデヒドであり、そして前記基質が注射により提供される、項目60に記載の方法。
(項目62) 光を生成し得るグラム陽性細菌であって、ここで、(a)該細菌は、luxAおよびluxBのコード配列を含み、そして(b)約1×10 6 個の細菌細胞が、約37℃にて、少なくとも約1×10 4 の相対光単位を生成し得る、グラム陽性細菌。
(項目63) 項目1〜36、44〜48のいずれか1項に記載の発現カセットを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
(項目64) 項目1〜36、44〜48のいずれか1項に記載の発現カセットを含む、細菌。
(項目65) 前記細菌がグラム陽性である、項目64に記載の細菌。
(項目66) 項目48に記載のプラスミドを含む、細菌。
(項目67) 前記細菌がグラム陽性である、項目66に記載の細菌。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書における開示に鑑み、当業者には容易に行われる。さらに、本明細書において記載される異なる実施形態の種々の形態が組合され得る。
本発明の実施は、そうではないと示さない限り、当該分野における技術内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献において充分に説明されている。例えば、以下を参照のこと:Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990);Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan,eds.,Academic Press,Inc.);およびHandbook of Experimental Immunology,Vols.I−IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986,Blackwell Scientific Publications);Ausubel,F.M.,et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media,PA (1995).Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor,NY)(1989))。
本発明を記載するにあたり、以下の用語を使用し、そして以下に示されるように定義されることを意図する。そうではないと指示しない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明の分野における当業者にとってそれらがそうであるのと同じ意味を有する。
(発明の実施の形態)
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、処方またはプロセスパラメータが当然に変化し得るので、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用する用語法は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、限定する意図のないこともまた理解すべきである。
上記で議論されたように、天然に存在する生物発光性細菌における光の合成は、5つの必須遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子は、生物発光性表現型を生じる非生物発光性細菌へと移動し得るオペロン(luxCDABE)においてクラスター化される。天然に存在する海生および陸生の生物発光性細菌の全ての同定した種はグラム陰性であるので、他方でグラム陽性細菌の生物発光性表現型への形質転換は制限されている(一部、これら2つの細菌グループの遺伝子が異なることに起因する)。本発明は、Photorhabdus luminescens luxオペロン全体を再操作して、グラム陽性制御エレメントに導入することにより、1つの局面においてこの問題を解決する。この新規なluxABCDEカセットをいくつかの異なるグラム陽性/グラム陰性シャトルベクター(pCMOR G+シリーズ)に挿入し、そしてこれらの構築物を、宿主細菌による強い光の生産を生じるグラム陽性プロモーターを選択するために、プロモーター−プローブビヒクルとして使用した。このアプローチを用いると、グラム陽性細菌(Staphylococcus aureusおよびStreptococcus pneumoniaeのいくつかの株を含む)のいくつかの異なる属が、明るく生物発光性になった。後者の細菌両方において、100コロニー形成単位(c.f.u.)程度が生物発光を用いて37℃で検出され得た。
生物発光は、細菌感染を研究するための強力なレポーター系を提供する(例えば、米国特許第5,650,135号)。ルシフェラーゼは、基質(例えば、ルシフェリン、長鎖アルデヒドまたはコレントラジン(colentrazine))、エネルギー供給源(例えば、ATPまたはFMNH2)および酸素が提供される場合、光を生成する特性を共有する多様な酵素のファミリーのメンバーに適用される用語である。ルシフェラーゼは、広く真核生物ルシフェラーゼおよび原核生物ルシフェラーゼに分類され得る。真核生物ルシフェラーゼ(「luc」)は、代表的に、単一遺伝子によってコードされる(例えば、de Wet,J.R.ら、(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7870−7873;de Wet,J.R.ら(1987)Mol.Cell.Biol.7:725−737を参照のこと)。ルシフェラーゼ系を含む例示的な真核生物は、北米ホタルPhotinus pyralisである。ホタルルシフェラーゼは、大規模に研究されてきており、ATPアッセイに広く使用される。コメツキムシの別の種であるPyrophorus plagiophalamus由来のルシフェラーゼをコードするcDNAが、クローン化されかつ発現されてきた(Woodら)。このコメツキムシは、この種の異なるメンバーが異なる色の生物発光を放射するという点で、珍しい。互いに95〜99%相同性を有するクローンの4クラスを、単離した。それらは、546nm(緑色)、560nm(黄緑色)、578nm(黄色)および593nm(橙色)で光を放射する。最後のクラス(593nm)は、本発明の光生成部分としての使用に特に有利であり得る。なぜなら、放射された光は、より短い波長の光より容易に組織を貫通する波長を有する。
