CN102690857B - 一种生物法制备中低分子量右旋糖酐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物法制备中低分子量右旋糖酐的方法，包括以下步骤：在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）种子液进行发酵培养，再加入圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）种子液或者圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）的发酵液上清继续发酵培养，从发酵液中分离右旋糖酐，即得。本发明还公开了所制备的右旋糖酐及其应用。本发明采用双微生物偶联发酵的方式，提供生物法直接获得中低分子量右旋糖酐的方法。通过生物的方法来定向调控合成中低分子量的右旋糖酐，使生成的大分子右旋糖酐降解趋向于临床所需的中低分子量的右旋糖酐。同时，本发明可直接进行乙醇沉淀，省去了冗长费时又昂贵的逐级分划沉淀，提高了右旋糖酐的收率，减少了乙醇的使用量和耗量。
Description
技术领域
本发明属于精细化工领域，特别涉及一种生物法制备中低分子量右旋糖酐的方法及其产品。
背景技术
右旋糖酐（dextran）又名葡聚糖（学名），主要是蔗糖经某些微生物发酵产生的一种胞外多糖。右旋糖酐首先被应用于在医药领域，最主要的也是最早的使用是作为血容量扩充剂即代血浆。它是目前国际上公认的优良的代血浆首选药物。不同相对分子量的右旋糖酐具有许多的药理活性。此外，右旋糖酐在人体内可水解成较低分子质量的化合物，并会代谢生成葡萄糖而具有一定的营养作用。目前临床上常应用的有三种规格：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐还常用作药物载体，被科学家形象地称为“生物导弹”。目前已经应用于许多药物中作为载体，包括有降血糖药、抗肿瘤药、免疫蛋白和DNA等。在食品工业上的应用，右旋糖酐作为一种天然的来源丰富的微生物多糖是食品的一种优良的配料。主要是作为在食品中的保湿剂、稳定剂、增量剂和增稠剂。在石油工业上，右旋糖酐被作为油井钻泥的添加剂。
右旋糖酐的合成实质是蔗糖在胞外右旋糖酐蔗糖酶(又称葡聚糖蔗糖酶)的作用下催化合成的葡萄糖聚合物，由此可以将右旋糖酐的合成看成是由两步来完成，一步是酶的产生，二步是酶催化合成右旋糖酐。右旋糖酐蔗糖酶是一种高分子蛋白质，其分子量在170kD左右。可以生产右旋糖酐的菌种主要分为明串球菌属(Leuconostoc)和链球菌属(Streptococcus)。据文献记载，其中以明串珠菌属中的肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides，简写为L.M.)的产量最高。国内右旋糖酐的商业生产菌株应用较多的菌种是L.M.1226号菌种。微生物发酵合成右旋糖酐是目前工业上主要采用的一种方法。微生物发酵法是将右旋糖酐蔗糖酶的生成和合成右旋糖酐两大步合到同一个反应器中同时进行。传统的右旋糖酐生产工艺是以蔗糖作为底物，以游离的微生物为转化菌，控制一定的发酵条件，经微生物发酵利用蔗糖分子中的葡萄糖单元，因发酵过程对形成的分子量不能调控，最终发酵合成分子量巨大的右旋糖酐产物；而分子量巨大的右旋糖酐产物一般很少能直接使用。因此，发酵合成的分子量巨大的右旋糖酐须再经过一系列的后续加工（一般包括乙醇沉淀、捏洗、酸水解、划分、纯化、干燥等工序），最终才得到不同分子量级别的右旋糖酐成品。
右旋糖酐分子量的调控方法包括有化学法、物理法和生物法。其中化学法是传统所使用的方法，主要是通过盐酸把大分子量的右旋糖酐降解成小分子量的右旋糖酐，该法由于反应条件剧烈，不易控制，反应后部分右旋糖酐被降解成了单糖，因而导致收率很低。物理的方法主要是利用超声波来截断大分子的右旋糖酐而获取低分子量的右旋糖酐；此法耗能较多，不适于大规模生产采用，且反应过程会产生很多热量，目前在这方面的研究还处于初步探索阶段。