KR101700909B1 - 장쇄 레티닐 에스테르 제조를 위한 2상 반응 시스템 및 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법 - Google Patents

장쇄 레티닐 에스테르 제조를 위한 2상 반응 시스템 및 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산으로부터 에스테르 교환반응을 통해 장쇄 레티닐 에스테르 제조시 유기용매 상과 수용액 상으로 이루어진 2상 반응계를 이용하여 에스테르 교환반응의 전이율을 증가시켜 높은 순도로 장쇄 레티닐 에스테르를 제조할 수 있도록 한 2상 반응 시스템 및 제조방법에 관한 것이다.

Description

장쇄 레티닐 에스테르 제조를 위한 2상 반응 시스템 및 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법{Two-phase reaction system for production of long chain retinyl ester and Preparation Method of ong chain retinyl ester}
본 발명은 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산으로부터 에스테르 교환반응을 통해 장쇄 레티닐 에스테르 제조시 유기용매 상과 수용액 상으로 이루어진 2상 반응계를 이용하여 에스테르 교환반응의 전이율을 증가시켜 높은 순도로 장쇄 레티닐 에스테르를 제조할 수 있도록 한 2상 반응 시스템 및 제조방법에 관한 것이다.
레티놀(retinol, 비타민 A)과 레티놀 유도체는 주름개선 및 항산화 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 그에 따라 화장료 조성물로 오랫동안 사용되어 왔다. 그러나 레티놀은 피부자극성을 가져 고농도로 사용하는 경우 피부염 등의 부작용이 발생할 수 있으며 산화적 스트레스에 쉽게 손상되는 특성이 있어 화장료 조성물로 사용 시 보존기간에 제약이 발생한다. 따라서 보다 안정하고 자극성이 적은 다양한 레티놀 유도체가 레티놀의 대안으로 요구되고 있다.
레티놀 유도체로서 높은 활용가치를 지닌 장쇄 레티닐 에스테르의 경우 레티놀과 카르복시산을 화학적으로 반응시켜 에스테르화 하거나 효소를 이용하여 단쇄 레티닐 에스테르로부터 에스테르 교환을 통해 합성하는 연구가 진행되어왔다. 그러나 레티놀을 바로 에스테르화에 사용하는 것은 레티놀이 산화에 약한 특성 때문에 원료의 보존이나 반응과정에서 손실되어 최종 산물의 순도가 낮아질 위험을 감수해야 한다는 점에서 제약이 있다. 그에 따라 박테리아나 효모로부터 생산된 지질분해 효소를 고정화하여 보다 온화한 조건에서 반응을 수행하는 공정들에 대한 연구가 활발히 진행중이다. 고정화 지질분해효소를 레티닐 에스테르 합성반응에 활용하는 것은 효소의 회수 및 반복사용에 의한 원가절감, 반응속도의 조절, 반응장소의 분리에 따른 반응공정의 간편화등 다양한 이점이 있다.
한편, 단쇄 레티닐 에스테르인 레티닐아세테이트 등으로부터 에스테르 교환을 통해 장쇄 레티닐 에스테르를 합성하는 경우에는 반응 중 발생하는 단쇄 카르복시산(아세테이트 등)이 장쇄 카르복시산에 대한 경쟁적 억제제로 작용하므로 최종 수율을 감소시키는 원인이 된다. 특히, 화장품 분야의 조성물 원료로는 매우 높은 단가를 가지는 고순도 장쇄 카르복시산을 사용해야 하는 본 반응의 특성상 합성시의 순도가 단가경쟁력에 있어 매우 중요한 요소이다. 그러나 기존의 단일상을 반응용매로 사용하는 공정의 경우 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산을 1:1 비율로 반응에 사용하는 경우 전이율이 40-50%(mol/mol)에 불과하고 추가로 전이율을 증가시키기 위하여는 1:3의 비율까지 장쇄 카르복실산의 첨가량을 증가시킬 필요가 있다. 물론, 최초 기질의 카르복시산 비율을 증가시키는 경우 단쇄 레티닐 에스테르에 대한 전이율은 증가하지만 최종 생성물에 존재하는 장쇄 카르복시산에 의해 오히려 순도가 감소하게 된다. 결과적으로 낮은 순도의 장쇄 레티닐 에스테르를 산업적 활용가치가 높은 고순도로 만들기 위해서는 유독한 유기용매 및 고가의 고정상을 이용한 크로마토그래피 정제와 추가적인 분획 공정을 수행해야 하는 실정으로, 이는 2차적인 수율감소의 원인이 된다. 결론적으로 장쇄 레티닐 에스테르의 생산단가 절감을 위해서는 에스테르교환이 종료되는 시점에서 높은 순도의 장쇄 레티닐 에스테르를 얻을 수 있는 공정을 개발하는 것이 시급한 실정이다.
