CN1587417A - 适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体 - Google Patents
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Abstract
一种适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体。包括pJTU390、pJTU391、pJTU407、pJTU408、pJTU409、pJTU410、pJTU411、pJTU412，由以下DNA元件组成：①包含来自大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点(ori)，②包含氨苄青霉素抗性基因(bla)，③包含来自链霉菌质粒pIJ101复制起始位点(ori)和复制子，④包含硫链丝菌素抗性基因(tsr)，⑤包含λ噬菌体科斯(cos)位点，⑥包含来自RP4的接合转移起始位点(oriT)，⑦包含可被T3和T7噬菌体RNA聚合酶特异性识别启动子，⑧包含来自Tn5的不包含启动子的新霉素抗性基因(neo)。本发明同时包含有大肠杆菌质粒和链霉菌质粒复制子和抗性筛选标记，同时在两种宿主进行自主复制和遗传的功能，方便地在大肠杆菌中进行体外遗传操作和在链霉菌中进行基因功能分析研究。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物基因技术领域的基因载体，尤其是适用于链霉菌染色体基因敲除的一系列双功能科斯载体。
背景技术
链霉菌是一类具有分枝丝状体的好氧性革兰氏阳性细菌，是土壤中主要的微生物类群之一。同其它生物类群相比，其基因组最大特征之一就是其DNA具有极高的G+Cmol％，高达69-78％，是迄今为止已知的G+Cmol％含量最高的生物类群之一。链霉菌虽属于原核生物，却有着极其复杂的细胞分化机制，是研究基因在时间、空间和程序上表达调控机制的良好模式材料。其次，链霉菌是工业微生物中最具有商业应用价值的生物类群之一，自然界中有近70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的，链霉菌在其复杂的形态分化过程中所产生的极为丰富的次级代谢产物，在工、农、医等方面具有重要而广泛的应用价值。
自二十世纪70年代以来，链霉菌遗传学和分子生物学发展十分迅速，这在很大程度取决于各种分子遗传学操作手段的发展，其中对基因功能进行遗传分析的一个重要方法就是基因敲除，即通过染色体同源重组，置换或中断某个目的基因，然后观察和检测该基因被中断后的突变菌株表型或产物来判断其功能，这直接依赖于链霉菌中有效的基因工程载体以及基因克隆系统建立和发展，使人们能够方便地去操作各种目的基因。一般的链霉菌质粒缺少大肠杆菌质粒复制起始位点和可供利用的选择性标记而不能在大肠杆菌中自主复制和筛选，所以无法直接用作基因工程的载体，而大肠杆菌质粒由于不包含链霉菌质粒复制子和可供利用的选择性标记无法在链霉菌中自主复制和筛选，同时链霉菌宿主对许多外源DNA也存在着强烈的限制性。因此，将链霉菌质粒和大肠杆菌质粒进行人工组合形成同时兼具两者特性的穿梭载体，即同时含有链霉菌质粒和大肠杆菌质粒的复制起始位点和筛选标记，一方面既可以利用大肠杆菌质粒复制快、制备容易、便于体外操作等优点，另一方面又可以方便地在链霉菌宿主中进行功能研究。
经过对现有技术的文献(Kieser T，Bibb，M.J.，Buttner，M.J.，Chater，K.F.，and Hopwood，D.A.：Practical Streptomyces genetics《链霉菌遗传学操作手册》.Norwich，England：The John Innes Foundation；2000)检索发现，利用这种载体固然可以把链霉菌的基因文库构建在大肠杆菌中并可方便地进行克隆片段的结构分析，但要使克隆的DNA片段重新回到链霉菌中来进行功能分析常常遇到不少障碍，如原生质体的制备和再生，宿主对外源DNA存在的限制性等。
在链霉菌用于基因敲除的自主复制型载体通常应具备以下两个特性：首先是遗传不稳定性，即载体进入链霉菌宿主后，当培养环境中存在特定的选择压力时，该载体可以稳定遗传；当培养环境中不存在选择压力时，该载体则容易发生丢失。其次是结构稳定性，即载体在链霉菌宿主中应当保持结构的稳定，而不应该发生缺失。
发明内容
本发明的目的在于克服现有载体的不足，提供一系列结构更稳定而遗传更不稳定的链霉菌-大肠杆菌双功能科斯载体，使之更为有效地用于链霉菌染色体基因敲除，它们包括pJTU390、pJTU391、pJTU407、pJTU408、pJTU409、pJTU410、pJTU411、pJTU412，其共同的特征在于它们由以下DNA元件组成：
①包含来自大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点(ori)，可在大肠杆菌中自主复制。
②包含氨苄青霉素抗性基因(bla)，可在大肠杆菌中进行抗性筛选。
③包含来自链霉菌质粒pIJ101复制起始位点(ori)和复制子，可在链霉菌中自主复制。
④包含硫链丝菌素抗性基因(tsr)，可在链霉菌中进行抗性筛选，当培养环境中存在硫链丝菌素选择压力时，该载体可以稳定遗传；当培养环境中不存在硫链丝菌素选择压力时，则表现出遗传不稳定性。
