ES2267561T3 - Casetes de expresion de luciferasa y procedimientos de uso. - Google Patents

Abstract

Casete de expresión que comprende: Un polinucleótido codificante de los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE de luciferesa dispuestos en el siguiente orden relativo 5''¿luxA¿luxB¿ luxC¿luxD¿luxE¿3'', en el que (a) la transcripción del polinucleótido resulta en ARN policistrónico codificante de todos los productos génicos; (b) cada uno de los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE es expresado como un polipéptido individual; y (c) las secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias del sitio de unión al ribosoma Gram¿positivo están localizadas en 5'' con respecto a la totalidad de dichas secuencias codificantes de lux.

Description

Casetes de expresión de luciferasa y procedimiento de uso.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a vectores de expresión de luciferasa, a procedimientos para hacer los mismos y a procedimientos de uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

Las bacterias bioluminiscentes se encuentran ampliamente distribuidas tanto en medios marinos como terrestres. Curiosamente, todas las especies identificadas de bacterias bioluminiscentes marinas y terrestres naturales son Gram-negativas. Hasta la fecha, se han descrito al menos once especies pertenecientes a cuatro géneros Gram-negativos: Vibrio, Photobacterium, Shewanelia (Altermonas) y Photorhabdus (Xenorhabdus). En todas estas especies, los cinco genes responsables de la bioluminiscencia están agrupados en el operón lux (luxCDABE).

Se cree que la bioluminiscencia (luz verde-azulada emitida que tiene una longitud de onda de aproximadamente 490 nm) procede de una oxidación catalizada por la luciferasa de mononucleótido reducido de flavina (FMNH_{2}) y un aldehído graso de cadena larga. La enzima luciferasa está codificada por dos subunidades (luxAB), mientras que los polipéptidos de reductasa de ácido graso responsables de la biosíntesis del sustrato de aldehído para la reacción luminiscente están codificados por tres genes luxCDE. Los genes que codifican la luciferasa y los polipéptidos de reductasa de ácido graso han sido clonados a partir de operones lux de Vibrio, Photobacterium y Photorhabdus, y secuenciados. En cada caso, los genes de luxCDE flanquean los genes de luxAB, con la transcripción en el orden luxCDABE. Aunque se ha identificado un número de genes de lux adicionales en cada una de estas tres bacterias, sólo los luxA-E son esenciales para la biosíntesis de luz (revisado por Meighen, E., (1993, The FASEB Journal 7:1016-1022 y Ulitzur, S., (1997), J. Biolumin Chemilumin 12: 179-192).

Los procedimientos descritos en la patente estadounidense 5.650.135 hacen posible la detección de bacterias luminiscentes en un animal vivo sin diseccionarlo ni abrir de ningún otro modo al animal ("monitorización in vivo"); la luz se detecta a través de músculos, piel, pelo y otros tejidos tradicionalmente "opacos", usando una cámara altamente sensible. En este y en otros contextos, sería por tanto deseable conferir propiedades bioluminiscentes a una bacteria de la elección del usuario, de manera que la bacteria pudiera ser rastreada con una monitorización in vivo en diversos modelos de infección. En concreto, sería deseable conferir tales propiedades de bioluminiscencia a bacterias Gram-positivas, pues muchas de las bacterias patógenas para los mamíferos son, de hecho, Gram-positivas. Por ejemplo, las infecciones causadas por Stapholococcus, un estafilococo Gram-positivo, son omnipresentes e incluyen, p.ej., abscesos, mastitis, neumonía, bacteremia, osteomielitis, enterocolitis y el síndrome del shock tóxico (SST). Otros estafilococos Gram-positivos, los Streptococcus, son la primera causa de infección faríngea ("inflamación" de garganta). Los bacilos Gram-positivos tales como Anthrax y Listeria (causante de la meningitis) pueden causar infecciones graves e incluso fatales en humanos y en otros mamíferos.

Mientras que es posible diseñar mediante ingeniería genética de un modo común una bacteria Gram-negativa no bioluminiscente para que tenga propiedades de bioluminiscencia mediante su clonación en un operón luxCDABE (bajo el control de un promotor adecuado) desde una especie bioluminiscente (véase, p.ej., Contag, et al., patente estadounidense con número de serie 5.650.135), los intentos previos por fabricar bacterias Gram-positivas bioluminiscentes han obtenido unos resultados limitados. Por ejemplo, un enfoque empleó un casete de expresión que codificaba una proteína de fusión de LuxAB funcional (Jacobs, M., et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 251-256). En este casete, se insertó un sitio de unión al ribosoma Gram-positivo (RBS, Ribosome Binding Site) secuencia arriba de luxA con el gen luxB clonado en el marco secuencia abajo de luxA. Aunque este enfoque ha conseguido generar un número de nuevos géneros de bacterias Gram-positivas bioluminiscentes útiles para ciertos estudios medioambientales y de seguridad alimenticia (p.ej., la evaluación de productos alimenticios en cuanto a la contaminación por tales bacterias), estas bacterias no son útiles para estudiar la patogenicidad. Una razón principal de esta limitación es que las proteínas de fusión de LuxAB descritas en la técnica anterior no son estables a las temperaturas corporales de los mamíferos, siendo de ese modo únicamente capaces de catalizar una producción de luz mínima en células bacterianas a 37ºC.

Se ha introducido el gen luxAB en las bacterias Gram-positivas Clostridium perfringens. Las medidas de la bioluminiscencia fueron realizadas en el anaerobio resultante (Phillips-Jones, M.K., (1993), FEMS Microbiology Letters, 106: 265-270).

La solicitud de patente EP-A-0 639641 también revela cepas bioluminiscentes de Streptococcus thermophilus que contienen los genes luxAB de Vibrio harveyi y Xenorhabdus para su uso en la determinación de bacteriófagos y antibióticos en muestras líquidas.

La publicación de patente WO 99/14311 A revela un procedimiento de rastreo para compuestos antimicrobianos que usa bacterias bioluminiscentes que contienen el gen marcador luxCDABE.

De hecho, ninguna de las bacterias Gram-positivas bioluminiscentes que han sido publicadas hasta la fecha producen suficiente luz in vivo para hacerlas útiles para las aplicaciones de monitorización in vivo anteriormente tratadas. Por lo tanto, sería deseable tener un procedimiento mediante el cual se pudieran convertir en bioluminiscentes bacterias Gram-positivas a las temperaturas encontradas en las células hospedadoras mamíferas y a niveles de luminosidad adecuados para la monitorización en animales vivos. La presente invención proporciona, entre otros, tales procedimientos, casetes de expresión y otras herramientas útiles para generar bacterias Gram-positivas bioluminiscentes adecuadas para los estudios relativos a la infección y/o la patogénesis.

Descripción de la invención

En un aspecto, la invención incluye un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE dispuestos en el siguiente orden relativo 5'-luxA-luxB-luxC-luxD-luxE-3', en el que (a) la transcripción del polinucleótido resulta en un ARN policistrónico que codifica todos los productos génicos; (b) cada uno de los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE es expresado como un polipéptido individual; y (c) las secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de sitio de unión al ribosoma Gram-positivo están localizadas en 5' con respecto a la totalidad de dichas secuencias codificantes de luxA, luxB, luxC, luxD y luxE. En otra realización, el casete de expresión tiene al menos un sitio de unión al ribosoma Gram-positivo que comprende la secuencia presentada como SEQ ID Nº: 1. La secuencia del sitio de unión (SEQ ID Nº:1) está secuencia arriba de cada una de las secuencias de polinucleótido de cada producto génico luxA, luxB, luxC, luxD y luxE. Las secuencias codificantes de los productos génicos codifican preferiblemente una luciferasa que es estable a 37ºC, tal como la luciferasa de Photorhabdus luminescens. Por consiguiente, las secuencias codificantes de nucleótidos para la luciferasa están preferiblemente derivadas de tales organismos. El polinucleótido del casete de expresión puede comprender además un promotor localizado en 5' con respecto a todas las secuencias codificantes de lux, en el que la transcripción del polinucleótido resulta en un ARN policistrónico que codifica todos los productos génicos de lux. En una serie de realizaciones, la transcripción del polinucleótido es mediada por un promotor contenido en la secuencia de ampliación de la expresión seleccionada entre el grupo constituido por Sa1 (SEQ ID Nº: 15), Sa2 (SEQ ID Nº: 16), Sa3 (SEQ ID Nº: 17), Sa4 (SEQ ID Nº: 18), Sa5 (SEQ ID Nº: 19) y Sa6 (SEQ ID Nº: 20); tales como Sa2 y Sa4. En una serie relacionada de realizaciones, la transcripción del polinucleótido es mediada por un promotor contenido en una secuencia de ampliación de la expresión seleccionada entre el grupo constituido por Sp1 (SEQ ID Nº: 21), Sp5 (SEQ ID Nº: 22), Sp6 (SEQ ID Nº: 23), Sp9 (SEQ ID Nº: 24), Sp16 (SEQ ID Nº: 25) y Sp17 (SEQ ID Nº: 26), por ejemplo, Sp16 (SEQ ID Nº: 25).

En la presente memoria, se revela un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica los productos génicos luxA y luxB, en el que (a) la transcripción del polinucleótido resulta en un ARN policistrónico que codifica ambos productos génicos y (b) las secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de sitios de unión al ribosoma Gram-positivos están localizadas adyacentes al extremo 5' de las secuencias codificantes de luxA y adyacentes al extremo 5' de las secuencias codificantes de luxB. El casete de expresión puede comprender además un sitio de inserción 5' a al menos una entre la secuencia codificante de luxA o la secuencia codificante de luxB. El sitio de inserción puede, por ejemplo, comprender además un sitio de inserción múltiple. En una realización, el sitio de inserción múltiple está localizado en 5' con respecto a las secuencias codificantes de luxA. En una realización relacionada, el sitio de inserción múltiple está localizado en 5' con respecto a las secuencias codificantes de luxB. En otra realización, el polinucleótido codifica además los productos génicos luxC, luxD y luxE. La disposición de las secuencias codificantes para los productos génicos lux puede ser, por ejemplo, en el siguiente orden relativo 5'-luxA-luxB-luxC-luxD-luxE-3'. Preferiblemente, las secuencias de Shine-Dalgarno bacterianas Gram-positivas están en 5' con respecto a todas las secuencias codificantes de lux. En un grupo de realizaciones, la transcripción del polinucleótido está mediada por un promotor contenido en una secuencia de ampliación de la expresión seleccionada del grupo constituido por Sa1-Sa6, p.ej., Sa2 o Sa4. En otro grupo de realizaciones, la transcripción del polinucleótido está mediada por un promotor contenido en una secuencia de ampliación de la expresión seleccionada del grupo constituido por Sp1, Sp5, Sp6, Sp9, Sp16 y Sp17, tal como Sp16. Como fue descrito anteriormente, las secuencias codificantes para luxA y luxB se obtienen preferiblemente de un organismo con una luciferasa que sea estable a 37ºC, tal como Photorhadus luminescens.

Además se describe en la presente memoria un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica los productos génicos luxA, luxB y luc, en el que (a) la transcripción del polinucleótido resulta en un ARN policistrónico codificante de los tres productos génicos, md (b) la secuencias de polinucleótido que comprenden las secuencias de Shine-Dalgarno bacterianas Gram-positivas están localizadas adyacentes al extremo 5' de las secuencias codificantes de luxA, adyacentes al extremo 5' de las secuencias codificantes de luxB y adyacentes al extremo 5' de las secuencias codificantes de luc. En una realización, el polinucleótido codifica además los productos génicos luxC, luxD y luxE. En otra realización, las secuencias de Shine-Dalgarno bacterianas Gram-positivas están localizadas en 5' con respecto a todas las secuencias codificantes de lux o en 5' con respecto únicamente a luxA y luxC. En un conjunto de realizaciones, la transcripción del polinucleótido es mediada por un promotor contenido en una secuencia de ampliación de la expresión seleccionada del grupo constituido por Sa1-Sa6, p.ej., Sa2 o Sa4. En un conjunto seleccionado, la transcripción del polinucleótido es mediada por un promotor contenido en una secuencia de ampliación de la expresión seleccionada del grupo constituido por Sp1, Sp5, Sp6, Sp9, Sp16 y Sp17, p.ej., Sp16. El casete de expresión puede incluir además un sitio de inserción múltiple localizado adyacente al extremo 5' de las secuencias codificantes de luxA. Preferiblemente, las secuencias codificantes para luxA y luxB se obtienen de Photorhadus luminescens.

También se revela un casete de expresión que comprende un polinucleótido codificante de una fusión en marco de los productos génicos luxA y luxB, en el que (a) las secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de Shine-Dalgarno Gram-positivas están localizadas adyacentes al extremo 5' de las secuencias codificantes de luxA, y (b) hay un sitio de inserción localizado entre las secuencias codificantes de luxA y luxB. El sitio de inserción puede comprender además un sitio de inserción múltiple. La disposición de las secuencias codificantes para los productos génicos está preferiblemente, pero no necesariamente, en el siguiente orden relativo: 5'-luxA-luxB-luxC-luxD-luxE-3'. En una realización preferida, las secuencia de Shine-Dalgarno bacterianas Gram-positivas están en 5' con respecto a las secuencias codificantes de la fusión de luxA-luxB, y todas las secuencias codificantes de luxC, luxD y luxE.

Se entenderá que todos los casetes de expresión descritos anteriormente según la invención pueden estar contenidos en un transposón bacteriano o un mini-transposón bacteriano. Además, en todos estos casetes, las secuencias codificantes de los productos génicos pueden comprender codones que son óptimos para la expresión de los productos génicos en un sistema hospedador dentro del cual se vaya a introducir el casete de expresión.

También se revela en esta memoria un procedimiento de selección de un casete de expresión productor de luz para su uso en un tipo de célula seleccionado. El procedimiento incluye las etapas de (i) preparar fragmentos de ADN genómico aislado del tipo de célula seleccionado e (ii) insertar los fragmentos en el sitio de inserción de un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una fusión en marco de los productos génicos luxA y luxB, en el que (a) las secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de Shine-Dalgarno Gram-positivas están localizadas adyacentes al extremo 5' de las secuencias codificantes de luxA, y (b) hay un sitio de inserción localizado entre las secuencias codificantes de luxA y luxB. El casete de expresión es preferiblemente capaz de expresar los productos génicos en el tipo de célula seleccionado. La etapa (iii) del procedimiento consiste en introducir los casetes de expresión que portan los fragmentos a las células del tipo de célula seleccionado, y la etapa (iv) consiste en rastrear las células productoras de luz, estando la producción de luz mediada por el casete de expresión. Los fragmentos pueden ser producidos, por ejemplo, mediante la digestión enzimática de ADN genómico, la digestión parcial usando una endonucleasa de restricción seleccionada o mediante la fragmentación mecánica de ADN genómico. La transcripción de los genes lux está preferiblemente mediada por un promotor que se obtiene del tipo de célula seleccionado, por ejemplo, Staphylococcus, Streprococcus, Actinomyces, Lactobacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Clostridium, Propionibacterium, Enterococcus o Bacillus. En una realización, el rastreo se lleva a cabo a una temperatura mayor de aproximadamente 37ºC.

También se revela un casete de expresión de luciferasa que comprende: a) un polinucleótido que codifica luc; y b) secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de ampliación de la expresión (p.ej., promotor Gram-positivo y/o secuencias de Shine-Dalgarno Gram-positivas) obtenidas de 5' de bacterias Gram-positivas con respecto al polinucleótido codificante de luc. El fragmento pequeño de ADN que comprende las secuencias de ampliación de la expresión está preferiblemente entre luc y el promotor.

El contenido de esta memoria revela además un casete de expresión de luciferasa que comprende: a) un polinucleótido que codifica luxY; y b) secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de ampliación de la expresión (p.ej., promotor Gram-positivo y/o secuencias de Shine-Dalgarno Gram-positivas) obtenidas de 5' de bacterias Gram-positivas con respecto al polinucleótido codificante de luxY. El fragmento pequeño de ADN que comprende las secuencias de ampliación de la expresión está preferiblemente entre luxY y el promotor.