由于酶解法具有反应条件温和，耗能少，适于实现工业规模化生产等优点，因而目前有关采用酶来调控右旋糖酐分子量的研究也比较多，但就在发酵法合成右旋糖酐基础上如何实现定向控制合成右旋糖酐分子量方面的研究报道很少，因而本发明采用双微生物偶合作用，对生物法降解右旋糖酐分子量进行研究，通过生物的方法来定向调控合成右旋糖酐的分子量，以到达临床医学所需的右旋糖酐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服传统的制备中低分子量右旋糖酐存在的步骤多、成本高的不足，提供一种新的生物法制备中低分子量右旋糖酐的方法及其产品。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的技术方案之一为：一种生物法制备中低分子量右旋糖酐的方法，包括以下步骤：在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）种子液进行发酵培养，再加入圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）种子液或者圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）的发酵液上清继续发酵培养，从发酵液中分离中低分子量的右旋糖酐。
其中，所述的肠膜明串珠菌种子液是本领域常规的肠膜明串珠菌种子液，优选处于菌体生长指数期的肠膜明串珠菌种子液。该肠膜明串珠菌种子液中的培养基是本领域常规的用于培养肠膜明串珠菌的培养基，优选的种子液培养基是：蔗糖8%，蛋白胨0.7%，磷酸氢二钠0.2%，磷酸二氢钾0.05%。发酵培养基的pH值优选pH7.3~7.6，更优选7.5。
其中，所述的圆弧青霉菌种子液也是本领域常规的圆弧青霉菌种子液，优选处于菌体生长指数期的圆弧青霉菌种子液。该圆弧青霉菌种子液中的培养基是本领域常规的用于培养圆弧青霉菌的种子液培养基，优选的种子液培养基是CM0015查氏培养基。
其中，所述的圆弧青霉菌的发酵液上清是指圆弧青霉菌的发酵液固液分离除去固相后所剩下的液相部分。圆弧青霉菌的发酵液上清中含有多种生物活性成分，包括右旋糖酐酶。右旋糖酐酶可以降解右旋糖酐，使右旋糖酐分子量降低，从而得到中小分子量的右旋糖酐。
其中，所述的含蔗糖的发酵培养基是本领域常规的用于发酵培养肠膜明串珠菌的发酵培养基，其中含有蔗糖，蔗糖含量优选10%—20%。优选的所述的发酵培养基含：蔗糖10%-20%，蛋白胨0.5-0.8%，磷酸氢二钠0.1-0.3%，磷酸二氢钾0.02-0.07%和酵母浸膏0.2-0.8%；更优选的发酵培养基是：蔗糖18%，蛋白胨0.7%，磷酸氢二钠0.2%，磷酸二氢钾0.05%和酵母浸膏0.5%。所述的百分比为质量百分比。
其中，发酵条件是先在发酵培养基中加入发酵培养基体积10%-15%的肠膜明串珠菌种子液，在20-35℃，发酵12-48小时后；再加入发酵培养基体积8%-13%的圆弧青霉菌种子液，继续在20-35℃下发酵12-96小时，优选48-72小时。优选为在发酵培养基中加入10%的肠膜明串珠菌种子液，25-30℃发酵24小时后加入发酵培养基体积10%的圆弧青霉菌种子液，在25-30℃继续发酵48小时；更优选为肠膜明串珠菌的发酵温度为28℃，发酵时间为36小时；圆弧青霉菌的发酵温度为28℃，发酵时间为36小时；优选在摇床转速为150r/min下发酵。
其中，所述的圆弧青霉菌的发酵液上清的加入量优选发酵培养基的10%-15%，更优选12%。继续发酵的条件优选为：发酵温度为28℃，发酵时间为48小时；优选在摇床转速为150r/min下发酵。
其中，本发明的方法中，所述的肠膜明串珠菌（Leuoconostocmesenteroides，简写为L.M.)是属于肠膜明串珠菌（Leuoconostocmesenteroides）种内的任何一种，优选的为肠膜明串珠菌（Leuoconostocmesenteroides）CICC-21725，肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）CICC-20074，肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）L.M.N-4，肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）L.M.NCTC 10817，和肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）L.M.1226中的一种或多种。可以是野生型的菌株，也可以是通过采用基因工程技术手段改造野生型菌株所获取的基因工程菌。