미국 등록특허 7,566,795호 미국 등록특허 6,406,735호 중국특허공개공보 102424662호 미국 등록특허 제8,030,352호 국제특허공개공보 WO 2008045185호
Thierry Maugard et. al. (2000) Study of Vitamin Ester Synthesis by Lipase-Catalyzed Transesterification in Organic Media, Biotechnol. Prog. 16, 358-362 Zhu Kai et. al. (2011) Synthesis of Retinyl Palmitate Catalyzed by Candida sp.99-125 Lipase Immobilized on Fiber-Like SBA-15 Mesoporous Material, Journal of Nanoscience and Nanotechnology Vol. 11, 7593-7602 Fadi Ataya et. al. (2006) Single-Phase and Two-Phase Base-Catalyzed Transesterification of Canola Oil to Fatty Acid Methyl Esters at Ambient Conditions, Ind. Eng. Chem. Res. 45 (15), pp 5411-5417 Michel Goldberg et. al. (1990) The control of lipase-catalysed transesterification and esterification reaction rates - Effects of substrate polarity, water activity and water molecules on enzyme activity Eur. J. Biochem. 190, 603-609 Patrick Adlercreutz et. al. (1994) Enzyme-catalysed Lipid Modification, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 12:1, 231-254
본 발명의 과제는 장쇄 레티닐 에스테르 제조시 지질분해 효소를 매개로 하는 단쇄 레티닐 에스테르와 고순도 카르복시산 간의 에스테르 교환반응에 있어서 전이율을 높이기 위한 2상 반응시스템 및 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 에스테르 교환반응에서 생성된 산물의 정제를 최소화 하기 위한 2상 반응시스템 및 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법을 개발하는 것이다.
상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명은
단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매와 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산의 에스테르교환 반응을 유도하는 지질분해효소를 포함하는 유기용매 상과,
상기 에스테르교환 반응의 부산물로 생성되는 단쇄 카르복시산을 회수하기 위한 수용액 상을 포함하고,
상기 유기용매 상과 수용액 상은 상호 연결되어 서로 순환되도록 구성되는 장쇄 레티닐 에스테르 제조를 위한 2상 반응 시스템을 제공한다.
또한 본 발명은
단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매와 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산의 에스테르교환 반응을 유도하는 지질분해효소를 포함하는 유기용매 상을 준비하는 단계와,
상기 유기용매 상과 상호 연결되며, 상기 에스테르교환 반응의 부산물로 생성되는 단쇄 카르복시산을 회수하기 위한 수용액 상을 준비하는 단계와,
단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매를 지질분해효소와 반응시켜 에스테르교환 반응을 통해 장쇄 레티닐 에스테르를 제조하는 단계와,
상기 지질분해효소와 반응한 유기 용매를 수용액 상과 접촉시켜 에스테르교환 반응의 부산물로 생성된 단쇄 카르복시산을 제거하는 단계와,
상기 수용액과 접촉한 유기용매를 다시 유기용매 상으로 순환시키는 단계
를 포함하는 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법은 지질분해효소로 인해 생성되는 부산물인 단쇄 카르복시산을 수용액 상을 통과시키는 과정에서 제거할 수 있으며, 이를 통해 반응액 중의 단쇄 레티닐 에스테르의 평형농도를 높임으로써 추가적인 반응이 가능하게 한다. 이는 장쇄 카르복시산의 몰농도가 단쇄 레티닐 에스테르와 동일한 경우에 있어서 전이율이 40-50%에 불과하던 기존의 단일용매를 이용하는 장쇄 레티닐 에스테르 생산 방법과는 달리, 2상 반응시스템을 이용한 순환식 반응공정을 통해 지속적으로 부산물인 단쇄 카르복시산을 제거할 수 있다. 따라서 원료인 단쇄 레티닐 에스테르의 활용을 극대화하여 반응조건에 따라서는 전이율을 95% 이상 증가시키는 것이 가능하다.