También se revelan en la presente memoria los plásmidos designados como pCMOR G+1 Sa1-6 y pCMOR G+2 Sp1, Sp5, Sp6, Sp9, Sp16 y Sp17.

Otro aspecto de la invención incluye un vector lanzadera que comprende a) un casete de expresión según cualquiera de los casetes de expresión anteriormente descritos; b) un polinucleótido que codifica un marcador seleccionable; c) un origen Gram-positivo de replicación; y d) un origen Gram-negativo de replicación.

También se revela un procedimiento de rastreo de secuencias de ampliación de la expresión que son útiles en la obtención de la expresión de luedinue en bacterias Gram-positivas. El procedimiento comprende las etapas de a) introducir fragmentos de ADN procedentes de un genoma bacteriano Gram-positivo en un casete de expresión que comprende (i) polinucleótidos que codifican los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE, estando los polinucleótidos en el siguiente orden relativo 5'-luxABCDE; (ii) secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de ampliación de la expresión obtenidas de 5' de bacterias Gram-positivas con respecto a al menos uno de los polinucleótidos codificantes de lux e (iii) un sitio de inserción 5' a al menos uno de los polinucleótidos codificantes de lux; b) transformar el casete de expresión de la etapa (a) en una célula hospedadora de bacterias Gram-positivas; y c) determinar el nivel de actividad de la luciferasa en la célula hospedadora, identificando así las secuencias de ADN ampliadoras de la
expresión Gram-positivas que son útiles en la obtención de la expresión de luciferasa en bacterias Gram-positivas.

Otra revelación de esta memoria se refiere al procedimiento de rastreo de secuencias de ampliación de la expresión que son útiles en la obtención de la expresión de luciferasa en bacterias Gram-positivas. El procedimiento comprende las etapas de a) introducir fragmentos de ADN procedentes de un genoma bacteriano Gram-positivo en un casete de expresión que comprende (i) polinucleótidos que codifican los productos génicos luxA y luxB, (ii) secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de ampliación de la expresión obtenidas de 5' de bacterias Gram-positivas con respecto al menos uno de los polinucleótidos codificantes de lux e (iii) un sitio de inserción 5' a al menos uno de los polinucleótidos codificantes de lux; b) transformar el casete de expresión de la etapa (a) en una célula hospedadora de bacterias Gram-positivas; y c) determinar el nivel de actividad de la luciferasa en la célula hospedadora, identificando así las secuencias de ADN ampliadoras de la expresión Gram-positivas que son útiles en la obtención de la expresión de luciferasa en bacterias Gram-positivas.

También se revela un procedimiento de rastreo de secuencias de ampliación de la expresión que son útiles en la obtención de la expresión de luciferasa en bacterias Gram-positivas. El procedimiento comprende las etapas de a) introducir fragmentos de ADN procedentes de un genoma bacteriano Gram-positivo en un casete de expresión que comprende (i) un polinucleótido que codifica luc; (ii) secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias de ampliación de la expresión obtenidas de 5' de bacterias Gram-positivas con respecto a al menos uno de los polinucleótidos codificantes de luc e (iii) un sitio de inserción 5' a al menos uno de los polinucleótidos codificantes de luc; b) transformar el casete de expresión de la etapa (a) en una célula hospedadora de bacterias Gram-positivas; y c) determinar el nivel de actividad de la luciferasa en la célula hospedadora, identificando así las secuencias de ADN ampliadoras de la expresión Gram-positivas que son útiles en la obtención de la expresión de luciferasa en bacterias Gram-positivas.

También se revela en la presente memoria un procedimiento para hacer un casete de expresión de luciferasa, que comprende las etapas de: (a) preparar polinucleótidos que codifican en una dirección 5'-3' los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE; y secuencias de nucleótido de Shine-Daigamo Gram-positivas ligadas operativamente a uno o más de los polinucleótidos codificantes de lux; y (b) insertar secuencias pequeñas de ácidos nucleicos entre uno o más de los polinucleótidos codificantes de un producto génico lux.

También se revela un procedimiento para hacer un casete de expresión de luciferasa, que comprende las etapas de: (a) preparar polinucleótidos que codifican los productos génicos luxA y luxB; y secuencias de nucleótidos de Shine-Dalgarno Gram-positivas ligadas operativamente a uno o más de los polinucleótidos codificantes de lux; e (b) insertar secuencias pequeñas de ácidos nucleico entre uno o más de los polinucleótidos codificantes de un producto génico lux.

Además, se revela en la presente memoria un procedimiento para hacer un casete de expresión de luciferasa, que comprende las etapas de: (a) preparar polinucleótidos que codifican productos génicos luc; y secuencias de nucleótidos de Shine-Dalgarno Gram-positivas ligadas operativamente al polinucleótido codificante de luc; e (b) insertar secuencias pequeñas de ácido nucleico en 5' con respecto al polinucleótido codificante del polinucleótido codificante de luc.

También se revela un procedimiento para hacer un casete de expresión de luciferasa, que comprende las etapas de: (a) preparar polinucleótidos que codifican productos génicos luxY; y secuencias de nucleótidos de Shine-Dalgarno Gram-positivas ligadas operativamente al polinucleótido codificante de luxY; y (b) insertar secuencias pequeñas de ácido nucleico en 5' con respecto al polinucleótido codificante del polinucleótido codificante de luxY.

También forma parte de la invención un procedimiento para modificar un organismo Gram-positivo para que produzca luz, que comprende transformar el organismo Gram-positivo con cualquiera de los casetes de expresión descritos anteriormente según la invención.

En otro aspecto, la invención incluye un procedimiento de rastreo de un analito en cuanto a su estabilidad para afectar a la expresión de un marcador indicador, que comprende (a) proporcionar el análogo a bacterias Gram-positivas que comprenden el casete de expresión de luciferasa de la presente invención, en el que dicho marcador indicador comprende luciferasa; y (b) proporcionar el analito a las bacterias; (c) proporcionar, si fuera necesario, el sustrato necesario para la producción de luz por parte de la luciferasa; y (d) monitorizar el efecto del analito sobre la capacidad de las bacterias Gram-positivas para producir luz, identificando así si el analito afecta a la expresión del indicador en bacterias Gram-positivas. El procedimiento puede incluir además la etapa, antes de monitorizar el efecto del analito, de proporcionar un sustrato necesario para la producción de luz por parte de la luciferasa. En una realización, el sustrato es aldehído y se proporciona como un vapor.

También se incluye en las revelaciones de esta memoria un procedimiento de rastreo de un analito en cuanto a su capacidad para afectar a la expresión de un marcador indicador en un animal entero. El procedimiento incluye las etapas de (a) transformar bacterias Gram-positivas con cualquiera de los casetes de expresión de luciferasa anteriormente descritos; (b) introducir las bacterias en un animal entero; (c) proporcionar el analito al animal; (d) proporcionar, si fuera necesario, el sustrato necesario para la producción de luz por parte de la luciferasa; y (e) monitorizar el efecto del analito sobre la capacidad de las bacterias Gram-positivas para producir luz, identificando así si el analito afecta a la expresión del indicador en bacterias Gram-positivas. En una realización, el sustrato es aldehído y se proporciona por inyección.

También se revelan en la presente memoria bacterias Gram-positivas capaces de producir luz, en las que (a) las bacterias comprenden secuencias codificantes de luxA y luxB, y (b) aproximadamente 1 x 10^{6} células bacterianas pueden producir al menos aproximadamente 1 x 10^{4} unidades relativas de luz a aproximadamente 37ºC. En otras realizaciones, se revelan células que emiten al menos aproximadamente 10 fotones por segundo por célula. También se revelan células que emiten al menos aproximadamente 25 fotones por segundo por célula. Se revelan células que emiten al menos aproximadamente 50 fotones por segundo por célula. Se revelan células que emiten al menos aproximadamente 75 fotones por segundo por célula. También se revelan células que emiten al menos aproximadamente 100
fotones.

También se revela un animal no humano transgénico que comprende cualquiera de los casetes de expresión anteriormente descritos.

También se revela en la presente memoria una secuencia promotora contenida en cualquiera de las secuencias ampliadoras de la expresión Sa1-Sa6 o las secuencias Sp (según lo revelado más abajo). En una realización preferida, la secuencia promotora se selecciona entre las secuencias de ampliación de la expresión seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID Nº: 15-26.

En una realización general, la invención incluye un casete de expresión que comprende una secuencia promotora según lo definido en el párrafo anterior ligada operativamente a una secuencia de polinucleótido codificante de una proteína generadora de luz (PGL). En una realización, la PGL es una proteína fluorescente, tal como una proteína verde fluorescente. En otra realización, la PGL es una proteína luminiscente o bioluminiscente, tal como la luciferasa. En realizaciones específicas, la luciferasa puede ser bien una luciferasa procariota (una luciferasa codificada por lux) o una luciferasa eucariota (codificada por luc).

Esta memoria revela además un procedimiento para localizar una entidad en un sujeto mamífero no humano, que comprende las siguientes etapas: (a) administrar al sujeto un conjugado de la entidad y una luciferasa procariota que comprende las subunidades alfa y beta; (b) administrar aldehído al sujeto; (c) tras un período de tiempo durante el cual el conjugado pueda alcanzar la localización en el sujeto, medir a través de un tejido opaco la emisión de fotones procedentes de la luciferasa localizada en el sujeto con un dispositivo fotodetector hasta que sea posible construir una imagen de emisión de fotones, y (d) construir una imagen de emisión de fotones, en la que la imagen muestre la localización de la entidad en el sujeto mamífero.

La invención también incluye células hospedadoras bacterianas, por ejemplo, bacterias Gram-positivas, que comprenden uno o más de los casetes de expresión, p.ej., vectores, plásmidos, transposones, etc descritos anteriormente según la invención.

Éstas y otras realizaciones de la presente invención serán producidas fácilmente por aquéllos expertos habituales en la técnica en vista de la revelación de la presente memoria. Además, se pueden combinar diversas formas de las diferentes realizaciones descritas en la presente memoria.

Breve descripción de las figuras

La fig. 1 es un diagrama esquemático del plásmido pCMOR G+1. La estructura del plásmido es pMK4 (9). Las secuencias de nucleótidos de los genes lux, ordenadas según lo mostrado, son como se proporcionan en el banco de genes (número de acceso M90093)flanqueadas por las secuencias relevantes mostradas en la tabla 1. El plásmido puede ser usado como el vehículo de una sonda promotora ligando el ADN genómico (particularmente digerido por un cortador de cuatro bases) en los sitios BamHI o SmaI únicos y seleccionando para la luz en la bacteria Gram-positiva de la que deriva el ADN.

La fig. 2 es una comparación de la bioluminiscencia procedente de S. aureus y E. coli que contienen el luxCDABE nativo frente al luxABCDE modificado. Se diluyeron cultivos exponenciales de pCMOR Sa1 de RN4220 de S. aureus (-\blacksquare-), de pMK4 luxCDABE Sa1 de RN4220 de S. aureus (-\ding{115}-), pCMOR Sa1 de DH5\alpha de E. coli (..\blacksquare..) y pMK4 luxCDABE Sa1 de DH5\alpha de E. coli (..\ding{115}..) por placas de microvaloración de 96 pozos negras en diluciones dobles (-0,3 log) y se monitorizaron en cuanto a la luz durante un período de 30 min usando una cámara CCD con contador de fotones (Hamamatsu, modelo 2400-32). Los contenidos de cada pozo fueron luego colocados en placas para permitir la comparación del número de unidades formadoras de colonias (u.f.c.) con los niveles de bioluminiscencia (URL). El pCMOR Sa1 también es conocido como pMK4 luxABCDE PI.

La fig. 3 es una gráfica que muestra la estabilidad de la temperatura del luxABCDE modificado. Se cultivaron cultivos exponenciales de pCMOR Sa1 de RN4220 de S. aureus (-\blacksquare-), pCMOR Sa1 de DH5\alpha de E. coli (..\blacksquare..) y pMK4 luxCDABE Sa1 de DH5\alpha de E. coli (..\ding{115}..) hasta aproximadamente 10^{7} u.f.c./ml a 30ºC, y se colocaron volúmenes de 1 ml de cada una en bloques de calentamiento configurados a 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47ºC. Tras una hora a cada una de estas temperaturas elevadas, se colocaron consecutivamente los nueve bloques de calentamiento dentro del compartimento de una cámara CCD con contador de fotones (Hamamatsu, modelo 2400-32) y se registró la luz de cada uno de los tres cultivos durante un período de 1 min. Se muestran las URL a cada una de las temperaturas, con estos datos expresados como un porcentaje de la bioluminiscencia máxima alcanzada y ajustada para variaciones en el número de u.f.c.

La figura 4, los paneles A y B, son gráficos que representan los datos de bioluminiscencia registrados de ratones infectados con pMK4 luxABCDE P1 de 8325-2 de S. aureus (panel A) y pMK4 luxABCDE P2 de 8325-4 de S. aureus (panel B). Cada conjunto de datos representa el número medio de URL procedente de seis ratones bien tratados (\blacksquare) o sin tratar (\ding{115}) con amoxicilina (10 mg/kg), de los que se tomaron imágenes tanto dorsal como ventralmente durante 5 minutos a las 0, 4, 8 y 24 horas posteriores a la infección usando una cámara ICCD. Las barras de error representan los errores estándar de las medias.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de Química, Bioquímica, Biología Molecular, Inmunología y Farmacología, pertenecientes al alcance de la técnica. Tales técnicas se explican en su totalidad en el material publicado. Véase, p.ej., "Remington's Pharmaceutical Sciences", XVIII edición (Easton, Pennsylvania: Mack Pub-lishing Company, 1990); "Methods In Enzymology" (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); y "Handbook of Experimental Immunology", Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Ausubel, F.M., et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995). Sambrook, J., et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY) (1989)).

Definiciones

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y están destinados a ser definidos según lo indicado a continuación. A no ser que se indique lo contrario, todos los términos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que tendrían para cualquier experto en la técnica de la presente invención.

Como se usa en esta memoria y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural a no ser que el contenido indique claramente lo contrario. De ese modo, por ejemplo, la referencia a "un antígeno" incluye una mezcla de dos o más de tales agentes.

Los términos "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" son usados indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, o a análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden desempeñar cualquier función, conocida o desconocida. Los ejemplos no restrictivos de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores.

Un polinucleótido está comúnmente compuesto de una secuencia específica de cuatros bases de nucleótido: adenina (A); citosina (C); guanina (G); y timina (T) (uracilo (U) por timina (T) cuando el polinucleótido es ARN). Así, el término secuencia de polinucleótido es la representación alfabética de una molécula de polinucleótido. Esta representación alfabética puede ser introducida en bases de datos de un ordenador que tenga una unidad de procesamiento central, y usadas para aplicaciones de Bioinformática tales como de genómica funcional y búsqueda de homologías.

Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que es transcrita (en el caso de ADN) y traducida (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas (o "elementos de control"). Las fronteras de la secuencia codificante están determinadas por un codón de iniciación en el terminal (amino) 5' y un codón de terminación de la traducción en el terminal (carboxilo) 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADNc de ARNm vírico, procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN vírico o procariota, e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar localizada en 3' con respecto a la secuencia codificante.

Los "elementos de control" comunes incluyen, pero no se limitan a, reguladores de la transcripción, tales como promotores, elementos ampliadores de la transcripción, señales de terminación de la transcripción y secuencias de poliadenilación; y reguladores de la traducción, tales como secuencias de optimización de la iniciación de la traducción, p.ej., secuencias (de sitio de unión al ribosoma) de Shine-Dalgarno, y secuencias de terminación de la traducción. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (en los que la expresión de una secuencia de polinucleótido ligada operativamente al promotor es inducida por un analito, un cofactor, una proteína reguladora, etc), promotores represibles (en los que la expresión de una secuencia de polinucleótido ligada operativamente al promotor es inducida por un analito, un cofactor, una proteína reguladora, etc) y promotores constitutivos.

Las "secuencias de ampliación de la expresión" se refieren comúnmente a elementos de control que mejoran la transcripción o la traducción de un polinucleótido en relación con el nivel de expresión en ausencia de tales elementos de control (por ejemplo, promotores, ampliadores de los promotores, elementos ampliadores y ampliadores de la traducción (p.ej., secuencias de Shine-Dalgarno)).