種々のルシフェラーゼコード遺伝子が同定されており、これには以下が挙げられるがこれらに限定されない:B.A.SherfおよびK.V.Wood,米国特許第5,670,356号、Kazami、Jら、米国特許第5,604,123号、S.Zennoら、米国特許第5,618,722号;K.V.Wood、米国特許第5,650,289号、K.V.Wood、米国特許第5,641,641号、N.KajiyamaおよびE.Nakano、米国特許第5,229,285号、M.J.CormierおよびW.W.Lorenz、米国特許第5,292,658号、M.J.CormierおよびW.W.Lorenz、米国特許第5,418,155号、de Wet,J.R.ら(1987)Molec.Cell.Biol.7:725〜737;Tatsumi,H.N.ら(1992)Biochim.Biophys.Acta 1131:161〜165、ならびにWood,K.V.ら(1989)Science 244:700〜702(全て参考として本明細書において援用される)。
本発明の1つの局面において、構造lux遺伝子産物および基質コードlux遺伝子産物の両方をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットが提供される。本発明者らは、例えば、CABDEからABCDEにlux遺伝子を再整列すること、および1つ以上のlux遺伝子の前にグラム陽性シャインダルガーノ(Shine−Dalgano)配列を挿入することが、得られたルシフェラーゼに光を生成する能力の増強を付与することを実証した。適切なグラム陽性シャインダルガーノ配列(例えば、配列番号1)は、本明細書の教示に照らして当業者に公知であり、そしてまた以下の実施例に記載されている。luxABCDE発現カセットはルシフェラーゼを発現するだけでなく、luxルシフェラーゼ基質(アルデヒド)の合成に必要な生合成酵素も発現する。従って、酸素は、この発現カセットを用いる場合に、生物発光に必要な唯一の外因性の必要とされるものである。
本発明はまた、真核生物ルシフェラーゼの発現を可能にする発現カセットを含む。1つの実施形態において、このluc発現カセットは、構成的に発現されるプロモーターに作動可能に連結された、luc遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、このプロモーターは、グラム陽性細菌から得られる。次いで、この発現カセットを、適切なベクター骨格(例えば、シャトルベクター)に導入し得る。1つの実施形態において、このシャトルベクターは、選択マーカーおよび2つの複製起点を含み、この複製起点の一方は、グラム陰性生物における複製のための複製起点であり、もう一方は、グラム陽性生物における複製のための複製起点である。
本発明の好ましい実施形態において、このルシフェラーゼ発現カセットを、ベクター骨格、例えば、シャトルベクター(例えば、pMK4(Sullivan,Mら(1984)Gene 29:21−26)、pDL289(Buckley,N.ら(1995)J.Bacteriol 177:5028−5034)およびpSUMシリーズ(Ainsa,J.A.ら(1996)Gene 176:23−26))に挿入する。代表的には、これらのシャトルベクターは、以下を含む:(1)グラム陽性複製起点;(2)グラム陰性複製起点(3)ポリリンカー;および(4)選択マーカー(例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール)をコードするポリヌクレオチド。
ルシフェラーゼベクター構築物(例えば、上記および実施例に記載の構築物)を、種々の宿主細胞の形質転換における使用に適応させ得る。これらの宿主細胞としては、ほとんどの細菌(例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌)および多くの真核生物細胞(微生物、植物細胞、哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない)が挙げられる。さらに、特定のウイルス(例えば、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルス)が、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、Kovacsらは、ヘルペスウイルスにおけるホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子の安定な発現を教示する。Brasierらは、哺乳動物細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子構築物の使用を教示する。培養物中の哺乳動物細胞からのルシフェラーゼ発現は、巨視的(Israel,H.(1991)Gene 104:139−145)および微視的(Hooper,Cら(1990)Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 5:123−130)の両方でのCCD画像化を使用して研究されている。
本明細書中に記載される発現カセットは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方において有用なレポーター系である。ルミネセンスをモニタリングすることによって、プロモーターおよび分析物は、細胞培養系において評価され得る。例えば、誘導が薬物耐性と関連する遺伝子から得られたプロモーターは、本明細書中に記載されるルシフェラーゼ発現カセット(例えば、luxABまたはluxABCDE)に作動可能に連結され得る。これらの発現カセットは、細胞中に(例えば、シャトルベクターによって)導入され、そして分析物の有効性がルミネセンスをモニタリングすることによって評価される。
