KR100673872B1

KR100673872B1 - 요로감염증의 예방 및 치료를 위한 재조합 디엔에이,플라스미드, 형질전환 미생물 및 경구용 백신 단백질

Info

Publication number: KR100673872B1
Application number: KR1020040026900A
Authority: KR
Inventors: 표석능; 이용화
Original assignee: 학교법인 성균관대학
Priority date: 2004-04-19
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2007-01-25
Also published as: US7001744B2; US20050232938A1; KR20050101513A; GB0417480D0; GB2413327A; WO2005100568A1; JP2005304471A

Abstract

본 발명은 요로계 감염 대장균에 대한 새로운 융합단백질 백신에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 요로계 감염 대장균의 항원 결정기를 코딩하는 유전자와, 점막 면역효과를 증가시킬 수 있고 면역보조제 역할로써 작용하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균의 무독성 톡신유전자 CTXA2B와 열에 약한 장내독소 대장균(heat-labile E. coli enterotoxin)의 무독성 톡신유전자 LTXA2B를 유전자 재조합하여, 이 재조합된 유전자를 대장균에서 발현, 분리, 및 정제함으로써 요로계 감염 대장균에 대해 백신으로 사용할 수 있는 융합단백질에 대한 것이다.

상기한 구성의 본 발명에 따르면, 부작용이 적고 효과가 탁월한 경구용 백신의 획득이 가능하므로 재발성 요로감염증을 상당히 감소시킬 것으로 기대됨은 물론, 항생제의 남용에 따른 내성균의 출현을 막고, 요로감염증에 있어서의 화학요법제 의존도를 상당히 줄일 것으로 예상된다. 또한 적은 비용으로 단시간 내에 사업화 및 제품화가 가능하며, 손쉽게 구성성분을 변경함으로써 다양한 백신류로의 응용을 위한 유연기술을 습득할 수 있다고 여겨진다.

요로감염증, 예방 및 치료, 백신, 단백질.

Description

요로감염증의 예방 및 치료를 위한 재조합 디엔에이, 플라스미드, 형질전환 미생물 및 경구용 백신 단백질{Recombined DNA, plasmid, transformed microorganism and vaccine protein, for prevention and therapy of Urinary Tract Infection}

도 1은 요로계 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 열에 약한 장내독소 대장균(heat-labile E. coli enterotoxin; LTX)의 무독성톡신 유전자인 LTXA2B 유전자에 생물공학 방법을 이용하여 대장균의 핌브리어 H(Fimbriae H; FimH)를 연결시킨 융합 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 2는 요로계 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 비브리오 콜레라균의 무독성 톡신유전자인 CTXA2B 유전자에 생물공학 방법을 이용하여 대장균의 핌브리어 H(Fimbriae H; FimH)을 연결시킨 융합 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 3은 요로계 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 비브리오 콜레라균의 무독성 톡신유전자인 CTXA2B 유전자에 생물공학 방법을 이용하여 대장균의 핌브리어 H (Fimbriae H; FimH)을 연결시킨 융합 유전자의 크기를 전기영동으로 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 4는 CTXA2B 유전자와 FimH 유전자를 융합한 유전자를 발현벡터인 pMAL-p2E에 생물공학 방법을 이용하여 클로닝(A)을 시킨 것을 제한 효소 처리(B)와 중합효소연쇄반응(C)으로 융합단백질의 크기를 전기영동으로 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 5는 요로계 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 열에 약한 장내독소 대장균(heat-labilc E. coli enterotoxin; LTX)의 무독성톡신 유전자인 LTXA2B 유전자에 생물공학 방법을 이용하여 대장균의 핌브리어 H(Fimbriae H; FimH)를 연결시킨 융합 유전자의 크기를 전기영동으로 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 6은 LTXA2B 유전자와 FimH 유전자를 융합한 유전자를 발현벡터인 pMAL-p2E에 생물공학 방법을 이용하여 클로닝(A)을 시킨 것을 제한효소 처리(B)와 중합효소연쇄반응(C)으로 융합단백질의 크기를 전기영동으로 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 7은 요로 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 대장균 내에서 FimH/CTXA2B 융합단백질을 발현시킨 것을 SDS-PAGE(A, C)와 Western blot(B, D)으로 융합단백질의 발현 크기를 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 8은 요로계 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 대장균 내에서 FimH/LTXA2B 융합단백질을 발현시킨 것을 SDS-PAGE(A, C)와 Western blot(B, D)으로 융합단백질의 발현 크기를 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 9는 요로계 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 대장균 내에서 FimH/CTXA2B 융합단백질을 발현시킨 것을 삼투압 충격법과 흡착크로마토 그라피를 이용하여 페리프라슴 (periplasm)에서 정제한 FimH/CTXA2B 융합단백질을 SDS-PAGE(A, C)와 Western blot(B, D)으로 융합단백질의 발현 크기를 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 10은 요로계 감염 대장균에 대한 융합단백질 백신을 생산하기 위해, 대장균 내에서 FimH/LTXA2B 융합단백질을 발현시킨 것을 삼투압 충격법과 흡착 크로마토그라피를 이용하여 페리프라슴(periplasm)에서 정제한 FimH/LTXA2B 융합단백질을 SDS-PAGE(C)와 Western blot(A, B)으로 융합단백질의 발현 크기를 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 11은 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질들의 면역원성을 시험하기 위해, 암컷 BALB./C 생쥐에 융합단백질을 경구 투여한 후 혈청에서 IgG 항체 생성능을 융합단백질 투여군과 대조군과의 비교를 나타낸 것이다.

도 12는 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질들의 면역원성을 시험하기 위해, 암컷 BALB./C 생쥐에 융합단백질을 경구 투여한 후 질점액에서 sIgA항체 생성능을 융합단백질 투여군과 대조군과의 비교를 나타낸 것이다.

도 13은 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 백신에 대한 예방효과를 시험하기 위해, 암컷 BALB./C 생쥐에 융합단백질을 경구투여로 면역화 시킨 후 요로감염성 대장균을 생쥐의 요도를 통해 방광에 주입한 후 요로감염성 대장균의 집락수를 융합단백질 투여군과 대조군과의 비교를 나타낸 것이다.

도 14는 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 백신에 대한 예방효과를 시험하기 위해, 암컷 BALB./C 생쥐에 융합단백질을 경구투여로 면역화 시킨 후 요로 감염성 대장균을 생쥐의 요도를 통해 방광에 직접 주입한 후 염증유발 시방광 점막층 주변에 가장 먼저 침투하는 면역세포 중의 하나인 호중구수의 증가를 조직병리학적 검사인 H＆E 염색으로 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 15는 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 백신에 대한 예방효과를 시험하기 위해, 암컷 BALB./C 생쥐에 융합단백질을 경구투여로 면역화 시킨 후 요로감염성 대장균을 생쥐의 요도를 통해 방광에 직접 주입한 후 방광 점막층주변에 존재하는 요로감염성 대장균에 대한 수를 조직병리학적 검사인 그람염색으로 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 16은 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 백신에 대한 예방효과를 시험하기 위해, 암컷 BALB./C 생쥐에 융합단백질을 경구투여로 면역화 시킨 후 요로감염성 대장균을 생쥐의 요도를 통해 방광에 직접 주입한 후 염증유발시 가장 먼저 침투하는 면역세포 중의 하나인 호중구수의 증가를 측정할 수 있는 MPO 분석에 의해 융합 단백질 투여군과 대조군과의 호중구 수 증가 비교를 나타낸 것이다.

도 17은 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 백신에 대한 치료효과를 시험하기 위해, 요로감염성 대장균을 암컷 BALB./C 생쥐의 요도를 통해 방광에 직접 주입한 후 융합단백질을 경구투여로 면역화 시킨 후 요로감염성 대장균의 콜로니 수를 융합단백질 투여군과 대조군과의 비교를 나타낸 것이다.

도 18은 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 백신에 대한 치료효과를 시험하기 위해, 요로감염성 대장균을 암컷 BALB./C 생쥐의 요도를 통해 방광에 직접 주입한 후 융합단백질을 경구투여로 면역화 시킨 후 염증유발 시 가장 먼저 침투하 는 면역세포 중의 하나인 호중구수의 증가를 측정할 수 있는 MPO 분석에 의해 융합 단백질 투여군과 대조군과의 호중구 수 증가 비교를 나타낸 것이다.

본 발명은 대장균의 항원 결정기를 코딩하는 유전자와 비브리오 콜레라 CTXA2B 유전자 및 열에 약한 장내독소 대장균 LTXA2B 유전자를 연결시켜서 제조되는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA, 이를 함유하는 발현 플라스미드, 그 발현 플라스미드를 세포주에 도입하여 형질전환 시킴으로서 제조되는 형질전환 미생물 및 그 형질전환 미생물에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 요로감염 대장균에 대한 백신 단백질에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명은 요로계 감염 대장균에 대한 새로운 융합단백질 백신에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 요로계 감염 대장균의 항원 결정기를 코딩하는 유전자와, 점막 면역효과를 증가시킬 수 있고 면역보조제 역할로써 작용하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균의 무독성 톡신유전자 CTXA2B와 열에 약한 장내독소 대장균(heat-labile E. coli enterotoxin)의 무독성 톡신유전자 LTXA2B를 유전자 재조합하여, 이 재조합된 유전자를 대장균에서 발현, 분리, 및 정제함으로써 요로계 감염 대장균에 대해 백신으로 사용할 수 있는 융합단백질에 대한 것이다.

