CN104470537A - 表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的伤寒沙门氏菌Ty21a及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文描述了用于表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的质粒构建体的产生。在所公开的质粒中，所述F1-V融合蛋白编码序列与大肠杆菌htrA启动子可操作地连接，并且与大肠杆菌HlyA分泌信号序列框内融合。还描述了包含所述F1-V融合蛋白表达质粒的肠道沙门氏菌血清变型伤寒沙门氏菌菌株Ty21a，例如用作抗鼠疫的口服疫苗。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年5月23日提交的美国临时申请61/650,676的优先权，所述临时申请以引用的形式全文纳入本文。
技术领域
本公开内容涉及开发用于产生针对鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)——鼠疫的致病菌——的保护作用的免疫原性组合物。本公开内容还涉及包含F1-V融合蛋白表达构建体的伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)菌株Ty21a，及其使用方法。
背景技术
鼠疫耶尔森氏菌是鼠疫的致病菌。历史上已记录了鼠疫的至少3次大流行，其杀死了近2亿人。鼠疫是人畜共患病(zoonotic disease)，通常通过被感染的跳蚤的叮咬传播。鼠疫耶尔森氏菌的天然贮存宿主包括啮齿目动物、松鼠和草原犬鼠(prairie dog)。目前，鼠疫耶尔森氏菌的大的贮存宿主存在于除了澳大利亚之外的所有主要人类栖息地(Sun et al.,J Infect Dev Ctries 5(9):614-627,2011)。鼠疫在世界上许多地方流行，包括非洲、中国、印度、南美部分地区和美国西南部(Yanget al.,J Immunol 178:1059-1067,2007；Leary et al.,Microb Pathog23:167-179,1997)。最近的流行病学研究表明，全世界每年有大约4000个人类鼠疫病例(Sun et al.,J Infect Dev Ctries 5(9):614-627,2011)。因此，鼠疫仍然是严重的公共健康问题。
鼠疫最常表现为腺鼠疫，其特征在于突然发热以及靠近跳蚤叮咬处的淋巴结肿痛(“炎性淋巴腺肿”)。用抗生素迅速治疗通常是有效的(Morton et al.,Vaccine 22:2524-2532,2004)。但是，细菌能够从跳蚤叮咬处广泛传播，并且在某些情况下，会感染肺部。如果肺部被感染，鼠疫可在由咳嗽或喷嚏所产生的气溶胶中传播，导致原发性肺鼠疫的爆发(Leary et al.,Microb Pathog 23:167-179,1997)。肺鼠疫是高度传染性的，并且通常是致命的(Morton et al.,Vaccine22:2524-2532,2004)。因为鼠疫是高度传染性的，并且能通过气雾化传播，鼠疫耶尔森氏菌被认为是潜在的生物武器(Sun et al.,J InfectDev Ctries 5(9):614-627,2011；Yang et al.,J Immunol 178:1059-1067,2007)。
发明内容
本文公开了用于表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的质粒构建体的产生。还公开了包含所述公开的质粒构建体的肠道沙门氏菌血清变型伤寒沙门氏菌菌株Ty21a(称为“伤寒沙门氏菌Ty21a”或“Ty21a”)，例如用作抗鼠疫的疫苗。
本文提供了重组核酸分子，包含可操作地连接到诱导型启动子的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列，所述诱导型启动子在真核宿主细胞中具有活性，如大肠杆菌(Escherichia coli)htrA启动子。在某些实施方案中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1-1558至少85％相同的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子还包含分泌信号肽编码序列(如大肠杆菌HlyA分泌信号序列)，其与F1-V融合蛋白编码序列框内融合。在具体的非限制性实施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1的序列。
还提供了包含所公开的核酸分子的质粒，以及包含所公开的核酸分子或质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌。
在一个非限制性实施方案中，提供了重组核酸分子，其包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列，以及与所述F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO:1。还提供了包含所述核酸分子、复制起点、选择性标记以及大肠杆菌HlyB和HlyD蛋白编码序列的质粒。还提供了包含所述质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a。
还提供了免疫原性组合物，其包括包含F1-V表达质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a和可药用载体。
本公开内容还提供了在受试者中引起针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的方法，所述方法是通过给予所述受试者包含F1-V表达载体的伤寒沙门氏菌Ty21a或是通过给予本文所公开的免疫原性组合物进行。还提供了在受试者中预防鼠疫、降低发生鼠疫的风险或治疗鼠疫的方法，所述方法是通过给予所述受试者包含本文所公开的质粒或重组核酸分子的伤寒沙门氏菌Ty21a或是通过给予如本文所公开的免疫原性组合物进行。
根据以下参考附图进行的详细描述，本发明的前述和其他目的、特征和优点将会变得更加显而易见。
附图说明
图1是克隆到质粒pHtrF1-V-Hly中的所述合成F1-V融合DNA插入片段的示意图。
图2是质粒pHtrF1-V-Hly(9407bp)的示意图，其由克隆到低拷贝质粒pGB-2中的鼠疫F1-V基因融合构建件组成。所述pGB-2复制起点(ORI)的位置与可选择的大观霉素抗性基因(spcR)相邻。所述合成的基因融合插入片段是由与F1-V基因连接的(其通过修饰的接头(linker)序列相互融合)并且与HlyA细胞外分泌信号(HlyAs)连接的htrA启动子组成。所述质粒还包括分泌机器蛋白HlyB和HlyD的编码序列。
图3示出了通过SDS-PAGE对蛋白质提取物进行的分析。使用pHtrF1-V-hly(包含鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白)或pHtrPAcm-hly(包含炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)；如记载于Osorio et al.,InfectImmun 77(4):1475-1482,2009)转化伤寒沙门氏菌Ty21a。使培养物过夜培养，并收集培养物上清液(S)和细胞沉淀(P)。通过SDS-PAGE分析蛋白质提取物，并用市售的抗F1单克隆抗体或抗V单克隆抗体探测。用pHtrF1-V-hly转化的伤寒沙门氏菌Ty21a产生并分泌所述F1-V融合蛋白(58kDa)。
