CN104673870A

CN104673870A - 固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法

Info

Publication number: CN104673870A
Application number: CN201310631626.8A
Authority: CN
Inventors: 于洪巍; 覃广德; 吕国锋; 陈志荣; 刘浩; 黄国东; 解丕昭
Original assignee: ZHEJIANG NHU PHARMACEUTICAL CO Ltd; SHANGYU XINHECHENG BIO-CHEMICAL Co Ltd; Zhejiang University ZJU; Zhejiang NHU Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG NHU PHARMACEUTICAL CO Ltd; SHANGYU XINHECHENG BIO-CHEMICAL Co Ltd; Zhejiang University ZJU; Zhejiang NHU Co Ltd
Priority date: 2013-11-29
Filing date: 2013-11-29
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-11-29
Also published as: CN104673870B

Abstract

本发明采用固定化酯酶E.coli BioH在非水相体系催化合成维生素A棕榈酸酯。该方法以维生素A醋酸酯与低级醇为原料，先在固定化酯酶E.coli BioH催化下转变成维生素A醇，再与棕榈酸在非水相条件经固定化酯酶E.coli BioH的催化进行酯化反应得到维生素A棕榈酸酯。该方法转化率高达98%以上，酶套用次数可达40次以上，且产品后续分离纯化简单，生产成本较低，有利于实现工业化。本发明方法制备的维生素A棕榈酸酯，外观为淡黄色油状物。采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179～180万IU/g，相当于含量98%～99%，可广泛用作药物、饲料添加剂、食品添加剂等。

Description

固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法

技术领域

本发明涉及维生素A棕榈酸酯的合成方法，特别是固定化酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法。

背景技术

维生素A棕榈酸酯已被广泛用作药物、食品添加剂和饲料添加剂等，已有多种合成方法的相关报道，这些方法包括由维生素A醇或维生素A低级脂肪酸酯为原料制备维生素A棕榈酸酯的方法，涉及多种反应路线。

日本专利JP 62,248495公开的合成路线为：维生素A醋酸酯和棕榈酸在脂肪酶的作用下得到维生素A棕榈酸酯；英国专利GB 816224公开的合成路线为：维生素A醋酸酯和棕榈酸烷基酯在甲醇钠的作用下得到维生素A棕榈酸酯；英国专利GB 1293041公开的合成路线为：维生素A醇和棕榈酰氯在三乙胺的存在下得到维生素A棕榈酸酯；国内专利CN 102363606 A公开的合成路线为：维生素A醇与卤代酰胺反应得到维生素A卤代物，卤代物与棕榈酸盐溶解反应制得到维生素A棕榈酸酯。

上述制备维生素A棕榈酸酯的方法具有下列问题：

日本专利JP 62,248495公开的方法：通过脂肪酶催化，由维生素A醋酸酯与棕榈酸反应制成维生素A棕榈酸酯。反应可以在室温下进行，但是该酶催化的方法必须在较低的浓度下进行，生产能力低，维生素A棕榈酸酯转化率一般在80%左右并且反应产物中含有脂肪酶和维生素A醋酸酯等，使后续分离较困难，难以得到高质量高收率的维生素A棕榈酸酯。

英国专利GB 816224公开的方法：棕榈酸烷基酯与维生素A醇的酯交换反应是一个可逆反应，反应过程生成的烷基醇必须及时蒸馏除去才能打破平衡，因此反应很难进行完全。由于反应是在碱性和加热的条件下进行，会导致反应产物颜色较深，质量和稳定性较差。

英国专利GB 1293041公开的方法：维生素A醇与棕榈酰氯反应制备维生素A棕榈酸酯。此方法在有机碱存在下进行反应，产品的收率一般在94%左右，因为维生素A醇高度不稳定，在酰氯等酸性介质及高温的条件影响下容易被破坏形成脱水维生素A 和顺式维生素A酯，因而产品热稳定性较差。

国内专利CN 102363606 A公开的方法：维生素A醇与卤代酰胺反应得到维生素A卤代物，卤代物与棕榈酸盐溶解反应制得到维生素A棕榈酸酯。该方法在反应过程使用卤族原料及吡啶，反应条件较酰氯法温和，收率可达95%，但产品由于卤族离子的残留对产品的热稳定性有较大影响。