其中，所述的圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）是属于圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）种内的任何一种，优选圆弧青霉菌（Penicilliumcyclopium）CICC-4022或者圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4021。可以是野生型的菌株，也可以是通过采用基因工程技术手段改造野生型菌株所获取的基因工程菌。
本发明继续发酵培养后的发酵液中含有的右旋糖酐的分子量分布情况是：均重分子量大于40000的产物部分在8%以下，均重分子量小于20000的产物部分小于5%以下，均重分子量40000的产物部分约占总产物的80%。较好地实现了产物分子量的调控。
本发明中，从继续发酵培养后的发酵液中分离右旋糖酐的方法可以是本领域常规的分离方法。优选在发酵液中加入乙醇沉淀，进行两级沉淀分离。包括在分离除去大部分菌体的发酵液中加入乙醇使发酵液中乙醇的体积浓度在43-48%（V/V），进行一级沉淀除杂，以沉淀的方式除去发酵液中的大分子量右旋糖酐和少量的菌体；在沉淀分离后，再在清液中加入乙醇使发酵液中的乙醇浓度为48%-52%（V/V），进行二级沉淀，获得的沉淀即为中低分子量的右旋糖酐粗品。本发明省略了传统右旋糖酐生产过程中的酸解操作，减少了乙醇的使用量和生产过程中乙醇的消耗量。
本发明的技术方案之二为：由所述方法制备的右旋糖酐。
本发明还提供所述的右旋糖酐在制备药物中的应用以及在食品、化工中的应用。
右旋糖酐可以用于制备代血浆，也可以作为药物载体制备各种药物。在食品工业上，右旋糖酐可作为天然来源的微生物多糖作为优良的配料，如保湿剂、稳定剂、增量剂和增稠剂。在石油工业上，右旋糖酐作为油井钻泥的添加剂。右旋糖酐还作为化妆品、B1T1杀虫剂的增效剂、土壤改良剂等。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明采用双微生物耦合发酵的方式，提供生物法合成右旋糖酐分子量调控的方法，通过生物的方法来定向调控合成低分子量的右旋糖酐，使大分子右旋糖酐降解趋向于临床所需的中低分子量的右旋糖酐。同时，本发明可直接进行乙醇沉淀，省去传统生产工艺中的酸解操作和冗长费时又昂贵的逐级分划沉淀，提高了右旋糖酐的收率，减少了乙醇的使用量和生产过程中乙醇的消耗量。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1圆弧青霉菌CCIC-4022的生长曲线。
图2肠膜明串珠菌CICC-21725的生长曲线。
图3右旋糖酐分子量标准曲线图。
图4圆弧青霉菌与肠膜明串珠菌CICC-21725耦合发酵的产物分子量变化。
图5产品分子量的液相色谱分析结果。
具体实施方式
本发明人经过长期而广泛的研究，发现在生物法合成右旋糖酐的生产中，通过产右旋糖酐蔗糖酶的微生物在含蔗糖的发酵培养基中发酵所得的发酵液中加入产右旋糖酐酶的微生物或者该产右旋糖酐酶的微生物的发酵液上清，使两种微生物耦合共同发酵或者使产右旋糖酐蔗糖酶的微生物在右旋糖酐酶存在的情况下继续发酵，可以对发酵过程中生成的右旋糖酐的分子量进行调控，从共同发酵液中分离得到符合使用要求的分子量降低的右旋糖酐。
进而本发明人通过对两微生物种类的筛选和优选，以及生产工艺中各个生产工艺参数的优化，终于得到了一种可以调控发酵过程中右旋糖酐分子量的方法，直接获得符合医学和其他工业领域使用要求分子量的右旋糖酐，从而完成了本发明。
本发明人对两微生物种类以及生产工艺中的参数，比如两种微生物的种子培养基，发酵培养基，发酵初始pH值，发酵温度和时间，两种微生物合并发酵的时间，合并时两者的用量比例，发酵条件等进行了大量的试验，包括单因素试验，两因素交互试验以及多因素试验，采用“正交试验设计”数学方法来确定配方和生产工艺，通过方差分析，确定影响较大的因素。从而得到了双生物耦合发酵调控产物右旋糖酐分子量的方法。本发明对这些因素的优选方式如前文中技术方案部分所述。在所述的技术方案下，得到的右旋糖酐分子量可以达到临床所需的中低分子量要求。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的常温是指10-35℃，一般为25℃。