Una molécula de "polinucleótido aislado" es una molécula de ácido nucleico separada y diferenciada del organismo completo con el que la moléculas se encuentra en la naturaleza; o una molécula de ácido nucleico carente, por completo o en parte, de secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas (según lo definido más abajo) en asociación con la
misma.

Un "polipéptido" se usa en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más aminoácidos subunitarios, análogos de aminoácido u otros peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar ligadas por enlaces peptídicos o por otros enlaces, por ejemplo, de tipo éster, éter, etc. Como se usa en la presente memoria, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos bien naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo la glicina y ambos isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácido y peptidomiméticos. Un péptido de tres o más aminoácidos es comúnmente denominado oligopéptido, si la cadena peptídica es corta. Si la cadena peptídica es larga, el péptido es comúnmente denominado polipéptido o proteína.

"Ligados operativamente" se refiere a una disposición de los elementos en la que los componentes así descritos están configurados para que realicen su función habitual. Así, un promotor dado que está ligado operativamente a una secuencia codificante (p.ej., un gen indicador) es capaz de afectar a la expresión de la secuencia codificante cuando estén presentes las enzimas apropiadas. El promotor u otros elementos de control no necesitan estar contiguos a la secuencia codificante, siempre y cuando funcionen para dirigir la expresión de la misma. Por ejemplo, pueden estar presentes secuencias no traducidas aunque transcritas intercaladas entre la secuencia promotora y la secuencia codificante, y la secuencia promotora puede seguir siendo considerada "ligada operativamente" a la secuencia codificante.

"Recombinante" como se usa en la presente memoria para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una parte del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; y/o (2) está ligado a un polinucleótido distinto al que está ligado en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o un polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. Los términos de "células hospedadoras recombinantes", "células hospedadoras", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos tales que denotan microorganismos procariotas o líneas celulares eucariotas cultivados como entidades unicelulares se usan indistintamente y se refieren a células que pueden ser, o han sido, usadas como receptores para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transformada. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN total o genómico al padre original, debido a mutaciones accidentales o deliberadas. La progenie de la célula parental que es suficientemente similar al padre que será caracterizada por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido deseado, está incluida en la progenie englobada por esta definición y está cubierta por los términos
anteriores.

También se conocen en la técnica las técnicas para determinar la "identidad secuencial" de ácidos nucleicos y aminoácidos. Comúnmente, tales técnicas incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm de un gen y/o determinar la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con nucleótido o de aminoácido con aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. Se pueden comparar dos o más secuencias (polinucleótido o aminoácido) determinando su "porcentaje de identidad". El porcentaje de identidad de dos secuencias, bien secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de las secuencias más cortas y multiplicado por 100. El algoritmo de homología local de Smith y Waterman proporciona una alineación aproximada para secuencias de ácido nucleico, "Advances in Applied Mathematics" 2:482-489 (1981). Este algoritmo puede ser aplicado a secuencias de aminoácidos usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, "Atlas of Protein Sequences and Structure" M.O. Dayhoff ed., 5 sppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU., y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Un ejemplo de puesta en práctica de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia es proporcionado por Genetics Computer Group (Madison, WI) en la aplicación de la utilidad "BestFit". Los parámetros por defecto para este procedimiento están descritos en "Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual", Versión 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI). Un procedimiento preferido para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH propiedad de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de este juego de paquetes, se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman en el que se utilizan los parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, una penalización para la apertura de espacio de 12, una penalización para la extensión de espacio de uno y un espacio de seis). A partir de los datos generados, el valor de "coincidencia" refleja la "identidad secuencial". Se conocen en general otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o de similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineamiento es el BLAST, usado con los parámetros por defecto. Por ejemplo, el BLASTN y el BLASTP pueden ser usados mediante los siguientes parámetros por defecto: código genético = patrón; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias; clasificado por = HIGH SCORE; bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + proteína Swiss + Spupdate + PIR. Se puede encontrar información sobre estos programas en la siguiente dirección de Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, se puede determinar la homología mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones que formen dúplex estables entre las regiones homólogas, seguida por la digestión con nucleasa o nucleasas específicas monocatenarias y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de ADN o dos secuencias polipeptídicas son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias muestran al menos aproximadamente del 80%-85%, preferiblemente, al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferible, al menos aproximadamente el 95-98% de identidad secuencial a lo largo de una longitud definida de las moléculas, determinada usando los procedimientos anteriores. Como se usa en la presente memoria, sustancialmente homólogas también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con la secuencia de ADN o polipeptídica especificada. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación Southern en, por ejemplo, condiciones restrictivas, según lo definido para el sistema en concreto. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas pertenece al alcance del experto en la técnica. Véase, p.ej., Sambrook et al., supra; Clonación de ADN, supra; Hibridación de ácidos nucleicos, supra.

Un "gen" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto que es capaz de codificar un determinado polipéptido o una determinada proteína tras ser transcrito o traducido. Se puede usar cualquiera de las secuencias de polinucleótido descritas en la presente memoria para identificar fragmentos más largos o secuencias codificantes de longitud completa de los genes con los que están asociadas. Los procedimientos para aislar secuencias de fragmentos más largos son conocidos por el experto en la técnica.

Dos fragmentos de ácido nucleico son considerados "que se hibridan selectivamente" según lo descrito en la presente memoria. El grado de identidad secuencial entre las dos moléculas de ácido nucleico afecta a la eficacia y a la fuerza de los sucesos de hibridación entre tales moléculas. Una secuencia de ácido nucleico parcialmente idéntica inhibirá al menos parcialmente la hibridación de una secuencia completamente idéntica con una molécula diana. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente idéntica puede ser evaluada usando ensayos de hibridación que son muy conocidos en la técnica (p.ej., transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación en solución o similares; véase Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tales ensayos pueden ser realizados usando grados variables de selectividad, por ejemplo, usando condiciones que varían desde una condición restrictiva baja a una alta. Si se emplean condiciones restrictivas bajas, se puede medir la ausencia de unión inespecífica usando una sonda secundaria que carezca incluso de un grado parcial de identidad secuencial (por ejemplo, una sonda que tenga menos del aproximadamente 30% de identidad secuencial con la molécula diana), tal que, en ausencia de eventos de unión inespecífica, la sonda secundaria no se hibridará a la diana.

Cuando se utiliza un sistema de detección basado en la hibridación, se selecciona una sonda de ácido nucleico que sea complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana, y entonces, mediante la selección de condiciones apropiadas, la sonda y la secuencia diana "se hibridan selectivamente", o se unen entre sí para formar una molécula híbrida. Una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridarse selectivamente a una secuencia diana en condiciones "moderadamente restrictivas", normalmente, se hibrida en condiciones que permiten la detección de una secuencia de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de longitud que tenga al menos aproximadamente un 70% de identidad secuencial con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones restrictivas de hibridación comúnmente conducen a la detección de secuencias de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de longitud que tienen una identidad secuencial de más del aproximadamente 90-95% con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación útiles para la hibridación de sonda/diana, en la que la sonda y la diana tienen un grado específico de identidad secuencial pueden ser determinadas según lo conocido en la técnica (véase, por ejemplo, "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach", editores B.D. Hames y S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

Con respecto a las condiciones restrictivas para la hibridación, se conoce en la técnica que es posible emplear numerosas condiciones equivalentes para establecer unas determinadas condiciones restrictivas mediante la variación de, por ejemplo, los siguientes factores: lo longitud y la naturaleza de la sonda y las secuencias diana, la composición de las bases de diversas secuencias, las concentraciones de sales y otros componentes de la solución de hibridación, la presencia o la ausencia de agentes bloqueantes en las soluciones de hibridación (p.ej., formamida, sulfato de dextrano y poletilenglicol), la temperatura de la reacción de hibridación y parámetros temporales, así como, mediante la variación de las condiciones de lavado. La selección de un determinado conjunto de condiciones de hibridación se selecciona siguiendo procedimientos estándar en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

"Codificada por" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia polipeptídica, en la que la secuencia polipeptídica o una porción de la misma contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3 a 5 aminoácidos, más preferiblemente, de al menos 8 a 10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente de al menos 15 a 20 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. También se engloban secuencias polipeptídicas que son identificables inmunológicamente con un polipéptido codificado por la secuencia.

"Polinucleótido purificado" se refiere a un polinucleótido de interés o a un fragmento del mismo que es esencialmente libre, p.ej., que contiene menos del aproximadamente 50%, preferiblemente, menos del aproximadamente 70%, y más preferiblemente, menos del aproximadamente 90% de la proteína con la que el polinucleótido está asociado de forma natural. Las técnicas para purificar polinucleótidos de interés son conocidas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la interrupción de la célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico y la separación del o de los polinucleótidos y las proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y sedimentación según la densidad.

Un "vector" es capaz de transferir secuencias génicas a células diana (p.ej., vectores víricos, vectores no víricos, vehículos particulados y liposomas). Comúnmente, los términos "constructo de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia de genes" significan cualquier constructo de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias génicas a células diana. De ese modo, el término incluye la clonación y la expresión de vehículos, así como de vectores víricos.

"Vector de expresión de ácidos nucleicos" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o un gen de interés. El vector de expresión de ácidos nucleicos incluye un promotor que está ligado operativamente a las secuencias o al gen o los genes de interés. También pueden estar presentes otros elementos de control. Por ejemplo, además de los componentes de un casete de expresión, el constructo plasmídico también puede incluir uno o más orígenes bacterianos de replicación, uno o más marcadores seleccionables, una señal que permita la existencia del constructo plasmídico como ADN monocatenario (p.ej., un origen M13 de replicación), un sitio de clonación múltiple y un origen "mamífero" de replicación (p.ej., un origen SV40 o de adenovirus de replicación).

Un "vector de expresión" comprende cualquier constructo de ácido nucleico que contiene gen o genes, o secuencia o secuencias de polinucleótido capaces de ser expresados en una célula. Los casetes de expresión pueden contener, además del gen o los genes y la secuencia o las secuencias de polinucleótido de interés, otros elementos de control transcripcional, traduccional o reguladores. Tales casetes se construyen comúnmente en un "vector", "constructo vectorial", "vector de expresión" (es decir, un "vector de expresión de ácidos nucleicos") o "vector de transferencia de genes", con el fin de transferir el casete de expresión a las células diana. De ese modo, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores víricos.

"Gram-positiva" es una característica taxonómica que se refiere a las bacterias que resisten la decoloración con cualquier tinte de coloración de Gram estándar. Por el contrario, las bacterias Gram-negativas son fácilmente decoloradas con ciertos disolventes orgánicos tales como etanol o acetona. La capacidad de las bacterias para aceptar o resistirse a la coloración refleja generalmente la estructura de la pared celular, y se ha sugerido que las bacterias Gram-positivas tienen un entrecruzamiento de peptidoglicanos más amplio y paredes celulares menos permeables que sus homólogos Gram-negativos. Los ejemplos no restrictivos de las bacterias Gram-positivas incluyen: Stapholococcus, Streptococcus, ciertos bacilos, Anthrax, Mycobacterium, etc.

"Generador de luz" se define como capaz de generar luz a través de una reacción química o a través de la absorción de radiación.

"Luz" se define en la presente memoria, a no ser que se establezca otra cosa, como una radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre aproximadamente 300 nm y aproximadamente 1.100 nm.

"Luz visible" se define en la presente memoria, a no ser que se establezca otra cosa, como una radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 750 nm.

"Proteína generadora de luz" se define como una proteína o un polipéptido capaz de generar luz a través de una reacción química (p.ej., bioluminiscencia, como la generada por la luciferasa) o a través de la absorción de radiación (p.ej., fluorescencia, como la generada por la proteína verde fluorescente).

"Luciferasa", a no ser que se establezca otra cosa, incluye luciferasas procariotas y eucariotas, así como las variantes que poseen propiedades ópticas variadas o alteradas, tales como las luciferasas que producen diferentes colores de luz (p.ej., Kajiyama, N., y Nakano, E., (1991) Protein Engineering 4(6): 691-693. "Lux" se refiere a genes procariotas asociados con la luciferasa y la emisión de fotones. "Luc" se refiere a genes eucariotas asociados con la luciferasa y la emisión de fotones.

"Animal" como se usa en la presente memoria se refiere comúnmente a un mamífero no humano, incluyendo, sin limitación, animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cerdos de guinea; aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y similares. El término no denota una edad en concreto. De ese modo, se pretende cubrir tanto individuos adultos como recién nacidos.

"Analito" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier compuesto o sustancia cuyos efectos (p.ej., la inducción o la represión de un promotor específico) puedan ser evaluados usando los animales de ensayo y los procedimientos de la presente invención. Tales analitos incluyen, pero no se limitan a, compuestos químicos, compuestos farmacéuticos, polipéptidos, péptidos, polinucleótidos y análogos de polinucleótido. Muchas organizaciones (p.ej., los Institutos Nacionales de Sanidad, las corporaciones farmacéuticas y químicas) tienen grandes bibliotecas de compuestos químicos y biológicos procedentes de procesos naturales y procedimientos sintéticos, o de caldos de fermentación o extractos. Tales compuestos/analitos pueden ser empleados en la práctica de la presente invención.

Modos de llevar a cabo la invención

Antes de describir la presente invención en detalle, se entenderá que esta invención no está limitada a determinadas formulaciones o que los parámetros de los procedimientos, como tales, pueden, por supuesto, variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente memoria tiene el único propósito de describir realizaciones particulares de la invención, y no pretende ser restrictiva.

Aunque se puede usar un número de procedimientos o materiales similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica de la presente invención, los materiales y los procedimientos preferidos son descritos en la presente memoria.

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Perspectiva general de la invención

Según lo tratado anteriormente, la síntesis de luz en bacterias bioluminiscentes naturales está codificada por cinco genes esenciales. Estos genes están agrupados en un operón (luxCDABE) que puede ser introducido en bacterias no bioluminiscentes para producir un fenotipo bioluminiscente. Como todas las especies identificadas de bacterias bioluminiscentes marinas y terrestres son Gram-negativas, la transformación de bacterias Gram-positivas en fenotipo bioluminiscente ha sido limitada, debido en parte a las diferentes genéticas de estos dos tipos de bacterias. La presente invención resuelve este problema en un aspecto volviendo a diseñar genéticamente el operón lux completo de Photorhabdus luminescens para introducir elementos de control Gram-positivos. Este nuevo casete de luxABCDE fue insertado en varios vectores lanzadera Gram-positivos/negativos diferentes (serie pCMOR G+), y estos constructos fueron luego usados como vehículos de promotores-sondas para seleccionar promotores Gram-positivos que resultaron en una fuerte producción de luz por parte de la bacteria hospedadora. Mediante el uso de este enfoque, se fabricaron diversos géneros diferentes de bacterias Gram-positivas muy bioluminiscentes, incluyendo diversas cepas de Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. En estas dos últimas bacterias, se pudieron detectar tan sólo 100 unidades formadoras de colonias (u.f.c.) a 37ºC mediante el uso de bioluminiscencia.

La enzima luciferasa es codificada por luxA y luxB, mientras que las enzimas responsables de la biosíntesis de aldehídos están codificadas por los tres genes luxC, luxD y luxE. Sin embargo, como el aldehído puede difundirse rápidamente a través de las membranas celulares y está comercialmente disponible (p.ej., Sigma), los genes que codifican la síntesis de este sustrato (luxCDE) no son una necesidad absoluta para la bioluminiscencia y pueden ser sustituidos por la adición de este compuesto exógenamente. Por tanto, para generar una bacteria bioluminiscente Gram-positiva, sólo es necesario asegurarse de que la célula puede sintetizar una luciferasa funcional.