发明内容

针对文献报道的维生素A棕榈酸酯合成方法中所存在的问题，本发明的目的是提供一种收率高、纯度高、能耗低、对环境友好的生物酶催化合成维生素A棕榈酸酯方法。

一种固定化酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，该方法包括：

以维生素A醋酸酯和低级醇为原料，在固定化酯酶E.coli BioH催化下，于20-60℃、减压蒸馏条件下进行酯交换反应直到维生素A醋酸酯残留低于0.5%，反应液过滤得到的固定化酯酶E.coli BioH回用，滤液减压下蒸出过量低级醇，得到高纯度的维生素A醇；将上述维生素A醇与棕榈酸在有机溶剂中经固定化酯酶E.coli BioH催化，在减压蒸馏条件下于20～60℃进行酯化反应至维生素A醇转化率达到99.0%以上，反应液冷却、过滤得到的固定化酯酶E.coli BioH和过量棕榈酸回用，滤液减压下蒸出有机溶剂，得到维生素A棕榈酸酯。

所述的固定化酯酶E.coli BioH，基因信息及来源由以下公开发表文献获得：Tang Xiaoling,Liu Ji,Yu Hongwei^*,Cloning,screening and characterization of enantioselective ester hydrolases from Escherichia coli K-12,World Journal of Microbiology and Biotechnology,2011(27),129-136.

所述的固定化酯酶E.coli BioH的固定化方法来自以下公开发表文献：Ren Gangfeng,Yu Hongwei^*,Oriented adsorptive immobilization of esterase BioH based on protein structure analysis,Biochemical Engineering Journal,2011(53),286-291.

优选地，固定化酯酶E.coli BioH中E.coli BioH酶的重量含量为15～25%，这时酶的含量高，而且酶与载体结合牢固。

优选地，所述的酯交换反应的维生素A醋酸酯、低级醇、固定化酯酶E.coli BioH投料比例为100g:500～2000mL:10～100g。适当过量的低级醇不仅能促进反应往正方向进行，也可以作为反应溶剂有效分散维生素A醋酸酯和固定化酯酶E.coli BioH；但低级醇过量太多降低了设备利用率，也使反应物、催化剂浓度降低，不利于反应进行；固定化酯酶E.coli BioH用量增加有促进反应的作用，但过多则不利于分散。

优选地，所述的酯化反应维生素A醇、棕榈酸、有机溶剂、固定化酯酶E.coli BioH投料比为100g:90～180g:800～2000mL:10～100g。适当过量的棕榈酸能促进反应往正方向进行，但过量太多则不利于回收；有机溶剂用于分散反应物和固定化酯酶E.coli BioH，用量太多降低了设备利用率，也使反应物、催化剂浓度降低，不利于反应进行；固定化酯酶E.coli BioH用量增加有促进反应的作用，但过多则不利于分散。

优选地，所述的酯交换反应或酯化反应的反应温度为25℃～40℃，能最好地保持固定化酯酶E.coli BioH的活性。

所述酯交换反应的低级醇为甲醇、乙醇的至少一种，生成的醋酸酯沸点低，容易蒸出；所述酯化反应的有机溶剂为戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、二氯甲烷、甲苯中的至少一种，减压蒸馏时有较好的带水能力，且不与水相溶。

本发明采用维生素A醋酸酯先与低级醇经过充分酯交换反应得到维生素A醇和醋酸低级醇酯，维生素A醇再与棕榈酸酯化反应，得到维生素A棕榈酸酯。醋酸低级醇酯在酯交换反应过程中通过与低级醇一起蒸出，得到高纯度的维生素A醇；维生素A醇与棕榈酸酯化反应，其副产物为水，通过有机溶剂蒸馏带水的方式，加速反应正向进行。

本发明的技术方案避免酶与酸性、碱性物质接触而造成酶结构的破坏，从而大大提高了酶的套用次数，降低酶的使用成本；酶固定化后，经过简单的过滤就能与反应液分离，避免了酶的流失以及维生素A棕榈酸酯被酶污染。生产过程中反应条件温和、能耗低、无废水、转化率高，同时产品纯度高、稳定性好，避免了前述维生素A棕榈酸酯合成方法存在的缺陷。

本发明方法制备的维生素A棕榈酸酯，外观为淡黄色油状物。采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179～180万IU/g，相当于含量98%～99%，可广泛用作药物、饲料添加剂、食品添加剂等。

附图说明

图1为维生素A棕榈酸酯转化率与固定化酯酶E.coli BioH套用次数的关系图，表明酶套用40次以上仍然保持相同的活性。

具体实施方式

本发明实施例使用的固定化酯酶E.coli BioH，固定化方法来自以下公开发表文献： Ren Gangfeng,Yu Hongwei^*,Oriented adsorptive immobilization of esterase BioH based on protein structure analysis,Biochemical Engineering Journal,2011(53),286-291.