实施例1
菌种：肠膜明串珠菌（Leuconostoc Mesenteroides，L.M.）CICC-21725和圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4022购于中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）。
1、圆弧青霉菌种子液的制备
（1）圆弧青霉菌种子制备
圆弧青霉菌种子培养和保存基制备：种子培养和保存基为CM0015查氏琼脂培养基：蔗糖3%，亚硝酸钠0.3%，七水硫酸镁0.05%，氯化钾0.05%，四水硫酸亚铁0.001%，磷酸氢二钾0.1%，琼脂1.5%，pH6.0~6.5。
按上述培养和保存基配方称取各个培养基组分，放入干净的烧杯中，再加入一定量的蒸馏水，搅拌加热完全溶解后，用精密pH试纸测定其pH，并用酸碱调节溶液的pH值至6.0~6.5；随后将其放入高压灭菌锅中进行灭菌；灭菌条件为121℃，0.1MPa，20min。取出趁热将其倒入圆形培养皿中，待其温度下降至常温；并放置24h，观察培养基有无杂菌污染，如果无，便可以使用。
种子制备：将购置的圆弧青霉菌按常规转移到有种子培养和保存基的培养皿中，在28℃静置培养3天。
（2）圆弧青霉菌种子扩大液的制备
种子扩大培养基的制备：按CM0015查氏液体培养基组成，去掉琼脂制备1L的液体种子扩大培养基，调节其pH至6.0~6.5之间，定容后分装成50mL每瓶，用棉花塞塞住，包扎好；放入高压锅中灭菌。
种子扩大液制备：在无菌环境下，分别从圆弧青霉菌种培养皿中挑取几环菌体接入已灭菌好的50mL CM0015查氏种子扩大培养基中，在28℃,150r/min条件下进行培养，测定不同培养时间下种子扩大培养基中菌体的重量，以确定种子扩大培养时间，获得可用于发酵的圆弧青霉菌种子液。
圆弧青霉菌生长曲线的绘制：
菌体收集：发酵培养中，每隔一定的时间，取其中的一瓶发酵培养液，采用8000r/min，离心10分钟，去掉上清收集菌体。
菌体干重的测定：将带有菌体的离心管一起放入烘箱中，115℃，干燥至恒重，取出置于玻璃干燥器中进行冷却干燥，称量三次取平均值，并计算菌体干重（菌体干重=平均总重-空管重）。
圆弧青霉菌生长曲线见图1。前1~2天是菌体生长繁殖的迟缓期，此时由于菌种刚加入到新的培养环境中，需要一段时间来调整适应新环境，2~5天时为菌种生长繁殖的对数生长期，当发酵时间到达第5天左右，圆弧青霉菌CCIC-4022的生长处于稳定期。而到了第7天之后开始进入了衰亡期，此时在实验中观察到：发酵液已经发粘、变色，菌体呈现泛红色。
根据上述实验结果，将种子扩大培养2天后的圆弧青霉菌作为下一步发酵用的圆弧青霉菌种子液，简称A液。
2、发酵制备右旋糖酐
（1）肠膜明串珠菌种子液制备
肠膜明串珠菌L.M.CICC-21725种子扩大液体培养基为：蔗糖8%，蛋白胨0.2%，磷酸氢二钠0.14%，磷酸二氢钾0.03%。pH 7.0~7.2。
种子培养液制备：按上述液体培养基配方（蔗糖8%，蛋白胨0.2%，磷酸氢二钠0.14%，磷酸二氢钾0.03%）称取各个培养基组分，放入干净的烧杯中，再加入一定量的蒸馏水，搅拌加热完全溶解后，待其温度下降至常温；再用已校准好的pH计测定溶液的pH值并用酸碱调节溶液的pH值至7.0~7.2，之后补加蒸馏水定容。然后将配制好的培养液分装到的250mL锥形瓶中，装液量为50mL，之后用棉花塞塞住瓶口，并用牛皮纸包扎严实。随后将其放入高压灭菌锅中进行灭菌；灭菌条件为121℃，0.1MPa，20min。灭菌之后，取出让其自然冷却至常温，并放置24h，观察培养液中有无杂菌污染，如果无，便可以使用。
在无菌的环境下操作，从培养皿中挑选长势好的肠膜明串珠菌落，挑取几环接入种子扩大培养基中进行传代培养，培养条件：温度25℃，转速150r/min培养，测定不同培养时间下种子扩大培养基中菌体的重量，以确定种子扩大培养时间，获得可用于发酵的肠膜明串珠菌L.M.CICC-21725种子液。
肠膜明串珠菌生长曲线见图2，根据实验结果，将种子扩大培养1天后的肠膜明串珠菌L.M.CICC-21725作为下一步发酵用的肠膜明串珠菌L.M.CICC-21725种子液。