本明細書中に記載される発現カセットは、動物全体の非侵襲性画像化に特に有用である。動物全体の非侵襲性画像化は、Contagらによる共有にかかる米国特許第5,650,135号に記載され、そして本明細書中に参考として援用される。(また、Contagら(1998)Nature Medicine 4(2):245−247;Contagら(1996)OSA Tops on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3:220−224;Contagら(1997)Photochemistry and Photobiology,66(4):523−531;およびContagら(1995)Mol.Microbiol.18:593−603を参照のこと)。
本明細書中に記載されるルシフェラーゼ発現カセットは、動物において原核生物細胞および真核生物細胞の両方を評価する際に有用である。病原性細菌(例えば、グラム陽性細菌)が、本明細書中に記載のルシフェラーゼ発現カセットと結合体化され得、そして/またはこの発現カセットで形質転換され得、その後、動物全体に導入され得る。次いで、この動物が、インビボでの感染プロセスを追跡ため、そして感染を阻害する際のその効力について潜在的抗感染薬物(例えば、新規な抗生物質)を評価するために、使用され得る。従って、1つの局面において、本明細書中に記載の発現カセットは、ルシフェラーゼ発現カセットを保有する細菌に感染した哺乳動物被験体における光放出結合体の非侵襲的画像化および/または検出において有用である。例として、このルシフェラーゼ発現カセットは、病原性細菌の成長および/または増殖を阻害する際に有用な薬剤をスクリーニングするために使用され得る。
本明細書中に記載される発現カセットを使用して、トランスジェニック動物を産生し得る。トランスジェニック非ヒト動物を産生する方法は、当該分野において公知である(Leder,P.ら、米国特許第4,736,866号;Melmed,S.ら、米国特許第5,824,838号;Bosch,F.ら、米国特許第5,837,875号;Capecchi,M.R.ら、米国特許第5,487,992号;Bradley,A.ら、米国特許第5,614,396号;Ruley,H.E.,米国特許第5,627,058号、全て、本明細書中に参考として援用される)。
上記のように、本明細書中に記載される特定の発現カセットは、光の生成のために、外因性基質の添加を必要とする(例えば、lucおよびluxAB発現カセット)。本発明の好ましい実施形態において、基質は、アルデヒドである。細胞に投与される場合に、アルデヒドは、蒸気として、培養培地を囲む雰囲気に適用され得るか、または液体もしくは固体として培養培地に直接適用され得る。
他に示されない限り、細胞、タンパク質および核酸(例えば、DNA)の操作を、例えば、Sambrookら、およびAusubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media,PA(1995)に記載されるような、標準的な方法を使用して実施した。他に示されない限り、制限酵素を、New England Biolabsから入手し、改変酵素を、PromegaまたはBoehringer Mannheimから入手し、そして他の実験室用化学物質を、Sigma Chemical Company(St.Louis,MO)から入手した。
(アルデヒドを使用するスクリーニング) 外因性アルデヒド基質を添加し、その後、luxCDE遺伝子を含まない細菌のプレートまたは培養物を画像化した。プレートを画像化するために、n−デシルアルデヒド(デカナール;Sigma Chemical Company)を、画像化されるべき細菌を含むプレートを覆う蓋の表面の内側表面に散布し(「アルデヒド蒸気画像化」)次いで、このプレートを、増感したCCDカメラ(Hamamatsu Photonics model 2400−32)を使用して、本質的に米国特許第5,650,135号に記載されるように、画像化した。液体培養物を画像化するために、1μlのデカナールを、培養物の約10倍の希釈物1mlに添加した。
他に示されない限り、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼでの消化に続いて、DNAサンプルを、85℃に15分間加熱して、この制限酵素を不活化した。連結を、16℃で一晩実施した。
(コンピテント細胞の調製)他に記載しない限り、細菌細胞は、以下のように形質転換された。細菌培養物をLB中で一晩増殖させた。5mlのそれぞれの培養物を使用して新鮮な500ml容積のLBを播種した。これらの培養物を、約0.6のO.D(600nm)に到達するまで37℃で振盪した。次いで、これらの細胞を氷上で30分間冷却し、その後、3000×gで10分間4℃で遠心分離によって収集した。細胞を、50mlの冷0.5Mスクロース(S.aureus)中またはddH2O(E.coli)中のいずれかに再懸濁させ、その後、再遠心分離し、そして5mlの冷0.5Mスクロース(S.aureus)中またはddH2O(E.coli)中のいずれかに再懸濁させた。この段階で、細胞を氷上で30分間維持し、次いで、再遠心分離しそして5mlの冷10%グリセロール中で再懸濁させた。各細胞型のアリコートを凍結しそして−80℃で保存した。
サンプルを、以下に記載されるように少し改変をして、基本的にContagら、米国特許第5,650,135号に記載されるように画像化した。本発明のサポートで実施される実験(以下に詳述される)において、サンプルによって発生される光の量は、増感光子計数カメラ(Hamamatsu Photonics Model 2400−32)または冷却一体化(integrating)カメラ(Princeton Instruments Model LN/CCD 1340−1300−EB/1)のいずれかを使用して定量化した。他に示さない限り、光子計数カメラは、カメラXEN−3であり、そして一体化カメラは、カメラXEN−5であり、両方とも、Xenogen Corporation、Alameda、Californiaにあった。両方のタイプのカメラは、電荷結合素子アレイ(CCDアレイ)を使用して、選択された単位面積当たりの光子の数に比例するシグナルを生成する。選択される単位面積は、単一のCCDピクセルによって検出されるか、またはビニング(binning)が使用される場合、任意の選択されたグループのピクセルによって検出されるほど小さくあり得る。