对比例

在1000ml的四口烧瓶中，将30g维生素A醋酸酯和23.4g棕榈酸溶解于500ml正己烷，加入6g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%），在35℃下反应6个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为96.56%，反应较慢，转化率低。

实施例1 维生素A醇的合成

在1000ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和400ml乙醇，再加入6g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为15%），在35℃、-0.08MPa减压蒸馏条件下反应18个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.43%。

实施例2 维生素A醇的合成

在1000ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和400ml乙醇，再加入18g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%），在40℃、-0.07MPa减压蒸馏条件下反应10个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.39%。

实施例3 维生素A醇的合成

在1000ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和600ml甲醇，再加入18g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%），在20℃、-0.08MPa减压蒸馏条件下反应16个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.21%。

实施例4 维生素A醇的合成

在1000ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和600ml甲醇，再加入30g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为25%），在35℃、-0.075MPa减压蒸馏条件下反应3个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.32%。

实施例5 维生素A醇的合成

在1000ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和150ml甲醇，再加入3g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为25%），在60℃、-0.03MPa减压蒸馏条件下反应18个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.34%。

实施例6 维生素A醇的合成

在1000ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和300ml甲醇，再加入6g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为25%），在50℃、-0.05MPa减压蒸馏条件下反应8个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.39%。

实施例7 维生素A醇的合成

在1000ml的四口烧瓶中，加入40g维生素A醋酸酯和600ml甲醇，再加入8g固定化酯酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%），在35℃、-0.075MPa减压蒸馏条件下反应8个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.41%。反应毕，过滤，滤液在35℃、-0.075～-0.099MPa条件下，减压蒸出过量甲醇，得到维生素A醇34.55g，经HPLC测试，含量为99.53%，收率99.08%。

实施例8 维生素A棕榈酸酯的合成

取按照实施例7的方法制得维生素A醇30g，加入600ml正己烷溶解，溶解毕，再加入棕榈酸30g和30g固定脂肪酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%）。在30℃、-0.08MPa减压蒸馏条件下反应4个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.33%。反应毕，将反应液冷却至-5℃，过滤得到过量棕榈酸和固定脂肪酶E.coli BioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.05～-0.099MPa、50℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品53.96g，收率为98.18%。采用美国药典USP28的方法进行分析，其效价为179.5万IU/g。

实施例9 维生素A棕榈酸酯的合成

取按照实施例7的方法制得维生素A醇30g，加入600ml环己烷溶解，再加入棕榈酸27g和30g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%）。在35℃、-0.08MPa减压蒸馏条件下反应7个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.56%。反应毕，将反应液冷却到20℃，过滤得到固定脂肪酶E.coli BioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.06～-0.099MPa、55℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品53.46g，收率为97.25%。采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179.2万IU/g。

实施例10 维生素A棕榈酸酯的合成

取按照实施例7的方法制得维生素A醇30g，加入240ml正庚烷溶解，再加入棕榈酸27g和3g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为25%）。在60℃、-0.075MPa减压蒸馏条件下反应12个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.58%。反应毕，将反应液冷却到20℃，过滤得到固定脂肪酶E.coli BioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.07～-0.099MPa、60℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品53.67g，收率为97.63%。采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179.1万IU/g。

实施例11 维生素A棕榈酸酯的合成

取按照实施例7的方法制得维生素A醇30g，加入600ml正戊烷溶解，再加入棕榈酸60g和15g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为15%）。在20℃、-0.04MPa条件下反应10个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.58%。反应毕，将反应液冷却至-10℃，过滤得到过量棕榈酸和固定脂肪酶E.coli BioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.03～-0.099MPa、30℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品53.76g，收率为97.80%，采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为180.0万IU/g。

实施例12 维生素A棕榈酸酯的合成

取按照实施例7的方法制得维生素A醇30g，加入600ml环戊烷溶解，再加入棕榈酸45g和15g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为15%）。在30℃、-0.05MPa条件下反应9个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.52%。反应毕，将反应液冷却至-10℃，过滤得到过量棕榈酸和固定脂肪酶E.coli BioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.03～-0.099MPa、40℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品53.65g，收率为97.72%，采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179.7万IU/g。