图4的两个图示出了针对F1-V和PA抗原的总的血清IgG效价。通过腹膜内途径，使用3个每两周一次的剂量(含有产生F1-V或之前构建的炭疽杆菌PA的伤寒沙门氏菌Ty21a)免疫10只6-8周龄小鼠的组。第三组小鼠接受了产生F1-V的Ty21a和产生PA的Ty21a的1:1的混合物。对照组小鼠接受了3个剂量的用空pGB-2载体转化的Ty21a。经免疫的小鼠接受了2-5×107菌落形成单位形成单位(CFU)/剂量。在第三次和最后一次免疫后一周收集血清。通过ELISA分析总的循环F1-V特异性和PA特异性的IgG效价。
图5的图表示出了针对F1-V抗原的总的血清IgG效价。每两周使用以F1-V质粒或空pGB-2载体转化的伤寒沙门氏菌Ty21a，通过腹膜内途径，免疫8周龄小鼠(每个时间点每一组n＝5)3次。在0周、2周和4周时，小鼠接受了2-5×107菌落形成单位(CFU)/剂量。在0、1、3和5周时，收集来自每次处理的5只小鼠的血清。通过ELISA分析总的循环F1-V特异性的IgG效价。
图6A-6D的图表示出了对rF1-V的脾细胞体外回忆应答。未对10只6-8周龄小鼠的组进行免疫，或者通过腹膜内途径使用3个每两周一次的剂量(含有产生F1-V或空pGB2载体的Ty21a)对其进行免疫。经免疫的小鼠接受2-5×107CFU/剂量。在第三次和最后一次免疫后一周收集脾细胞，并在体外用rF1-V刺激72小时。收集培养物上清液并针对细胞因子进行分析。
序列表
列于所附序列表中的核酸和氨基酸序列是使用如37C.F.R.1.822所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。只显示每条核酸序列的一条链，但是应理解任何提及所示链时均包括其互补链。所述序列表以创建于2013年5月9日的13.8KB的ASCII文本文件提交，以引用的方式纳入本文。在所附序列表中：
SEQ ID NO:1是克隆到质粒pHtrF1-V-Hly中的所述F1-V融合DNA插入片段的核苷酸序列。SEQ ID NO:1包含以下元件：
核苷酸1-112＝htrA启动子序列
核苷酸113-562＝F1抗原编码序列
核苷酸563-580＝接头序列
核苷酸581-1558＝V抗原编码序列
核苷酸1559-1747＝HlyA分泌信号序列
SEQ ID NO:2是所述F1抗原的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是所述接头肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是所述V抗原的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是所述HlyA分泌信号肽的氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写
CFU 菌落形成单位
ELISA 酶联免疫吸附测定
F1 级分1抗原
IFN 干扰素
IL 白细胞介素
i.p. 腹膜内
ORI 复制起点
PA 保护性抗原
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
TNF 肿瘤坏死因子
V 毒力抗原
II.术语和方法
除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于由Benjamin Lewin,Genes V，published by OxfordUniversity Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published byVCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：
佐剂：非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可包括其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬液；或其中抗原溶液被乳化在矿物油中的油包水乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包含灭活的分枝杆菌(mycobacteria)(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。
给药：给予、施用组合物或使其与受试者接触。给药可通过许多途径中的任一种来完成，例如，局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内和肌肉内给药。在本文所述的一些实施方案中，通过口服途径将免疫原性组合物给予受试者。
编码序列：编码蛋白或肽(即包含开放阅读框)的核酸序列。
F1抗原：鼠疫耶尔森氏菌毒性蛋白。F1抗原是由鼠疫耶尔森氏菌特有的100kb的质粒编码，并且是包含鼠疫耶尔森氏菌的荚膜的主要蛋白组分。所述F1抗原被认为能阻止宿主细胞的吞噬作用。所述F1抗原还被称为“F1荚膜抗原”。F1序列是已知的且可公开获得(例如在GenBank数据库中)。示例性的F1抗原核苷酸序列在本文被列出为SEQ ID NO:1的核苷酸113-562；示例性的F1氨基酸序列被提供为SEQ ID NO:2。
框内融合：是指这样的两条核酸序列，即它们被连接起来以使得它们在同一阅读框内。
融合蛋白：通过表达由编码两种不同蛋白质中的至少一部分的核酸序列改造而来的核酸序列而产生的蛋白质。为了产生融合蛋白，所述核酸序列必须在相同阅读框内(“框内”)，并且不含内部终止密码子。
HlyB和HlyD：原核溶血素分泌蛋白。在本文的一些实施方案中，所公开的质粒编码大肠杆菌HlyB和HlyD蛋白。编码大肠杆菌HlyB和HlyD的低拷贝质粒(pGB-2)之前已记载于美国专利7,758,855中，其以引用的方式纳入本文。
免疫应答：免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(如抗原)的应答。免疫应答包括参与宿主防御反应的任何机体的细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。如本文所使用的，保护性免疫应答是指保护受试者免遭感染(预防感染或预防与感染有关的疾病的发生)的免疫应答。
免疫：使受试者受到保护免患疾病(例如，传染病)，例如通过疫苗接种。
免疫原性组合物：本文使用的术语意指可用于在受试者中刺激或引发特定的免疫应答(或免疫原性应答)的组合物。在本文的一些实施方案中，所述免疫原性组合物包括包含F1-V表达质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a。在一些实施方案中，所述免疫原性应答是保护性的或提供保护性免疫，因为其使得所述受试者能更好地抵御鼠疫耶尔森氏菌感染或由鼠疫耶尔森氏菌所致的疾病进展(例如，腺鼠疫或肺鼠疫)。一种类型的免疫原性组合物的具体实例是疫苗。