일반적으로 요로감염증은 요로 장기 등에서 볼 수 있는 세균감염증의 총칭으로 방광염, 신우염, 그리고 급만성 신우신염 등의 임상적 소견을 나타낸다(Kunin, 1994; Haley 등, 1985). 요로계 감염에 의한 질병은 주로 많은 수의 미생물들이 요로 내에서 증식하기 전까지는 임상적인 증상이 발견되지 않는 특징이 있으며, 호흡기 질환 다음으로 많은 빈도를 나타내는 질병이다. 요로감염은 상행성이고 하부요도를 통해 세균이 침입하여 감염증을 일으키는 것으로 보고되었다(Patton 등, 1991), 혈행성 감염은 황색포도상구균이나 진균, 결핵균 등에 의해 일어날 수 있다. 유발인자로는 임신, 결석 등으로 인한 요로폐쇄, 신경성 방관, 방관 뇨관의 역류, 신질환, 고혈압, 당뇨병, 도뇨관 삽입, 진통제 및 해열제 복용 등이 있다(Kunin, 1994)). 한편 여자들에게는 주로 방광염과 신장염이 많고, 어린이들의 경우에는 방광염이, 남자들에게는 요도염이 많이 발생하는 것으로 보고되었다(Haley 등, 1985). 합병증으로 신장 유두괴사, 신장농양 및 신장주위 농양 등이 나타날 수 있다(Stamm 등, 1993). 이러한 요로 감염의 약 70％ 이상은 대장균이 원인균으로 밝혀져 있다. 이 질환으로 인해 미국의 경우 연간 700만 명 이상이 1차 의료기관을 찾고 있으며, 약 100만 명 이상이 병원치료를 필요로 한다고 보고되었다(Hooton, 2003; Kunin, 1994; Patton 등, 1991). 또한 이 질병은, 인체 생리적 구조 및 기능상으로 인해 여자들의 요도 길이가 짧고 넓어 세균이 쉽게 번식할 수 있으므로, 남자들에 비해 여자들이 4∼10배 정도 발병률이 높은 것으로 알려져 있다. 성인 여성의 50％ 이상이 요로 감염에 의한 질환으로 병원을 찾고 있는데, 이는 최근의 가임기 여성의 성생활 및 피임제 사용과 상당히 관련되어 있음이 보고되었다(Hooton 등, 1996; Kunin, 1994; Stamm 등, 1993; Uehiling 등, 1994).

요로감염증은 감염 경로에 따라 크게 상부 요로감염증과 하부 요로감염증으 로 분류되어지며, 증세는 신우염 등 상부 요로감염증의 경우에는 발열, 오심 및 구토, 늑골척추 각압통, 혈청 항체 증가, 백혈구 원주 등의 징후가 나타나고, 방광염 및 요도염 등 하부 요로감염증의 경우에는 배뇨 곤란, 다뇨증, 절박 요실금, 치골상부 통증 등의 증세가 나타난다(Hooton, 2003).

또한 감염의 상태에 따라 단순성 요로감염인 급성 단순성 방광염과 급성 단순성 신우신염, 만성 복합성 요로감염증으로 분류되어진다(Stamm 등, 1993). 단순성 요로감염증은 20∼30 대 요로감염증에서 다발적으로 발생하는 반면 복합성 만성 요로감염증의 경우 기초질환인 요로결성, 수신염, 방광종양, 방광뇨관 역류, 신성인성방광 및 전립선 비대증 등의 영향으로 어느 연령층에서나 다발적으로 발증하는 것을 볼 수 있고 특히 보통 고령자나 남자들에게 많이 발병하는 것으로 보고되고 있다(Gupta 등, 1999b; Haley 등, 1985). 급성단순성 방광염의 경우 전신성 발열, 소변불리, 빈뇨, 혈뇨 및 염증반응에 의한 농뇨 등의 증상이 나타나며 적절한 항생제 투여에 의해 호전되는 것으로 보고되고 있다(Stamm 등, 1993). 하지만 급성단순성 신장염은 고열, 측복통, 방광자극 증세를 일으키며 치료 후에도 미생물에 의해 재감염이 발생하여 만성 감염으로의 전이 등이 문제되고 있는데, 약60％ 이상이 쉽게 재발하여 발열 및 잦은 농뇨, 그리고 세균뇨를 동반한 만성복합성 요로감염증으로 이환되어 신질환을 심화시키고, 단백뇨 및 괴사를 동반한 소상사구체신염(focal segmental glomerulosclerosis; FSG) 등도 일으키는 것으로 알려져있다(Kunin, 1994). 한편, 요로계 감염 대장균의 약 50％가 kanamycin에 내성을 나타내고 신우신염, 방광염 환자의 10％가 2∼3 년 내에 재감염된다고 한다. 또한 이들 환자 중 약 10％는 평생 동안 감염에 의해 고통을 받고 있다고 보고되었다(Haley 등, 1985, Hooton 등, 1996).

급성단순성 요로감염증의 치료는 병원균 사멸 및 재감염으로의 이환을 감소시키기 위한 목적으로 시행된다. 특히 재감염 방지를 위한 치료는 요로감염증치료에 있어 매우 중요한 것으로 보고되고 있다. 일반적으로 적절한 기간동안의 치료를 하지 않을 경우, 급속히 재발하는 것으로 보고되고 있는데, 이는 새로운 대장균 혹은 새로운 세균류에 의한 것으로 보인다. 주로 항생제 투여를 통한 치료를 통해 24시간 내에 세균뇨가 사라지지만, 농뇨나 관련증상은 수일 동안 지속되는 것으로 보고되고 있다(Hooton, 2003).

급성단순성 감염의 또 다른 종류인 신우신염의 경우 신장 및 요로상피에 깊숙한 감염을 일으키게 되는데, 이때는 수일 동안의 비경구적 치료를 시행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 치료에는 보통 2주일 이상의 기간이 걸리며 ampicillin과 같은 항생제보다는 trimethoprimsulfamethoxazole(TMP/SMX)(Bactrim^□)과 같은 화합요법제가 더 효과적인 것으로 알려져 있다(Gupta, 등 1999a, 1999b; Hooton, 2003; Nicolle, 2003). 그 외에도 amilogycosides, cephalosporins 및 quinolone 등이 사용된다(Nicolle, 2003).

만성복합성 감염의 경우 일반적인 항생제, 화학 요법제 사용을 통한 치료가 행해지지만 오랜 기간의 약물투여에 의한 부작용 및 합병증 발생의 위험성이 높은 것으로 보고되고 있다(Kunin, 1994). 그러나 이러한 치료에 따른 1) 항생제 내성 균류의 출현, 2) 잦은 재감염으로 인한 비용증가, 그리고 3) 높은 감염율(연0.5∼0.7％) 등의 문제점으로 인해 요로감염증 치료를 위한 효과적인 백신의 개발필요성이 증가하고 있다(Hooton 등, 1996; Kunin, 1994; Patton 등, 1991).

지금까지 요로계 감염 대장균에 대한 백신이 제품화된 경우는 없으며 다만 전임상 단계에 있는 것들이 있지만 다음과 같은 개발 전략에 의해 대장균에 대한 백신이 만들어져야 한다. 첫째, 균 생존에 필수적인 어드헤신(adhesin)이 항원단백질로 사용되는 게 바람직하며 둘째, 항원 단백질은 면역성이 높고 독성이 없어야 한다. 셋째, 점막의 상피세포 간 접합부에 서식하고 있는 미생물에 대해서 점막 면역 반응을 유발시킬 수 있는 항원 단백질이 필요하며 넷째, 대부분 단독항원 단백질로는 면역성이 약하기 때문에 면역원성을 증가시켜 줄 수 있는 면역 보조제(adjuvant)가 필요하다. 다섯째, 복용이 편리하고 부작용이 없는 경구용 백신이 필요하다(Service, 1997).

한편, 요로감염성 대장균이 생산하는 Gal-Gal pili는 요로계 상부 상피세포에 특이적으로 부착하는데 관여하고 헤모라이신(hemolysin)은 다양한 종류의 세포파괴성과 균의 세포 속으로의 침입을 관여한다고 밝혀졌다(Roberts 등, 1994). 현재 국내에서는 이들 유전자 재조합 및 펩타이드 합성을 통한 백신개발이 이루어졌으나 낮은 항원성 등으로 인해 기대하는 만큼의 많은 효과를 얻지 못하였다. 국외에서는 Lagermann 등(2000)이 요로감염성 대장균의 FimH 단백질을 유전자 재조합을 통해 백신으로 개발하려는 연구를 수행하고 있는 것으로 알려져 있다(Kunin, 1994; Patton 등, 1991). 최근 이들 연구그룹은 FimH를 이용한 Cynomolgus 원숭이들에서의 요로감염증에 대한 백신효과를 보고한 바 있다(Kunin, 1994), 이에 따르면 면역보조제인 MF59와 FimH를 4마리의 실험동물에 투여한 결과 3마리에서 백신효과를 볼 수 있었지만, 이 경우 효과적인 백신 효과에도 불구하고 면역보조제를 함께 투여해야 하는 불편함이 있는 것으로 보인다. 특히 경구용 백신으로 이용하기 위해서는 점막 면역 반응을 유발시켜야 한다는 점이고, 독성이 없으면서 백신의 항원 단백질에 대해 면역성을 증가시켜줄 수 있는 면역보조제가 필수적인 것으로 보여진다(Foss 등, 1999).