Como se trata en el apartado de "Antecedentes de la invención", esto se ha conseguido en muchas bacterias Gram-positivas mediante la introducción de un casete de luxAB diseñado genéticamente de nuevo en el que se ha insertado un sitio de unión al ribosoma (RBS) Gram-positivo secuencia arriba de luxA y este gen fusionado en marco con luxB, permitiendo así la síntesis de una proteína de fusión de luxAB funcional (Jacobs, M., et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 251-256). Aunque este enfoque ha conseguido generar un número de nuevos géneros de bacterias bioluminiscentes Gram-positivas que son útiles para estudios medioambientales (p.ej., la evaluación de productos alimenticios en cuanto a la contaminación por tales bacterias), los constructos de luxAB existentes son de un uso limitado para estudiar la patogenicidad, pues ninguna de las cepas o de los constructos publicados hasta la fecha producen suficiente luz in vivo que les haga útiles par las aplicaciones de monitorización in vivo anteriormente tratadas.

La presente invención se refiere a casetes de expresión de luciferasa. Estos casetes de expresión pueden entonces ser insertados en una estructura adecuada (p.ej., un vector lanzadera) y conferir así la capacidad de producir luz en una célula o en un animal. Los casetes de expresión descritos en la presente memoria permiten, por primera vez, la producción de una cantidad mayor a la mínima de luz por parte de bacterias Gram-positivas a temperaturas fisiológicas.

En una realización, el casete de expresión contiene genes lux bacterianos diseñados genéticamente por recombinación para promocionar la expresión funcional de lux, por ejemplo, disponiendo los genes en el orden luxABCDE. De ese modo, este casete reorganiza el orden no modificado de estos genes, en concreto, luxCABDE. Al incluir tanto los genes estructurales (luxAB) como los genes codificantes del sustrato (luxCDE), este casete de expresión no necesita la adición de sustrato exógeno. Además, la reorganización de los genes junto con la introducción de secuencias Gram-positivas de Shine-Dalgarno confiere una mayor capacidad de producción de luz que el orden no modificado. Preferiblemente, se inserta una secuencia Gram-positiva de Shine-Dalgarno antes de (comúnmente en 5' con respecto a) más de uno o todos los genes lux reorganizados. Opcionalmente, las secuencias de ADN cortas que comprenden promotores u otros reguladores transcripcionales o traduccionales son insertadas antes del casete de lux.

Otro casete de expresión que se proporciona incluye polinucleótidos que codifican luxAB, pero no incluye el sustrato codificador de genes. Cuando se emplean tales casetes de expresión de luxAB, se proporciona sustrato exógeno, por ejemplo, aldehído, para monitorizar la capacidad de producir luz. Los casetes de expresión de luxAB incluyen por lo común una secuencia de ADN que aumenta la traducción entre los genes codificantes de luxA y luxB (por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno).

Además, otro gen bacteriano, luxY, aislado de la cepa Y-1 de Vibrio fischeri, codifica una proteína amarilla fluorescente (PAF), un sustrato que emite luz amarilla con un máx. de lambda de 545 nm cuando actúa mediante la enzima luciferasa. Véase Baldwin, T.O., et al. (1990) Biochem 29: 5509-5515. Por consiguiente, otro casete de expresión revelado en la presente memoria comprende polinucleótidos que codifican luxY funcional. En una realización, el casete de expresión incluye polinucleótidos que codifican luxY y elementos de control, tales como promotores y/o secuencias de Shine-Dalgarno, por ejemplo, de bacterias Gram-positivas. Los casetes de expresión de luxY también pueden contener una secuencia de ADN codificante de secuencias polipeptídicas, estando esta secuencia codificante de polipéptidos comúnmente colocada entre el promotor y las secuencias codificantes de luxY. En otro aspecto de la invención, luxABCDEY, se proporcionan casetes. La adición del gen luxY a, por ejemplo, el casete de genes luxABCDE, resulta en la ampliación del intervalo de longitud de onda de la luz emitida durante la bioluminiscencia hacia el extremo rojo del espectro de la luz visible. Dado que la luz de mayor longitud de onda penetra más fácilmente por los tejidos vivos en comparación con la luz de longitudes de onda menores, las realizaciones seleccionadas del casete de genes luxABCDE de la presente invención (p.ej., según lo descrito anteriormente) incluirán además la secuencia
de aumentar la sensibilidad de las aplicaciones que empleen la bioluminiscencia como un medio indicador.

Otro casete de expresión más de la invención incluye polinucleótidos que codifican luc funcional, un gen de luciferasa eucariota. En una realización, el casete de expresión comprende polinucleótidos codificantes de luc y elementos de control, tales como promotores y/o secuencias de Shine-Dalgarno, por ejemplo, de bacterias Gram-positivas. Los casetes de expresión de luc también pueden contener una secuencia de ADN codificante de secuencias polipeptídicas, estando esta secuencia codificante de polipéptidos comúnmente localizada entre el promotor y la secuencia codificante de luc.

Se ha identificado una variedad de genes codificantes de la luciferasa, incluyendo, pero no limitándose a los siguientes: B.A. Sherf y K.V. Wood, patente estadounidense nº: 5.670.356; Kazami, J., et al., patente estadounidense nº: 5.604.123; S. Zenno, et al, patente estadounidense nº: 5.618.722; K.V. Wood, patente estadounidense nº: 5.650.289; K.V. Wood, patente estadounidense nº: 5.641.641; N. Kajiyama y E. Nakano, patente estadounidense nº: 5.229.285; M.J. Cormier y W.W. Lorenz, patente estadounidense nº: 5.292.658; M.J. Cormier y W.W. Lorenz, patente estadounidense nº: 5.418.155; de Wet, J.R., et al, (1987) Molec. Cell. Biol. 7:725-737; Tatsumi, H.N., et al, (1992) Biochim. Biophys. Acta 1131:161-165 y Wood, K.V., et al, (1989) Science 244:700-702. Tales genes codificantes de la luciferasa pueden ser modificados mediante los procedimientos descritos en la presente memoria para producir secuencias polipeptídicas y/o casetes de expresión útiles, por ejemplo, en microorganismos Gram-positivos.

También se proporcionan procedimientos de rastreo de secuencias que aumentan la expresión de la luciferasa usando los casetes de expresión descritos en la presente memoria. Según lo indicado, se pueden insertar diversas secuencias en estos casetes de expresión (p.ej., entre los nucleótidos codificantes de luxA y luxB o entre luc y la secuencia promotora). Bien antes o después de la inserción de tales secuencias, los casetes de expresión pueden ser introducidos en la estructura de un vector adecuado, por ejemplo, de un vector lanzadera. Posteriormente, se puede evaluar la capacidad de producción de luz conferida mediante el casete de expresión y la secuencia insertada en un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula microbiana o mamífera relacionada).

En otro aspecto, los casetes de expresión son útiles en los procedimientos de monitorización de células (p.ej., procariotas y eucariotas) de sistemas de cultivo. En una realización, se introduce un casete de expresión de luciferasa descrito en la presente memoria en bacterias Gram-positivas y se monitoriza el efecto de analitos en estas células monitorizadas por su capacidad para producir luz. De este modo, por ejemplo, se pueden rastrear fácilmente antibióticos en células por su capacidad de matar o inhibir el crecimiento de la células. Según lo descrito anteriormente, ciertos casetes de expresión (p.ej., luxAB y luc) requieren la adición de sustrato exógeno. De ese modo, la invención también incluye procedimientos para administrar un sustrato (p.ej., aldehído), por ejemplo, añadiendo vapor de aldehído a la atmósfera en contacto con el medio de cultivo que contiene las células que portan los casetes de expresión de la presente invención.

Alternativamente, los casetes de expresión (es decir, que incluyen una estructura adecuada) de la invención pueden ser introducidos en un animal entero. En una realización, los casetes de expresión son primero introducidos en células, por ejemplo, en bacterias Gram-positivas. Se puede evaluar entonces el efecto de un analito en bacterias Gram-positivas de animales enteros. Cuando se requiere sustrato exógeno (p.ej., aldehído), puede ser proporcionado al animal, por ejemplo, mediante una inyección o dejando que el animal respire en vapor de aldehído, proporcionándose también estos procedimientos.

Además, se pueden usar los casetes de expresión de la presente invención para crear animales transgénicos.

Las ventajas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, (i) obtener niveles elevados de expresión de luciferasa (lux o luc) en cepas virulentas de bacterias, particularmente, bacterias Gram-positivas, que, por ejemplo, permitan monitorizar las infecciones en células; (ii) obtener niveles elevados de expresión de luciferasa (lux o luc) en cepas virulentas de bacterias, particularmente, bacterias Gram-positivas, que, por ejemplo, permiten la monitorización de infecciones cuando se usa luciferasa como un gen indicador en una célula o un sistema animal, (iii) la expresión de genes de lux codificantes de sustrato de evita la necesidad de la adición de sustrato exógeno; (iv) la reorganización del operón lux de CDABE a ABCDE permite la separación de componentes funcionales del operón (p.ej., se transforma por separado con componentes AB de lux y/o CDE de lux).

Luciferasas

La bioluminiscencia proporciona un poderoso sistema indicador para estudiar la infección bacteriana (p.ej., patente estadounidense nº: 5.650.135). "Luciferasa" es un término aplicado a miembros de una familia de diversas enzimas que comparten la propiedad de producir luz cuando se les proporciona un sustrato (p.ej., luciferina, aldehído de cadena larga o colentrazina), una fuente de energía (p.ej., ATP o FMNH_{2}) u oxígeno. Las luciferasas pueden ser clasificadas de manera general en luciferasas eucariotas y luciferasas procariotas. La luciferasa eucariota ("luc") está comúnmente codificada por un único gen (véase, p.ej., de Wet, J. R., et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 7870-7873; de Wet, J.R., et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737). Un ejemplo de organismo eucariota que contiene un sistema de luciferasa es la luciérnaga norteamericana Photinus pyralis. La luciferasa de la luciérnaga ha sido estudiada ampliamente, y se usa mucho en los ensayos de ATP. Los ADNc que codifican las luciferasa de Pyrophorus plagiophthalamus, otra especia de agriote, han sido clonados y expresados (Wood, et al.). Este escarabajo es poco habitual en que los diferentes miembros de la especie emiten bioluminiscencia de diferente color. Se aislaron cuatro clases de clones con una homología del 95-99% entre sí. Emiten luz a 546 nm (verde), 560 nm (amarilla verdosa), 578 nm (amarilla) y 593 nm (naranja). La última clase (593 nm) puede ser particularmente ventajosa para su uso como un resto generador de luz con la presente invención, porque la luz emitida tiene una longitud de onda que penetra los tejidos más fácilmente que la luz de longitud de onda más corta.

La luciferasa bacteriana ("lux") está comúnmente formada por dos subunidades (\alpha y \beta) codificadas por dos genes distintos (luxA y luxB) en el operón lux. Otros tres genes del operón (lux C, lux D y lux E) codifican las enzimas necesarias para la biosíntesis del sustrato de aldehído. El lux bacteriano está presente en determinadas bacterias bioluminiscentes Gram-negativas (p.ej., Photorhabdus luminescens) y está ordenado como CDABE.

Casetes de expresión de luciferasa

Se ha identificado una variedad de genes codificantes de luciferasa incluyendo, pero no limitándose a, los siguientes: B.A. Sherf y K.V. Wood, patente estadounidense nº: 5.670.356; Kazami, J., et al., patente estadounidense nº: 5.604.123; S. Zenno, et al, patente estadounidense nº: 5.618.722; K.V. Wood, patente estadounidense nº: 5.650.289; K.V. Wood, patente estadounidense nº: 5.641.641; N. Kajiyama y E. Nakano, patente estadounidense nº: 5.229.285; M.J. Cormier y W.W. Lorenz, patente estadounidense nº: 5.292.658; M.J. Cormier y W.W. Lorenz, patente estadounidense nº: 5.418.155; de Wet, J.R., et al, (1987) Molec. Cell. Biol. 7:725-737; Tatsumi, H.N., et al,(1992) Biochim. Biophys. Acta 1131:161-165 y Wood, K.V., et al, (1989) Science 244:700-702.

Casetes de expresión codificantes de lux

En un aspecto de la invención, se proporcionan casetes de expresión que comprenden polinucleótidos codificantes de tanto los productos génicos lux estructurales como los codificantes del sustrato. Los presente inventores han determinado que la reorganización de los genes lux, por ejemplo, de CABDE a ABCDE, así como la inserción de secuencias de Shine-Dargarno Gram-positivas antes de uno o más de los genes lux, confieren en la luciferasa resultante una mayor capacidad de producir luz. Las secuencias de Shine-Dargarno Gram-positivas (p.ej., SEQ ID Nº: 1) serán conocidas por aquéllos expertos en la técnica en vista de las enseñanzas de la memoria, y también están descritas en los ejemplos que figuran más adelante. Los casetes de expresión de luxABCDE no sólo expresan luciferasa, sino también las enzimas biosintéticas necesarias para la síntesis del sustrato de luciferasa lux (aldehído). Por consiguiente, el oxígeno es el único requisito extrínseco para la bioluminiscencia cuando se usa este casete de expresión.

En otro aspecto, se proporcionan casetes de expresión de luxAB. Los casetes de luxAB contienen comúnmente un sitio de unión al ribosoma Gram-positivo (también denominado "secuencias de Shine-Dargarno") ligado operativamente secuencia arriba de cada uno de los polinucleótidos codificantes de luxA y B. Como se describe en la presente memoria, estos casetes confieren niveles más elevados de actividad de luciferasa que los encontrados en los constructos conocidos, particularmente, cuando se expresan en bacterias Gram-positivas tales como Stapholococcus o Streptococcus.

Ambos casetes de expresión de luxABCDE y luxAB descritos en la presente memoria contienen opcionalmente un sitio para la inserción de una secuencia conocida o desconocida. En ambos casetes, el sitio de inserción está normalmente localizado en 5' con respecto al gen luxB (es decir, entre luxA y luxB). Mediante el uso de este sitio de inserción, se puede realizar un muestreo de secuencias ampliadoras de la expresión de fragmentos aleatorios (RFEESS, Random Fragment Expression Enhancing Sequence Screen), por ejemplo, según lo descrito en los ejemplos mediante (1) digestiones enzimáticas parciales (p.ej., usando SauIIIa) de un ADN de interés, p.ej., ADN obtenido de bacterias Gram-positivas; (2) la inserción de estos fragmentos en 5' con respecto al gen luxB; (3) la clonación de estos fragmentos de polinucleótido en vectores adecuados que contienen los casetes de expresión de lux; (4) la transformación de éstos en células (p.ej., bacterias Gram-positivas) y (5) la evaluación de éstos en cuanto a su capacidad para producir luminiscencia.

Casetes de expresión codificantes de luc

La presente invención también incluye casetes de expresión que permiten la expresión de luciferasa eucariota. En una realización, el casete de expresión de luc incluye un polinucleótido codificante del producto génico luc ligado operativamente a un promotor expresado constitutivamente. Preferiblemente, el promotor se obtiene de una bacteria Gram-positiva. Entonces se puede introducir el casete de expresión en la estructura de un vector adecuado, por ejemplo, un vector lanzadera. En una realización, el vector lanzadera incluye un marcador seleccionable y dos orígenes de replicación, uno para la replicación en organismos Gram-negativos y el otro para la replicación en organismos Gram-positivos.

Los promotores apropiados pueden ser identificados por cualquier procedimiento conocido en la técnica en vista de las enseñanzas de la presente memoria. En uno de tales procedimientos, descrito anteriormente y a continuación en los ejemplos, se realiza un muestreo de secuencias ampliadoras de la expresión de fragmentos aleatorios (RFEESS) usando ADN parcialmente digerido (p.ej., usando SauIIIa) obtenido de bacterias Gram-positivas. Los fragmentos aleatorios son luego clonados en vectores que contienen luc, transformados en bacterias, preferiblemente, bacterias Gram-positivas y evaluados en cuanto a su capacidad para producir luminiscencia.

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Procedimientos para fabricar vectores de expresión de luciferasa

En una realización preferida de la presente invención, se insertan los casetes de expresión de luciferasa en la estructura de un vector, p.ej., un vector lanzadera, tal como las series pMK4 (Sullivan, M., et al., (1984) Gene 29: 21-26), pDL289 (Buckley, N. et al., (1995) J. Bacteriol 177: 5028-5034) y pSUM (Ainsa, J.A., et al., (1996) Gene 176: 23-26). Comúnmente, los vectores lanzadera incluyen lo siguiente: (1) un origen de replicación Gram-positivo; (2) un origen de replicación Gram-negativo; (3) poliligadores; y (4) un polinucleótido codificante de un marcador seleccionable (p.ej., ampicilina, cloranfenicol).