在一些实施方案中，免疫原性组合物的“有效量”或“免疫刺激量”是在给药受试者时足以产生可检测的免疫应答的量。这样的应答可包括，例如，产生特异性针对所述免疫原性组合物中提供的一种或多种表位的抗体。或者，所述应答可包含针对所述免疫原性组合物中提供的一种或多种表位的基于T辅助细胞或CTL的应答。所有这三种应答可源自初始细胞(cell)或记忆细胞。在其他实施方案中，免疫原性组合物的“保护性有效量”是在给药动物时足以赋予所述动物保护性免疫力(如抵御鼠疫的保护作用)的量。
分离的：“分离的”或“纯化的”生物组分(例如核酸、肽或蛋白质)已经基本上从所述组分天然存在于其中的生物体的细胞中其他生物组分中(即，其他的染色体和染色体外DNA和RNA，以及蛋白质)分离、分开产生或纯化出来。已经被“分离”或“纯化”的核酸、肽或蛋白质因此包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。所述术语还包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸或蛋白质。所述术语“分离的”或“纯化的”不要求绝对的纯度；而是旨在作为一个相对术语。因此，例如，分离的生物组分是这样的组分，即其中所述生物组分比其细胞内天然环境或其他生产容器中的所述生物组分更富集。优选地，将制品纯化以使得所述生物组分占所述制品的总生物组分含量的至少50％，如至少70％、至少90％、至少95％或更高。
核酸分子：多聚形式的核酸，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA以及上述的合成形式和混合聚合物的正义链和反义链。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。本文使用的术语“核酸分子”是“核酸”和“多核苷酸”的同义词。除非另有说明，核酸分子的长度通常为至少10个碱基。所述术语包括单链和双链形式的DNA。多核苷酸可包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸连接键(linkage)而连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸的任一种或两种。
开放阅读框(ORF)：编码没有任何内部终止密码子的氨基酸的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可被翻译成肽/多肽/蛋白质/多聚蛋白。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列的位置处于有功能的关系时，所述第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接于所述编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区域时则位于相同的阅读框中。如果存在内含子，则可操作地连接的DNA序列可以是不连续的。
复制起点(ORI)：在基因组或质粒中(DNA复制在其中起始)的特定核酸序列。ORI的具体结构因物种而异，但是通常所有的都具有高AT含量的特征。
可药用载体：可用于本公开内容的可药用载体是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)描述了适于一种或多种治疗化合物或分子以及其他药物制剂的药物递送的组合物和制剂。
通常，所述载体的性质会取决于采用的具体给药模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体作为载体，所述可注射液体包括可药用和生理上可接受的液体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性的载体之外，待给药的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
鼠疫：由肠杆菌科家族中的非运动性、生长缓慢的兼性细菌——鼠疫耶尔森氏菌导致的传染病。鼠疫耶尔森氏菌是通过啮齿类动物(特别是大鼠)携带，并且在以其为食的跳蚤中。其他动物和人类通常直接因啮齿类动物或跳蚤叮咬而感染所述细菌。感染鼠疫耶尔森氏菌可导致腺鼠疫、败血性鼠疫或肺鼠疫。
在鼠疫耶尔森氏菌诱导的致病的最常见形式——腺鼠疫中，细菌感染淋巴系统，使其发炎。腺鼠疫通常通过感染的跳蚤或啮齿动物的叮咬而感染。在少数情况下，来自患鼠疫的人使用的一块污染的衣服或其他材料的鼠疫耶尔森氏菌通过皮肤上的开口进入。腺鼠疫侵袭淋巴结，并且在暴露于所述细菌的3-7天内，出现类似于流感的症状，如发热、头痛、寒战、虚弱和肿胀、触痛的淋巴腺(炎性淋巴腺肿)。腺鼠疫很少在人和人之间传播。
败血性鼠疫以与腺鼠疫相同的方式感染，通常通过跳蚤或啮齿动物叮咬感染，并且细菌在血液中增殖。但是，败血性鼠疫的特征在于细菌增殖发生在血流中而不仅仅是在淋巴系统中。败血性鼠疫通常作为未治疗的腺鼠疫或肺鼠疫的并发症出现，其症状包括发热、寒战、虚弱、腹痛、休克，以及皮下或其他器官出血。但是，在败血性鼠疫中不会产生炎性淋巴腺肿，并且败血性鼠疫很少在人和人之间传播。
肺鼠疫是鼠疫的最严重形式，并且在鼠疫耶尔森氏菌感染肺部并引起肺炎时发生。当鼠疫耶尔森氏菌被吸入时，可感染肺鼠疫。在暴露于肺鼠疫的空气播散飞沫(airborne droplet)1-3天内，就会产生发热，头痛，虚弱，带有气短、胸痛、咳嗽以及有时血痰或水样痰的肺炎的快速发生。当腺鼠疫和败血性鼠疫在所述疾病扩散到肺部后未得到治疗时，此类鼠疫可在人和人之间传播。在这点上，通过所感染的个体咳嗽或喷嚏时释放到空气中的携带鼠疫耶尔森氏菌的飞沫(respiratory droplet)，所述疾病可被传播给其他人。
质粒：能够在宿主细胞中自主复制的环形核酸分子。在本公开内容的一些实施方案中，所述质粒是低拷贝数质粒。例如，所述低拷贝数质粒可以是在宿主细胞中产生约1-10(例如3-9或5-7)个拷贝的所述质粒的质粒。在具体实施例中，所述低拷贝数质粒在宿主细胞中产生约5-7个拷贝。在具体实施例中，所述低拷贝数质粒是基于记载于以引用的方式纳入本文的美国专利7,758,855中的pGB-2质粒。
预防、治疗或减轻疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发生。“治疗”是指当疾病或病理病症开始发生后减轻疾病或病理病症的征象(signs)或症状的治疗性干预。“减轻”是指减少疾病征象或症状的数量或严重程度。
启动子：一系列指导核酸转录的核酸控制序列。启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列。启动子还任选地包括可定位于距转录起始位点起多达几千个碱基对的远端增强子或抑制子元件。包括组成型启动子和诱导型启动子(参见，例如Bitter et al.,Methods inEnzymology 153:516-544,1987)。在本文的一些实施方案中，所述启动子是大肠杆菌的htrA(高温需求A)基因的启动子。所述htrA启动子是在原核细胞的沙门氏菌感染过程中具有活性的诱导型启动子。在具体的非限制性实施例中，所述htrA启动子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1-112。
重组体：重组体核酸或蛋白质是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个原本独立的序列片段而产生的序列的重组体核酸或蛋白质。所述人工组合常常是通过化学合成或通过人工操纵的分离核酸片段(例如通过遗传工程技术)完成。
肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)：一种革兰氏阴性的、杆状、有鞭毛的细菌。所述肠道沙门氏菌种包括超过2500种不同的血清变型(serovar)，其中之一是伤寒沙门氏菌血清变型。
伤寒沙门氏菌Ty21a：Ty21a是肠道沙门氏菌血清变型伤寒沙门氏菌的菌株。Ty21a是减毒的活细菌菌株，其被用作抗伤寒的口服疫苗(Osorio et al.,Infect Immun 77(4):1475-1482,2009；Germanier andFurer,J Infect Dis 131:553-558,1975；Wahdan et al.,Bull WHO58:469-474,1980；U.S.Patent No.3,856,935)。
选择性标记：编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质赋予表达所述标记的生物体(如细菌)阳性或阴性选择优势。选择性标记包括，例如，抗生素抗性基因，如壮观霉素。
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性被表示为所述序列之间的相似性，又称为序列同一性。序列同一性常以同一性(或相似性或同源性)百分数来度量；所述百分数越高，两个序列越相似。当使用常规方法进行比对时，给定基因或蛋白的同系物或变体具有相对高的序列同一性程度。
比对用于比较的序列的方法在本领域中是公知的。多种程序和比对算法记载于：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson andLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins andSharp,Gene 73:237-244,1988；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153,1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881-10890,1988；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；和Altschul et al.,Nature Genet.6:119-129,1994。
NCBI基础局部比对搜索工具(BLASTTM)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)可以从若干来源获得，包括美国国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。
在本文的一些实施方案中，提供了与SEQ ID NO:1-5中有任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸或氨基酸序列。
血清变型(Serovar)：物种或亚种的细分，通过一组特征性抗原来区分。血清变型(Serovar)还被称为“血清型(serotype)”。
信号肽：指导蛋白质翻译后转运的短肽链(长度一般为3-60个氨基酸)。分泌信号肽是指导蛋白质从产生其的细胞中分泌的信号肽。在本文的一些实施方案中，所述分泌信号肽是来自大肠杆菌溶血素蛋白HlyA的信号肽。在具体的非限制性实施例中，所述HlyA分泌信号肽具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且由SEQ ID NO:1的核苷酸1559-1747编码。
受试者：活的多细胞脊椎生物——包括人和非人哺乳动物的种类。
治疗有效量：足以在用该试剂治疗的受试者中达到所需效果的具体试剂的量。例如，这可以是用于在受试者中引起免疫应答和/或用于预防鼠疫耶尔森氏菌感染的含F1-V表达质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a的量。理想地，在本公开内容的上下文中，含F1-V表达质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a的治疗有效量是足以在受试者中增加对由鼠疫耶尔森氏菌引起的感染的抵抗力，预防、减轻和/或治疗所述感染，而不会在所述受试者中导致明显的细胞毒性作用的量。用于在受试者中增加对感染的抵抗力，预防、减轻和/或治疗感染的含F1-V表达质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a的治疗有效量会取决于，例如，被治疗的受试者、治疗组合物的给药方式和其他因素。
单位剂量：包含经计算以单独或共同产生所需作用(如免疫原性作用)的预定量的活性物质的物理独立单位。可使用单个单位剂量或多个单位剂量以提供所需作用，例如免疫原性作用。在一个实施例中，单位剂量包括所需量的如本文所公开的表达F1-V融合蛋白的伤寒沙门氏菌。
V抗原：由lcrV基因编码的鼠疫耶尔森氏菌毒性蛋白。V抗原是在鼠疫耶尔森氏菌毒力中发挥多功能作用的分泌蛋白。例如，V抗原是低钙应答毒性基因表达的正调控因子，并参与效应蛋白通过II型分泌系统向真核细胞的易位。V抗原还被认为通过抑制细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生而发挥免疫调节剂的作用。V抗原序列是已知的并可公开获得。本文提供的示例性V抗原核苷酸序列为SEQ ID NO:1的核苷酸581-1558，并且本文列出的示例性V抗原氨基酸序列为SEQID NO:4。
疫苗：可被给予受试者(如兽医或人类受试者)而赋予对疾病或其他病理病症(如鼠疫)的免疫力(如主动免疫)的免疫原性组合物。疫苗可用于治疗或用于预防。因此，疫苗可用于降低感染的可能性或降低疾病或病症的症状的严重程度或限制所述疾病或病症的进展。在本文的实施例中，所述疫苗包含如本文所公开的表达F1-V融合蛋白的伤寒沙门氏菌。
鼠疫耶尔森氏菌：革兰氏阴性的、杆状细菌。鼠疫耶尔森氏菌是能够感染人类和其他动物的兼性厌氧菌。鼠疫耶尔森氏菌的感染能导致腺鼠疫、败血性鼠疫或肺鼠疫。
除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。除非上下文中另有明确说明，单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代对象。类似地，除非上下文中另有明确说明，词语“或”意欲包括“和”。因此，“包含A或B”意指包括A、或B、或A和B。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量和分子质量值都是近似值，并且用于描述目的。尽管与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可用于本公开内容的实施或测试，但适合的方法和材料如下所述。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。如果出现冲突，以本说明书(包括对术语的解释)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的，不意欲进行限制。
III.若干实施方案概述
本文公开了用于表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的质粒构建体的开发。还公开了包含F1-V融合蛋白表达质粒的肠道沙门氏菌血清型伤寒沙门氏菌菌株Ty21a(在本文称为“伤寒沙门氏菌Ty21a”或“Ty21a”)，其例如用作抗鼠疫的口服疫苗。