면역반응에 관여하는 세포들은 기능의 효과적인 수행을 위해 조직이나 기관을 구성하게 되는데, 이를 림프계(lymphoid system)라 한다. 림프계는 실질적으로 림프구를 생산하고 분화시키는 1차(혹은 중추) 림프 조직계(흉선, 골수)와 림프구와 항원과의 접촉 또는 림프구간의 상호작용을 돕는 2차(혹은 말초) 림프 조직계(비장, 림프절 및 점막림프기관 등)로 분류된다. 2차 림프 조직계 중 생체 림프조직의 1/3 이상을 차지하는 점막 림프기관은 수많은 필수 영양소들의 소화와 흡수의 중추적인 장소이면서 유해한 이물질들과 병원성 미생물에 대한 물리학적 장벽역할을 수행할 뿐만 아니라 면역 방어 시스템에서 중요한 면역학적 장벽 기능을 담당하고 있다(Kagnoff 등, 1996). 이러한 점막림프기관은 크게 기도에서의 폐조직과 폐포 세포에 관련된 호흡 림프상 조직기관인 BALT(Bronchous Associated Lymphoid Tissue)와 입천장과 코가 연결되는 부위의 비강관련 림프조직인 NALT(Nasal Associated Lymphoid Tissue) 및 장관 림프상 조직으로서의 GALT(Gut Associated Lymphoid Tissue)로 구분할 수 있다(Kiyono 등, 1996). 한편 Bienenstock(1984)은 BALT와 GALT를 합쳐서 MALT(Mucosal Associated Lymphoid Tissue)로 명명할 것을 제안하였다. MALT는 생체 내에서 가장 큰 림프상 조직으로 장관의 점막부위에 존재하여 장관면역계 내 IgA 면역반응을 비롯하여 생체방어에서 대단히 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다(Mestecky, 1987). 한편, MALT에서의 여러 면역기관 중 Peyer's patch는 장관 내 핵심적인 림프기관일 뿐만 아니라 sIgA 생산을 위한 인덕티브(inductive) 부위로 알려져 있으며, 루멘 돔(lumen dome)은 항원의 흡수에 중요한 특정화된 M 세포로 구성된 flattered 상피로 덮여있다(de Haan 등, 1995; Frey 등, 1997; Roit 등, 1992). 이와 같은 M 세포는 lumen으로부터 가용성 항원, 세균과 바이러스 등을 피노사이토시스(pinocytosis)나 식균 작용에 의해 포획되어 림프세포에 이동시킴으로써 세포의 활성화에 기여한다(Kerneis 등, 1997). 즉, 장관 내에 있는 Peyer's patch의 림프구들은 M 세포에 의해 섭취된 항원과 반응하여 활성화된 후 림프소절의 저미널 센터(germinal center)에서 분화하고 성숙하게 되며, 점막으로부터 빠르게 이동하여 precursor slgA⁺ B세포와 CD4⁺ Th 세포들을 활성화시켜 장관막 림프절(mesentric Lymph Node; MLN)로 이동하여 혈류에 도달하기 위해 흉관(thoracic duct; TD) 내로 들어와서 체내를 순화하게 된다(Kerneis 등, 1997). 이들 이동하는 세포들은 IgA effector 부위로 들어와서 sIgA의 수송이 일어나게 된다. 결국 Peryer's patch를 포함한 장관 면역계는 장관의 면역학적 방어 시스템에 기여할 뿐만 아니라 시스템(systemic) 염증을 조절하여 알레르기 반응 및 자가 면역질환 등을 효과적으로 억제할 수 있는 것이다.

점막에 서식하고 있는 미생물에 대한 백신에 있어서 대부분의 단백질들은 장 관련 림포이드 조직(gut-associated lymphoid tissues; GALT)에 의해서 분해되거나 흡수가 되지 않는다(de Haan 등, 2000; Kerneis 등, 1997; Kunin, 1994). 그러나 점막면역을 강하게 유발시킬 수 있는 보조 물질로 알려진 콜레라에서 생성되는 비브리오 콜레라 톡신(Vibrio cholera toxin; CTX) 및 대장균에서 생성되는 heat-labile E. coli enterotoxin(LTX) 단백질들은 G_Ml-ganglioside의 흡착과 GALT의 굴성(tropism)에 의해 강한 점액 면역반응을 유발시키는 것으로 보고되었다(de Haan 등, 1996; Freytag 등, 1999; Pizza 등, 2001). 그러나 두 단백질 모두 Al 소단위체의 독성으로 인해 자연 상태로는 점막 면역보조제로서 사용하지 못하고, 현재 변종 혹은 A 소단위체의 독소가 제거된 CTXB, LTXB 또는 Al 소단위체가 제거된 CTXA2B 및 LTXA2B 등이 면역보조제로 사용되고 있다(Agren 등, 1999; Douce 등, 1999; Haley 등, 1985; Hooton 등, 1996). 백신개발과 관련하여 점막면역보조제로 사용되는 CTXA2B에 대해 Czerkinsky 등 (1989)은 CTXA1 부분에 단백질 항원인 Streptococcal 어드헤신으로 대체한 후 CTXB에 화학적으로 연결시킨 백신을 만들었으며, Hajishengallis 등(1995)과 Russell 등(1991)은 CTXA1 부분에 단백질 항원인 Streptococcal mutant adhesin I/II의 saliva-binding region (SBR)으로 대체한 후 CTXB에 유전자 재조합 기술로 연결시킨 융합 유전자 재조합 백신이 G_Ml-ganglioside를 경유하여 분비성 IgA 항체(secretory IgA antibody; sIgA Ab)를 분비시키는 점 액면역을 효과적으로 유발시킴으로써 점막에 병원성 세균이 부착하거나 집락을 형성하는 것을 효과적으로 막을 수 있음을 보고하였다(de Haan 등 1995; Harokopakis 등, 1998; Lebens 등, 1994; Saito 등, 2001; Tochikubo 등, 1998; Verweij 등, 1998). Harokopakis 등(1997)은 Salmonella typhimurium 백신개발에 있어 CTXA1 부분에 streptococcal protein adheisn I/II의 saliva-binding region(SBR)으로 대체한 후 유전자 재조합으로 CTXA2B에 결합시킨 후 마우스 실험을 한 결과 혈청에서의 IgG와 IgA의 항체가 높게 유도됨을 보여주었다. Hall 등(2001)은 장염(enterotoxigenic Escherichia coli; ETEC) 백신을 제조하기 위해 CTXB에 ETEC-CTXB을 연결한 융합백신을 제조하여 임상실험을 한 결과 IgA의 경우 어린이는 70∼96％가, 성인은 31∼69％가 증가하는 것을 보였을 뿐만 아니라, IgG의 경우에도 어린이는 44∼75％가, 성인은 25∼81％가 높게 나타나는 것을 보였다. 또한 Kim 등(2001)은 Helicobacter pylori의 hpa 어드헤신을 CTXA2B에 유전학적으로 연결시킨 융합단백질 백신을 제조하여 동물실험을 한 결과 혈청에서 IgA 항체가 높게 나타났을 뿐 아니라 위 점막에서의 sIgA 항체도 높게 유도가 되었음을 보여 주여 예방 백신으로 효과를 입증하게 되었다. 또한 Lee 등(2003)은 Pertusis Toxin 의 S1 단편을 CTXA2B에 유전학적으로 연결한 융합백신을 만들어 마우스 실험을 한 결과 예방효과에서 상당히 효력이 있는 걸로 보고하였다.

또한 백신개발과 관련하여 면역보조제로써 사용되는 LTXA2B에 대해 Loregian 등(1999)은 herpes simplex virus 1(HSV-1)의 DNA 중합효소로부터 얻은 27-mer 펩타이드(antiviral peptide)를 LTXB 소단위체에 유전자 재조합 기술로 연결한 융합 단백질(LTXB-Pol)을 제조하였다. 한편 바이러스의 DNA 합성은 핵 내에서 일어나는데 이러한 합성은 바이러스에 의해 암호화가 된 UL42라는 부속인자(accessory factor)의 상호작용에 인해 일어난다. 제조된 융합단백질은 LTXB와 펩타이드 성분 모두를 지니고 있어 polymerase-UL42 복합체의 파괴를 통해서 in vitro에서 바이러스의 DNA 중합효소 활성을 억제함을 보여 주였다. 이는 단백질 전달자(carrier)로서의 역할을 보여 주였는데, HSV 백신에 대한 가능성을 부여하고 있는 것 같다.

이러한 CTXA2B 및 LTXA2B를 면역보조제로 사용할 때의 장점은, 1) 점막상피세포의 투과성을 좀 더 증가시킬 수 있고(Lycke, 1997), 2) MHC class Ⅱ 발현 및 IL-1 생성 증가를 통한 항원 제시를 유도시키며(Bromander 등, 1991; Millar 등, 2001; Nashar 등, 1993), 3) B 세포를 자극하여 sIgA를 생성시키는 점막면역을 유도할 수 있다는 점이다(Haley 등, 1985; Langermann, 1996; Roit 등, 1992). 따라서 요로감염증 백신의 개발에 있어서도 이러한 면역보조제의 특성을 이용하는 것이 필요할 것이라고 생각된다(Hess 등, 2000).