Los casetes de expresión descritos en la presente memoria pueden ser construidos utilizando metodologías conocidas en la técnica de la Biología Molecular (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M., et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995) o Sambrook, et al.) en vista de las enseñanzas de la memoria. Por lo común, los casetes de expresión son ensamblados desde polinucleótidos codificantes de genes lux o luc mediante el enlace operativo de estos polinucleótidos a elementos reguladores de la traducción y de la transcripción (p.ej., un promotor) adecuados (p.ej., secuencias de Shine-Dalgarno Gram-positivas). También se pueden introducir en los casetes de expresión, en posiciones adecuadas, secuencias cortas de nucleótidos aleatorios, marcadores seleccionables y similares.

Un procedimiento preferido para obtener polinucleótidos, secuencias reguladoras adecuadas y secuencias cortas de nucleótidos aleatorios es la PCR. Los procedimientos generales para la PCR se enseñan en MacPherson, et al., "PCR: A PRACTICAL APPROACH", (IRL Press de Oxford University Press, (1991)). Las condiciones de la PCR para la reacción de cada aplicación pueden ser determinados empíricamente. Hay un número de parámetros que influyen en el éxito de una reacción. Entre estos parámetros, están la temperatura y el tiempo de apareamiento, el tiempo de extensión, la concentración de Mg^{2+} y ATP, el pH, y la concentración relativa de cebadores, moldes y desoxiribonucleótidos. En el ejemplo 1 que figura a continuación, se describen los ejemplos de cebadores. Tras una amplificación, los fragmentos resultantes pueden ser detectados mediante electroforesis sobre gel de agarosa seguida por una visualización con una coloración con bromuro de etidio y una iluminación ultravioleta.

Otro procedimiento para obtener polinucleótidos, por ejemplo, secuencias cortas de nucleótidos aleatorios, es mediante digestión enzimática. Como se describe más abajo en los ejemplos, las secuencias de ADN cortas generadas por digestión de ADN procedente de una bacteria adecuada con, p. ej., una enzima de restricción con reconocimiento de cuatro nucleótidos cortadora de extremos romos tal como AluI, HaeIII y Sau3AI, fueron ligadas con el casete de lux modificado.

Los polinucleótidos son insertados en los genomas de los vectores usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el inserto y el ADN del vector pueden entrar en contacto, en condiciones adecuadas, con una enzima de restricción para crear extremos complementarios o romos en cada molécula que pueden aparearse entre sí y ser unidos con una ligasa. Alternativamente, los ligadores de ácido nucleico sintéticos pueden ser ligados en los terminales de un polinucleótido. Estos ligadores sintéticos pueden contener secuencias de ácido nucleico que corresponden con un determinado sitio de restricción del ADN vectorial. También se conocen y se encuentran disponibles otros medios en la técnica.

Evaluación de los casetes de expresión de luciferasa en cultivos celulares

Los constructos de vectores de luciferasa tales como los descritos anteriormente en los ejemplos pueden ser adaptados para su uso en la transformación de una variedad de células hospedadoras, incluyendo la mayoría de las bacterias (p.ej., bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas) y muchas células eucariotas (incluyendo, pero no limitándose a, microorganismos, células vegetales, células mamíferas). Además, ciertos virus, tales como los virus del herpes o el virus Vaccinia, pueden ser diseñados genéticamente para que expresen luciferasa. Por ejemplo, Kovacs, et al. enseñan la expresión estable del gen codificante de la luciferasa de luciérnaga en un virus de herpes. Brasier, et al., enseñan el uso de constructos de gen de luciferasa en células de mamíferos. La expresión de luciferasa desde células mamíferas en cultivos ha sido estudiada usando la formación de imágenes mediante un dispositivo de transferencia de carga (CCD) tanto macroscópica (Israel, H., (1991) Gene 104: 139-145) como microscópicamente (Hooper, C., et al., (1990) Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 5: 123-130).

De ese modo, las células tanto procariotas como eucariotas, son dianas útiles para los casetes de expresión de la presente invención. Las células pueden ser cargadas con concentraciones relativamente elevadas de casetes de expresión, proporcionadas por, por ejemplo, un constructo genético heterólogo usado para transformar las células. Además, las células pueden ser seleccionadas de manera que expresen "los restos diana" o las moléculas eficaces para dirigirse a ellos en las localizaciones deseadas dentro del sujeto. Alternativamente, las células pueden ser transformadas con un constructo vectorial que exprese un resto de acceso adecuado.

Los procedimientos de transformación tanto para células procariotas como eucariotas son conocidos en la técnica (p.ej., Sambrook, et al.) e incluyen, pero no se limitan a, precipitación con fosfato de calcio, microinyección o electroporación. Los vectores que contienen los elementos reguladores apropiados y los sitios de clonación múltiple se encuentran ampliamente disponibles comercialmente (p.ej., Stratagene, La Jolla, Calif.; Clontech, Palo Alto, Calif.).

Uso de vectores de luciferasa como indicadores en cultivos celulares

Los casetes de expresión descritos en la presente memoria son sistemas indicadores útiles tanto en células eucariotas como procariotas. Mediante la monitorización de la luminiscencia, se pueden evaluar promotores y analitos en sistemas de cultivo celular. Por ejemplo, es posible ligar operativamente un promotor obtenido de un gen cuya inducción está asociada con la resistencia a un fármaco a un casete de expresión de luciferasa descrito en la presente memoria (p.ej., luxAB o luxABCDE). Los casetes de expresión son introducidos en células (p.ej., mediante un vector lanzadera) y se evalúa la eficacia de los analitos mediante la monitorización de la luminiscencia.

También se puede evaluar la tumoregenicidad usando los casetes de expresión de luciferasa descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se pueden transformar células eucariotas (p.ej., Candida albicans, Giardia y células tumorales) con casetes de expresión de luciferasa que contengan un promotor regulador que sea expresado en ciertas condiciones, por ejemplo, en la infección de la célula con un virus o la estimulación por una citoquina. Los promotores que responden a factores asociados con éstos y otros estímulos son conocidos en la técnica. En un aspecto relacionado, se pueden usar promotores inducibles tales como el sistema Tet (Goossen et al.) para activar transitoriamente la expresión de la proteína generadora de luz. Por ejemplo, se puede ligar operativamente el casete de expresión de luxABCDE a promotores asociados a un tumor, pudiéndose usar las células transformadas con este casete para muestrear compuestos antitumorales.

Evaluación de los vectores de expresión de luciferasa en animales

Los casetes de expresión descritos en la presente memoria son particularmente útiles para la formación no invasiva de imágenes de animales enteros. La formación no invasiva de imágenes de animales enteros se describe en la patente estadounidense 5.650.135 copropiedad de Contag, et al. (véase, también, Contag, et al., (1998) Nature Medicine 4(2):245-247; Contag, et al., (1996) OSA Tops on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3:220-224; Contag, et al., (1997) Photochemistry and Photobiology, 66(4):523-531; y Contag, et al., (1995) Mol. Microbiol. 18:593-603.

En el procedimiento de formación de imágenes, los conjugados contienen una entidad biocompatible (p.ej., una bacteria transformada) y un resto generador de luz (p.ej., una enzima luciferasa). Los conjugados que emiten luz son comúnmente administrados a un sujeto mediante cualquiera entre una variedad de procedimientos, permitidos ser localizados dentro del sujeto y aplicados el procedimiento de formación de imágenes. Como la formación de imágenes o la medición de la emisión de fotones desde el sujeto puede durar hasta decenas de minutos, comúnmente, pero no necesariamente, el sujeto es inmovilizado durante el procedimiento de formación de imágenes.

La formación de imágenes de entidades emisoras de luz supone el uso de un fotodetector capaz de detectar niveles extremadamente bajos de emisión de fotones integrantes y de luz (comúnmente eventos de un solo fotón) hasta que es posible construir una imagen. Los ejemplos de tales fotodetectores sensibles incluyen dispositivos que intensifican los eventos de un solo fotón antes de que éstos sean detectados por una cámara y cámaras (enfriadas, por ejemplo, con nitrógeno líquido) que son capaces de detectar fotones individuales sobre un ruido de fondo inherente a los sistemas de detección.

Una vez generada la imagen de emisión de fotones, lo común es expresarla como una imagen en pseudocolor superpuesta sobre una imagen de luz reflejada "fotográfica" del sujeto para proporcionar un marco de referencia para la fuente de los fotones emitidos (es decir, localizar los conjugados emisores de luz con respecto al sujeto). Tal imagen "compuesta" es luego analizada para determinar la localización y/o el nivel de expresión de un gen indicador en el sujeto.

Infección de animales

Los casetes de expresión de luciferasa descritos en la presente memoria son útiles en la evaluación de tanto células procariotas como eucariotas de un animal. Las bacterias patógenas (p.ej., las bacterias Gram-positivas) pueden ser conjugadas y/o transformadas con los casetes de expresión de luciferasa descritos en la presente memoria y ser posteriormente introducidas en un animal entero. El animal puede ser entonces usado para seguir el proceso de infección in vivo y evaluar el potencial anti-infectivo de fármacos tales como nuevos antibióticos, en cuanto a su capacidad de inhibir la infección. De este modo, en un aspecto, los casetes de expresión descritos en la presente memoria son útiles en la formación no invasiva de imágenes y/o la detección de conjugados emisores de luz en sujetos mamíferos infectados con bacterias que portan un casete de expresión de luciferasa. A modo de ejemplo, los casetes de expresión de luciferasa pueden ser usados para muestrear agentes útiles en la inhibición del crecimiento y/o la proliferación de bacterias patógenas.

Además, es posible obtener genotecas de E. coli que contengan bacterias que expresen anticuerpos unidos a la superficie que puedan ser muestreados para identificar una colonia que exprese un anticuerpo frente a un antígeno seleccionado (Stratagene, La Jolla, Calif.). Las bacterias de esta colonia pueden ser luego transformadas con un casete de expresión de luciferasa de la presente invención, pudiéndose utilizar los transformantes en los procedimientos de la presente invención, según lo descrito anteriormente, para localizar el antígeno en un hospedador mamífero.

Alternativamente, las células transformadas pueden ser administradas a un sujeto de análisis tal que se distribuyan uniformemente en el sujeto. Además, se puede emplear un promotor regulable en el casete de expresión tal que la proteína generadora de luz sea expresada en ciertas condiciones, por ejemplo, en la infección por un virus o la estimulación por una citoquina. Los promotores que responden a factores asociados con éstos y otros estímulos son conocidos en la técnica. En un aspecto relacionado, se pueden usar promotores inducibles, tales como el sistema Tet (Gossen, et al.) para activar transitoriamente la expresión de proteína generadora de luz.

Por ejemplo, se pueden transformar células linfáticas CD4+ con un constructo que contenga elementos LTR del VIH que responden en tat, y usadas como un ensayo para la infección del VIH (Israel, H., (1991) Gene 104: 139-145). Las células transformadas con tal constructo pueden ser introducidas en ratones SCID-hu (McCune, et al., (1997), Science 278: 2141-2) y usadas como modelo para la infección del VIH y el SIDA en humanos.

Las líneas celulares tumorales transformadas según lo anterior, por ejemplo, con un promotor constitutivamente activo, pueden ser usadas para controlar el crecimiento y la metástasis de tumores. Las células tumorales transformadas pueden ser inyectadas en un modelo animal, y dejadas que formen una masa tumoral para controlar el tamaño y la metástasis de la masa tumoral durante el tratamiento con inhibidores de la metástasis o del crecimiento putativos.

También se pueden generar células tumorales a partir de células transformadas con constructos que contienen promotores regulables, cuya actividad es sensible a diversos agentes infecciosos o a compuestos terapéuticos.

Animales transgénicos

Los casetes de expresión descritos en la presente memoria pueden ser usados para generar animales transgénicos. Los procedimientos para generar animales no humanos transgénicos son conocidos en la técnica (Leder, P., et al, patente estadounidense nº: 4.736.866; Melmed, S., et al., patente estadounidense nº: 5.824.838; Bosch; F., et al, patente estadounidense nº: 5.837.875; Capecchi, M.R., et al, patente estadounidense nº: 5.487.992; Bradley, A., et al, patente estadounidense nº: 5.614.396; Ruley, H.E., patente estadounidense nº: 5.627.058).

Administración de sustrato

Según lo descrito anteriormente, ciertos casetes de expresión descritos en la presente memoria requieren la adición de sustrato exógeno para la producción de luz (p.ej., casetes de expresión de luc o luxAB). En una realización preferida de la presente invención, el sustrato es aldehído. Cuando es administrado a células, el aldehído puede ser aplicado en la atmósfera circundante al medio de cultivo como un vapor o directamente al medio de cultivo como un líquido o un sólido.

Además, el sustrato también puede ser administrado a animales enteros. Las concentraciones apropiadas para el sustrato pueden ser determinadas empíricamente para cada línea de animal de ensayo construida. El sustrato (comúnmente, luciferina o aldehído) puede ser administrado antes, concomitantemente con, o después de la administración del analito de interés. Las vías de administración del sustrato pueden ser como las descritas para el analito. Las vías preferidas de administración para el sustrato incluyen, pero no se limitan a, la administración intravenosa o tópica, o el suministro del sustrato en la atmósfera, por ejemplo, como un vapor.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, esta invención.

Materiales y procedimientos

A no ser que se indique otra cosa, la manipulación de células, proteínas y ácidos nucleicos (p.ej., ADN) fue realizada usando procedimientos estándar, según lo descrito en, p.ej., Sambrook, et al., y Ausubel, F.M., et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995). A no ser que se indique otra cosa, las enzimas de restricción fueron obtenidas en New England Biolabs; las enzimas de modificación fueron obtenidas en Promega o Boehringer Mannheim y el resto de productos químicos de laboratorio fueron obtenidos en Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).

Rastreo in vitro en presencia de aldehído exógeno

Rastreo usando aldehído. Se añadió sustrato de aldehído exógeno antes de la formación de imágenes de las placas o los cultivos de bacterias que no contenían genes luxCDE. Para formar imágenes de las placas, se extendió aldehído de n-decilo (decanal; Sigma Chemical Company) en la superficie interior de las tapas de las placas que contenían las bacterias por ser sometidas a la formación de imágenes ("formación de imágenes con vapor de aldehído") y luego se sometieron las placas a la formación de imágenes usando una cámara CCD intensificada (modelo 2400-32 de Hamamatsu Photonics) esencialmente según lo descrito en la patente estadounidense nº: 5.650.135. Para la formación de imágenes de cultivos líquidos, se añadió 1 \mul de decanal a 1 ml de las diluciones por 10 apropiadas del cultivo.

B. Preparación del ADN y clonación

A no ser que se indique otra cosa, tras la digestión con una o más endonucleasas de restricción, las muestras de ADN fueron calentadas hasta 85ºC durante 15 minutos para desactivar las enzimas de restricción. Las ligaciones fueron realizadas a 16ºC durante una noche.

C. Transformación de células bacterianas

Preparación de células competentes. A no ser que se indique otra cosa, las células bacterianas fueron transformadas como sigue: se cultivaron cultivos bacterianos durante una noche en LB. Se usaron cinco ml de cada cultivo para inocular volúmenes frescos de 500 ml de LB. Estos cultivos fueron agitados a 37ºC hasta que se alcanzó una OD (600 nm) de aproximadamente 0,6. Entonces se enfriaron las células sobre hielo durante 30 min antes de ser cosechadas por centrifugación a 3.000 xg durante 10 min a 4ºC. Se volvieron a suspender las células en 50 ml de bien sacarosa 0,5M fría (S. aureus) o ddH_{2}O (E. coli), antes de volver a centrifugarlas y volver a suspender en 50 ml de bien sacarosa 0,5M fría (S. aureus) o ddH_{2}O (E. coli). En esta etapa, las células fueron mantenidas sobre hielo durante 30 min, y luego se volvieron a centrifugar y suspender en 5 ml de glicerol al 10% frío. Se congelaron alícuotas de cada tipo de célula y se almacenaron a -80ºC.