⑤包含λ噬菌体科斯(cos)位点，可用于基因文库构建的构建。
⑥包含来自RP4的接合转移起始位点(oriT)，在大肠杆菌ET12567辅助质粒pUZ8002存在时，可用于大肠杆菌和链霉菌之间的属间接合转移。
⑦包含可被T3和T7噬菌体RNA聚合酶特异性识别的启动子，可用于插入DNA片段的体外扩增。
⑧包含来自Tn5的不包含启动子的新霉素抗性基因(neo)，可用于启动子的克隆。
本发明同时包含有大肠杆菌质粒和链霉菌质粒复制子和抗性筛选标记，可同时在两种宿主进行自主复制和遗传的功能，从而方便地在大肠杆菌中进行体外遗传操作和在链霉菌中进行基因功能分析研究。
本发明包含了接合转移起始位点oriT，从而赋予了该载体从大肠杆菌向链霉菌接合转移的穿梭功能，使得对尚未建立原生质体转化等基因克隆系统的链霉菌进行遗传功能研究成为了可能。
本发明具有的突变株筛选系统，由于该载体系列包含了硫链丝菌素抗性基因(tsr)，当培养环境中存在硫链丝菌素选择压力时，该载体可在链霉菌中可以稳定遗传；当培养环境中不存在硫链丝菌素选择压力时，则表现出遗传不稳定性，以极高的频率发生丢失，这使得通过对培养环境中硫链丝菌素的调节，则可以方便地对链霉菌目的突变株进行有效的筛选。
本发明包含了λ噬菌体科斯(cos)位点，使之具备了克隆大片段外源DNA(26-41kb)的优点，可方便用于染色体基因文库构建的构建。
此外，本发明还包含有可被T3和T7噬菌体RNA聚合酶特异性识别的启动子，可方便地用于插入DNA片段的体外扩增以及包含来自Tn5的不包含启动子的新霉素抗性基因(neo)，可方便地用于启动子的克隆。
所述的pJTU390，它还包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85，2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为鸟嘌呤(G)。
所述的pJTU391，它还包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85，2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
所述的pJTU407，它不包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和orf85，但包含2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为鸟嘌呤(G)。
所述的pJTU408，它不包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和orf85，但包含2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
所述的pJTU409，它包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和1个36bp的同向重复序列，但不包含orf85，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
所述的pJTU410，它包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85和1个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为鸟嘌呤(G)。
所述的pJTU411，它包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85和1个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
所述的pJTU412，它不包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和orf85，只包含1个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
附图说明
图1链霉菌染色体基因敲除双功能科斯系列载体的构建过程示意图
图2基因敲除结构pJTU194、pJTU413的构建流程及基因敲除示意图
图3基因敲除菌株的分子杂交验证
具体实施方式
以下结合附图对本发明链霉菌染色体基因敲除双功能科斯系列载体的构建过程进一步说明：
如图1所示，ori CoIE1：大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点；ori pIJ101：链霉菌质粒pIJ101复制起始位点；rep pIJ101：链霉菌质粒pIJ101复制子；tsr：硫链丝菌素抗性基因；bla：氨苄青霉素抗性基因；sti pIJ101：质粒强不相容区；cos：λ噬菌体包装位点；oriT RP4：RP4接合转移起始位点；T3和T7：可被T3和T7噬菌体RNA聚合酶特异性识别的启动子；(neo)Tn5：来自Tn5的缺失了启动子的新霉素抗性基因；R1，R2：36bp同向重复序列。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU390的构建过程及特征：