대장균에 의한 요로감염의 발병 및 진행 과정에서 많은 유해성 인자들이 관여하고 있지만, 요로감염을 일으키기 위한 선행 조건은 먼저 병원감염성 대장균이 요로 숙주세포 내에서 적정한 집락을 형성해야 한다는 것이다(Kunin, 1994; Patton 등, 1991). 집락의 형성은 대장균의 특정 어드헤신(adhesin)이 점막표면에서 발현하는 특정 수용체인, 만노즈(mannose)에 부착함으로서 일어나는데, 이러한 요로감염성 대장균의 집락 형성은 감염부위 및 조직에 한정되는 것으로 보고되었다(Abraham 등, 1985; Beachey 등, 1981; Beachey 등, 1988; Wizemann 등, 1999). 한편, 대장균의 어드헤신은 주로 핌브리에 (fimbirae) 또는 피브리에(fibrillae)로 구성되어져 있으며, 대장균의 특정 어드헤신이 결합하기 위한 숙주세포의 특정 수용체는 주로 당지질(glycolipid) 또는 당단백질(glycoprotein)들로 이루어져 있다(Beachey 등, 1988; Thankavel 등, 1997).

이러한 집락형성을 위한 숙주세포 및 조직의 부착은 요로감염성 대장균의 특정 어드헤신을 통해 자물쇠와 열쇠 형태로 일어난다고 보고되었다(Abraham 등 1988; Beachy 등, 1988; Jones 등, 1993; Jones 등, 1995; Kunin, 1994). 일반적으로 박테리아가 상피세포에 부착을 조절하는 데는 크게 스트렙토코커스(Streptococcoi)의 리포테코익 산(lipoteichoic acid; LTA) 조절과 대장균의 type 1 핌브리에(fimbriae) 조절에 의해 이루어진다. 스트렙토코커스(Streptococci)에서의 어드헤신은 LTA로서 상피세포에 연결된 피브로넥틴(fibronectin) 분자와 더불어 지방부분을 통해 상호작용을 하면서 일어난다. 또한 type 1 fimbriate 대장균은, 핌브리에의 끝부분에 위치한 29 kDa 크기의 소단위체인, FimH 어드헤신이 숙주세포의 당단백질 수용체에 있는 D-만노스 잔기에 결합함으로써 상호작용이 일어난다고 보고하였다(Beachey 등, 1988; Krogfelt 등, 1990). 이러한 요로감염성 대장균 등에서 보이는 특정 어드헤신은 매우 보존적인 것으로 알려져 있다(Abraham 등, 1988; Kunin, 1994; Palaszynski 등, 1998).

Langermann 등의 연구(1997)는 FimH knockout 변종을 이용하여 요로감염성 대장균의 표면 단백질인 FimH가 요로감염성 대장균의 요로 내 부착 및 집락형성을 통한 감염에 있어 결정적인 역할을 하며, 이를 억제할 경우 90％ 이상의 감염을 방지할 수 있음을 확인하는 등, 세포 어드헤신의 중요한 역할을 규명한 바 있다(Jones-Carson 등, 1999; Minion 등, 1986; Palaszynski 등, 1998). 특히 요로감염성대장균 등에서 보이는 type 1 pili의 선단 부위에 존재하는 FimH가 방광 상피조직의 당지질 수용체의 소단위체인 만노즈 부분에 특이적으로 결합을 하는데, 이러한 결합은 세균성 요도감염에 직접 관련이 있다고 보고하였다(Langermann 등, 2001; Knudsen 등, 1998). 특히 FimCH 복합체 이용 시 세균성 요로감염을 방지할 수 있는 적절한 백신으로서 가능성을 제안하였다. 그 이유로는 FimC가 페리프라즈믹(periplasmic) chaperon의 기능을 지니는데 전체의 어드헤신을 안정화 및 적절하게 엉키도록 하는데 있어 매우 중요한 역할을 담당하기 때문인 것으로 보고되었다(Langermann 등, 2001).

지금까지 요로계 감염 대장균의 병원성 인자인, 항원 결정기를 암호화하는 유전자는 숙주세포의 점막 상피세포에 존재하는 만노즈에 결합하는 type 1 pili의 FimH 어드헤신과 P-fimbriae의 PapG 어드헤신(Hultgren 등, 1989), heat-labile toxin(LTX)와 heat-stable toxin(STX) 및 aerobactin, 용혈소, 혈청저항성 및 KI 협막 등이 밝혀져 있다(Abraham 등, 1988; Hutgren 등, 1993).

본 발명자들은 요로계 감염 대장균에 대해 면역원성이 뛰어나며 위내의 환경에 안정하고 점막면역반응을 촉진하는 백신을 개발하고자 광범위한 연구를 수행하던 중, 면역보조제로서 비브리오 콜레라균의 무독성 톡신 유전자 CTXA2B 및 대장균 의 무독성 톡신 유전자 LTXA2B와 대장균의 항원 결정기를 코딩하는 유전자를 융합하여 생산된 백신이 이러한 문제점을 해결할 수 있는 우수한 발명인 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

참고로 밝히면, 비브리오 콜레라균의 무독성 톡신 유전자(CTXA2B)에 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 어드헤신 유전자(adhesin gene)를 융합단백질에 합성하여 경구용 백신으로 투여한 결과 분비성 면역단백질(sIgA) 및 체액성 면역단백질(serum IgG)의 생성을 촉진시켰다는 연구보고가 발표되었다(Hajishengallis, et al., J, Immunol., 154, 4322 (1995)). 그러나 콜레라의 무독성 톡신 CTXA2B 및 대장균의 무독성 톡신 LTXA2B와 요로계 감염대장균의 항원결정기를 코딩하는 유전자를 결합시켜 백신을 제조한 기술은 아직까지 없었다. 따라서 비브리오 콜레라균의 CTXA2B 및 열에 약한 장내독성 대장균의 LTXA2B와 대장균의 FimH 유전자를 결합시켜 융합단백질 백신을 제조한 것은 본 발명이 최초이다.

요로감염이나 방광염의 경우 세계적으로 70∼80％가 장내세균(enterobacteria)에 의해서 감염되어진다고 보고되었고, 이 중 치료 후 60％ 이상 재발병을 하고 있는 것으로 보고되고 있다. 이로 인해 대장균은 여러 가지 항생제에 대한 내성을 가지고 있으며 항생제의 한계성 즉, pH에 대한 안정성, 치료비용, 부작용 등의 문제로 인하여 대장균에 대한 예방 및 치료를 할 수 있는 백신개발이 시급한 실정이다.

이러한 상황에서 개발된 본 발명에서 요로감염성 대장균의 항원 단백질중 어 드헤신을 이용하게 된 이유는 어드헤신이 면역반응을 유도시킬 수 있고, 점막의 이뮤노글로빈(immunoglobulin)도 유발시킬 수 있는 단백질로 알려져 있으며, 요로감염성 대장균이 요로 점막 표면에 집락을 형성하게 하는 필수적인 단백질이기 때문이다. 또한 여러 항원 단백질과는 달리 독성이 없으며, 모든 요로감염성 대장균에 존재하는 단백질이고, 분자크기가 29kDa으로 요로 내에서도 다른 항원 단백질과 비교하여 안정한 단백질로 알려져 있기 때문이다.

한편 요로 감염증을 유발하는 초기단계의 숙주세포 부착에 결정적으로 관여하는 type 1 핌브리에의 소단백질인 FimH 어드헤신은 전신 면역반응을 유발시킬 수 있으나 점액성 면역반응이 약해 어드헤신 단독으로는 요로감염성 대장균에 대한 백신으로써의 가능성이 부족하므로, 본 발명에서는 점액성 면역보조제로 점막면역성을 두 배 이상 증가시킬 수 있는 것으로 알려진 비브리오 콜레라 톡신(CTX) 및 열에 약한 장내독소 대장균(LTX)의 독성부위(A1 소단위체)를 제거한 CTXA2B 및 LTXA2B 단백질을 유전자 재조합 기술을 이용하여 연결한 FimH/CTXA2B와 FimH/LTXA2B 융합 단백질을 클로닝하여 대장균 내에서 발현, 분리 및 정제하여 융합단백질들에 대한 생화학적 및 면역원성에 대한 특성을 조사하였다.

또한 분리된 융합단백질을 마우스에 각각 경구 투여하여 혈청과 질점액에서의 항체생성을 비교하여 요로감염성 대장균에 대한 백신으로서의 가능성을 검토하고, 면역보조제로서 LTXA2B와 CTXA2B 단백질의 기능을 조사하였다.

또한 융합단백질로 면역된 마우스에 요로감염대장균을 감염시켜, 요로병원 성 대장균에 대한 예방효과와 조직검사, 조금 더 나아가서 마우스에 요로감염성대 장균을 감염시킨 후 융합단백질을 마우스에 경구 투여한 후에 치료백신으로서 효과가 있는지를 검토하며 조직학적 검사를 통하여 확인하였다.

상기한 바와 같은 본 발명은,

1. 대장균의 항원 결정기를 코딩하는 유전자와 비브리오 콜레라 CTXA2B 유전자를 연결시켜서 제조되는 재조합 DNA인 것을 특징으로 한다.

2. 또한, 대장균의 항원 결정기를 코딩하는 유전자와 열에 약한 장내독소대장균 LTXA2B 유전자를 연결시켜서 제조되는 재조합 DNA인 것을 특징으로 한다.