Electroporación. Se purificó ADN de plásmido usando una columna Qiagen, se sometió a diálisis y se sometió a electroporación en células competentes usando un "GenPulser" (BioRad). Los parámetros fueron 25 \muF, 2,5 kV y una resistencia de bien 100 ohms para S. aureus o de 400 ohms para E. coli y S. pneumoniae. Se dejaron recuperar las células en 1 ml de medio de cultivo 2 h a 37ºC antes de ser colocados en placas sobre un agar adecuado que contenía el antibiótico de selección necesario.

D. Muestras de formación de imágenes

Las muestras fueron sometidas a la formación de imágenes esencialmente según lo descrito en Contag, et al., patente estadounidense nº: 5.650.135, con modificaciones menores según lo indicado a continuación. En los experimentos realizados como apoyo a la presente invención (detallados más abajo), la cantidad de luz generada por una muestra fue cuantificada usando bien una cámara con contador de fotones intensificada (modelo 2400-32 de Hamamatsu Photonics) o una cámara integradora enfriada (Modelo LN/CCD 1340-1300-EB/1 de Princeton Instruments). A no ser que se indique otra cosa, la cámara con contador de fotones era una cámara XEN-3 y la cámara integradora era una cámara XEN-5, ambas localizadas en Xenogen Corporation, Alameda, California. Ambos tipos de cámaras usan una formación de dispositivo de carga acoplada (formación CCD) para generar una señal proporcional al número de fotones por superficie unitaria seleccionada. La superficie unitaria seleccionada puede ser tan pequeña como la detectada por un único píxel de CCD o si se usa binning, como la detectada por cualquier grupo seleccionado de píxeles. Esta señal puede ser enviada opcionalmente a través de un procesador de imágenes, tal como el Argus disponible en Hamamatsu Photonics, y luego transmitida a un ordenador (bien un PC con Windows NT (Dell Computer Corporation; Microsoft Corporation, Redmond, WA) o un Macintosh (Apple Computer, Cupertino, CA) que ejecute una aplicación de programa de procesamiento de imágenes, tal como "LivingImage" (Xenogen Corporation, Alameda, CA)). El programa y/o el procesador de imágenes son usados para adquirir imágenes, almacenadas en un fichero de datos de un ordenador. Los datos generalmente adoptan la forma de valores (x, y, z), en los que x e y representan las coordenadas espaciales del punto o la superficie desde la que se recoge la señal, y z representa la cantidad de señal en ese punto o esa superficie, expresada como "Unidades relativas de luz" (URL).

Para facilitar la interpretación, los datos son comúnmente mostrados como una imagen en "pseudocolor", usando un espectro de colores para denotar el valor z (cantidad de señal) en un determinado punto. Además, la imagen de señales en pseudocolor es comúnmente superpuesta sobre una luz reflejada o una imagen "fotográfica" para proporcionar un marco de referencia.

Se entenderá que si la señal es adquirida en una cámara que ha sido calibrada usando un patrón de fotoemisión estable (disponible en, p.ej., Xenogen Corporation), los valores de señal de URL procedentes de cualquier cámara pueden ser comparados con las URL de cualquier otra cámara que haya sido calibrada usando el mismo patrón de fotoemisión. Además, tras la calibración del patrón de fotoemisión para un flujo de fotones absoluto (fotones emitidos desde una superficie unitaria en una unidad de tiempo), cualquier experto en la técnica puede convertir los valores de URL desde cualquiera de tales cámaras en valores de flujo de fotones, que luego permitan la estimación del número de fotones emitidos por una célula transformada en la muestra por unidad de tiempo.

E. Cuantificación de salida de luz usando placas de microvaloración de 96 pozos

Se cuantificó la cantidad de luz generada por células en solución colocando las diluciones de la solución en los pozos de una placa de 96 pozos y formando imágenes de la placa según lo descrito anteriormente en la cámara Xen-3. Entonces se usó el programa LivingImage para superponer los bordes definidos alrededor de cada superficie de la imagen que mostraba una señal correspondiente a la luz procedente de un determinado pozo. La señal de cada una de estas superficies fue luego cuantificada y expresada como un único valor de URL para cada pozo. Estas URL fueron usadas en varios estudios detallados más adelante, incluyendo los ejemplos 13, 14 y 15.

Ejemplo 1 Incorporación de sitios de unión al ribosoma Gram-positivos secuencia arriba de luxA, B, C, D y E

Los cinco genes del operón lux de Photorhabdus luminescens, lux A-E, fueron amplificados por PCR usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Mullins; Mullins, et al.) para incorporar la secuencia del sitio de unión al ribosoma Gram-positivo (RBS) AGGAGG (SEQ ID Nº: 1) tal que este sitio estaba al menos siete nucleótidos secuencia arriba del codón de iniciación. Cada uno de los genes lux fue amplificado individualmente usando los conjuntos de cebadores mostrados en la tabla 1 que figura más adelante. En cada caso, los nucleótidos destacados en negrita muestran la posición y la secuencia de los diferentes endonucleótidos de restricción (identificados en la columna de más a la derecha) incorporada para facilitar la clonación. Los RBS Gram-positivos y los codones de iniciación son destacados por líneas continuas y discontinuas respectivamente.

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TABLA 1

1

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La PCR fue realizada con un termociclador automático (Techne Progenie, Princeton, N. J.) con tubos de PCR de pared delgada de 200 \mul (Molecular BioProducts, San Diego, CA). Las reacciones fueron llevada a cabo en volúmenes de 50 \mul que contenían 5 \mul tampón PCR x10 (suministrado con ADN polimerasa de Taq obtenida en Roche Molecular Biochemicals (Suiza)), MgCl_{2} 2,0 mM, 50 pmoles de cada cebador de oligonucleótido (operón; véase la tabla 1 para las secuencias), 0,2 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido (dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Amersham Pharmacia Biotech, (Uppsala, Suecia)), 1U de ADN polimerasa de Taq de Roche Molecular Biochemicals (Suiza) y 10 ng de ADN de plásmido que contiene el casete de luxCDABE de P. luminescens (bien pSB417 o pSB384; Winson, et al., (1998), FEMS, 163: 185-202). La amplificación de cada gen se consiguió usando 30 ciclos a 95ºC durante 15 s, 50ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min., seguidos por una etapa de extensión final a 72ºC durante 2 min.

La secuencia del casete de luxCDABE de Photorhabdus luminescens (anteriormente denominado Xenorhabdus luminescens) está disponible en el Banco de Genes con el número de acceso M90092.1 (GI: 155411; XENLABCDEB) (Meighen, E.A. y Szittner, R., J. Bacteriol. 174: 5371-5381 (1992)).

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Ejemplo 2 Construcción de pSK-G+luxAG+luxB (casete de luxAB en pBluescript)

Los genes amplificados en el ejemplo 1 anterior fueron ensamblados individualmente en vectores pBluescript SK- (Stratagene, La Jolla, CA). El producto de PCR de luxA fue digerido con BamH I/Sal I y ligado en pBluescript SK- en los sitios BamH I/Sal I (orientados direccionalmente secuencia abajo del promotor lacZ inducible por IPTG), generando plásmido Psk-G+luxA. Entonces se sometió a electroporación el plásmido Psk-G+luxA en DH5\alpha de E. coli (Stratagene), y las células fueron colocadas en placas con agar LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Se cultivaron colonias seleccionadas para preparaciones de plásmido, y se aisló ADN de plásmido y se cortó con Sal I. Los fragmentos resultantes fueron ligados con ADN amplificado por PCR de luxB cortado con Sal I/Xho I (ejemplo 1) para generar pSK-G+luxAG+luxB.

Se sometió a electroporación el pSK-G+luxAG+luxB en células DH5\alpha de E. coli, se colocó sobre agar LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, y se muestrearon los transformantes resultantes en cuanto a la luz en presencia de aldehído exógeno (véase Materiales y procedimientos) usando una cámara CCD con contador de fotones (Hamamatsu Photonics, Shizuoka pref., Japón; modelo 2400-32). Se purificaron las colonias bioluminiscentes y se monitorizaron en cuanto a la intensidad de su luz. Se registraron niveles de bioluminiscencia extremadamente elevados (sensibilidad de la cámara sólo de 2,0). Incluso en ausencia de aldehído exógeno, los niveles de fondo de luz pudieron ser detectados tanto en solución como desde las placas (cambiando el intervalo de bits de 0-5 en 1 min en el último caso). Sorprendentemente, el nivel de luz de las colonias de E. coli Gram-negativas que contenían pSK-G+luxAG+luxB fue significativamente mayor (en presencia de aldehído exógeno) que el nivel de luz de las colonias de E. coli transformadas con el operón lux de Phororhabdus luminescens.

Estos resultados muestran que las subunidades \alpha y \beta de luciferasa de Photorhabdus luminescens funcionales pueden ser expresadas individualmente en bacterias Gram-negativas (p.ej., E. coli) desde un casete de expresión de ADN conducido por el promotor lacZ, en el que el casete de expresión de ADN contiene secuencias de Shine-Dalgarno Gram-positivas secuencia arriba de cada una de las secuencias codificantes de luxA y luxB.

Ejemplo 3 Construcción de pSK^{-}luxABCDE (casete de luxABCDE en Bluescript)

El ensamblaje de un casete de luxCDE separado en pBluescript SK^{-} se consiguió mediante la clonación secuencial de luxC, luxD y luxE esencialmente según lo descrito en el ejemplo 2 para la generación del casete de luxAB. Los productos de la amplificación por PCR de luxC-E fueron digeridos individualmente por enzimas compatibles Sal I y XhoI, y cada etapa del procedimiento de clonación fue confirmada mediante PCR de los transformantes de E. coli. La fidelidad del casete de luxCDE final fue confirmada mediante la inserción de esta secuencia, cortada con SalI/Xho I, en el sitio Sal I secuencia abajo de los genes luxAB de pSK^{-}G+luxAG+luxB, generando luxABCDE de pSK. El rastreo fue realizado según lo descrito anteriormente, a excepción de que no se realizó ningún tratamiento con aldehído, pues el sustrato fue codificado por los genes luxCDE. Según lo anterior, las DH5\alpha de E. coli que contenían pSK^{-}luxABCDE fueron considerablemente más luminosos que las bacterias que contenían el operón lux de Photorhabdus luminescens nativo.

Ejemplo 4 Construcción de vectores lanzadera pMK4luxAB y pMK4luxABCDE, y evaluación de sus propiedades de bioluminiscencia en Staphylococcus aureus A. Construcción del vector lanzadera pMK4luxAB

Se aisló el casete luxAB generado según lo descrito en el ejemplo 2 anterior de pSK^{-}G+luxAG+luxB mediante una digestión con BamHI/Sal I, y se clonó en sitios BamHI/Sal I del vector lanzadera Gram positivo/negativo pMK4 (Sullivan, M., et al., (1984) "New shuttle vectors for Bacillus subtiles and Eschericha coli which Allow rapid detection of inserted fragments", Gene 29: 21-26). El pMK4 está disponible en la colección americana de cultivos tipo (ATCC; Manassas, VA) con un número ATCC 37315. La clonación fue llevada a cabo tal que (i) el casete luxAB fue orientado opuesto al promotor lacZ inducible por IPTG, e (ii) se mantuvo un sitio de restricción de BamH I secuencia arriba de la región codificante de luxA. El constructo de vector resultante (pMK4luxAB)fue sometido a electroporosis en DH5\alpha y colocado en placas sobre LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina.

B. Muestreo de secuencias ampliadoras de la expresión de fragmentos aleatorios (RFEESS) usando el plásmido pMK4luxAB y vapor de aldehído exógeno

Para muestrear secuencias ampliadoras de la expresión (EES) adecuadas (p.ej., secuencias promotoras), se cortó ADN genómico de Staphylococcus aureus con Sau3 A en un digesto parcial (véase, p.ej., Ausubel, F.M., et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995)) y se ligó al plásmido pMK4luxAB que había sido cortado con BamH I. Se digirieron cinco concentraciones distintas de ADN (1 \mug/\mul; 500 ng/\mul; 200 ng/\mul; 100 ng/\mul y 50 ng/\mul) en conjuntos de diluciones enzimáticas de 4 x 0,6 log (comenzando por 4U de Sau3A en una dilución de ADN de 20 \mul). Entonces se sometieron a electroporación las 20 ligaciones separadas en RN4220 de S. aureus, se mezclaron, se incubaron durante 2 h y se colocaron en placas sobre BHI que contenía 5 \mug/ml de cloranfenicol. Se muestrearon aproximadamente 20.000 colonias (100 placas con 200 colonias) en cuanto a la luz en presencia de aldehído exógeno. Esto resulto en el aislamiento de 73 transformantes altamente bioluminiscentes (pMK4luxABSa1-Sa73; abreviados como Sa1 - Sa73 en la siguiente tabla 2).

Se purificaron las colonias de estos aislados y se clasificaron en base a su bioluminiscencia sobre placas con LB en presencia de vapor de aldehído. Se colocó cada placa bajo la cámara CCD y se puntuaron durante una monitorización continua (es decir, sin recogida de datos). La puntuación fue ordenada como: fuera de escala: FE (la sensibilidad de la cámara cambiando automáticamente al número indicado), Muy alta: MA (en los límites superiores de la detección normal de la cámara a una sensibilidad de 10); alta: A (algunas zonas con parpadeos rojos continuos); media: M (frecuencia alta de los picos); baja: B (frecuencia baja de los picos)

TABLA 2

3

C. Adición de genes luxCDE a pMK4luxAB para generar vectores lanzadera pCOMOR G+1 (pMRK4)

Se introdujeron genes luxCDE en pMK4luxABSa1-Sa6 para generar la familia de plásmidos pMK4luxABCDESa1-Sa6 (renombrada pCMOR G+1 Sa1-Sa6 o pMK4 luxABCDEP1-P6) como sigue: Se volvieron a amplificar plásmidos Sa1-Sa6 en DH5\alpha de E. coli y se cortaron con SalI. Entonces se ligaron individualmente estos digestos con luxCDE cortado con Xho I/SalI (con el sitio XhoI en el extremo 5' y el sitio Sal I en el extremo 3' del casete de luxCDE), que fue amplificado por PCR (35 ciclos de 95ºC 30''; 50ºC 1' y 72ºC 3') desde pSK luxCDE usando los cebadores inversos M13 (-20) y M 13 (Véase, p.ej., "1999 Stratagene Catalog". Página 320 para las secuencias). En la figura 1 se ilustra un mapa representativo de los plásmidos resultantes (menos las EES Sa1-Sa6, con el sitio de inserción BamH I sustituido para las secuencias Sa1-6 mostradas en su lugar).

Se sometieron a electroporación las seis ligaciones en RN4220 de S. aureus, se colocaron sobre placas de LB que contenían 5 \mug/ml de cloranfenicol y se muestrearon las colonias resultantes en cuanto a la luz en ausencia de aldehído exógeno. Curiosamente, los niveles de bioluminiscencia registrados de los transformantes de luxABCDE Sa1-Sa6 difirieron de los correspondientes transformantes de luxAB. Las SEE que dieron como resultado los niveles más bajos de bioluminiscencia en el constructo de luxAB pMK4 (Sa2) produjeron la señal más luminosa cuando se usó el constructo luxABCDE.

Los plásmidos que proporcionaron la mayor luz en RN4220 de S. aureus, pMK4 luxABCDE Sa2 (pCMOR G+1 Sa2) y pMK4 luxABCDE Sa4 (pCMOR G+1 Sa4), fueron minipreparados y sometidos a electroporación en el aislado patógeno 8325-4 de S. aureus. Los transformantes resultantes fueron altamente bioluminiscentes (niveles elevados en comparación con los alcanzados con bacterias Gram-negativas modificadas genéticamente). El plásmido pMK4 luxABCDE Sa2 (pCMOR G+1 Sa2; a.k.a. pXGN-lux-1) de la cepa 8325-4 de S. aureus (cepa transformada denominada StaphA-XGN-1) fue depositado el 15 de junio de 1999 en virtud del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el número de acceso: PTA-222.