또한 반응 생성물의 경우 잔류하는 단쇄 레티닐 에스테르, 장쇄 카르복시산, 단쇄 카르복시산이 거의 존재하지 않기 때문에 추가적인 정제공정을 최소화할 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 2상 반응시스템의 모식도이다.
도 2는 지질분해효소의 공정별 배양 시간에 따른 레티닐 에스테르의 생산량을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 순환식 액체-액체 2상 반응 시스템을 이용하여 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산으로부터 장쇄 레티닐 에스테르를 제조함으로써, 기존의 반응에 비하여 기질을 효율적으로 반응에 사용하여 전이율과 합성 산물의 순도를 높일 수 있는 반응시스템 및 제조방법을 제시한다.
본 발명의 2상 반응시스템은 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매와 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산의 에스테르교환 반응을 유도하는 지질분해효소를 포함하는 유기용매 상과, 상기 에스테르교환 반응의 부산물로 생성되는 단쇄 카르복시산을 회수하기 위한 수용액 상을 포함한다.
상기 2상 반응 시스템은 친수성 물질은 수용액 상으로, 소수성 물질은 유기용매 상으로 분리하는 것이 가능하다는 특성이 있다. 따라서 장쇄 레티닐 에스테르를 합성하는 과정에서 발생하는 부산물인 단쇄 카르복시산은 수용액 상으로 분리하고 반응에 사용되지 못한 잔여 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산은 다시 유기용매 상으로 회귀시키는 순환공정을 통해 장쇄 레티닐 에스테르의 전이율을 극대화시킬 수 있다. 이러한 공정에서는 원료의 이용효율이 높아질 뿐만 아니라 반응이 완료된 유기용매 상에 불순물이 존재하지 않기 때문에 별도의 정제과정이 필요하지 않아 경제적이다.
상기 유기용매 상과 수용액 상은 상호 연결되어 서로 순환되도록 구성된다. 즉, 유기용매 상과 수용액 상은 서로 구별될 수 있는 상태에서 접해 있다. 일 예로, 유기용매 상과 수용액 상은 하나의 반응용기 내에 순차적으로 층을 이루거나, 반투과성 소재를 사이에 두고 위치하여, 서로 연결되어 있으나 서로 혼합되지 않은 상태에 있을 수 있다. 또한, 수용액 상과, 유기용매 상에 존재하는 에스테르교환 반응의 반응물과 생성물은 물리적 또는 화학적 특성, 농도 차에 의한 확산, 또는 물리적 교반으로 인해 상호 이동될 수 있다.
상기 지질분해효소는 미생물 유래의 지질분해효소로서 칸디다 속(Candida sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 또는 무코 속(Mucor sp.) 유래 효소로서 지질 분해활성이 높은 균주를 배양하여 정제 후 사용할 수 있다. 뿐만 아니라 상기 기술된 미생물 이외 유래 효소 혹은 유전공학적으로 재조합된 효소를 생성하는 미생물로부터 생산, 정제하여 얻은 효소를 사용하거나 그 외 상용화된 지질분해 효소도 사용할 수 있다.