3. 또한, 위 1 또는 2에 있어서, 항원결정기를 코딩하는 유전자는 FimH인 것을 특징으로 한다.

4. 또한, 서열번호 3(=도 2)에 기재된 FimH/CTXA2B 융합단백질의 염기서열을 함유하는 재조합 DNA인 것을 특징으로 한다.

5. 또한, 서열번호 1과 2(=도 1)에 기재된 FimH/LTXA2B 융합단백질의 염기서열을 함유하는 재조합 DNA인 것을 특징으로 한다.

6. 또한, 위 1 또는 2의 재조합 DNA를 함유하는 발현 플라스미드인 것을 특징으로 한다.

7. 또한, 위 5 또는 6의 염기서열을 함유하는 발현 플라스미드인 것을 특징으로 한다.

8. 또한, 위 7에 있어서, 발현 플라스미드는 pMAL-p2E인 것을 특징으로 한다.

9. 또한, 위 7의 발현 플라스미드를 세포주에 도입하여 형질전환 시킴으로서 제조되는 형질전환 미생물인 것을 특징으로 한다.

10. 또한, 위 9에 있어서, 세포주는 대장균인 것을 특징으로 한다.

11. 또한, 위 10에 있어서, 발현 플라스미드는 pMAL-p2E인 것을 특징으로 한다.

12. 또한, 위 10에 있어서, 형질전환 미생물은 E. coli PSC KCCM-10553 또는 E. coli PSL KCCM-10552 인 것을 특징으로 한다.

13. 또한, 위 11에 있어서, 형질전환 미생물은 E. coli PSC KCCM-10553 또는 E. coli PSL KCCM-10552 인 것을 특징으로 한다.

14. 또한, 위 9 내지 13 중 어느 하나의 형질전환 미생물에 의하여 생산되는 요로감염 대장균에 대한 백신 단백질인 것을 특징으로 한다.

15. 또한, 서열번호 4(=도 1)의 아미노산 서열을 함유하는 요로 감염대장균에 대한 융합 백신 단백질인 것을 특징으로 한다.

16. 또한, 서열번호 5(=도 2)의 아미노산 서열을 함유하는 요로 감염대장균에 대한 융합 백신 단백질인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 발명자들은 대장균의 FimH 유전자와 비브리오 콜레라균의 CTXA2B 유전자 및 대장균의 LTXA2B 유전자의 융합 디엔에이(DNA)에 의해 발현되는 융합단백질이 대장균 내에서 생산되도록 하기 위하여 먼저, 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 대장균의 FimH 유전자와 비브리오 콜레균의 CTXA2B 및 열에 약한 장내독소 대장균의 LTXA2B 유전자를 얻었다. 각각의 단편유전자를 제한효소 BamH와 HindIII로 절단 한 후, 다시 T4 디엔에이 리가제로 두 유전자를 결합시켰다. 이렇게 결합된 유전자와 pMAL-p2E 플라스미드를 제한효소 BamH와 HindIII로 절단한 후, 다시 T4 디엔에이 리가제로 두 유전자를 결합시켰다. 이 융합된 플라스미드를 pMALfimH/ctxA2B 및 pMALfimH/ltxA2B이라 명명하였으며, 이를 대장균 TB1에 하나한(Hanahan, D)의 방법으로 형질전환 시켰다(DNA cloning Vol.1. A practical Approach, IRL press, 1985, 135). pMALfimH/ctxA2B 및 pMALfimH/ltxA2B을 함유하는 대장균 형질전환체는 E. coli PSC 및 E. coli PSL로 명명되었으며, 2004년 1월 6일 한국종균협회 (KCCM)에 기탁번호 KCCM-10553과 KCCM-10552로 기탁하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

[실시예 1] : 요로계 감염 대장균의 염색체 디엔에이(DNA) 분리

요로감염성 대장균을 tryptic soy broth 배지에 접종하고 37℃에서 12시간 배양한 후, 염색체 디엔에이 분리법을 이용하여 대장균의 염색체 디엔에이를 분리했다.

[실시예 2] : fimH/ctxa2b 융합유전자의 증폭 및 클로닝

fimH/ctxa2b 융합유전자 단편 제조는 ctxa2b 앞부분의 12개의 염기를 fimH 유전자 뒷부분에 붙인 fimH'유전자(924 bp)와, fimH 뒷부분의 12개의 염기를 ctxa2b유전자 앞부분에 붙인 ctxa2b' 유전자(578 bp)를 5'말단에는 BamH1, 3'말단 에는 HindIII 제한효소 인식부위를 가지도록 디자인한 올리고뉴크레타이드 프라이머(oligonucleotide primer)를 사용하여 중합효소연쇄반응 방법으로 제조한 융합유전자를 증폭시켰다. 얻어진 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 1％ 아가로스(agarose) 겔로 전기영동 후, 이티비알(EtBr)로 염색한 다음 자외선 광에서 디엔에이 밴드를 관찰한 결과 fimH/ctxa2b의 계산된 크기에 해당하는 1,478 염기쌍의 위치에서 뚜렷한 디엔에이 밴드를 확인하였다[도 3]. 이들 증폭된 fimH/ctxa2b 융합유전자 단편들을 DsaI, Pst 및 SSpI 제한효소에 의해 절단하여 융합유전자의 크기가 정확한지를 확인한 결과 절단한 부위에서 정확한 밴드위치를 확인할 수 있었다. 확인된 융합유전자를 BamH1와 HindIII 제한효소들에 의해 잘려진 발현 벡터인 pMAL-p2E에 클로닝 하였다. 그 결과 pMALfimH/ctxa2b의 융합 유전자 클로닝 산물을 얻을 수 있었다[도 4A]. 이 산물은 BamH1와 HindIII 제한효소들에 의해 잘려져 벡터와 삽입 디엔에이 (fimH/ctxa2b 유전자 단편)로 나누어져 fimH/ctxa2b 유전자의 크기에 해당하는 1,478 염기쌍의 위치에서와 벡터의 크기에 해당하는 6,695 염기쌍에서 뚜렷한 디엔에이 밴드를 확인할 수 있었다[도 4B]. 또한 위의 제조한 올리고뉴크레타이드 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 클로닝되어진 fimH/ctxa2b 융합유전자 단편 부분의 크기를 1％ 아가로스 겔로 전기영동 후, 이티비알로 염색한 다음 자외선 광에서 디엔에이 밴드를 확인한 결과, 1,478염기쌍의 위치에서 뚜렷한 디엔에이 밴드를 재확인하였다[도 4C]. DsaI, Pst 및 SSpI 여러 제한효소들에 의해 클로닝되어진 전체 pMALfimH/ctxa2b 벡터를 절단하여 크기가 정확한지를 확인한 결과 절단되어진 부위에서 정확한 밴드위치를 확인할 수 있었다. 정확한 핵산 배열은 핵산 염기 서열 분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit; USB™)를 이용하여 확인하였으며 그 결과 fimH/ctxa2b 유전자의 아미노산 서열을 알 수 있었다. 핵산의 유사성 검색 결과 fimH와 ctxa2b 유전자와 100％ 일치함을 확인하였다(Blatter 등, 1997; Domenighimi 등, 1995; Mekalanos 등, 1983). 한편 비브리오 콜레라의 디엔에로부터 얻은 ctxa2b 유전자는 ctxa의 중지 암호(stop codon)와 ctxb의 개시암호(start codon)가 4개의 뉴클레오타이드(ATGA)로 중첩되어져 있는 것을 디엔에이 염기서열을 통해 확인할 수 있었다[도 2].

[실시예 3] : fimH/ltxa2b 융합유전자의 증폭 및 클로닝

fimH/ltxa2b 융합유전자 단편은 ltxa2b 앞부분의 12개의 염기를 fimH 운전자 뒷부분에 붙인 fimH'유전자 (924 bp)와 fimH 뒷부분의 12개의 염기를 ltxa2b 유전자 앞부분에 붙인 ltxa2b' 유전자 (611 bp)를 5'말단에는 BamH1, 3'말단에는 HindIII 제한효소 인식부위를 가지도록 디자인한 올리고뉴크레타이드 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응 방법으로 제조한 융합유전자를 증폭시켰다. 얻어진 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 1％ 아가로스 겔로 전기영동 후, 이티비알로 염색한 다음 자외선 광에서 디엔에이 밴드를 관찰한 결과 fimH/ltxa2b의 계산된 크기에 해당하는 1,511 염기쌍의 위치에서 뚜렷한 디엔에이 밴드를 확인하였다[도 5]. 확인된 융합유전자를 BamH1와 HindIII 제한효소들에 의해 잘려진 발현 벡터인 pMAL-p2E에 클로닝 하였다. 그 결과 pMALfimH/ltxa2b의 융합 유전자 클로닝 산물을 얻을 수 있었다[도 6A]. 이 산물은 BamH1와 HindIII 제한효소들에 의해 잘려져 벡터와 삽입 디엔에이(fimH/ltxa2b 유전자 단편)로 나누어져 fimH/ltxa2b 유전자의 크기에 해당 하는 1,511 염기쌍의 위치에서와 벡터의 크기에 해당하는 6,695 염기쌍에서 뚜렷한 디엔에이 밴드를 확인할 수 있었다[도 6B]. 또한 위의 제조한 올리고뉴크레타이드 프라이머을 사용하여 중합효소연쇄반응 방법으로 클로닝 되어진 fimH/ltxa2b 유전자 단편 부분의 크기를 1％ 아가로스 겔로 전기영동 후, 이티비알로 염색한 다음 자외선 광에서 디엔에이 밴드를 확인한 결과, 1,511 염기쌍의 위치에서 뚜렷한 디엔에이 밴드를 재확인하였다[도 6C]. 정확한 핵산 배열은 핵산염기 서열 분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit; USB™)를 이용하여 확인하였으며, 그 결과 fimH/ltxa2b 유전자의 아미노산 서열을 알 수 있었다. 핵산의 유사성 검색 결과 fimH와 ltxa2b 유전자와 100℃ 일치함을 확인하였다(Blatter 등, 1997; Domenighimi 등, 1995; Dallas 등, 1980; Domenighini 등, 1995; Spicer 등, 1981). 한편 열에 약한 장내독소 대장균 DNA로부터 얻은 ltxa2b 유전자는 ltxa의 중지 암호와 ctxb의 개시 암호가 4개의 뉴크레오타이드 (ATGA)로 중첩되어져 있는 것을 디엔에이 염기서열을 통해 확인할 수 있었다[도 1].