D. Secuencias de secuencias ampliadoras de la expresión de S. aureus identificadas seleccionadas

Las EES de S. aureus (ejemplo 4B) de pCMOR G+1 Sa2-Sa6 fueron secuenciadas con procedimientos estándar usando el retrocebador luxA (LUXA-REV; SEQ ID Nº: 12: CCA CAC TCC TCA GAG ATG CG) y se presentan a continuación. Cada secuencia finaliza justo secuencia arriba del sitio de inserción del promotor BamH I indicado en la fig. 1 (pCMOR G+1), correspondiendo el último nucleótido de cada secuencia con la primera posición de la secuencia de reconocimiento de BamH I (GGATCC; SEQ ID Nº: 13). Hay que tener en cuenta que sólo una de las EES (Sa1) finalizó con una "G", conservando así la integridad del sitio de BamH I en el constructo final pMK4 luxABCDE Sa1 (a.k.a. luxABCDE P1).

La secuencia del vector entre el sitio de inserción del promotor BamH I y el codón de iniciación ATG (incluido) del casete de luxABCDE es como sigue (SEQ ID Nº: 14): GGA TCC TGC AGA TGA AGC AAG AGG AGG ACT CTC TATG. El sitio de BamH I se indica en negrita y la secuencia de Shine-Dalgarno Gram-positiva y el codón de iniciación ATG en subrayado.

4

La secuencia Sa1 tiene una similitud con las secuencias asociadas con la hidrolasa de la pared celular LytE/papce de Bacillus subtilis (Margot, et al., J. Bact. 180: 769, (1998)).

5

La secuencia Sa2 tiene una similitud limitada con las secuencias asociadas con la proteína YIpC de Bacillus subtilis (número de acceso emb CAA74247; Y13937; gi 2633960), así como con las secuencias asociadas con la proteína PlsX putativa de Bacillus subtilis (números de acceso emb CAA74248; Y13937).

6

La secuencia Sa3 tiene una similitud con las secuencias asociadas con la thioredoxina de Staphylococcus aureus (número de acceso emb CAA11404; AJ223480).

7

La secuencia Sa4 tiene una similitud con las secuencias asociadas con MnhG de Staphylococcus aureus(número de acceso dbj BAA35101; AB015981).

8

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9

La secuencias Sa6 tiene similitud con las secuencias asociadas con la proteína primosómica Dnal Bacsu de Bacillus subtilis (Número de acceso sp P06567; gi 279708).

Los resultados tratados anteriormente indican que el RFEESS es un procedimiento útil para el aislamiento de EES eficaces en el resultado de la bioluminiscencia cuando las EES son ligadas operativamente a genes de luciferasa. Además, los datos proporcionan ejemplos de EES específicas de S. aureus eficaces para producir tal bioluminiscencia.

Ejemplo 5 Evaluación de toxicidad del aldehído en animales

Cuatro ratones fueron inyectados IP a las 0, 2, 4 y 6 horas con volúmenes de 500 \mul de aldehído de n-decilo a concentraciones del 0,1% y 0,01%. Las soluciones de aldehído fueron preparadas como sigue: se diluyeron 100 \mul de aldehído en 900 \mul de etanol. Entonces se diluyeron 10 \mul de esta solución al 10% en 990 \mul de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) pH 7,4 para proporcionar un volumen final del 0,1% de solución de aldehído. Se observaron los animales durante un período de 24 horas. Ninguno de los ratones mostró ningún síntoma aparente de enfermedad o comportamiento anormal tras 24 horas.

Ejemplo 6 Evaluación de pMK4 luxAB Sa3 en S. aureus en cuanto a la bioluminiscencia en ratones

Veinticuatro horas después de las inyecciones iniciales, los cuatro ratones analizados según lo descrito en el ejemplo 5 fueron inyectados con una cepa patógena (8325-4) y una cepa resistente a la metacilina clínica (MRSA) de S. aureus que contenían pMK4 luxAB Sa3. Se cultivaron las cepas de S. aureus a una OD (600 nm) de aproximadamente 0,5 en volúmenes de 10 ml de LB que contenían 5 \mug/ml de cloranfenicol. Se peletizaron las bacterias y se resuspendió cada muestra en 10 ml de PBS estéril. Se volvió a medir la OD de las muestras y se ajustó hasta proporcionar 1 x 10^{5}, 1 x 10^{6} y 1 x 10^{7} células por ml, usando la conversión: # células = (A600)(11,1 x 10^{8}). Se confirmaron las diluciones mediante su colocación sobre placas de chocolate que contenían 5 \mug/ml de cloranfenicol.

Las dosis fueron bien intraperitoneales de 250 \mul (IP; 1 x 10^{5} y 1 x 10^{6} por ml) o intramusculares de 100 \mul (IM; en el muslo con 1 x 10^{6} y 1 x 10^{7} por ml). Los cuatro ratones fueron luego inyectados IP con 500 \mul de aldehído de n-decilo al 0,1%. Se repitió esta administración de aldehído a las 2, 4 y 6 horas, justo antes de realizar la formación de imágenes de la bioluminiscencia. Inmediatamente antes de realizar la formación de imágenes, los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intramuscular (IM) con una mezcla 4:1 de "Ketaset" (Ketamina [Fort Dodge Products] a 100 mg/ml y "Rompumn" (Xilazina para animales pequeños [Darby Drug Company] a 20 mg/ml, a una dosis de 15 \mul por 10 g de peso corporal. Por consiguiente, un ratón de 20 g recibió 30 \mul. La anestesia tuvo efecto comúnmente a los 2-3 minutos, y los animales permanecieron, por lo común, sedados durante 20-30 minutos. En caso necesario, se administró una segunda dosis de 7 \mul por 10 g de peso corporal. En general, los animales se recuperaron a los 60-90 minutos de la administración de una sola dosis. Los animales que habían recibido doble dosis, sin embargo, necesitaron tanto como 4 horas para recuperarse.

Se realizó la formación de imágenes de los ratones esencialmente según lo descrito en Contag, et al., patente estadounidense 5.650.135. Se observó bioluminiscencia a las 0 y 2 horas, indicando que el aldehído administrado exógenamente puede ser usado in vivo para formar imágenes de células transformadas sólo con luxA y luxB. Estos resultados demuestran que el aldehído administrado exógenamente puede difundirse a través del cuerpo, pues una inyección IP de aldehído permite la generación de luz procedente de bacterias luxAB localizadas en el músculo del muslo.

Ejemplo 7 Evaluación de pMK4 luxABCD Sa2 (pCMOR G+1 SA2) en S. aureus en cuanto a la bioluminiscencia en ratones

Se prepararon cepas 8325-4 de S. aureus y MRSA que contenían PCMOR G+1 SA2 (pMK4 luxABCDE Sa2; pXEN-lux-1) según lo descrito en el ejemplo 6 y se analizaron en cuanto a la bioluminiscencia en ratones. Las cepas fueron inoculadas en ratones IP a 100 \mul (4 x 10^{6} por ml) e IM a 100 \mul (4 x 10^{6} por ml en muslo derecho y 4 x 10^{7} por ml en muslo izquierdo) y se monitorizaron a las 0, 4, 6 y 24 horas. Entonces se realizó la formación de imágenes de los ratones según lo descrito anteriormente a los tiempos 0, 4 h, 6 h y 24 h. Ambas cepas fueron visualizadas fácilmente en los animales in vivo.

Ejemplo 8 Construcción del vector lanzadera pDL289 luxABCDE (pCMOR G+2) y evaluación de sus propiedades de bioluminiscencia en Streptococcus pneumoniae A. Construcción del vector lanzadera pDL289 luxABCDE

Se aisló el casete de luxABCDE generado según lo descrito en el ejemplo 3 de pSK^{-}luxABCDE mediante un digesto de BamH I/Sal I, y se clonó en los sitios de BamH I/Xho I del vector lanzadera Gram-positivo/negativo pDL289 (Buckley, N., et al., (1985) J. Bacteriol 177: 5028-5034), generando pDL289 luxABCDE (pCMOR G+2). Como fue el caso del ejemplo 3, la clonación fue llevada a cabo de manera que el sitio de restricción de BamHI fue mantenido secuencia arriba de la región codificante de luxA, pero en este caso, el casete de luxABCDE estaba en la misma orientación que, y secuencia abajo de, el promotor lacZ. Se sometió a electroporación pCMOR G+2 en DH5\alpha de E. coli. Los clones positivos resultantes fueron extremadamente luminosos (pues el casete estaba secuencia abajo del promotor lacZ), con un cultivo puro, permitiendo que la cámara alcanzara una sensibilidad de 4.

B. Muestreo de secuencias ampliadoras de la expresión de fragmentos aleatorios (RFEESS) usando pDL289 luxABCDE (pCMOR G+2)

Se preparó con plásmido uno de los clones positivos identificados en la parte (A) anterior, y se usó el ADN resultante para construir una genoteca de promotores que pudiera ser muestreada en S. pneumoniae. Se cortó ADN genómico de R6 de Streptococcus pneumoniae con Sau3A en un digesto parcial (Ausubel, F.M., et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995)) y se ligó con plásmido pCMOR G-2 cortado con BamHI. Entonces se sometieron a electroporación estas ligaciones en DH5\alpha de E. coli. Los transformantes resultantes fueron mezclados directamente desde placas, se extrajo su ADN plasmídico y se sometió este ADN a electroporación en las células competentes de una cepa encapsulada patógena de Streptococcus pneumoniae.

Entonces se muestrearon aproximadamente 20.000 transformantes Gram-positivos sobre placas con chocolate que contenían 250 \mug/ml de kanamicina en cuanto a la bioluminiscencia usando una cámara CCD con contador de fotones (Hamamatsu Photonics, modelo 2400-32) según lo descrito anteriormente. Se recogieron ochenta colonias de intensidad de luz media a alta y se separaron las 21 más luminosas como colonias individuales. Estos 21 aislados fueron monitorizados en cuanto a las lecturas de intensidad de luz a las 24 y 72 horas sobre placas con chocolate que contenían 400 \mug/ml de kanamicina. A las 24 horas, las colonias individuales tenían un diámetro aproximado de menos de 0,5 mm, siendo la luz emitida desde el haz entero. Sin embargo, a las 72 horas, las colonias individuales habían crecido hasta un tamaño comparable con el alcanzado por el crecimiento de E. coli para 16 horas, y eran muy bioluminiscentes, con poca o ninguna luz siendo emitida desde el haz sólido. También se midieron las intensidades de luz desde cultivos líquidos a las 16 h de BHI que contenían 250 \mug/ml de kanamicina (D.O. de 0,5-0,8). Las unidades de luz en el intervalo de los bits (URLB) son iguales a la velocidad del cambio del intervalo de bits (expresada como el intervalo de bits por segundo) en una cámara CCD intensificada de Hamamatsu Photonics modelo 2400-30 conectada a un equipo procesador de imágenes Argus a una ganancia de "cero". En la siguiente tabla 3, se muestra un resumen de esta información:

TABLA 3

10

C. Secuencias de secuencias ampliadoras de la expresión de S. pneumoniae identificadas seleccionadas

Las EES de S. pneumoniae en pDL289 luxABCDE Sp1, 5, 6, 9, 16 y 17 fueron secuenciadas con procedimientos estándar usando el retrocebador luxA (LUXA-REV; SEQ ID Nº: 12) y se presentan a continuación. Cada secuencia finaliza justo secuencia arriba del sitio de inserción del promotor BamH I, correspondiendo el último nucleótido de cada secuencia con la primera posición de la secuencia de reconocimiento de BamH I (GGATCC; SEQ ID Nº: 13). Hay que tener en cuenta que sólo dos de las EES (Sp9 y sP16) finalizaron con una "G", conservando así la integridad del sitio de BamH I en los constructos finales pDL289 luxABCDE Sp9 y pDL289 luxABCDE Sp16 (a.k.a. luxABCDE P1).

La secuencia del vector entre el sitio de inserción del promotor de BamH I y el codón de iniciación ATG (incluido) del casete de luxABCDE es como sigue (SEQ ID Nº: 14): GGA TCC TGC AGA TGA AGC AAG AGG AGG ACT CTC TATG. El sitio de BamH I se indica en negrita y la secuencia de Shine-Dalgarno Gram-positiva y el codón de iniciación ATG en subrayado.

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12

La secuencia Sp1 tiene similitud con las secuencias asociadas con la enzima de adición de ácido D-glutámico MurD (murD) de Streptococcus pneumoniae, la undecaprenil-PP-MurNAc-pentapéptido-UPDGIcNAc GIcNAc transferasa (murG), la proteína de división celular DivIB (divIB), la orotidin-5'-descarboxilasa PyrF (pyrF) (Massidda, O., et al., Microbiology 144 (11): 3069-3078 (1998); Número de acceso gb/AF068902).

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13

La secuencia Sp5 tiene similitud con las secuencias asociadas con la UDP-N-acetil-muramoialanina-D-glutamato ligasa de Mycobacterium tuberculosis (UDP-N-acetilmuranoil-L-alanil-D-glutamato sintetasa; enzima de adición de ácido D-glutámico) (Número de acceso sp/O06222; MURD_MYCTU).

14

15

La secuencia Sp9 tiene similitud con las secuencias asociadas con el homólogo de la proteína O de unión a ATP de transporte de cobalto en Methanococcus jannaschii (número de acceso: gi/1591732 y U67551).

16

La secuencia Sp16 tiene similitud con las secuencias asociadas con la cadena alfa de la ADN polimerasa III de Bacillus subtilis (números de acceso gi/1591732 y U67551) y con la ADN polimerasa III de Staphylococcus aureus (número de acceso dbj/BAA13160; D86727).

17

Ejemplo 9 Evaluación de S. pneumoniae transformada con pDL289 luxABCDE Sp1, 5, 6, 9 y 16 en cuanto a la bioluminiscencia en ratones

Se analizaron en ratones los cultivos líquidos de 16 horas de S. pneumoniae que contenían pDL289 luxABCDE Sp1, 5, 6, 9 y 16. Se peletizaron bacterias de 1 ml de cada cultivo, se resuspendieron en 1 ml de PBS, y se inocularon 100 \mul de éste y una dilución 1/10 en el músculo del muslo derecho e izquierdo de un ratón, respectivamente. Se colocó la más baja de cada dilución en placas con agar chocolate que contenía 250 \mug/ml de kanamicina para evaluar las unidades formadoras de colonias (u.f.c. en inoculación; véase la tabla 3 anterior). Se monitorizó cada ratón a los tiempos de 0, 4, 7 y 24 horas durante períodos de 5 minutos bajo la cámara CCD.

Como resulta evidente a partir de los datos de la tabla 3, la S. pneumoniae que contenía pDL289 luxABCDE Sp1, 5 y 6 proporcionó entre 1 x 10^{4} y 6 x 10^{4} u.f.c., con >80% de retención de plásmido. No se recuperó ninguna u.f.c. de Sp9 (probablemente, debido a una trituración ineficaz). Mientras que Sp16 proporcionó 2,5 x 10^{5} u.f.c. con >90% de retención de plásmido.

En base a los datos anteriores, la S. pneumoniae que contenían pDL289 luxABCDE Sp16 fue seleccionada como la mejor cepa candidata para posteriores estudios.

Ejemplo 10 Construcción de Mycobacterium tuberculosis bioluminiscente usando vector lanzadera pCMOR G+3

Se aisló el casete luxABCDE generado según lo descrito en el ejemplo 2 de pSK^{-}luxABCDE mediante un digesto de BamHI/Kpn I, y se clonó en sitios BamHI/Kpn I del vector lanzadera Gram positivo / negativo Psum39 (Ainsa, et al., (1996) Gene 176: 23-26), generando pSUM39 luxABCDE (pCMOR G+3). Según lo anterior, la clonación se lleva a cabo de manera que se mantiene un sitio de restricción de BamH I secuencia arriba de la región codificante de luxA. Cualquier experto en la técnica reconocerá que, en lugar de pSUM39, se podrían usar otros vectores lanzadera Gram-positivo/negativo adecuados para su uso con Mycobacterium tuberculosis, tales como pSUM 40 o pSUM 41 (Ainsa, et al., (1996) Gene 176: 23-26).