바람직하기로, 지질분해효소는 담체에 물리적 흡착방법 또는 화학적 결합을 통해 고정된 고정화 효소를 사용한다. 이때 고정화 효소는 졸(sol) 혹은 겔(gel) 형태의 고점성 물질과 함께 고정화 되거나, 실리카, 다공성 유리 비드, 조절-동공 유리(controlled-pore glass), 다공성 세라믹, 다공성 알루미나 또는 다공성 티타니아인 등의 담체에 흡착(adsorption), 이온결합(ionic interaction)되거나, 에폭시, 아미노에폭시, 1,2-디올, 에틸아미노, 헥사메틸아미노 작용기를 가지는 작용기에 공유결합하거나, 글루타르알데히드, 디카르복시산, 톨루엔 디이소시아네이트, 폴리아민, 폴리에틸렌이민, 폴리스티렌 설포네이트, 그 외 다양한 인산화합물 등을 이용하여 상호결합(cross-linking)하거나, 카라기난, 헥사메틸렌 디아민 등의 폴리머 지지체(support)를 이용하여 포괄 고정화(entrapment)하거나, 나일론, 셀룰로오스 니트레이트, 실리카 기재 나노기공 졸-겔 유리(Silica based nanoporous sol-gel glasses) 등을 이용한 캡슐화(encapsulation)하는 과정으로 고정화된 것을 포함하나, 상기 서술한 내용에만 국한되는 것은 아니다.
지질분해효소는 수분이 없는 환경에서는 에스테르화 반응이나 에스테르교환반응을 수행하나, 수분함량이 높은 자연계에서는 트리애실글리세롤 등의 에스테르화합물을 분해하여 카르복시산과 알코올을 생성하는 가역적 반응을 수행한다. 따라서, 효율적으로 장쇄 레티닐 에스테르 합성을 위해서는 고정화하여 수용액 상과 분리하여야 하며, 필요에 따라서는 반응액에 잔류하는 소량의 수분까지 제거하기 위해 K2SO4나 Na2SO4 등의 염이 내부에 충진된 탈수장치를 통과시키는 공정을 추가하여야 한다. 이에 본 발명의 지질분해효소는 유기용매 상 내에 별도로 구획 형성된 반응기 내에 수용되는 것이 바람직하다. 이때 상기 반응기는 유기용매 상과 연통되어, 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해되어 있는 유기용매를 공급받는다. 바람직하기로, 상기 반응기로 공급되기 이전에 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해되어 있는 유기용매는 탈수처리된다.
본 발명의 순환식 액체-액체 2상 반응 시스템을 이용한 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법은,
단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매와 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산의 에스테르교환 반응을 유도하는 지질분해효소를 포함하는 유기용매 상을 준비하는 단계와,
상기 유기용매 상과 상호 연결되며, 상기 에스테르교환 반응의 부산물로 생성되는 단쇄 카르복시산을 회수하기 위한 수용액 상을 준비하는 단계와,
단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매를 지질분해효소와 반응시켜 에스테르교환 반응을 통해 장쇄 레티닐 에스테르를 제조하는 단계와,
상기 지질분해효소와 반응한 유기 용매를 수용액 상과 접촉시켜 에스테르교환 반응의 부산물로 생성된 단쇄 카르복시산을 제거하는 단계와,
상기 수용액과 접촉한 유기용매를 다시 유기용매 상으로 순환시키는 단계
를 거쳐 제조된다.
상기 장쇄 레티닐 에스테르는 12개 이상의 탄소수를 갖는 카르복시산과 레티놀의 에스테르화물을 의미한다. 대표적인 예로, 레티닐 리놀레이트(retinyl linoleate), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티닐 리놀리네이트(retinyl linolenate), 레티닐 올레이트(retinyl oleate) 등이 가능하다.