本文提供了一种重组核酸分子，其包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列。所述htrA启动子是在真核宿主细胞中具有活性的诱导型启动子。在某些情况下，所述F1和V蛋白的编码区被核酸接头(如包含SEQ ID NO:1的核苷酸563-580的接头)分隔开。
在一些实施方案中，所述F1-V融合蛋白编码序列与SEQ ID NO:1的核苷酸113-1558有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在具体的实施例中，所述F1-V融合蛋白编码序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸113-1558或由其组成。
在一些实施方案中，所述htrA启动子序列与SEQ ID NO:1的核苷酸1-112有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在具体的实施例中，所述htrA启动子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1-112或由其组成。
在一些实施方案中，所述包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列的核酸分子包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1-1558有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在具体的实施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸1-1558或由其组成。
在一些实施方案中，所述重组核酸分子还包含与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的分泌信号肽编码序列。在一些实施例中，所述分泌信号肽是大肠杆菌HlyA分泌信号肽。在具体的非限制性实施例中，所述大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列与SEQ ID NO:1的核苷酸1559-1747有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，或者包含SEQ ID NO:1的核苷酸1559-1747或由其组成。
在具体的实施方案中，所述重组核酸分子的序列与SEQ ID NO:1有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在具体的非限制性实施例中，所述核酸分子包含SEQID NO:1或由其组成。
还提供了包含本文所公开的重组核酸分子的质粒。因此，在一些实施方案中，所述质粒包含与SEQ ID NO:1有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列，或包含SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述质粒是低拷贝数质粒。例如，所述低拷贝数质粒可以是在宿主细胞中产生约1-10或3-9或5-7个拷贝的质粒。在具体的实施例中，所述低拷贝数质粒在宿主细胞中产生约5-7个拷贝。在具体的实施例中，所述低拷贝数质粒是基于美国专利7,758,855中所述的pGB-2质粒，所述美国专利以引用的方式纳入本文。
在一些实施方案中，所述质粒还包含选择性标记。选择性标记为本领域中所公知的，适合的选择性标记可由本领域技术人员根据所述质粒的所需选择标准和特定用途来进行选择。在一些实施例中，选择性标记是抗生素抗性基因。在一个非限制性实施例中，所述选择性标记是壮观霉素抗性基因。
在一些实施方案中，所述质粒还包含大肠杆菌HlyB和HlyB蛋白编码序列。所述HlyB和HlyD蛋白是溶血素分泌蛋白，其使得由该质粒编码的F1-V融合蛋白能够进行细胞外分泌。
还提供了包含本文所公开的重组核酸分子或质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌。伤寒沙门氏菌Ty21a是减毒的活细菌菌株，该菌株被批准作为用于伤寒的口服疫苗。已证明伤寒沙门氏菌Ty21a的给药是安全的，并且此菌株之前已被有效地用于表达炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)(参见，例如，Osorio et al.,Infect Immun 77(4):1475-1482,2009；和美国专利7,758,855，其以引用的方式纳入本文)。本文公开了伤寒沙门氏菌Ty21a细菌作为载体来递送鼠疫耶尔森氏菌的经克隆的F1和V抗原(作为融合蛋白)的用途。
还提供了包含含有本文公开的质粒或重组核酸分子的伤寒沙门氏菌Ty21a，以及可药用载体的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物被配制为用于口服给药。在一些实施方案中，以单位剂量形式配制所述免疫原性组合物。
还提供了在受试者中引起针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的方法，所述方法是通过给予所述受试者包含本文公开的质粒或重组核酸分子的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌，或通过给予如本文所公开的免疫原性组合物进行。在一些实施方案中，所述免疫应答是保护性免疫应答。在一些实施方案中，治疗性地给予所述伤寒沙门氏菌Ty21a或所述免疫原性组合物，例如在鼠疫耶尔森氏菌感染之后。在其他实施方案中，预防性地给予所述伤寒沙门氏菌Ty21a或所述免疫原性组合物，例如为预防鼠疫耶尔森氏菌感染或降低鼠疫耶尔森氏菌感染的风险。
还提供了在受试者中预防鼠疫、降低发生鼠疫的风险或治疗鼠疫的方法，所述方法是通过给予所述受试者包含本文公开的质粒或重组核酸分子的伤寒沙门氏菌Ty21a，或通过给予如本文所公开的免疫原性组合物进行。所述鼠疫可以是腺鼠疫、败血性鼠疫或肺鼠疫。在一些实施方案中，治疗性地给予所述伤寒沙门氏菌Ty21a或所述免疫原性组合物，例如在所述受试者中已经产生鼠疫的临床征象之后。在其他实施方案中，预防性地给予所述伤寒沙门氏菌Ty21a或所述免疫原性组合物，例如为预防鼠疫或降低鼠疫风险。
在一个非限制性实施例中，本文提供了包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列以及与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列的重组核酸分子，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO:1。
在另一个非限制性实施例中，提供了一种质粒，其包含(i)包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列以及与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列的重组核酸分子，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO:1；(ii)复制起点；(iii)选择性标记；以及(iv)大肠杆菌HlyB和HlyD蛋白编码序列。