（2）发酵培养基制备
用肠膜明串珠菌L.M.CICC-21725发酵合成右旋糖酐的发酵培养基为：蔗糖18%，蛋白胨0.7%，磷酸氢二钠0.2%，磷酸二氢钾0.05%，酵母浸膏0.5%。pH 7.2-7.5。
按上述配方制备1L的发酵培养基，调节其pH至7.2-7.5之间，定容后分装成每瓶250mL，用棉花塞塞住，包扎好；放入高压锅中灭菌。
（3）合成右旋糖酐及其产率测定：
将肠膜明串珠菌发酵培养基分装成两组，分别接入（1）中获得的肠膜明串珠菌种子液，接种量为10%（v/v），25℃发酵48小时，即得含产物的发酵液。
采用称重取样法，称取一定量经肠膜明串珠菌发酵获得的发酵液，并加入一定量的蒸馏水进行稀释，然后高速离心（10000r/min,10min）去除菌体；取上清液，用60%乙醇进行沉淀，所得沉淀产物再用无水乙醇进行脱洗两次，离心收集沉淀；将沉淀物置于真空度0.05MPa以上、50℃左右的条件下真空干燥至恒重，再转移至干燥器中进行冷却干燥，三次称重取平均值，并计算右旋糖酐产率（右旋糖酐产率=粗酐产量/蔗糖用量×0.474×100%）。
结果，肠膜明串珠菌L.M.CICC21725发酵合成右旋糖酐的产率达98%。
（4）右旋糖酐分子量的测定
相对分子量分布检测：
产物相对分子质量利用凝胶渗透色谱法(ge1 permeationchromatography，GPC)检测。用6个标准相对分子质量右旋糖酐作出标准曲线，重均相对分子质量从5000～2000kD。在该色谱条件下测定样品的保留时间，来检测右旋糖酐的分子量分布。
色谱条件：流动相0.7%NaSO4+0.02%NaN3的水溶液，流速1.0min/mL,检测池温度40℃，柱温35℃。
配制标准品溶液：取一定量的相对分子量（Mw）分别为5kD、10kD、20kD、40kD、70kD、2000kD的葡聚糖（Dextran）标准品，加入流动相配制成约2%标样溶液，用0.45μm膜过滤，进样检测，记录不同标样的保留时间，并根据保留时间和对应的相对分子质量的对数值绘制标准曲线。
在所测得的高效液相凝胶色谱图中右旋糖酐样品的峰分布较窄且峰形较尖，出峰效果良好，可用来制作标准曲线来检验及计算发酵液中的右旋糖酐分子量大小及分布情况。以tR为横坐标，右旋糖酐标准品的分子量对数值为纵坐标，绘制右旋糖酐分子量标准曲线（如图3所示），其线性回归方程为lgMw=-0.5885t+9.5305,其中R2=0.9974；Mw代表右旋糖酐的相对分子量，tR代表相对应的保留时间。在所选定的测定范围内，保留时间与右旋糖酐的相对分子量具有良好的线性关系，因而可以通过在该色谱条件下测定样品的保留时间，来检测反映样品中右旋糖酐的分子量及分布。
在（3）中获得的右旋糖酐产物，经分子量测定，其分子量全部大于2000000D。
3、双菌体耦合发酵制备中低分子量右旋糖酐
（1）双菌发酵
分别向两组发酵培养基中加入10%（v/v）经扩大培养的肠膜明串珠菌L.M.CICC21725种子液，25℃发酵24小时后，再加入发酵培养基体积10%的圆弧青霉菌扩大种子液（A液），继续在25℃下发酵72小时。
发酵过程中右旋糖酐分子量的检测：在加入圆弧青霉菌后，在发酵条件下，分别取12h、24h、36h、48h、60h、72h的发酵液进行右旋糖酐分子量检测。检测方法：取2mL发酵液入离心管中进行离心除菌体，取上液清1mL加入4mL无水乙醇，混匀静置过夜后离心，去上清液，取沉淀，真空干燥除去水分和乙醇；再向各个离心管中加入5mL流动相，振荡充分溶解；用0.45μm水系膜过滤头过滤，取滤液，在获得的色谱条件下检测产物相对分子量。其中12h和24h的溶解液由于还比较黏，先稀释2倍后离心除菌体，再按检测方法检测产物的分子量。结果见图4。
从实验结果可获得双菌耦合发酵的时间为72小时。
（2）双菌发酵右旋糖酐产率测定
取发酵72小时的发酵液，并加入一定量的蒸馏水进行稀释，然后高速离心（10000r/min,10min）去除菌体；取上清液，加入乙醇使其中乙醇含量为60%（V/V），进行沉淀，所得沉淀产物再用无水乙醇进行脱洗两次，离心收集沉淀；将沉淀物置于真空度0.05MPa以上、50℃左右的条件下真空干燥至恒重，再转移至干燥器中进行冷却干燥，三次称重取平均值，并计算右旋糖酐产率（右旋糖酐产率=粗酐产量/蔗糖用量×0.474×100%）。结果，双菌耦合发酵合成右旋糖酐的产率达95%。