[실시예 4] : 대장균의 형질전환

대장균 DH5α 균주를 이용하여 competent 세포를 다음과 같은 방법으로 제조하여 사용하였다. LB 액체배지 7㎖에 DH5α를 접종한 후 12∼14시간 동안 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다. 이후 이 중 1㎖를 50㎖ LB 액체배지에 접종한 후 OD₆₀₀에서 0.5∼0.6이 될 때까지 진탕 배양한 후 5분간 얼음에 방치하였다. 배양액 30㎖를 멸균된 관에 옮긴 후 4℃, 12,000 × g에서 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 얼음에 방치되어진 형질전환 완충용액 (50 mM CaCl₂) 15㎖를 15분간 tapping을 하며 얼음에 방치한다. 4℃ 12,000 × g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 버리고, 3㎖를 형질전환 완충액 (50mM CaCl₂) 3㎖을 가한 후 4℃에서 3시간 방치한다. 제조된 200㎕의 competent 세포에 클로닝이 되어진 플라스미드을 2㎕ 가한 후 30분간 얼음에서 교반한 후 방치하였다. 이후 90초간 42℃에서 열 충격을 준 후 2분간 얼음에 방치하였다. 여기에 LB 액체배지를 1㎖ 가한 후, 37℃진탕배양기에서 200 × g의 속도로 1시간 동안 진탕 배양시킨 후, 7,000 × g에서 원심분리 하여 세포 침전물을 얻은 후 상등액 1㎖를 제거하고, 이를 혼탁한 후 항생제 함유 LB 고체배지에 10㎕와 100㎕씩 각각 도말하여 하룻밤 동안 37℃에서 배양하였다. 형질 전환된 plasmid를 단백질 발현을 위해 대장균 K12 TB1 균주를 앞에서 서술한 방법과 같이 동일하게 형질 변환을 하였다. 항생제 함유 LB 고체배지에 10㎕와 100㎕씩 각각 도말한 후 18시간 이상 배양하였다. 벡터 내 클로닝부위에 β-gal 유전자가 삽입되어 있는 경우에는 X-gal 기질을 부가하여 항생제가 함유된 LB 고체 배지 상에서 무색의 요로 감염성 대장균을 색출하여 배양하여 분리하였다. pMALfimH/ctxA2B 및 pMALfimH/ltxA2B을 함유하는 대장균 형질 전환체는 E. coli PSC 및 E. coli PSL로 명명되었으며, 2004년 1월 6일 한국종균협회(KCCM)에 기탁번호 KCCM-10553과 KCCM-10552로 기탁하였다.

[실시예 5] : 중합효소연쇄반응

fimH/ctxa2b를 증폭하기 위한 중합효소연쇄 반응은 fimH', ctxa2b' 50 ng을 주형으로 primer를 20 pmole, 0.25 mM dNTPs를 사용해 Takara사의 pfu 중합효소를 사용해 공급회사의 중합효소연쇄 반응 수행방법(High fidelity PCR kit : Boehringer Mannheim, U.S.A)에 따라 94℃에서 120 초간 변성하고, 94℃에서 10초간 다시 변성하고, 55℃에서 60초간 annealing하고, 72℃에서 60초간 신장으로 10회 반복한 다음, 다시 94℃에서 15초간 다시 변성하고, 58℃에서 30초간 annealing하고, 70℃에서 180초간 신장으로 20회 반복하여 증폭한 후, 72℃에서 420초간 완료한 후 4℃에서 저장하였다.

fimH/ltxa2b를 증폭하기 위한 PCR 반응은 fimH'와 ltxa2b' 50 ng을 주형으로 하여 앞에서 서술한 fimH/ctxa2b 증폭과 동일한 방법으로 시행하였다. 단지 차이점은 54℃에서 60 초간 annealing하고 다시 58℃에서 60초간 annealing하고 72℃에서 160초간 신장할 때에 약간의 차이가 있었다.

[실시예 6] : G_Ml-ganglioside ELISA 분석

콜레라톡신(CTX) 및 열에 약한 장내독소 대장균 (LTX)의 B 소단위체는 점막층에 존재하는 monosialoganglioside G_Ml과 특이적으로 결합하는 성질을 가지고 있어 ELISA을 이용하여 CTX 및 LTX, 특히 CTXB 및 LTXB를 정량할 때 사용할 수 있다. G_Ml-ganglioside ELISA는 먼저 G_Ml-ganglioside을 PBS로 1㎍/㎖가 되도록 희석한 후 ELISA plate의 각 well에 100㎕씩 넣고 상온에서 하룻밤을 배양한다. Plate 각 well을 PBS로 3 번 씻고, 물기를 완전히 제거한 다음, blocking 용액(PBS에 1％ BSA)을 200㎕씩 넣은 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. Plate의 well을 PBS로 3 번 씻어내고 샘플을 희석한 용액을 plate에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. Well을 PBS로 씻고 1 차 항체 (anti-CTX goat antibody, Biogenesis Co., 2060-0004)를 2,000 배 희석하여 각 well에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. PBS로 well을 씻어 내고 2차 항체(anti-goat IgG alkaline phosphatase conjugate antibody, Sigma Co., A4187)를 5,000배 희석하여 각 well에 100㎕ 씩 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. PBST로 well을 씻어 내고 para-nitrophenylphosphate (pNPP) 용액을 각 well에 100㎕씩 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨다. 반응 후 ELISA reader를 이용하여 파장 405nm에서 샘플의 흡광도를 측정하였다.

[실시예 7] : FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 발현

FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B의 단백질 발현을 확인하기 위하여 각각의 pMALfimH/ctxa2b 및 pMALfimH/ltxa2b을 함유하고 있는 대장균 TB1을 0.2％ 글루코스 가 포함된 LB 배지에 배양한 다음 OD₆₀₀에서 배양액의 흡광도가 0.5∼0.6에 도달하였을 때 IPTG의 최종농도가 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 및 1.0 mM이 되도록 넣어 클로닝 된 유전자를 각각 유도 발현시켰다. IPTG 유도 후, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 및 48 시간 된 균체들을 각각 채취하여 7％와 15％ SDS-PAGE로 전기영동 한 후 코마시에 블루(commassie blue) 시약으로 염색한 결과 MBP(42.2 kDa)와 결합된 FimH/CTXA2(36 kDa) 단백질 크기로 추정되는 약 78kDa과 CTXB 단백질로 추정되는 14kDa 크기의 단백질 밴드가 IPTG 유도 후 모든 배양 시간에서 확인되었다[도 7A, 도 7C]. 이는 유전적으로 연결시킨 fimH/ctxa2b 융합유전자를 발현벡터에 클로닝하여 발현시켰을 때, Mekalanos 등(1983)이 언급한 ctx operon에서와 같이 두 개의 단백질이 동일한 메세지에 의해서 번역되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 동일한 SDS-PAGE 겔로 immunoblot 분석 결과 MBP와 CTXB 항체를 이용하여 MBP/FimH/CTXA2 및 CTXB에 특이적인 단백질 밴드를 확인하였다[도 7B, 도 7D]. 또한 FimH/CTXA2B 단백질의 존재 위치를 G_Ml-ganglioside ELISA 법으로 확인하였고, 세포 밖 페리프라슴 공간에서 주로 용해성 형태로 발현됨을 확인하였다.

또한 FimH/LTXA2B의 단백질 발현을 확인하기 위해서 앞서 서술한 방법과 동일하게 시행하여 7％와 15％ SDS-PAGE로 전기영동 한 후 코마시에 블루 시약으로 염색한 결과 MBP(maltose binding protein, 42.2kDa)와 결합된 FimH/LTXA2(37kDa)단백질 크기로 추정되는 약 79kDa과 LTXB 단백질로 추정되는 14kDa 크기의 단백질밴드가 IPTG 유도 후 모든 배양시간에서 확인되었다[도 8A, 도 8C]. 이는 유전적으로 연결시킨 fimH/ltxa2b 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 발현시켰을 때, ctx operon에서와 같이 두 개의 단백질이 동일한 message에 의해서 번역되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 동일한 SDS-PAGE 겔로 immunoblot 분석 결과 MBP와 LTXB 항체를 이용하여 MBP와 FimH/LTXA2 및 LTXB에 특이적인 단백질 밴드를 확인하였다[도 8B, 도 8D]. 또한 FimH/LTXA2B 단백질의 존재 위치를 G_Ml-ganglioside ELISA법으로 확인하였고, 세포 밖 페리프라슴 공간에서 주로 용해성 형태로 발현됨을 확인하였다.