Para identificar las secuencias promotoras potencialmente útiles, se corta ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis con Sau3A en un digesto parcial (Ausubel, F.M., et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995) o Sambrook, et al.) según lo descrito anteriormente y se liga con plásmido pCMOR G+3 cortado con BamH I. Entonces se someten a electroporación estas ligaciones en DH5\alpha de E. coli. Los transformantes resultantes son mezclados, se extrae su ADN plasmídico y se somete este ADN a electroporación en células hospedadoras competentes de M. smegmartis. Entonces se recogen los transformantes que han incorporado el vector, se expanden y se somete su ADN a electroporación en células hospedadoras competentes de
M. tuberculosis.

Se muestrean los transformantes Gram-positivos en cuanto a la bioluminiscencia usando una cámara CCD con contador de fotones según lo descrito anteriormente.

Ejemplo 11 Construcción de Listeria monocytogenese bioluminiscente usando vector lanzadera pCMOR G+1

Se corta ADN genómico de Listeria monocytogenes con Sau3A en un digesto parcial (Ausubel, F.M., et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995) o Sambrook, et al.) y se liga con plásmido pCMOR G+1 (ejemplo 4) que había sido cortado con BamH I. Entonces se someten a electroporación estas ligaciones en DH5\alpha de E. coli. Los transformantes resultantes son mezclados, se extrae su ADN plasmídico y se somete este ADN a electroporación en células hospedadoras competentes de Listeria monocytogenes.

Se muestrean los transformantes Gram-positivos en cuanto a la bioluminiscencia usando una cámara CCD con contador de fotones según lo descrito anteriormente.

Ejemplo 12 Identificación de una secuencia promotora Gram-positiva de especies cruzadas

Debido al amplio espectro hospedador de pMK4, se sometió a eletroporación un conjunto de los constructos de pCMOR G+1 que contenían EES de S. aureus (Sa1-6) en una cepa patógena de Listeria monocytogenes (ATCC 23074) para analizar si alguna de las EES de S. aureus induciría a la luz en Listeria. Aunque los seis plásmidos fueron trasladados correctamente a esta cepa de Listeria, se encontró que sólo pCMOR G+1 Sa4 proporcionó niveles significativos de luz, induciendo el resto de los constructos sólo a niveles bajos de bioluminiscencia. Como pCMOR G+1 Sa4 fue capaz de inducir niveles elevados de luz tanto en S. aureus como en L. Monocytogenes, este constructo puede ser usado para transformar otros géneros de bacterias Gram-positivas en un fenotipo de luz.

Ejemplo 13 Comparación de la bioluminiscencia procedente de S. aureus que contiene el luxABCDE modificado con respecto a la de S. aureus que contiene el luxCDABE nativo

Se seleccionó el constructo pCMOR Sa1 de S. aureus (que conservaba el sitio de BamH I entre el promotor y el casete de luxABCDE; véase el ejemplo 4) como el vector inicial para comparar los niveles de bioluminiscencia generados usando el casete de luxABCDE modificado genéticamente con los niveles de bioluminiscencia generados usando el casete de luxCDABE nativo (estando los dos casetes bajo el control del promotor Sa1 de S. aureus). El constructo luxCDABE fue generado como se describe a continuación: primero se aisló el casete de luxCDABE nativo de pSB417 (Winson, et al., 1988, FEMS, 163: 185-202) como un fragmento de BamHI/SalI, y luego se usó este fragmento para reemplazar el correspondiente fragmento BamHI/SalI de luxABCDE sacado de pCMOR Sa1 para generar pMK4 luxCDABE Sa1. La clonación fue llevada a cabo en DH5\alpha de E. coli y el plásmido acabado fue trasladado a RN4220 de S. aureus.

Se comparó la bioluminiscencia generada por los dos casetes distintos usando células DH5\alpha de E. coli transformadas y células RN4220 de S. aureus transformadas, conteniendo cada una bien pCMOR G+1 Sa1 (pMK4 luxABCDE Sa1) o pMK4 luxCDABE Sa1. Se diluyeron cultivos exponenciales de cada una de las cuatro cepas bacterianas por placas de microvaloración de 96 pozos en diluciones dobles (-0,3 log) y se monitorizaron en cuanto a la luz durante un período de 30 min a 37ºC usando una cámara CCD con contador de fotones (Hamamatsu, modelo 2400-32). Entonces se emplacaron los contenidos de cada pozo para permitir la comparación del número de unidades formadoras de colonias (u.f.c.) con los niveles de bioluminiscencia (unidades relativas de luz; URL).

En la figura 2, se muestran los resultados. Ambos casetes luxACDAB y luxABCDE funcionan comparativamente bien en E. coli, pero sólo luxABCDE resultó en una bioluminiscencia significativa en S. aureus. Sa1: luxABCDE produjo aproximadamente 4 veces menos de luz que Sa1:luxCDABE en E. coli. Una explicación posible a este fenómeno es que las eficacias altas de transcripción y traducción pueden tener un alto coste energético y ser así negativas para la célula, conduciendo a una menor bioluminiscencia.

El número mínimo de pCMOR Sa1 de RN4220 de S. aureus detectable a 37ºC usando una cámara CCD modelo 2400-32 de Hamamatsu Photonics fue de aproximadamente 400 u.f.c. Sin embargo, este número mínimo fue significativamente mejorado al usar una cámara CCD integradora enfriada con nitrógeno líquido más sensible (véase el ejemplo 14 que figura a continuación). La cepa de MRSA produjo significativamente más luz (aproximadamente 4 veces más) que bien RN4220 O 8325-4, independientemente del plásmido (pCMOR Sa1-20) analiza-
do.

Los resultados muestran que al usar los procedimientos de la presente invención, es posible generar organismos Gram-positivos capaces de producir más de 1 x 10^{4} URL por 1 x 10^{6} organismos (medidas con una cámara CCD con contador de fotones modelo 2400-32 de Hamamatsu Photonics XEN-3).

Ejemplo 14 Número mínimo de u.f.c. de S. aureus, S. pneumoniae y L. monocytogenes analizadas en cultivo líquido

Se monitorizaron cultivos exponenciales de pCMOR G+1 Sa1 de RN4220 de S. aureus, pCMOR G+1 Sp16 de S. pneumoniae y pCMOR G+1 Sa4 de ATCC23074 de L. Monocytogenes de luz usando una cámara CCD integradora enfriada con nitrógeno líquido altamente sensible (Princenton Instruments, Trenton, NJ; modelo LN/CCD 1340-1300-EB/1) para determinar el número mínimo de u.f.c. detectables de cada una de estas cepas de bacterias. Se diluyeron cultivos en placas de microvaloración de 96 pozos desde concentraciones bacterianas de aproximadamente 10^{3}/pozo a 10^{1}/pozo en diluciones dobles (-0,3 log) y se monitorizaron en cuanto a la luz durante un período de 10 minutos. Sólo se pudieron detectar 80 u.f.c. tanto de S. aureus como de S. pneumoniae a 37ºC usando la cámara de Princeton Instruments, mientras que aproximadamente 400 u.f.c. de L. Monocytogenes fueron detectables mediante el mismo procedimiento.

Ejemplo 15 Estabilidad de la temperatura de bioluminiscencia de S. aureus

Para controlar las bacterias patógenas en animales usando la bioluminiscencia (Contag. C., et al., (1995) Mol. Microbiol. 18: 593-603), es importante que tanto los genes lux como las proteínas lux funcionen adecuadamente a la temperatura corporal (es decir, a alrededor de 37ºC). Para determinar si la modificación de los genes lux había alterado el intervalo de temperatura en el que tiene lugar la bioluminiscencia óptimamente en células bacterianas, se comparó la luz procedente del casete de luxABCDE modificado con la procedente del luxCDABE nativo en bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas entre 31ºC y 47ºC. Como ya se observó previamente que pMK4 luxCDABE Sa1 de RN4220 de S. aureus estaba a oscuras (fig. 2), se analizaron únicamente pCMOR G+1 Sa1 de RN4220 de S. aureus, pCMOR G+1 Sa1 de DH5\alpha de E. coli y pMK4 luxCDABE Sa1 de DH5\alpha de E. coli en este conjunto de experimentos. Se cultivaron cultivos exponenciales de estas tres últimas cepas bacterianas hasta aproximadamente 10^{7} u.f.c./ml a 30ºC y se colocaron volúmenes de 1 ml de cada una en bloques de calentamiento configurados a 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47ºC. Tras dejar que las bacterias se aclimataran y crecieran a cada una de las temperaturas elevadas durante un período de 1 hora, se colocaron consecutivamente los nueve bloques de calentamiento dentro del compartimento de una cámara CCD con contador de fotones (Hamamatsu, modelo 2400-32) y se registró la luz de cada uno de los tres cultivos durante un período de 1 min. Para eliminar los errores en el número de unidades relativas de luz procedentes de las variaciones en los números de bacterias, se colocó cada cultivo en placas para permitir el registro de las u.f.c. y el ajuste de los datos de luz.

Como puede observarse en la figura 5, la luz máxima registrada procedente de un cultivo de pCMOR G+1 Sa1 de RN4220 de S. aureus se produjo a 37ºC. Además, entre 31ºC y 41ºC, la emisión de luz procedente de esta cepa permaneció por encima del 60% de este máximo, incluso a las 2 y 4 horas, lo que indica que las enzimas lux fueron detectables dentro de este intervalo más limitado de temperatura. Por el contrario, tanto pCMOR G+1 Sa1 de DH5\alpha de E. coli como pMK4 luxCDABE Sa1 de DH5\alpha de E. coli produjeron la máxima luz a 41ºC, siendo pCMOR G+1 Sa1 de DH5\alpha de E. coli ligeramente más luminosa a esta temperatura.

\newpage

Ejemplo 16 Transformación y evaluación de Listeria monocytogenes con operones luxABCDE modificados

Se usó un plásmido luxABCDE modificado para transformar correctamente Listeria monocytogenes Gram-positiva, según lo descrito anteriormente en el ejemplo 14. Las bacterias Gram-positivas que portaban un operón luxABCDE modificado eran altamente bioluminiscentes y, además, pudieron ser monitorizadas in vivo en animales. La pérdida de plásmido en ausencia de selección de antibióticos fue demostrada ser mínima desde L. Monocytogenes durante un período de 24 a 48 horas in vivo (>80% de retención de plásmido) con nada de inestabilidad estructural observable.

Todos los plásmidos descritos han sido depositados en Xenogen Corporation, 860 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501.

<110> Francis, Kevin P.

\hskip1cm

Contag, Pamela R.

\hskip1cm

Joh, Danny J.

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<120> CASETES DE EXPRESIÓN DE LUCIFERASA Y PROCEDIMIENTOS DE USO

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<130> PXE-006.PC

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<140>

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<141>

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<160> 26

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sitio de unión al ribosoma Gram-positivo

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggagg

\hfill

6

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XAF3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccggatcc tgcagatgaa gcaagaggag gactctctat g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XAR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggatccg tcgacttaat ataatagcga acgttg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XBF

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattctc gaggaggaga gaaagaaatg aaatttgga

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XBR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggatccg tcgacttagg tatattccat gtggtac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XCF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattctc gaggaggatg gcaaatatga ctaa

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggatccg tcgacttatg ggacaaatac aaggaac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XDF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattctc gaggaggagt aaaagtatgg aaaatga

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XDR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggatccg tcgacttaag acagagaaat tgcttga

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XEF

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattctc gaggaggaaa acaggtatga cttcatatg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador XER

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggatccg tcgacttaac tatcaaacgc ttcggtta

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: LUXA-REV

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacactcct cagagatgcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de reconocimiento de BamH I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de vector

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcctgca gatgaagcaa gaggaggact ctctatg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 645

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pMK4 luxABCDE Sa1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pMK4 luxABCDE Sa2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 623

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pMK4 luxABCDE Sa3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pMK4 luxABCDE Sa4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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21

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 650

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia: pMK4 luxABCDE Sa5

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 677

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pMK4 luxABCDE Sa6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 622

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: pDL289 luxABCDE Sp1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

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24

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 610

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: pDL289 luxABCDE Sp5

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<400> 22

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25

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<210> 23

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<211> 626

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: pDL289 luxABCDE Sp6

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<400> 23

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26

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<210> 24

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<211> 607

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: pDL289 luxABCDE Sp9

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<400> 24

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27

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<210> 25

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<211> 616

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia: pDL289 luxABCDE Sp16

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<400> 25

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28

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<210> 26

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<211> 609

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: pDL289 luxABCDE Sp17

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<400> 26

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29

Claims (18)

1. Casete de expresión que comprende:

Un polinucleótido codificante de los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE de luciferasa dispuestos en el siguiente orden relativo 5'-luxA-luxB-luxC-luxD-luxE-3', en el que (a) la transcripción del polinucleótido resulta en ARN policistrónico codificante de todos los productos génicos; (b) cada uno de los productos génicos luxA, luxB, luxC, luxD y luxE es expresado como un polipéptido individual; y (c) las secuencias de polinucleótido que comprenden secuencias del sitio de unión al ribosoma Gram-positivo están localizadas en 5' con respecto a la totalidad de dichas secuencias codificantes de lux.

2. Casete de expresión de la reivindicación 1, que comprende además un sitio de inserción múltiple localizado en 5' con respecto a dichas secuencias codificantes de luxA, luxB, luxC, luxD y luxE.

3. Casete de expresión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que al menos un sitio de unión al ribosoma Gram-positivo comprende la secuencia presentada como SEQ ID Nº: 1.

4. Casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias codificantes de los productos génicos lux son derivadas de Photorhabdus luminescens.

5. Casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polinucleótido comprende además un promotor localizado en 5' con respecto a la totalidad de dichas secuencias codificantes de lux, resultando la transcripción del polinucleótido en un ARN policistrónico codificante de todos los productos génicos lux.

6. Casete de expresión de la reivindicación 5, en el que dicho promotor está contenido en una secuencia ampliadora de la expresión seleccionada del grupo constituido por Sa1 (SEQ ID Nº: 15), Sa2 (SEQ ID Nº: 16), Sa3 (SEQ ID Nº: 17), Sa4 (SEQ ID Nº: 18), Sa5 (SEQ ID Nº: 19) y Sa6 (SEQ ID Nº: 20).

7. Casete de expresión de la reivindicación 5, en el que dicho promotor está contenido en una secuencia ampliadora de la expresión seleccionada del grupo constituido por Sp1 (SEQ ID Nº: 21), Sp5 (SEQ ID Nº: 22), Sp6 (SEQ ID Nº: 23), Sp9 (SEQ ID Nº: 24), Sp16 (SEQ ID Nº: 25) y Sp17 (SEQ ID Nº: 26).

8. Casete de expresión de la reivindicación 6, en el que dicho promotor está contenido en la secuencia ampliadora de la expresión Sp16 (SEQ ID Nº: 25).

9. Casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el casete de expresión está contenido en un transposón bacteriano.

10. Casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el casete de expresión está contenido en un mini-transposón bacteriano.

11. Casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias codificantes de los productos génicos comprenden codones que son óptimos para la expresión de los productos génicos en un sistema hospedador en el que el casete de expresión va a ser introducido.

12. Vector lanzadera que comprende:

un casete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-11;

un polinucleótido codificante de un marcador seleccionable;

un origen de replicación Gram-positivo; y

un origen de replicación Gram-negativo.

13. Procedimiento de modificación de una bacteria Gram-positiva para que produzca luz, que comprende transformar la bacteria Gram-positiva con un casete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Procedimiento de rastreo de un analito en cuanto a su capacidad de afectar a la expresión de un marcador indicador que comprende:

proporcionar el analito a bacterias Gram-positivas que comprenden el casete de expresión de luciferasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho marcador indicador comprende luciferasa; y

monitorizar el efecto del analito en la capacidad de las bacterias Gram-positivas para producir luz, identificando así si el analito afecta a la expresión del indicador en bacterias Gram-positivas.

15. Procedimiento de la reivindicación 14, que comprende además, antes de monitorizar el efecto del analito, proporcionar un sustrato necesario para la producción de luz de la luciferasa.

16. Procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho sustrato comprende un aldehído, y dicho aldehído es proporcionado como un vapor.

17. Bacteria Gram-positiva que comprende un casete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

18. Bacteria que comprende el vector lanzadera de la reivindicación 12.