在另一个非限制性实施例中，提供了包含重组核酸分子或质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a，其中所述重组核酸分子或质粒包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列以及与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列，其中所述核酸分子或质粒的序列包含SEQ ID NO:1。还提供了包括伤寒沙门氏菌Ty21a和可药用载体的免疫原性组合物。在一些情况下，所述免疫原性组合物被配制为用于口服给药。还提供了在受试者中引起针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的方法，所述方法是通过给予所述受试者所述伤寒沙门氏菌Ty21a或所述免疫原性组合物进行。
在另一个非限制性实施例中，提供了用于产生抵御鼠疫的保护作用的口服疫苗，其中所述疫苗包含重组核酸分子或质粒，其中所述重组核酸分子或质粒包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列以及与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列，其中所述核酸分子或质粒的序列包含SEQ ID NO:1。
本文公开的重组核酸分子和质粒，以及本文公开的包含所述重组核酸分子或质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a，相对于在先记载的鼠疫疫苗具有若干优势。例如，所述大肠杆菌htrA启动子主要在体内具有活性，从而使得所述F1-V融合蛋白能够在哺乳动物宿主细胞中有效表达，而限制在肉汤培养物中的表达，这促进了用于疫苗生产的表达构建体的稳定性。宿主细胞中F1-V的有效表达，增强了在所述宿主中引起的免疫应答，提高了疫苗的效力。另外，使用低拷贝质粒(如pGB-2质粒)，还增强了所述F1-V表达构建体的稳定性。另外，使用大肠杆菌HlyA分泌信号以及大肠杆菌HlyB和HlyD蛋白编码序列增强了所述F1-V融合蛋白在宿主中的细胞外分泌，进一步提高了由所述疫苗引起的免疫应答。最后，使用伤寒沙门氏菌Ty21a使得获得了用于口服给药鼠疫疫苗的安全且有效的方式。
IV.免疫原性组合物的配制和给药
本文公开的重组核酸分子、质粒和免疫原性组合物可方便地以单位剂型呈现，并通过传统制药技术制备。此类技术包括使活性成分和药物载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载体均一且紧密地结合来制备所述制剂。所述制剂可以单位剂量或多剂量容器(如密封的安瓿瓶和小瓶)呈现，并且可贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临使用前加入无菌液体载体(例如，注射用水)。临时注射溶液和悬液可由本领域普通技术人员所通常使用的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
在某些实施方案中，单位剂型是包含所给予的组分的一个剂量或一个单位或者其适当级分的那些。应理解，除了以上特别提到的所述组分，本文涵盖的制剂可包括本领域普通技术人员通常使用的其他试剂。
本文提供的组合物(包括用作免疫原性组合物的那些)，可通过不同途径(如口服(包括口腔和舌下)、直肠、肠胃外、喷雾(aerosol)、鼻内、肌内、皮下、皮内和局部)给药。它们可以不同形式给药，包括但不限于溶液、乳液和悬液、微球、颗粒、微粒、纳米颗粒和脂质体。在具体的实施方案中，所述免疫原性组合物通过口服给药。
给药量将根据给药途径而变化。本领域普通技术人员会了解不同给药途径的合适给药量。
给药可通过单剂量或多剂量完成。在本公开内容的上下文中，给予受试者的剂量应足以随时间引起有益的治疗反应，例如预防鼠疫耶尔森氏菌感染或鼠疫的发生。所需剂量可根据，例如所述受试者的年龄、体重和总体健康状况而改变。
选择每一剂量中的免疫原性组合物的量作为引起免疫刺激应答而没有明显有害副作用的量。这种量将根据所使用的具体组合物及其如何给药而变化。初始剂量的范围可为约1μg到约1mg，一些实施方案具有约10μg到约800μg的范围，并且其他实施方案的范围是约25μg到约500μg。在初次给予所述免疫原性组合物之后，受试者可以接受一次或多次充分间隔的加强给药。加强给药的范围可为约1μg到约1mg，其他实施方案的范围为约10μg到约750μg，还有其他的实施方案的范围为约50μg到约500μg。可能需要以1-5年(例如3年)的间隔进行定期加强以维持保护性免疫的所需水平。
当将细菌作为所述免疫原性组合物的组分进行给药时，可通过制剂中的菌落形成单位(CFU)的数量来测定剂量。因此，在一些实施例中，含有F1-V表达构建体的伤寒沙门氏菌Ty21a治疗有效剂量为伤寒沙门氏菌Ty21a的至少100CFU、至少103CFU、至少104CFU、至少105CFU、至少106CFU、至少107CFU、至少108CFU或至少109CFU，例如100CFU-109CFU或103CFU-108CFU或104CFU-107CFU或105CFU-106CFU。
本文提供了药物组合物(也称为免疫原性组合物或免疫刺激组合物)，所述药物组合物包括单独的或结合可药用载体的治疗有效剂量的重组核酸分子、质粒或包含F1-V表达构建体的伤寒沙门氏菌Ty21a。
可药用载体包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖(dextrose)、水、甘油、乙醇、及其组合。所述载体和组合物可以是无菌的，并且所述制剂适合所述给药方式。所述组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末。可使用传统的粘合剂和载体如甘油三酯将所述组合物配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。可使用任何常见的药物载体，如无菌盐水或芝麻油。所述介质(medium)还可包含传统的医药辅助材料，例如，调整渗透压的可药用盐、缓冲液、防腐剂等。其他可与本文提供的组合物和方法一起使用的介质是生理盐水和芝麻油。
所公开的免疫原性组合物可包括其他生物学惰性剂或生物学活性剂(或二者)。例如，所公开的免疫原性组合物可包括佐剂、载体、赋形剂和抗微生物试剂(如抗生素)。
任选地，可将一种或多种细胞因子，如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ；一种或多种生长因子，如GM-CSF或G-CSF；一种或多种分子，如OX-40L或41BBL；或这些物质的组合用作生物佐剂(参见，例如，Salgaller et al.,1998,J.Surg.Oncol.68(2):122-38；Lotze et al.,2000,Cancer J.Sci.Am.6(Suppl 1):S61-6；Cao et al.,1998,Stem Cells 16(Suppl 1):251-60；Kuiper et al.,2000,Adv.Exp.Med.Biol.465:381-90)。可将这些分子通过全身(或局部)给予所述宿主。