このシグナルは、必要に応じてイメージプロセッサ(例えば、Hamamatsu Photonicsから入手可能なArgus)を介してルートを決められ得、次いで、コンピュータ(イメージプロセシングソフトウエアアプリケーション(例えば、「LivingImage」(Xenogen Corpotration、Alameda、CA)を実行するWindows(登録商標) NTを実行するPC(Dell Computer Corporation;Microsoft Corporation、Redmond、WA)またはMacintosh(Apple Computer、Cupertino、CA)のいずれか)に伝送される。ソフトウェアおよび/またはイメージプロセッサを使用して画像を獲得し、コンピュータデータファイルとして保存する。データは、一般的に(x、y、z)の値の形態をとり、ここで、xおよびyは、シグナルが集められる点または領域の空間座標を表し、そしてzは、その点または領域におけるシグナルの量を表し、「相対光単位」(RLU)として表現された。
溶液中の細胞によって生成された光の量を、溶液の希釈液を96ウェルプレートのウェルにプレートし、そしてXen−3カメラで上記のようにプレートを画像化することによって定量化した。次いで、このLivingImageソフトウェアを使用して、特定のウェルからの光に対応するシグナルを示す画像の各領域の周りで、規定された輪郭を重ね合わせた。次いで、これらの領域の各々からのシグナルを定量化して、そして各ウェルの単一RLU値として表現した。これらのRLUを、以下で詳細に記載されるいくつかの研究(実施例13、14および15を含む)において使用した。
(LUXA、B、C、DおよびEの上流にグラム陽性RBSの取り込み)
Photorhabdus Luminescens luxオペロンの5つの遺伝子(luxA−E)を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR;Mullins;Mullinsら)を使用してPCR増幅し、グラム陽性リボゾーム結合部位(RBS)AGGAGG(配列番号1)の配列を取り込んだ。この部位は、各開始コドンの少なくとも7個のヌクレオチドの上流であった。lux遺伝子の各々を、以下の表1に示されたプライマーセットを使用して個々に増幅した。各々の場合、太字で強調したヌクレオチドは、クローニングを容易にするために取り込まれた、異なる制限エンドヌクレオチド(一番右の欄に示される)の位置および配列を示す。グラム陽性RBSおよび開始コドンは、それぞれ実線および破線によって下線が引かれている。
PCRを、200μlの薄壁のPCRチューブ(Molecular BioProducts,San Diego,CA)を備える自動サーモサイクラー(Techne Progene,Princeton,N.J.)を用いて実施した。反応を、以下を含む50μl中で実施した:5μlの10×PCR緩衝液(Roche Molecular Biochemicals(Switzerland)から市販されるTaq DNAポリメラーゼとともに供給される)、2.0mMのMgCl2、50pmolの各オリゴヌクレオチドプライマー(オペロン;表1の配列を参照のこと)、0.2mMの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート(dATP、dCTP、dGTP、dTTP;Amersham Pharmacia Biotech,(Uppsala,Sweden))、1UのTaq DNAポリメラーゼ Roche Molecular Biochemicals(Switzerland)および10ngのプラスミドDNA(P.luminescens luxCDABEカセット(pSB417またはpSB384のいずれか;Winsonら(1998)FEMS,163:185−202)。各遺伝子の増幅を、95℃で15秒間、50℃で30秒間、および72℃で1分間の30サイクル、続いて72℃で2分間の最終伸長工程を使用して達成した。
(pSK-G+LUXAG+LUXBの構築(pBLUESCRIPTにおけるLUXABカセット))
上記実施例1において増幅された遺伝子を、pBluescript SK-ベクター(Stratagene,LaJolla,CA)において個々に構築した。このluxA PCR産物を、BamH I/Sal Iで消化し、そしてそのBamH I/Sal I部位でpBluescript SK-に連結し(IPTG誘導可能lac Zプロモーターの指向的に特定の方向を向けられた下流)、プラスミドpSK-G+luxAを生成した。次いで、プラスミドpSK-G+luxAを、DH5αE.coli(Stratagene)にエレクトロポレートし、そして100μg/mlアンピシリンを含むLBアガー(agar)プレート上にプレートした。選択されたコロニーを、プラスミドプレップのために増殖し、そしてこのプラスミドDNAを単離し、そしてSal Iで切断した。得られたフラグメントを、Sal I/Xho Iで切断されたluxB PCR増幅されたDNA(実施例1)と連結し、pSK-G+luxAG+luxBを生成した。
(pSK- LUXABCDEの構築(pBLUESCRIPTにおけるLUXABCDEカセット))
pBluescriptSK-における別個のluxCDEカセットの構築を、luxABカセットの生成に関して実施例2において本質的に記載されるように、luxC、luxD、およびluxEの連続したクローニングにより達成した。luxC〜E PCR増幅産物を、互換性のある酵素Sal I/Xho Iを用いて、個々に消化し、そしてこのクローニング手順の各工程を、E.coli形質転換体のPCRにより、確認した。最終的なluxCDEカセットの忠実度を、pSK-G+luxAG+luxBにおけるluxAB遺伝子のSal I部位下流でSal I/Xho Iを用いて切断されたこの配列を挿入し、pSK- luxABCDEを生成することにより確認した。スクリーニングを、アルデヒド処理を行わなかった以外は、上記のように実施した。なぜなら、この物質は、luxCDE遺伝子によりコードされたからである。上記のように、pSK-luxABCDEを含むE.coli DH5αは、ネイティブなPhotorhabdus luminescens luxオペロンを含む細菌よりかなり明るかった。