[실시예 8] : 융합단백질의 정제

pMALfimH/ctxa2b 및 pMALfimH/ltxa2b plasmid를 포함하는 대장균 TB1이 생산하는 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질을 분리 및 정제를 하기 위하여 단백질 생성 최적 조건으로 배양하여 2 리터 배양액으로부터 각각 23㎎과 34㎎의 총 단백질들을 얻었다. 페리프라슴 공간에서 분리하기 위해서 Neu 등(1965) 방법에 언급한 삼투압 충격방법과 아일로스 레진(amylose resin)으로 충진 된 흡착 크로마토그라피(2×10㎝)을 이용하여 공급 회사의 지시된 방법 (pMAL™ Protein Fusion and Purification System, New England Biolabs, INC, USA)에 따라 정제를 행하여 얻어진 각 단백질 분획들을 UV 280 ㎚로 확인한 결과 FimH/CTXA2B의 경우 23∼28번 분획에서 단백질 정제가 일어났으며, FimH/LTXA2B은 36∼44번 분획에서 각각 단백질 정제가 되었다. G_Ml-ganglioside ELISA법을 이용하여 분획을 확인한 결과, FimH/CTXA2B는 18∼12번 분획에서, FimH/LTXA2B는 29∼34번 분획에서 역시 G_Ml-ganglioside 활성을 나타냈다. 또한 정제한 단백질의 순도검정과 순수 단백질임을 확인하기 위하여 각 단백질들의 UV 측정과 G_Ml-ganglioside 활성을 나타난 분획들을 amicon centriprep concentrator을 이용하여 농축을 한 후 SDS-PAGE[도 7A, 도 7C]와 MBP, CTX 및 LTX 항체를 이용하여 각각의 단백질에 대해서 western blot을 실시하였다. 그 결과 FimH/CTXA2B 융합단백질은 78kDa(MBP/FimH/CTXA2) 크기와 14kDa(CTXB monomer)의 정제되어진 단백질 밴드를 동시에 확인할 수 있었다[도 9B, 도 9D]. FimH/LTXA2B 단백질 또한 81kDa(MBP/FimH/LTXA2)크기와 14kDa(LTXB monomer)의 단백질 정제 밴드를 동시에 SDS-PAGE[도 10C]와 Western blot[도 10A, 도 10B]로 확인할 수 있었다. 한편 각 정제되어진 단백질들을 Bradford법으로 단백질 정량을 한 결과 2리터의 배양액으로부터의 최종 분리한 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B의 융합단백질들의 양은 각각 0.6㎎과 0.8㎎ 얻을 수가 있었다.

[실시예 9] : FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질의 면역원성 실험

실험군은 총 6개의 군으로 설정하였고, 각 군은 6∼8 주령의 BALB/c 생쥐 6마리로 구성하여 10일 간격으로 3번 면역화 시켰으며, 매번 100㎍과 25㎍의 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질과 200㎍의 FimH 단백질, 20㎍의 CTXA2B, 20㎍의 LTXA2B 단백질들을 존대를 이용하여 경구투여 하였다. 대조군은 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2)를 경구 투여하였다. 이때 사용할 동물을 경구투여 2시간 전과 투여 후 1시간 동안 절식시켰다. 3번째 면역화 후, 7일에 부검하여 혈액 샘플들을 채취하였다. 채취한 혈청에서의 IgG 항체들의 양을 ELISA법으로 각각의 항체 생성량을 정량하였다.

혈청에서의 IgG 항체 생성량을 대조군, FimH, CTXA2B, 및 LTXA2B 단일 투여군들과 비교할 때 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 투여군에서의 항체 생성량이 매우 유의성이 높은 것으로 나타났다[도 11].

순수 정제된 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합 단백질들의 점액에서 sIgA 항체 생성을 조사하기 위하여 6∼8주령의 암컷 BALB/c 생쥐 6마리를 한 군으로 하여 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질들 100㎍ 투여한 군, FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질 25㎍ 투여한 군, FimH 단백질 100㎍ 투여한 군, CTXA2B와 LTXA2B 단백질 20㎍ 투여한 군과 대조군으로 PBS 투여한 군으로 모두 8군으로 나누어 10일 간격으로 3번 경구 투여하여 면역화시켰다. 점액 샘플은 마우스의 질 세척을 통해 채취했으며 질 세척은 마우스 실험 3일 전부터 펜토바비탈 (pentobarbital) 100 mg/kg을 복강 내로 주사하여 마취시키고 마우스의 질을 통해서 마이크로파이펫을 이용하여 마우스 당 PBS 50㎍ 각 샘플들을 따로 모아서 원심 분리하여 상등액만 모았다. 채취한 샘플에서 sIgA 항체들의 생성량을 ELISA법으로 측정하였다. 최종 면역화 10일 후 점막에서 sIgA 항체 생성량을 대조군, FimH, CTXA2B 및 LTXA2B 투여군들과 비교하여 볼 때 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 투여군들이 단일 투여군들보다 항체 생성량이 매우 유의성 있게 나타났다[도 12].

[실시예 10] : ELISA 방법에 의한 항체 생성 측정

96-well Nunc Immunoplate (MaxiSorp U16j Nunc, Roskilde, Denmark)에 항원을 30㎍/㎖로 희석을 시킨 후 각 well에 100㎕씩 처리하여 37℃ 배양기에서 하루동안 반응 시켰다. Plate를 0.05％ Tween 20이 포함된 PBST 완충액으로 씻어내고 PBS에 1％ BSA가 포함된 blocking 용액을 각 well마다 200㎕씩 가하여 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 well을 PBST 완충액으로 3번 씻어내고, 마우스 질 세척을 통해 얻어진 샘플과 혈청을 10배 희석한 후 샘플 용액을 100㎕씩 처리하고, 상온에서 1∼2시간 동안 반응시킨 후 각 well을 PBST 완충액으로 3번 씻어내고, 1％ BSA가 포함된 완충액에 alkaline phosphatase conjugate anti-mouse IgG, IgA와 IgM을 1,000배로 희석하여 100㎕씩 처리하고, 상온에서 1∼2시간 동안 반응 시킨 뒤, PBST 완충액으로 3번 씻어낸 다음, p-nitrophenylphosphate(pNPP) 100㎕씩 가하여 상온에서 30분간 반응시킨다(Elson 등, 1984). Automatic Microplate Reader (Molecular device, U.S.A.)로 405㎚에서 결과를 판독하였다.

[실시예 11] : FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질의 예방백신효과

FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질들의 요로감염성 대장균에 대한 예방백신 효과를 보고자 FimH/CTXA2B(100㎍), FimH/LTXA2B(100㎍), FimH(200㎍), CTXA2B(20 ㎍), 및 LTXA2B(20㎍) 단백질 농도로 각각 면역화가 되어진 생쥐에 대한 요로감염성 대장균의 감염 여부를 조사함으로서 측정하였다. 실험군은 총 6개의 군으로 설정하였고, 각 군은 6마리의 암컷 BALB/c 생쥐을 구성하여, 각각의 샘플들을 10일 간격으로 3번 존데를 이용하여 경구 투여를 하였다. 대조군은 PBS로 경구투여 하였다. 3번째 면역 후, 10일에 요로감염성 대장균 J96 균주를 5 ×10⁷ CFU/㎖으로 멸균한 24-gauge Teflon catheter(외경, 0.7mm; 길이, 19mm; Becton Dickinson Infusion Therapy System, Inc., Sandy, Utah) 사용하여 생쥐의 요도를 통해 방광에다 50㎕씩 주입하였다 (Asahara 등, 2001; Hopkins 등, 1995; Jones-carson 등, 1999). 감염 후 3일째에 각 군들의 마우스를 부검하여 방광들을 절개하여 PBS 1㎖에 담구고 분쇄하였다 (ULTRA-TURRAX T25). 각 시료들을 PBS로 10배씩 희석시킨 후, 요로감염성 대장균 J96 선택 고체 배지 위에 100㎕를 접종하여, 37℃ 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 요로감염성 대장균 J96이 배양된 고체 배지 위에서 나타난 집락수를 계산하여 대조군 및 단일 투여군과 비교함으로서 요로감염성대장균에 대한 감염 예방 효능을 측정하였다.

그 결과 대조군에서 2.3 × 10⁵ CFU/㎖로 감염되었고, FimH 투여군은 8.8 ×10⁴ CFU/㎖로 감염되었다. FimH/CTXA2B 투여군은 8.2 × 10³ CFU/㎖, FimH/LTXA2B 투여군은 9.4 × 10³ CFU/㎖로 감염이 되었다. 이 실험 결과 대조군과 FimH 투여군에 비해 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 100 ㎍ 투여한 군에서 예방 효과가 매우 높게 나타난 것으로 평가된다[도 13].