XhoI+SpeI双酶切质粒pIJ101，回收1625bpXhoI-SpeI片段，与质粒pHZ1358经相同的XhoI+SpeI双酶切回收的9909bp的XhoI-SpeI片段连接，获得重组质粒pJTU390，如图1所示。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU391的构建过程及特征：
XhoI+SpeI双酶切质粒pIJ649，回收1625bpXhoI-SpeI片段，与质粒pHZ1358经相同的XhoI+SpeI双酶切回收的9909bp的XhoI-SpeI片段连接，获得重组质粒pJTU391，如图1所示。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU407的构建过程及特征：
pJTU390经SacI+SpeI双酶切后回收的10960bp片段再经末端补平后自连(去除一574bpSacI+SpeI片段)，获得重组质粒pJTU407，如图1所示。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU408的构建过程及特征：
pJTU391经SacI+SpeI双酶切后回收的10960bp片段再经末端补平后自连(去除一574bpSacI+SpeI片段)，获得重组质粒pJTU408，如图1所示。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU409的构建过程及特征：
pHZ1358经HpaI+SpeI双酶切后回收的8936bp片段再经末端补平后自连(去除一1908bpHpaI+SpeI片段)，获得重组质粒pJTU409，如图1所示。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU410的构建过程及特征：
pJTU390经HpaI+SpeI双酶切后回收的9630bp片段再经末端补平后自连(去除一1908bpHpaI+SpeI片段)，获得重组质粒pJTU410，如图1所示。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU411的构建过程及特征：
pJTU391经HpaI+SpeI双酶切后回收的9630bp片段再经末端补平后自连(去除一1908bpHpaI+SpeI片段)，获得重组质粒pJTU411，如图1所示。
链霉菌染色体基因敲除双功能科斯载体系列之一pJTU412的构建过程及特征：
pJTU391经HpaI+SacI双酶切后回收的9052bp片段再经末端补平后自连(去除一2486bpHpaI+SacI片段)，获得重组质粒pJTU412，如图1所示。
以下提供实施例：
由双功能科斯载体pJTU408，pJTU412所介导的变铅青链霉菌1326(S.lividans 1326)染色体上dnd基因簇的基因敲除。
实施例1
变铅青链霉菌1326染色体基因敲除结构pJTU194，pJTU413的构建
将来自变铅青链霉菌1326染色体上dnd基因簇(6462bp)两侧的两个大小分别为3830bp和4497bp同向DNA片段分别克隆至pJTU408和pJTU412的HpaI位点，分别构建成基因敲除结构pJTU194和pJTU413。构建流程见图2，P表示PvuII酶切位点。
实施例2
基因敲除结构pJTU194和pJTU413从大肠杆菌向链霉菌的属间接合转移
在2ml含氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(10μg/ml)、氯霉素(25μg/ml)抗生素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH7.0)中接种大肠杆菌ET12567(pUZ8002+pJTU194)或ET12567(pUZ8002+pJTU413)，37℃旋转培养(220rpm)12hr后，按1∶10比例接种至5ml含相同浓度抗生素的LB液体培养基中，37℃旋转培养(220rpm)2.5hr后用LB液体培养基洗涤2次。将作为受体的变铅青链霉菌1326孢子悬浮于5ml0.05mol/L pH8.0的TES缓冲液中，50℃水浴中热激10min，用自来水冷却后加入等体积孢子预萌发培养基(Difco酵母膏1g，Difco酪蛋白氨基酸1g，CaCl2 0.01M(需配制5M的原液，分开灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中)，蒸馏水100ml)，37℃旋转培养(220rpm)2.5hr，离心收集孢子并重新悬浮于适量的无菌水中，调节链霉菌孢子和大肠杆菌细胞浓度，以108等量混合后涂布SFM平板(黄豆饼粉20g，甘露醇20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.5)，37℃静置培养24hr后用含硫链丝菌素(10μg/ml)的1ml无菌水覆盖，置30℃培养48hr后即可观察到转移接合子。
实施例3
基因敲除菌株的筛选
将获得的硫链丝菌素抗性(ThioR)的接合转移子，经非抗性SFM平板松弛培养7天后，影印至含硫链丝菌素(10μg/ml)SFM平板，筛选表型为硫链丝菌素敏感(ThioS)的菌株，这些菌株则可能为基因敲除突变株。
实施例4
基因敲除菌株的分子杂交验证