(A.pMK4luxABシャトルベクターの構築)
上記の実施例2において記載した通りに作成されたluxABカッセトを、BamHI/SalI消化を介してpSK-G+luxAG+luxBから単離し、そしてグラム陽性/陰性シャトルベクターpMK4(Sullivan,M.ら、(1984)、「New shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichia coli which allow rapid detection of inserted fragments」、Gene 29:21−26(本明細書中で参考として援用される))のBamHI/SalI部位にクローニングした。pMK4は、ATCC番号37315の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC;マナサス、VA)から入手可能である。このクローニングを、以下のように行った:(i)luxABカッセトをIPTG誘導性lacZプロモーターと逆方向に配向し、そして(ii)BamHI制限酵素認識部位を、luxAコード領域の上流に維持した。得られたベクター(pMK4luxAB)構築物を、DH5αにエレクトロポレーションし、そして100μg/mlのアンピシリンを含有するLB上にプレートした。
適切な発現増強配列(EES)(例えば、プロモーター配列)についてスクリーニングするために、Staphylococcus aureusゲノムDNAを、部分的消化においてSau3Aで切断し(例えば、Ausubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media,PA(1995)を参照のこと)、そしてBamHIで切断しておいたpMK4luxABプラスミドに連結した。5つの異なるDNA濃度を、4×0.6 log酵素希釈(4UのSau3Aから開始して20μlにDNAを希釈した)のセットにおいて消化した(1μg/μl、500ng/μl、200ng/μl、100ng/μlおよび50ng/μl)。次いで、20個の別個の連結物を、S.aureus RN4220にエレクトロポレーションし、プールし、2時間インキュベートし、そして5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するBHI上にプレートした。およそ20,000コロニー(200コロニーを含むプレートを100枚)を、外因性アルデヒドの存在下で光についてスクリーニングした。これは、73個の非常に生物発光する形質転換体(pMK4luxABSa1−Sa73(以下の表2では、Sa1−Sa73と略した))の単離を生じた。
(C.pCMOR G+1(pMRK4)シャトルベクターを作製するためのpMK4luxABへのluxCDE遺伝子の付加)
luxCDE遺伝子を、プラスミドファミリーpMK4luxABCDESa1〜Sa6(pCMOR G+1 Sa1〜Sa6またはpMK4luxABCDE P1〜P6と再命名された)を作製するために、pMK4luxABSa1〜Sa6へ、以下のように導入した:プラスミドSa1〜Sa6をE.coli DH5α中で再増殖させて、そしてSalIで切断した。次いで、これらの消化物を(luxCDEカセットの、5’末端においてはXhoIを用いて、そして3’末端においてはSalIを用いて)XhoI/SalIで切断したluxCDEと個々に連結した。これを、M13(−20)およびM13逆方向プライマー(例えば、配列については、1999 Stratageneカタログ、320ページを参照のこと)を使用して、pSK luxCDEからPCR増幅した(95℃30秒、50℃1分および72℃3分の35サイクル)。得られたプラスミドを示すマップ(Sa1〜6配列の代わりにBamH I挿入部位を有する、EESを有さないSa1〜Sa6を、代わりに示す)を図1に示す。
pCMOR G+1 Sa1〜Sa6におけるS.aureus EES(実施例4B)を、luxAバックプライマー(LUXA−REV;配列番号12:CCA CAC TCC TCA GAG ATG CG)を使用する標準方法を用いて配列決定し、そしてこれを以下に示す。各配列は、図1(pCMOR G+1)に示されるBamH1プロモーター挿入部位のすぐ上流で終端し、各配列における最後のヌクレオチドは、BamHI認識配列における最初の位置
に対応する。EES(Sa1)の一つのみが「G」で終端し、これにより最終的なpMK4 luxABCDE Sa1(a.k.a. pMK4 luxABCDE P1)構築物におけるBamH Iの完全性を保有することに注意。
Sa2配列は、Bacillus subtilis(受託番号emb CAA74247;Y13937;gi 2633960)由来のYIpCタンパク質と関連する配列、ならびにBacillus subtilis(受託番号emb CAA74248;Y13937)の推定PlsXタンパク質と関連する配列に限定された類似性を有する。
(動物におけるアルデヒド毒性の評価)
4匹のマウスに、0、2、4および6時間で、n−デシルアルデヒドを0.1%および0.01%の濃度で500μlの量でIP注射した。アルデヒド溶液を、以下のように調製した:100μlのアルデヒドを、900μlのエタノール中に希釈した。次いで、この10%溶液の10μlを、pH7.4の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の990μl中に希釈して、0.1%の最終容量のアルデヒド溶液を得た。この動物を、24時間の期間にわたって観察した。24時間後に、どのマウスも、何らかの病気の明らかな症状または異常な挙動を示さなかった。
(S.AUREUSにおけるpMK4 LUXAB SA3の、マウスにおける生物発光についての評価)