본 발명의 제조방법에서 반응기질로 사용되는 단쇄 레티닐 에스테르는 탄소수 4개 이하의 카르복시산과 레티놀의 에스테르화물을 의미한다. 레티닐 프로피오네이트(retinyl propionate), 레티닐 아세테이트(retinyl acetate), 레티닐 락테이트(retinyl lactate), 레티닐 부티레이트(retinyl butyrate)를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단쇄 레티닐 에스테르와 함께 반응기질로 사용되는 장쇄 카르복시산은 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 올레산(oleic acid) 등 구성하는 탄소의 수가 12개 이상인 카르복시산 혹은 그 염을 포함하는 것으로 상기 예에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에서 합성반응의 효율을 높이기 위해서는 지질분해효소에 의해 반응이 일어나는 유기용매 상과 부산물을 회수하는 수용액 상 사이의 접촉면적을 넓혀 물질의 교환효율을 증가시킬 필요가 있으며, 이를 위하여 교반 속도를 조절하여 용매의 일부가 분산되도록 하거나, 다공성 수지 등을 이용하여 용매간 격리하여 각각 순환하는 방식을 취하거나, 기화장치 혹은 분산장치를 이용하여 친수성 용매층에 분산시킨 뒤 이를 밀도차에 의하여 회수하는 방식의 반응기를 이용할 수 있으나 반응기의 형태가 상기 기술된 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 유기용매 상의 구성에 사용되는 유기용매는 헥산, 사이클로헥산, 옥탄, 데칸, 도데칸, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 메틸렌 클로라이드, 디이소프로필 에테르, 카본테트라클로라이드, 에틸렌디클로라이드, 톨루엔, 아세토니트릴, 1,4-디옥산, 이소부틸메틸케톤, 벤젠, 이들의 혼합물 등 여러 가지에서 선택할 수 있ㄷ다.
상기 수용액 상은 단쇄 카르복시산이 쉽게 용해될 수 있도록 구성되는 것이 바람직하며, 물, 물, 디메틸설폭사이드 수용액 또는 K2SO4 수용액이 가능하다.
유기용매 상 내에서 지질분해효소에 의한 에스테르교환반응에 의해 반응기질인 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산은 장쇄 레티닐 에스테르와 단쇄 카르복시산으로 생산된다. 이후 유기용매 상과 연결되어 순환되는 수용액 상을 거치면서 부산물인 단쇄 카르복시산은 수용액 상에 용해되어 제거되며, 반응에 사용되지 못한 단쇄 레티닐 에스테르과 장쇄 카르복시산은 다시 유기용매 상으로 회귀한다. 이에 따라 유기용매 상 내 반응기질 중 단쇄 레티닐 에스테르의 평형농도를 높여 원료인 단쇄 레티닐 에스테르의 활용을 극대화하여 에스테르교환 반응의 전이율을 높일 수 있다. 또한 유기용매 상으로 회수된 반응 생성물의 경우 잔류하는 단쇄 카르복시산, 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 거의 존재하지 않아 추가적인 정제공정을 최소화할 수 있다.
이러한 제조방법을 통해 얻은 레티닐 리놀레이트(retinyl linoleate), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티닐 리놀리네이트(retinyl linolenate), 레티닐 올레이트(retinyl oleate)와 같은 장쇄 레티닐 에스테르는 화장품, 식품, 의약품 등에 다양하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
공정예 1
기본적으로 사용한 레티닐 리놀레이트의 효소 반응 방법은 아래와 같다:
1. 레티닐 아세테이트(retinyl acetate)와 리놀레산(linoleic acid)을 1:1의 몰비가 되도록 정량한 뒤 헥산에 완전히 녹여준다.
2. 반응기에 헥산에 녹인 반응기질 용액과 5% K2SO4 수용액을 첨가한다.
3. 핵산층에 연결된 정량펌프를 통하여 나온 반응액이 탈수장치를 통과한 뒤 고정화 효소가 들어있는 반응실을 통과하여 반응기의 친수성 층으로 빠져나오도록 유체의 통로를 설치한다.
4. 온도를 조절한 뒤 정량펌프를 가동하여 반응실에 반응액을 주입한다. (실험은 암소에서 진행하도록 한다.)
4. 일정 시간마다 시료를 취한 뒤 분석한다.