4、中低分子量右旋糖酐的分离
在所选择的发酵条件下经双菌耦合发酵72小时获得的发酵液用滤纸进行过滤，去除大部分菌体。在滤液中加入乙醇，控制溶液中的乙醇含量为43%，进行一级沉淀，将其中的大分子量右旋糖酐和少量的菌体去除。取上层清液，加入乙醇使其中乙醇含量达到51%，进行第二级沉淀，静置12小时后，先倾倒出上层清液，在沉淀物中加入等体积的95%乙醇，用滤纸过滤，滤渣再用少量95%乙醇洗涤一次。取出滤渣在50℃左右的条件下真空干燥12小时获得产品。对获得的产品进行分子量检测，产品的分子量在40000左右，结果见图5。可见：均重分子量大于40000的产物部分在8%以下，均重分子量小于20000的产物部分小于5%以下，均重分子量40000的产物部分约占总产物的80%。较好地实现了产物分子量的调控。结果，双菌耦合发酵获得的分子量为40000左右的右旋糖酐产率为92%。分子量分布D值为1.015。
由于在发酵液中右旋糖酐的分子量已符合使用的要求，不需要进行酸解和对酸解后的右旋糖酐进行多级乙醇划分，将可以大大的减少乙醇的用量，减少能耗，提高收率，降低生产成本。
实施例2
菌种：肠膜明串珠菌（Leuconostoc Mesenteroides，L.M.）CICC-21725和圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4022购于中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）。
1、圆弧青霉菌酶液的制备
按实施例1的扩大培养条件，将扩大培养3天后的圆弧青霉菌种子液在8000r/min离心10分钟，取上清液得圆弧青霉菌酶液，简称为B液。
2、发酵制备右旋糖酐
（1）肠膜明串珠菌种子液制备
与实施例1相同。
（2）发酵培养基制备
用肠膜明串珠菌L.M.CICC-21725发酵合成右旋糖酐的发酵培养基为：蔗糖13%，蛋白胨0.7%，磷酸氢二钠0.2%，磷酸二氢钾0.05%，酵母浸膏0.5%。pH 7.2-7.5。
按上述配方制备1L的发酵培养基，调节其pH至7.2-7.5之间，定容后分装成每瓶250mL，用棉花塞塞住，包扎好；放入高压锅中灭菌。
（3）合成右旋糖酐
将肠膜明串珠菌发酵培养基分装成两组，分别接入（1）中获得的肠膜明串珠菌种子液，接种量为10%（v/v），28℃发酵48小时后加入发酵培养基体积10%的圆弧青霉菌酶液（B液），继续发酵48小时。
取加入圆弧青霉菌酶液发酵48小时的发酵液，用滤纸进行过滤，去除大部分菌体。在滤液中加入乙醇，控制溶液中的乙醇含量为46%，进行一级沉淀，将其中的大分子量右旋糖酐和少量的菌体去除。取上层清液，加入乙醇使其中乙醇含量达到53%，进行第二级沉淀，静置12小时后，先倾倒出上层清液，在沉淀物中加入等体积的95%乙醇，用滤纸过滤，滤渣再用少量95%乙醇洗涤一次。取出滤渣在50℃左右的条件下真空干燥12小时获得产品。对获得的产品进行分子量检测，分子量为40000左右的右旋糖酐的产率为92%，分子量分布D值为1.007。
由于在发酵液中右旋糖酐的分子量已符合使用的要求，不需要进行酸解和对酸解后的右旋糖酐进行多级乙醇划分，将可以大大的减少乙醇的用量，减少能耗，提高收率，降低生产成本。
实施例3
菌种：肠膜明串珠菌（Leuconostoc Mesenteroides，L.M.）CICC-20074和圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4021购于中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）。
过程同实施例1，结果双菌耦合发酵获得的右旋糖酐的分子量在70000左右，分子量分布D值为1.031，产率为88%。
实施例4
菌种：肠膜明串珠菌（Leuconostoc Mesenteroides，L.M.）CICC-20074和圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4022购于中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）。
过程同实施例1，结果双菌耦合发酵获得的右旋糖酐的分子量在40000左右，分子量分布D值为1.032，产率为89%。