最初の注射の24時間後、実施例5に記載されるように試験した4匹のマウスに、病原性菌株(8325−4)、およびpMK4 luxAB Sa3を含むS.aureusの臨床的メチシリン耐性(methacillin−resistant)(MRSA)菌株を注射した。このS.aureus菌株を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含む10mlの容量のLBにおいて、約0.5のO.D(600nm)まで増殖させた。この細菌をペレット化し、そして各サンプルを10mlの滅菌PBSに再懸濁した。このサンプルのO.Dを再測定し、そして以下の変換:細胞の#=(A600)(11.1×108)を使用して、1ml当たり1×105、1×106、および1×107個の細胞となるように調整した。この希釈物を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むチョコレートプレート上にプレーティングすることによって、確認した。
(マウスにおける生物発光についての、S.AUREUS中のpMK4 LUXABCD SA2(pCMOR G+1 SA2)の評価)
pCMOR G+l SA2(pMK4 luxABCDE Sa2;pXEN−lux−1)を含む、S.aureus株8325−4およびMRSAを実施例6に記載されるように調製し、そしてマウスにおける生物発光について試験した。これらの株を、100μl IP(1mlあたり4×106)および100μl IM(右大腿において、1mlあたり4x106、左大腿において1mlあたり4×107)でマウスに接種し、そして0時間、4時間、6時間および24時間でモニターした。次いで、これらのマウスを、0時間、4時間、6時間および24時間で、上記のように画像化した。両方の株を、インビボで動物中で容易に可視化した。
(pDL289 LUXABCDE(pCMOR G+2)シャトルベクターの構築およびSTREPTOCOCCUS PNEUMONIAEにおけるその生物発光特性の評価)
(A.pDL289 luxABCDEシャトルベクターの構築)
実施例3に記載されるように生成されたluxABCDEカセットを、BamH I/Sal I消化を介して、pSK−luxABCDEから単離し、そしてグラム陽性/陰性シャトルベクターpDL289のBamH I/Xho I部位にクローニングし(Buckley,N.,ら,(1995)J.Bacteriol 177:5028−5034,本明細書中で参考として援用される)、pDL289 luxABCDE(pCMOR G+2)を生成した。実施例3の場合と同様に、クローニングを、BamHI制限酵素認識部位が、luxA コード領域の上流に維持されるように実施したが、この場合、luxABCDEカセットは、lacZプロモーターと同じ方向であり、そしてlacZプロモーターの下流にあった。次いで、pCMOR G+2を、E.coli DH5αにエレクトロポレートした。得られた陽性クローンを極端に明るく(なぜなら、このカセットは、lacZプロモーターの下流であるからである)、純粋な培養物は、カメラが4.0の感度に達することを可能にした。
上記パート(A)に同定される陽性クローンの1つを、プラスミド調製し、そして得られたDNAを使用して、S.pneumoniaeについてスクリーニングされ得るプロモーターライブラリーを構築した。Streptococcus pneumonie R6由来のゲノムDNAを、部分的な消化で、Sau3Aを用いて切断し(Ausubel,F.M.,ら,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media,PA(1995))、そしてBamHIで切断されたpCMOR G+2プラスミドを用いて連結した。次いで、これらの連結物を、E.coli DH5αにエレクトロポレートした。得られた形質転換体を、プレートから直接プールし、それらのプラスミドDNAを抽出し、そしてこのDNAを、Streptococcus pneumoniaeの病原性の被包性株のコンピテント細胞にエレクトロポレートした。
pDL289 luxABCDE Sp1、5、6、9、16および17中のS.pneumoniae EESを、luxAバックプライマー(LUXA−REV;配列番号12)を使用する標準的な方法を用いて配列決定し、そして以下に示す。各配列は、BamH Iプロモーター挿入部位のすぐ上流で終結し、各配列の最後のヌクレオチドは、BamH I認識配列(GGATCC;配列番号13)中の最初の位置に対応する。EESのうちただ2つ(Sp9およびSp16)のみが、「G」で終わり、それにより、最後のpDL289 luxABCDE Sp9およびpDL289 lux ABCDE Sp16構築物中のBamH I部位の完全性を保有することに注意のこと。
Sp1配列は、Streptococcus pneumoniae D−グルタミン酸付加酵素、MurD(mur D)、ウンデカプレニル−PP−MurNAc−ペンタペプチド−UDPGlcNAc GlcNAcトランスフェラーゼ(murG)、細胞分裂タンパク質DivIB(divIB)、オロチジン−5’−デカルボキシラーゼPyrF(pyrF)に関連する配列に対して類似性を有する(Massidda,O.ら、Microbiology 144(11):3069〜3078(1998);受託番号 gb│AF068902)。
Sp5配列は、Mycobacterium tuberculosis UDP−N−アセチルムラモイル(acetylmuramoyl)アラニン−D−グルタメートリガーゼ(UDP−N−アセチルムラノイル(acetylmuranoyl)−L−アラニル−D−グルタメートシンセターゼ;D−グルタミン酸付加酵素)(受託番号sp│O06222;MURD MYCTU)に関連する配列に対して類似性を有する。
Sp16配列は、Bacillus subtilis DNAポリメラーゼIIIα鎖(受託番号gi│1591732およびU67551)、およびStaphylococcus aureus DNAポリメラーゼIII(受託番号dbj│BAA13160;D86727)に関連する配列に対して類似性を有する。
(実施例9)
(pDL289 LuxABCDE Sp1、5、6、9および16で形質転換したS.pneumoniaeのマウスにおける生物発光についての評価)