实施例13 维生素A棕榈酸酯的合成

取按照实施例7的方法制得维生素A醇30g，加入240ml正辛烷溶解，再加入棕榈酸27g和10g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为25%）。在60℃、-0.09MPa减压蒸馏条件下反应7个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.51%。反应毕，将反应液冷却到20℃，过滤得到固定脂肪酶E.coli BioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.09～-0.099MPa、60℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品53.79g，收率为97.69%。采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179.2万IU/g。

实施例14 维生素A棕榈酸酯的合成

取按照实施例7的方法制得维生素A醇30g，加入600ml二氯甲烷溶解，再加入棕榈酸50g和30g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%）。在25℃、-0.04MPa条件下反应12个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.38%。反应毕，将反应液冷却至-15℃，过滤得到过量棕榈酸和固定脂肪酶E.coliBioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.03～-0.099MPa、30℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品53.87g，收率为98.19%，采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179.6万IU/g。

实施例15 催化剂的套用次数（见图1）

将30g维生素A醋酸酯和600ml甲醇，加入装有6g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%）的反应瓶，在35℃、-0.075MPa减压蒸馏条件下反应11个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.38%。反应毕，过滤，滤液在35℃、-0.075～-0.099MPa条件下，减压蒸出过量甲醇，得到维生素A醇25.66g，经过液相色谱测试，含量为99.0%，收率98.09%。将所制得的维生素A醇加入500ml甲苯溶解，再加入棕榈酸23.4g，6g固定化脂酶E.coli BioH（酯酶E.coli BioH的重量含量为20%）。在40℃、-0.09MPa减压蒸馏条件下反应16个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素A醇的残留为0.29%。反应毕，将反应液冷却到10℃，过滤得到固定脂肪酶E.coli BioH滤饼，可直接套用到下一次反应过程。将滤液在-0.08～-0.099MPa、60℃条件下减压浓缩得淡黄色维生素A棕榈酸酯成品46.68g。采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179.6万IU/g，收率为97.40%（以维生素A醋酸酯计）。

本发明采用的测定转化率和含量的方法：

取1mL未分离的上层反应清液，用100%甲醇准确定容至10mL，该溶液经0.22μm 有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。

HPLC条件：Agilent Technologies 1200系列高效液相色谱液

色谱柱：Grace Prevail Organic Acid 5u150mm×4.6mm

柱温：30℃，流动相：100％甲醇，流速：1mL/min

进样量：20μL，检测波长：325nm。

Claims

1.一种固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，其特征在于，包括：以维生素A醋酸酯和低级醇为原料，在固定化酯酶E.coli BioH催化下，于20～60℃、减压蒸馏条件下进行酯交换反应直到维生素A醋酸酯残留低于0.5%，反应液过滤得到的固定化酯酶E.coli BioH回用，滤液减压下蒸出过量低级醇，得到维生素A醇；将上述维生素A醇与棕榈酸在有机溶剂中经固定化酯酶E.coli BioH催化，在减压蒸馏条件下于20～60℃进行酯化反应至维生素A醇转化率达到99.0%以上，反应液冷却、过滤得到的固定化酯酶E.coli BioH和过量棕榈酸回用，滤液减压下蒸出有机溶剂，得到维生素A棕榈酸酯。

2.根据权利要求1所述的固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，其特征在于，酯交换反应的低级醇为甲醇、乙醇中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，其特征在于，酯化反应的有机溶剂为戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、二氯甲烷、庚烷、辛烷、甲苯中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，其特征在于，固定化酯酶E.coli BioH中E.coli BioH酶的重量含量为15～25%。

5.根据权利要求1或4所述的固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，其特征在于，酯交换反应的维生素A醋酸酯、低级醇、固定化酯酶E.coli BioH投料比例为100g:500～2000mL:10～100g。

6.根据权利要求1或4所述的固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，其特征在于，酯化反应维生素A醇、棕榈酸、有机溶剂、固定化酯酶E.coli BioH投料比为100g:90～180g:800～2000mL:10～100g。

7.根据权利要求1所述的固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，其特征在于，所述的酯交换反应或酯化反应的反应温度为25℃～40℃。