实施例5
菌种：肠膜明串珠菌（Leuconostoc Mesenteroides，L.M.）CICC-21725和圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4021购于中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）。
过程同实施例2，但加入的圆弧青霉菌酶液（B液）为15%，发酵温度为32℃，发酵时间为36小时，结果双菌耦合发酵获得的右旋糖酐的分子量在20000左右，分子量分布D值为1.011，产率为89%。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种生物法制备中低分子量右旋糖酐的方法，其特征在于，包括以下步骤：在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜明串珠菌（Leuoconostocmesenteroides）种子液进行发酵培养，再加入圆弧青霉菌（Penicilliumcyclopium）种子液继续发酵培养，所述的圆弧青霉菌种子液在肠膜明串珠菌在20-35℃发酵12-48小时加入，然后继续发酵，所述的继续发酵中，发酵条件是20-35℃，发酵时间是12-96小时，从发酵液中分离右旋糖酐，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基含：蔗糖10%-20%，蛋白胨0.5-0.8%，磷酸氢二钠0.1-0.3%，磷酸二氢钾0.02-0.07%和酵母浸膏0.2-0.8%，所述的百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肠膜明串珠菌种子液和圆弧青霉菌种子液的加入量分别是发酵培养基体积的10%-15%和8%-13%。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides)选自肠膜明串珠菌（Leuoconostocmesenteroides）CICC-20074，肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）CICC-21725，肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）L.M.N-4，肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）L.M.NCTC10817和肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides）L.M.1226中的一种或多种；所述的圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）选自圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4022和圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）CICC-4021中的一种或两种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肠膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroides)或圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）是野生型的菌株，或者是通过采用基因工程技术手段改造野生型菌株所获取的基因工程菌。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，从所述的继续发酵培养的发酵液中分离右旋糖酐的方法包括在分离除去大部分菌体的发酵液中加入乙醇使发酵液中乙醇的体积浓度在43-48%（V/V），进行一级沉淀除杂；在沉淀分离后，再在清液中加入乙醇使发酵液中的乙醇浓度为48%-52%（V/V），进行二级沉淀，获得的沉淀即为中低分子量的右旋糖酐粗品。
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