分别提取上述候选的基因菌突变株的总DNA，用PvuII进行完全酶切，经琼脂糖凝胶分离后进行Southern转膜，选用pJTU194或pJTU413中的一个包含3335bp外源片段的PvuII酶切片段为探针(如图2所示)进行Southern杂交。当野生型菌株染色体上包含dnd基因簇的6462bpDNA区域被敲除时，在野生型菌株中应出现大小分别为3610bp和977bp两条阳性信号带，而在基因敲除突变株HXY7和SYH40中应出现一条3335bp阳性信号带。Southern杂交实验结果证明SHXY7和SYH40成功发生了预期的基因置换，如图3所示，空心箭头指示的是野生型菌株1326中应出现的3610bp和977bp阳性信号带，实心箭头指示的一条约3335bp的阳性信号带是野生型菌株染色体上6462bp的DNA区域被敲除后新形成的一条PvuII酶切片段。
Claims (9)
1、一种适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征在于，包括pJTU390、pJTU391、pJTU407、pJTU408、pJTU409、pJTU410、pJTU411、pJTU412，由以下DNA元件组成：①包含来自大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点(ori)，②包含氨苄青霉素抗性基因(bla)，③包含来自链霉菌质粒pIJ101复制起始位点(ori)和复制子，④包含硫链丝菌素抗性基因(tsr)，⑤包含λ噬菌体科斯(cos)位点，⑥包含来自RP4的接合转移起始位点(oriT)，⑦包含可被T3和T7噬菌体RNA聚合酶特异性识别的启动子，⑧包含来自Tn5的不包含启动子的新霉素抗性基因(neo)。
2、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU390，它还包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85，2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为鸟嘌呤(G)。
3、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU391，它还包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85，2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
4、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU407，它不包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和orf85，但包含2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为鸟嘌呤(G)。
5、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU408，它不包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和orf85，但包含2个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
6、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU409，它包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和1个36bp的同向重复序列，但不包含orf85，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
7、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU410，它包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85和1个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为鸟嘌呤(G)。
8、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU411，它包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)，orf85和1个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
9、根据权利要求1所述的适用于链霉菌染色体基因敲除的系列双功能科斯载体，其特征是，所述的pJTU412，它不包含来自链霉菌质粒pIJ101的质粒强不相容区(sti)和orf85，只包含1个36bp的同向重复序列，链霉菌质粒复制子的第1117个碱基为腺嘌呤(A)。
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| CN102719471B (zh) * | 2012-06-05 | 2013-10-30 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌 |
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