提供了以下实施例以举例说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开内容限制于所描述的具体特征或实施方案中。
实施例
实施例1：质粒构建以及F1-V表达和分泌的分析
本实施例描述了用于在伤寒沙门氏菌疫苗菌株Ty21a中表达鼠疫耶尔森氏菌荚膜蛋白级分1(F1)/毒力抗原融合蛋白前体(LcrV)融合蛋白(称为F1-V融合蛋白)的遗传稳定质粒系统的产生。
之前已经开发了用于优化的炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)表达的遗传稳定的质粒表达系统(参见Osorio et al.,InfectImmun77(4):1475-1482,2009；美国专利7,758,855，其以引用的方式纳入本文)。为了产生用于表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的质粒系统，对之前公开的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合基因的合成构建体(GenBank登录号AY924380.1)进行了修饰。将已在Ty21a中成功使用的低拷贝数质粒pGB-2(Osorio et al.,Infect Immun77(4):1475-1482,2009；Xu et al.,Infect Immun 70(8):4414-4423,2002)用作质粒构建的骨架。将合成的F1-V融合基因克隆至质粒pGB-2中htrA启动子的下游(图2)。
为了诱导细胞外表达，使用大肠杆菌α-溶血素蛋白HlyA的分泌信号肽(最后66个氨基酸)制备了合成的F1-V融合基因(缺少终止子)的框内基因融合(图1和图2)。所述质粒载体中还包括编码HlyA转运装置的必要组分——HlyB和HlyD的基因(图2)。
克隆到质粒pHtrF1-V-Hly中的所述F1-V融合DNA插入片段的DNA序列：
tggacttttgtaaagatggacaataaatttttactttttccagaaactttattccggaacttcgcgttataaaatgaatctgacgtacacagcaattttaaggagaggacatatggcagatttaactgcaagcaccactgcaacggcaactcttgttgaaccagcccgcatcactcttacatataaggaaggcgctccaattacaattatggacaatggaaacatcgatacagaattacttgttggtacgcttactcttggcggctataaaacaggaaccactagcacatctgttaactttacagatgccgcgggtgatcccatgtacttaacatttacttctcaggatggaaataaccaccaattcactacaaaagtgattggcaaggattctagagattttgatatctctcctaaggtaaacggtgagaaccttgtgggggatgacgtcgtcttggctacgggcagccaggatttctttgttcgctcaattggttccaaaggcggtaaacttgcagcaggtaaatacactgatgctgtaaccgtaaccgtatctaaccaaggatccatcgaaggtcgtatgattagagcctacgaacaaaacccacaacattttattgaggatctagaaaaagttagggtggaacaacttactggtcatggttcttcagttttagaagaattggttcagttagtcaaagataaaaatatagatatttccattaaatatgatcccagaaaagattcggaggtttttgccaatagagtaattactgatgatatcgaattgctcaagaaaatcctagcttattttctacccgaggatgccattcttaaaggcggtcattatgacaaccaactgcaaaatggcatcaagcgagtaaaagagttccttgaatcatcgccgaatacacaatgggaattgcgggcgttcatggcagtaatgcacttctctttaaccgccgatcgtatcgatgatgatattttgaaagtgattgttgattcaatgaatcatcatggtgatgcccgtagcaagttgcgtgaagaattagctgagcttaccgccgaattaaagatttattcagttattcaagccgaaattaataagcatctgtctagtagtggcaccataaatatccatgataaatccattaatctcatggataaaaatttatatggttatacagatgaagagatttttaaagccagcgcagagtacaaaattctcgagaaaatgcctcaaaccaccattcaggtggatgggagcgagaaaaaaatagtctcgataaaggactttcttggaagtgagaataaaagaaccggggcgttgggtaatctgaaaaactcatactcttataataaagataataatgaattatctcactttgccaccacctgctcggataagtccaggccgctcaacgacttggttagccaaaaaacaactcagctgtctgatattacatcacgttttaattcagctattgaagcactgaaccgtttcattcagaaatatgattcagtgatgcaacgtctgctagatgacacgtctggtaaatatgcatcaacttatgcagacctggataatctgaatccattaattaatgaaatcagcaaaattatttcagctgcaggtaacttcgatgttaaggaggaaagatctgccgcttctttattgcagttgtccggtaatgccagtgatttttcatatggacggaactcaataactttgaccgcatcagcataa(SEQ ID NO：1)
为了评估F1-V在伤寒沙门氏菌Ty21a中的表达和分泌，将用pHtrF1-V-hly或之前构建的编码炭疽芽孢杆菌PA的质粒(Osorio et al.，Infect Immun 77(4)：1475-1482，2009)转化的Ty21a在具有壮观霉素选择的培养基中过夜生长，随后通过离心收集。将所得上清级分浓缩至约为原来的1/10。同时将所得沉淀级分裂解在与所浓缩的上清液体积相等的体积中。使用市售的针对F1或LcrV的单克隆抗体，通过蛋白质印迹法分析等体积的所述上清部分和沉淀级分。
如图3所示，所得结果清楚地证明pHtrF1-V转化的Ty21a产生并分泌F1-V融合蛋白。实际上，在沉淀级分中检测不到F1-V。根据所翻译的DNA序列，所述F1-V融合蛋白的预测分子量约为58kDa。所观察到的Ty21a分泌的F1-V的稍高分子量，可能反映了添加了66个氨基酸的分泌信号肽HlyA。使用抗LcrV的抗体对F1-V的检测检测到约为55-58kDa的第二产物。这条带可能代表已经切除HlyA的F1-V。
实施例2：疫苗构建体在小鼠中的免疫原性
本实施例描述了包含F1-V融合表达构建体的伤寒沙门氏菌Ty21a的免疫原性，这是通过血清IgG效价和经刺激的脾细胞的细胞因子表达所测定。