[실시예 12] : 조직병리학적 검사

FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질의 요로감염성 대장균에 대한 예방백신으로서의 효과를 좀 더 알아보고자, 융합단백질로 면역화 되어진 생쥐에 요로감염성 대장균으로 감염을 시킨 생쥐의 방광을 절개하여 H＆E 염색시약을 이용하여 방광조직에서의 염증유발 시 가장 먼저 침투하는 면역세포 중의 하나인 호중구(neutrophil) 수의 증가를 조작학적 검사를 통하여 알아보았다. 대조군의 경우 점막 표면층 주변에 많은 수의 호중구가 모여 있음을 볼 수 있었다 [도 14-A]. CTXA2B 및 LTXA2B 투여군도 대조군 못지않게 많은 수의 호중구가 모여 있었음을 알 수 있었다[도 14-C, 도 14-E], 반면 FimH 단일 투여군의 경우 대조군에 비해 적은 수의 호중구가 모여 있음을 알 수 있었다[도 14-B]. 한편 융합단백질 투여군에서 호중구의 수가 점막층 주변에 거의 없음을 알 수 있었다[도 14-D, 도 14-F]. 이는 융합단백질에 의해 IgG 및 sIgA 항체 생성이 유도가 되어 박테리아를 중화시켰거나 또는 점막층에 박테리아가 부착을 하지 못해 염증 반응이 방광 내에서 일어나지가 않았음을 보여준다.

또한 방광 점막층 주변에 박테리아 부착 정도를 그람염색을 이용하여 알아보았다. 대조군의 경우 점막층 주변 층에 따라 많은 수의 요로감염성 대장균이 밀집되어 있는 것을 볼 수 있었다[도 15-A]. CTXA2B 및 LTXA2B 투여군 경우에도 대조군 못지않게 많은 수의 대장균들이 모여 있음을 볼 수 있었다[도 15-C, 도 15-E]. FimH 단독 투여군의 경우 대조군에 비해서는 적지만 대장균이 점막층 라인에 따라 모여 있음을 볼 수 있었다[도 15-B]. 반면 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질을 투여한 군들에서는 점막층 주변에 박테리아 수가 상당히 감소되어진 것을 볼 수 있었다[도 15-D, 도 15-F].

[실시예 13] : Myeloperoxidase (MPO) Assay

MPO 분석은 염증유발 시 가장 먼저 침투하는 면역세포 중의 하나인 호중구의 증가를 측정할 수 있는 지표 실험이다. 예방백신 효과에서 MPO을 측정하기 위하여 실험군은 총 6 개의 군으로 설정하였고, 각 군은 6 마리의 암컷 BALB/c 생쥐로 구성하였고, FimH/CTXA2B(100 ㎍/mouse), FimH/LTXA2B(100 ㎍), FimH(200 ㎍), CTXA2B(20 ㎍) 및 LTXA2B(20 ㎍) 단백질을 10일 간격으로 존데를 이용하여 3번 경구 투여하였다. 대조군은 PBS로 경구투여 하였다. 요로감염성대장균 J96을 5 × 10⁷ CFU/㎖의 농도로, 멸균한 24-gauge Teflon catheter (외경, 0.7 mm; 길이, 19mm; Becton Dickinson Infusion Therapy System, Inc., Sandy, Utah) 사용하여 각 군들의 생쥐 요도를 통해 방광에다 50㎕씩 주입하였다. 감염 3일째에 각각의 생쥐의 방 광을 절개하여 PBS 1㎖에 담구고 동일 분쇄(ULTRA-TURRAXT25)를 했다. 원심분리 후 침전물에 0.5％ HTAB(Hexaadecyltrimethyl- ammnounium Bromide in PBS) 500 ㎕를 가한 후 10 초간 얼음 상태에서 초음파를 하였다. 세포추출액을 10,000 × g에서 원심분리를 한 후 상등액을 취하였다(Haraoka 등, 1999). 상등액을 10 ㎕씩 96 well plate 에 분주한 후, 각 well에 TMB(0.1 ㎎/㎖ tetramethylbenzidine dihydrochloride, 0.05 M phosphate citrate buffer, pH 5.0) 용액을 1:1 비율로 혼합한 후 100 ㎕씩 분주하였다. 발색되는 정도에 따라 650nm에서 Microplate Reader를 이용하여 흡광도 측정하였다.

측정 결과 대조군에 비해 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 투여군 모두 호중구의 수가 유의성 있게 감소하는 것을 볼 수 있었다[도 16]. 이는 예방 백신효과로서 가능성을 보여준다. 요로병원성 대장균으로 요로 감염을 시킬 경우 방광 점막부위 혈관 내에 존재하는 많은 수의 호중구 및 백혈구가 감염부위에 모이게 되고 이들 세포간의 면역반응이 증가하게 됨으로써 염증반응이 크게 확대되고 조직 손상에 이르게 된다. 이때 호중구의 수가 감소할 경우 감염에 대한 예방효과가 있다고 볼 수가 있다.

[실시예 14] : FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질의 치료백신효과

FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 단백질의 요로감염성 대장균에 대한 치료백신으로서의 효과를 측정하기 위하여 실험군은 총 6개의 군으로 설정하였고, 각 군은 6마리의 암컷 BALB/c 생쥐로 구성하였고, 요로감염성 대장균 J96 균주를 5× 10⁷ CFU/㎖의 농도로 멸균한 24-gauge Teflon catheter (외경, 0.7㎜; 길이, 19㎜; Becton Dickinson Infusion Therapy System, Inc., Sandy, Utah) 사용하여 각 군들의 생쥐 요도를 통해 방광에다 50 ㎕씩 주입하였다 (Asahara 등, 2001; Hopkins 등, 1995; Jones-carson 등, 1999). 감염 후 1일에 FimH(200㎍), CTXA2B(20㎍), LTXA2B(20㎍), FimH/CTXA2B(100㎍) 및 FimH/LTXA2B(100㎍)을 존데를 이용하여 경구 투여를 한 후 8일, 5일 간격으로 총 3번 경구 투여하였다. 대조군은 PBS로 경구투여 하였다. 마지막 투여 후 3일에, 각 생쥐의 방광을 절개하여 PBS 1㎖에 담구고 분쇄하였다(ULTRA-TURRAX T25). 각 시료들을 PBS로 10배씩 희석시킨 후 요로감염성 대장균 J96 선택 고체배지 위에 100㎕씩 도말하여 37℃ 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 요로감염성 대장균 J96 선택 고체배지 상에서 나타난 집락수을 계산하여 대조군 및 단일 투여군과 비교하여 요로병원성 대장균에 대한 치료효과를 조사하였다.

그 결과 대조군에서 8.8 × 10⁵ CFU/㎖로 감염되었고, FimH 단일 투여군에서 3.4 × 10⁵ CFU/㎖로 감염되었다. FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 투여군에서 각각 2.4 × 10⁴ CFU/㎖와 1.3 × 10⁴ CFU/㎖로 감염이 된 것을 확인하였다. 대조군 및 FimH 투여군에 비해 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 100 ㎍ 투여한 군에서 요로감염성 대장균에 의한 요도 감염이 상당히 완화된 것으로 보아 치료효과도 높은 것으로 사료된다[도 17].

[실시예 15] : 치료 백신 효과에 대한 MPO 측정

앞서 서술한 예방효과 실험 방법과 동일하게 시행한 결과 대조군에 비해 FimH/CTXA2B 및 FimH/LTXA2B 융합단백질 투여군 모두 호중구의 수가 유의성있게 감소하는 것을 볼 수 있었다[도 18]. 이는 치료 백신효과로서 가능성을 보여주었다. 요로병원성 대장균으로 요로 감염을 시킬 경우 방광 점막부위 혈관 내에 존재하는 많은 수의 호중구 및 백혈구가 감염부위에 모이게 되고 이들 세포간의 면역반응이 증가하게 됨으로써 염증반응이 크게 확대되고 조직 손상에 이르게 된다. 이때 호중구의 수가 감소할 경우 감염에 대한 치료효과가 있다고 볼 수가 있다.

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서열번호 3에 기재된 FimH/CTXA2B 융합단백질의 염기서열로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 DNA.
서열번호 1과 2에 기재된 FimH/LTXA2B 융합단백질의 염기서열(그 중 FimH 유전자에 해당하는 부위는 서열번호 1의 목록 중 첫 번째 염기부터 908번째 염기까지임)로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 DNA.
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제4항 또는 제5항의 염기서열을 함유함을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
제7항에 있어서,

발현 플라스미드는 pMAL-p2E인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
제7항의 발현 플라스미드를 세포주에 도입하여 형질전환 시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
제9항에 있어서,

세포주는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질 전환 미생물.
제10항에 있어서,

발현 플라스미드는 pMAL-p2E인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
제10항에 있어서,

형질전환 미생물은 E. coli PSC KCCM-10553 또는 E. coli PSL KCCM-10552 인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
제11항에 있어서,

형질전환 미생물은 E. coli PSL KCCM-10553 또는 E. coli PSL KCCM-10552 인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
제9항의 형질전환 미생물에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 요로감염 대장균에 대한 백신 단백질.
제10항의 형질전환 미생물에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 요로감염 대장균에 대한 백신 단백질.
제11항의 형질전환 미생물에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 요로감염 대장균에 대한 백신 단백질.
제12항의 형질전환 미생물에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 요로감염 대장균에 대한 백신 단백질.
제13항의 형질전환 미생물에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 요로감염 대장균에 대한 백신 단백질.
제14항에 있어서,

서열번호 4의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 요로 감염대장균에 대한 융합 백신 단백질.
제14항에 있어서,

서열번호 5의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 요로 감염대장균에 대한 융합 백신 단백질.