5. 반응 종결 후 여과 및 농축하여 최종산물을 회수하고 고정화효소는 반응실 채로 헥산을 흘려 세척한 뒤 건조하여 보존한다.
한편, 생성된 레티닐 리놀레이드 분석을 위한 HPLC 분석 조건은 아래와 같다:
- 컬럼(Column): Waters Sunfire C8 5㎛ 4.6X150mm
- 이동상 : 메탄올
- 유속: 0.8ml/min
- 검출기(Detector): UV 325nm
실시예 1
공정예 1에 기술된 절차에 기초하여 레티닐 리놀레이트를 제조하였다. 반응기질은 95% 이상의 순도를 가지는 것을 사용하였다. 500mL 규모의 캡슐형 반응기에 200mL 헥산 반응액과 200mL 5% K2SO4 수용액을 넣은 뒤 정량펌프를 이용하여 탈수장치를 통과한 헥산 반응액이 10g의 Novozyme 435가 충진된 유리재질의 반응실을 통과하도록 하였다. 고정화효소와 반응하는 유체의 부피는 24mL이었고, 유속은 96mL/min으로 설정하였다. 헥산 반응액에는 0.225M의 레티닐 아세테이트와 0.225M 리놀레산이 초기 기질로 첨가되었으며, 반응액과 수용액층 간 기질이 원활히 교환될 수 있도록 80 rpm으로 각각 교반하였다. 반응은 25℃에서 진행되었고 반응샘플은 0, 1, 2, 4, 10, 24, 48 시간에서 각각 수집되었다. 샘플은 톨루엔을 이용하여 10배 희석 후 다시 메탄올로 100배 희석하여 HPLC로 분석하였다. 분석결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 반응을 개시한지 48시간이 지난 시점에서 92%(mol/mol)의 레티닐 아세테이트가 레티닐 리놀레이트로 전환된 것으로 확인되었다.
실시예 2
공정예 1에 기술된 절차에 기초하여 레티닐 리놀레이트를 제조하였다. 반응기질은 95% 이상의 순도를 가지는 것을 사용하였다. 250mL 규모의 원기둥형 반응기에 100mL 헥산반응액과 100mL 5% K2SO4 수용액을 넣은 뒤 사이에 다공성 유리를 설치하여 반응액간 혼입을 제한하였다. 정량펌프를 이용하여 탈수장치를 통과한 헥산반응액이 10g의 Amano AK로 충진된 유리재질의 반응실을 통과하도록 하였다. 고정화효소와 반응하는 유체의 부피는 28mL이었고, 유속은 104mL/min 으로 설정하였다. 헥산반응액에는 0.225M의 레티닐 아세테이트와 0.225M 리놀레산이 초기 기질로 첨가되었으며, 반응액과 수용액층 간 기질이 원활히 교환될 수 있도록 80 rpm으로 각각 교반하였다. 반응은 25℃에서 진행되었고 반응샘플은 0, 1, 2, 4, 10, 24, 48 시간에서 각각 수집되었다. 샘플은 톨루엔을 이용하여 10배 희석후 다시 메탄올로 100배 희석하여 HPLC로 분석하였다. 그 결과 반응을 개시한 지 48시간이 지난 시점에서 83%(mol/mol)의 레티닐 아세테이트가 레티닐 리놀레이트로 전환된 것으로 확인되었다.
비교예 1
공정예 1에 기술된 절차를 참고하여 레티닐 리놀레이트를 제조하였다. 반응기질은 95% 이상의 순도를 가지는 것을 사용하였다. 500mL 규모의 캡슐형 반응기에 200mL 헥산 반응액을 넣은 뒤 정량펌프를 이용하여 탈수장치를 통과한 헥산 반응액이 10g의 Novozyme 435가 충진된 유리재질의 반응실을 통과하도록 하였다. 고정화효소와 반응하는 유체의 부피는 24mL이었고, 유속은 96mL/min으로 설정하였다. 헥산 반응액에는 0.225M의 레티닐 아세테이트와 0.225M 리놀레산이 초기 기질로 첨가되었으며, 반응액의 기질이 원활히 교환될 수 있도록 80 rpm으로 교반하였다. 반응은 25℃에서 진행되었고 반응샘플은 0, 1, 2, 4, 10, 24, 48 시간에서 각각 수집되었다. 샘플은 톨루엔을 이용하여 10배 희석 후 다시 메탄올로 100배 희석하여 HPLC로 분석하였다. 분석결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 반응을 개시한지 48시간이 지난 시점에서 48%(mol/mol)의 레티닐 아세테이트가 레티닐 리놀레이트로 전환된 것으로 확인되었다.