pDL289 luxABCDE Sp1、5、6、9および16を含むS.pneumoniaeの16時間液体培養物を、マウスにおいて試験した。各培養物の1mlからの細菌をペレット化し、1ml PBSに再懸濁し、そしてこれの100μlおよび1/10希釈物の100μlを、それぞれマウスの左大腿筋および右大腿筋に接種した。各希釈物のより低い方を、250μg/mlのカナマイシンを含有するチョコレート寒天にプレートし、コロニー形成単位(接種におけるc.f.u.;上記の表3を参照のこと)を評価した。マウスの各々を、時間0、4時間、7時間および24時間において、CCDカメラで5分間モニターした。
(pCMOR G+3シャトルベクターを用いる生物発光性Mycobacterium tuberculosisの構築)
実施例2に記載されるように生成したluxABCDEカセットを、BamH 1/Kpn I消化によりpSK-luxABCDEから単離し、そしてグラム陽性/陰性シャトルベクターpSUM39(Ainsaら、(1996)Gene 176:23−26(本明細書中に参考として援用される))のBamH I/Kpn I部位にクローン化し、pSUM39 luxABCDE(pCMOR G+3)を生成する。上記のように、クローニングを行い、その結果BamH I制限酵素認識部位をluxAコード領域の上流に維持する。当業者は、Mycobacterium tuberculosisとともに使用するために適切な他のグラム陽性/陰性シャトルベクター(例えば、pSUM40またはpSUM41(Ainsa,J.A.ら、(1996)Gene 176:23−26))をpSUM39の代わりに使用し得ることを理解する。
(pCMOR G+1シャトルベクターを用いる生物発光性Listeria monocytogeneseの構築)
Listeria monocytogenes由来のゲノムDNAを、部分的消化においてSau3 Aで切断し(例えば、Ausubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media,PA(1995)を参照のこと)、BamH Iで切断したpCMOR G+1プラスミド(実施例4)と連結する。次いで、これらの連結物を、E.coli DH5αにエレクトロポレーションする。得られた形質転換体を、プレートから直接プールし、それらのプラスミドDNAを抽出し、このDNAをコンピテントなListeria monocytogenes宿主細胞にエレクトロポレーションする。
(異種間のグラム陽性プロモーター配列の同定)
pMK4の広い宿主範囲に起因して、S.aureus EES(Sa1−6)を含む1セットのpCMOR G+1構築物を、Listeria monocytogenes(ATCC23074)の病原性株中にエレクトロポレートし、任意のS.aureus EESが、Listeriaにおいて光を誘導したか否かを試験した。全ての6つのプラスミドは、このListeria株に首尾良く移動したが、pCMOR G+1 Sa4のみが、有意な光レベルを与えることが見い出され、構築物の残部は、低レベルの生物発光を誘導するのみであった。pCMOR G+1 Sa4は、S.aureusおよびL. monocytogenesの両方で高レベルの光を誘導し得たので、この構築物は、グラム陽性細菌の他の属を光表現型に形質変換するために使用し得る。
(改変luxABCDEを含むS.aureusからの生物発光とネイティブluxCDABEを含むS.aureusからの生物発光の比較)
S.aureus構築物pCMOR Sa1(これは、プロモーターとluxABCDEカセットとの間に、BamH I部位を保持した;実施例4を参照)を、操作されたluxABCDEカセットを使用して発生させた生物発光のレベルをネイティブluxCDABEカセットを使用して発生させた生物発光のレベルと比較するための、開始ベクターとして選択した(ここで、2つのカセットは、それぞれ、S.aureus Sa1プロモーターの制御下にあった)。luxCDABE構築物を、以下のように生成した:まず、ネイティブluxCDABEカセットを、BamHI/Sa1Iフラグメントとして、pSB417(Winsonら、1998、FEMS、163、185−202)から単離し、そして次いで、このフラグメントを使用して、pCMOR Sa1から脱落された、対応するluxABCDE BamHI/Sa1Iフラグメントと置き換え、pMK4 luxCDABE Sa1を生成した。このクローニングを、E.coli.DH5αにおいて実行し、そして完了したプラスミドを、S.aureus RN4220に移した。
(液体培養物中で検出された最小数の生物発光性S.AUREUSおよびS.PNEUMONIAEおよびL.MONOCYTOGENESE)
光S.aureus RN4220 pCMOR G+1 Sal、S.pneumoniae pCMOR G+1 Sp16およびL.monocytogenes ATCC23074 pCMOR G+1 Sa4の指数培養物を、高感度液体窒素冷却積分CCDカメラ(Princeton Instruments,Trenton,NJ;model LN/CCD 1340−1300−EB/1)を使用してモニターし、細菌株のそれぞれの検出可能なc.f.u.の最小数を測定した。培養物を、黒96ウェルマイクロタイタープレート全体に渡って、約103/ウェル〜約101/ウェルの細菌濃度に2倍希釈(−0.3 log)で希釈し、10分間を超えて光についてモニターした。わずか80c.f.uのS.aureusとS.pneumoniaeの両者を、Princeton Instruments cameraを使用して37℃で検出し得、約400c.f.uのL.monocytogenesが、この同じ方法によって検出可能であった。
(S.AUREUSにおける生物発光の温度安定性)