通过免疫A/J小鼠检测了表达F1-V的Ty21a诱导保护性免疫应答的能力。通过腹膜内(i.p.)途径，使用三个每两周一次的剂量(包含产生F1-V或之前构建的炭疽PA的Ty21a)对10只6-8周龄的小鼠的组进行免疫。第三组小鼠接受了产生F1-V的Ty21a和产生PA的Ty21a的1:1的混合物。对照组小鼠接受了3个剂量的用空pGB-2载体转化的Ty21a。免疫的小鼠接受2-5×107CFU/剂量。在第三次和最后一次免疫后一周，收集血清和脾细胞。通过ELISA分析总的循环F1-V和PA特异性的IgG效价。
F1-V融合蛋白在Ty21a中的表达导致在小鼠中产生高的抗F1-V血清IgG效价，其平均的几何平均效价约为500,000(图4)。使用表达F1-V的Ty21a和表达PA的Ty21a进行的伴随免疫导致在小鼠中产生高的抗F1-V和抗PA IgG效价。表达空载体pGB2的Ty21a对照菌株未导致循环的抗F1-V IgG或抗PA IgG。
在随后的实验中，在以使用F1-V质粒或空pGB-2质粒转化的Ty21a每两周进行3次免疫(i.p.)的8周龄小鼠中确定了总的血清IgG效价。经免疫的小鼠在0周、2周和4周时接受了2-5×107CFU/剂，并在0周、1周、3周和5周时收集血清。通过ELISA分析总的循环F1-V特异性的IgG效价。所得结果表明，3次免疫在小鼠中产生了高的抗F1-V IgG效价(图5)。
几项现有研究已经表明，下一代鼠疫疫苗应旨在同时诱导鼠疫耶尔森氏菌特异性的Ig和细胞介导的免疫(CMI)应答。基于此，对在体外用rF1-V刺激72小时的所收集的脾细胞的细胞因子应答进行了测量。
未对10只6-8周龄小鼠的组进行免疫(对照组)，或者通过腹膜内途径使用3个每两周一次的剂量(包含产生F1-V的Ty21a或空载体pGB2的Ty21a)对它们进行免疫。经免疫的小鼠接受2-5×107CFU/剂量。在第三次和最后一次免疫后一周，收集脾细胞，并在体外用rF1-V刺激72小时。收集培养物上清液并针对细胞因子产生进行分析。
如图6A-6D所示，对rF1-V的细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-17)回忆应答是可变的。来自未经免疫的小鼠的脾细胞在用rF1-V刺激时不分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α或IL-17。但是，来自一些以经pHtrF1-V-hly转化的Ty21a免疫的小鼠的脾细胞表达大量的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-17。一只以经单独的pGB2转化的Ty21a免疫的小鼠对rF1-V具有明显的IFN-γ和TNF-α回忆应答。
实施例3：预防或抑制鼠疫耶尔森氏菌感染的方法
本实施例描述了可被用于预防或抑制鼠疫耶尔森氏菌感染，从而在处于患病风险中的受试者中预防或抑制发生鼠疫的示例性方法。
选择处于鼠疫耶尔森氏菌感染的风险中的受试者用于进行治疗。例如，所述受试者可以是生活在鼠疫是地方流行病的地区的个体，或者是已经与其他鼠疫受害者接触过的受试者。给予所述受试者包含含有F1-V融合蛋白表达构建体的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌的免疫原性组合物。所述F1-V表达质粒包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列以及与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列(SEQ IDNO:1)。所述免疫原性组合物的合适的治疗有效剂量可由有经验的开业医生选择。在一些实施例中，所述剂量为约106-约108CFU。为了引起足够的针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答，可根据需要给予所述受试者单剂量或多剂量。
考虑到所公开的本发明的原理所适用的许多可能的实施方案，应认识到，所示出的实施方案只是本发明的优选实例，而不应被认为是对本发明范围的限制。相反，本发明的范围是由以下的权利要求书所限定。因此，本发明人要求保护所有落入这些权利要求的范围和主旨的发明作为本发明人的发明。
Claims (19)
1.一种重组核酸分子，包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)F1-V融合蛋白编码序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1-1558至少95％相同的序列。
2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ IDNO:1的核苷酸1-1558的序列。
3.权利要求1或2的重组核酸分子，还包含与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的分泌信号肽编码序列。
4.权利要求3的重组核酸分子，其中所述分泌信号肽是大肠杆菌HlyA分泌信号肽。
5.权利要求3或4的重组核酸分子，其中所述核酸分子的序列与SEQ ID NO:1至少95％相同。
6.权利要求5的重组核酸分子，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO:1。
7.一种重组核酸分子，包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列，并且还包含与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO:1。
8.一种包含权利要求1-7中任一项的重组核酸分子的质粒。
9.权利要求8的质粒，其中所述质粒是低拷贝数质粒。
10.权利要求8或权利要求9的质粒，其还包含选择性标记。
11.权利要求10的质粒，其中所述选择性标记是抗生素抗性基因。
12.权利要求8-11中任一项的质粒，还包含大肠杆菌HlyB和HlyD蛋白编码序列。
13.一种质粒，包含权利要求7的重组核酸分子、复制起点、选择性标记以及大肠杆菌HlyB和HlyD蛋白编码序列。
14.一种伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)Ty21a细菌，包含权利要求1-7中任一项的重组核酸分子或权利要求8-13中任一项的质粒。
15.一种免疫原性组合物，包括权利要求14的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌和可药用载体。
16.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述组合物被配制为用于口服给药。
17.一种在受试者中引起针对抗鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的方法，包括给予所述受试者权利要求14的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌，或给予权利要求15或权利要求16的免疫原性组合物。
18.权利要求17的方法，其中所述免疫应答是保护性免疫应答。
19.一种在受试者中预防鼠疫、降低发生鼠疫的风险或治疗鼠疫的方法，包括给予所述受试者权利要求14的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌，或给予权利要求15或权利要求16的免疫原性组合物。
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