Claims (13)

  1. 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매와 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산의 에스테르교환 반응을 유도하는 지질분해효소를 포함하는 유기용매 상과,
    상기 에스테르교환 반응의 부산물로 생성되는 단쇄 카르복시산을 회수하기 위한 수용액 상을 포함하고,
    상기 유기용매 상과 수용액 상은 상호 연결되어 서로 순환되도록 구성되는 장쇄 레티닐 에스테르 제조를 위한 2상 반응 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지질분해효소는
    유기용매 상 내에 구획 형성된 반응기 내에 수용되고, 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해되어 있는 유기용매는 상기 반응기로 공급되는 것을 특징으로 하는 2상 반응 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지질분해효소는
    담체에 물리적 흡착방법, 포괄고정화(entrapment), 캡슐화(encapsulation) 또는 화학적 결합을 통해 고정된 고정화 효소인 것을 특징으로 하는 2상 반응 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유기용매 상과 수용액 상은
    하나의 반응용기 내에 순차적으로 층을 이루거나, 반투과성 소재를 사이에 두고 위치하여 서로 연결되어 있으나 서로 혼합되지 않은 상태인 것을 특징으로 하는 2상 반응 시스템.
  5. 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매와 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산의 에스테르교환 반응을 유도하는 지질분해효소를 포함하는 유기용매 상을 준비하는 단계와,
    상기 유기용매 상과 상호 연결되며, 상기 에스테르교환 반응의 부산물로 생성되는 단쇄 카르복시산을 회수하기 위한 수용액 상을 준비하는 단계와,
    단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매를 지질분해효소와 반응시켜 에스테르교환 반응을 통해 장쇄 레티닐 에스테르를 제조하는 단계와,
    상기 지질분해효소와 반응한 유기 용매를 수용액 상과 접촉시켜 에스테르교환 반응의 부산물로 생성된 단쇄 카르복시산을 제거하는 단계와,
    상기 수용액과 접촉한 유기용매를 다시 유기용매 상으로 순환시키는 단계
    를 포함하는 장쇄 레티닐 에스테르 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단쇄 레티닐 에스테르와 장쇄 카르복시산이 용해된 유기용매는 탈수처리 후 지질분해효소와 반응하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 유기용매는
    헥산, 시클로헥산, 옥산, 데칸, 도데칸, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 메틸렌클로라이드, 디이소프로필 에테르, 카본테트라클로라이드, 에틸렌디클로라이드, 톨루엔, 아세토니트릴, 1,4-디옥산, 이소부틸메틸케톤, 벤젠 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 수용액 상은
    물, 디메틸설폭사이드 수용액 또는 K2SO4 수용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 지질분해효소는
    칸디다 속(Candida sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 또는 무코 속(Mucor sp.) 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제5항 또는 제9항에 있어서,
    상기 지질분해효소는 담체에 물리적 흡착방법 또는 화학적 결합을 통해 고정된 고정화 효소인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 장쇄 레티닐 에스테르는
    레티닐 리놀레이트, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 리놀리네이트, 또는 레티닐 올레이트인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제5항에 있어서, 상기 단쇄 레티닐 에스테르는
    레티닐프로피오네이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 락테이트 또는 레티닐 부티레이트인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제5항에 있어서, 장쇄 카르복시산은
    리놀레산, 팔미트산, 리놀렌산 또는 올레산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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