生物発光を使用して動物中からの病原性細菌をモニターする(Contag,C.ら、(1995)Mol.Microbiol.18:593−603)ために、lux遺伝子とLuxタンパク質の両者が、体温(すなわち、37℃周辺)で十分に機能することが重要である。改変lux遺伝子が、生物発光が最適に細菌細胞内で起こる温度範囲を変えたかどうかを測定するために、改変されたluxABCDEカセットから発生する光を、31℃と47℃の間でグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両者における天然のluxCDABEから発生する光と比較した。S.aureus RN4220 pMK4 luxCDABE Salは、以先には暗く示された(図2)ので、S.aureus RN4220 pCMOR G+1 Sal、E.coli DH5α pCMOR G+1 SalおよびE.coli DH5α pMK4 luxCDABE Salのみを、実験のこのセットにおいて試験した。後者の3細菌株の指数培養物は、30℃で約107c.f.u/mlに増え、そして31、33、35、37、39、41、43、45および47℃でセットした加熱ブロックに各1ml容量を配置した。細菌を1時間の間各上昇させた温度で順応させ、そして増殖し得た後、9加熱ブロックを、逐次、光子計数CCDカメラ(Hamamatsu,model 2400−32)のチャンバ内に配置し、そして3培養物のそれぞれからの光を1分間の間記録した。バクテリアの数の変動から生じる相対光単位数におけるエラーを除去するために、各培養物を、c.f.uが記録され得るようにプレートし、そして光データは、それに応じて調整された。
(改変されたLUXABCDEオペロンを用いたLISTERIA MONOCYTOGENESの形質転換および評価)
改変されたluxABCDEプラスミドを使用して、実施例14に上述したようにグラム陽性Listeria monocytogenesを首尾良く形質転換した。改変されたluxABCDEオペロンを所有するグラム陽性細菌は、高い生物発光性であり、そしてさらに、動物においてインビボでモニターし得た。抗生物質選択の非存在下でのプラスミド喪失は、観察できる構造的な不安定性を有さず、L.monocytogenes由来ではインビボで24時間〜48時間の期間を超えて最小である(>80%プラスミド保持)ことが示された。
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WO2015031859A1 (en) * | 2013-08-29 | 2015-03-05 | The Regents Of The University Of California | Bacteria engineered for ester production |
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CN110295181B (zh) * | 2019-06-18 | 2022-10-11 | 山东大学 | 一种利用生物发光报告系统鉴定抗生素种类的方法 |
DE102020129009A1 (de) | 2020-11-04 | 2022-05-05 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (RWTH) Aachen, Körperschaft des öffentlichen Rechts | Nachweis von umwelteinflüssen mittels biolumineszenz |
CN113403243B (zh) * | 2021-06-16 | 2022-07-19 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0639641A2 (en) * | 1993-08-18 | 1995-02-22 | Valio Oy | Streptococcus thermophilus strains and their use |
JPH08501694A (ja) * | 1992-10-02 | 1996-02-27 | ロンザ アーゲー | ビオチンの生物工学的製造方法 |
WO1999014311A1 (en) * | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Smithkline Beecham Corporation | Method of screening for antimicrobial compounds |
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JPH08501694A (ja) * | 1992-10-02 | 1996-02-27 | ロンザ アーゲー | ビオチンの生物工学的製造方法 |
EP0639641A2 (en) * | 1993-08-18 | 1995-02-22 | Valio Oy | Streptococcus thermophilus strains and their use |
WO1999014311A1 (en) * | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Smithkline Beecham Corporation | Method of screening for antimicrobial compounds |
Non-Patent Citations (6)
Title |
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JPN5002012005; JACOBS M: MOL GEN GENET V230, 1991, P251-256 * |
JPN5002012006; FEMS Microbiol. Lett. 106, 1993, p.265-270 * |
JPN5002012007; SEIDLER L: Appl. Environ. Microbiol. 62(7), 1996, p.2356-2359 * |
JPN5002012008; LOIMARANTA V: ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY V42 N8, 1998, P1906-1910 * |
JPN6010047385; Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 1995, p.405-412 * |
JPN6010047386; FEMS Microbiol. Lett. 163, 1998, p.193-202 * |
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