CN114908068A

CN114908068A - 梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN114908068A
Application number: CN202210492980.6A
Authority: CN
Inventors: 吴巨友; 曹鹏; 汤超; 吴潇; 王鹏; 张绍铃; 齐开杰; 谢智华; 孔佳君
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-05-07
Filing date: 2022-05-07
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2042-05-07
Also published as: CN114908068B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其编码基因和应用；所述胼胝质合成酶PbrCalS5，其为如下a）或b)中的任一种：a）其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；b）将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物合成胼胝质相关的蛋白质。本发明提供的梨胼胝质合成酶PbrCalS5基因，经生物学功能验证具有促进花粉管生长的作用；敲低表达所述的PbrCalS5能够显著降低花粉管细胞壁中胼胝质的含量，抑制花粉管生长；本发明提供的PbrCalS5促进植物花粉管生长，为梨的生产指导工作提供理论依据，有利于降低农业生产成本，提高经济效益。

Description

梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其编码基因和应用。

背景技术

成功的授粉和受精是坐果的基础，精子细胞通过花粉管输送到胚珠是这一过程的关键。在被子植物中，花粉管通过花柱将精子细胞输送到子房，然后花粉管尖端爆裂，将精子细胞释放到胚囊中，从而实现受精(Xie et al.2010)。因此，花粉管生长在果树生产中起着重要作用。

花粉管的生长与许多因素有关，细胞壁的作用有助于保证花粉管的完整性。花粉管细胞壁具有多种功能，控制细胞形状、保护细胞免受机械损伤、抵抗膨胀压力等(Geitmann and Steer 2006)。胼胝质是一种多糖，在植物细胞壁发育的特定阶段在特化细胞中产生，作为植物细胞特殊细胞壁或与细胞壁相关的结构组成部分(Chen and Kim2014)。胼胝质多在植物遭遇胁迫应激时合成，然而在植物生殖生长过程中胼胝质作为一种结构成分沉积在生长的花粉管中(Nishikawa et al.2005)。花粉管细胞壁不同于植物营养细胞的细胞壁组分，胼胝质是花粉管细胞壁的重要组成成分，烟草花粉管中胼胝质的含量达80％以上(Schlüpmann and Read 1994)。CalS是合成胼胝质的关键基因(Stasinopouloset al.1999)，其功能对花粉管生长意义重大。然而，梨中关于CalS调控花粉管生长的研究未见报道。

梨是世界上的大宗果树，面积和产量居于我国水果产业的前三位，其产量关乎农民的经济收益，成功授粉受精是保证梨产量的前提，花粉管正常生长是实现双受精的关键，关乎梨产业发展。花粉管生长是一个复杂的过程，需要众多与细胞壁合成相关的基因参与管壁物质的沉积、重塑。因此，本研究开展关于调控果树花粉管中胼胝质合成的基因克隆及功能研究，研究结果为调控梨生殖生长奠定基础，同时对提高果树经济效益具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其编码基因和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明保护梨胼胝质合成酶PbrCalS5，其为如下a)或b)中的任一种：

a)其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

b)将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物合成胼胝质相关的蛋白质。

第二方面，本发明还保护编码前述的梨胼胝质合成酶PbrCalS5的基因。

作为本申请的优选技术方案，所述基因其为如下1)～2)中的任一种：

1)其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)与SEQ ID No.1具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上同源性，且编码合成胼胝质相关蛋白的DNA分子。

本发明还保护扩增前述基因的全长或任一片段的引物对。

优选的，所述的引物对为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

本发明还保护含有前述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌。

本发明还保护含有前述基因的反义寡核苷酸引物，其引物序列如SEQ ID No.5，所述引物降低胼胝质合成酶PbrCalS5的表达水平。

本发明还保护含有前述基因的正义寡核苷酸引物，其引物序列如SEQ ID No.6，所述引物不能降低胼胝质合成酶PbrCalS5的表达水平。

第三方面，本发明还保护前述胼胝质合成酶PbrCalS5，和/或，前述基因，和/或，前述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌，和/或，前述的反义寡核苷酸引物中的至少一种在调控花粉管生长中的应用。

作为本申请的优选技术方案，所述植物为梨，优选为砀山酥梨。

作为本申请的优选技术方案，所述应用包括以下步骤：

1)提供前述梨胼胝质合成酶PbrCalS5的基因；

2)对所述的梨胼胝质合成酶PbrCalS5的基因设计反义寡核苷酸引物；

3)将所述反义寡核苷酸引物转入花粉管细胞，获得敲低梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5表达后的花粉管。

本发明还保护前文所述基因的扩增方法，包括以下步骤：

1)以砀山酥梨花粉管为材料提取总RNA，反转录得到cDNA；

2)以cDNA为模板，进行PCR扩增得到梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5；所述扩增特异引物对包括正向引物F1和反向引物R1；所述正向引物F1的序列见SEQ ID No.3；所述反向引物R1的序列见SEQ ID No.4。

本发明还提供一种促进花粉管生长的方法，所述方法包括提高花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性。

优选的，所述提高花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性通过提高花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的编码基因的表达量来实现。

本发明还提供一种抑制花粉管生长的方法，所述方法包括降低花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性。

优选的，所述降低花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性通过敲低花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的编码基因的表达量来实现。

本发明的有益效果：本发明提供的梨胼胝质合成酶PbrCalS5基因，经生物学功能验证具有促进花粉管生长的作用；敲低表达所述的PbrCalS5能够显著降低花粉管细胞壁中胼胝质的含量，抑制花粉管生长；本发明提供的PbrCalS5促进植物花粉管生长，为梨的生产指导工作提供理论依据，有利于降低农业生产成本，提高经济效益。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2为本发明实施例1梨胼胝质合成酶PbrCalS5扩增电泳图；

图3为实施例2中梨胼胝质合成酶PbrCalS5在花粉管中高表达模式图；

图4为实施例3中本发明梨胼胝质合成酶PbrCalS5响应花粉管生长机制的表达模式图；

图5为实施例4中本发明梨胼胝质合成酶PbrCalS5亚细胞定位图；

图6为实施例5中敲低胼胝质合成酶PbrCalS5基因鉴定图及表型统计图，其中图6A敲低PbrCalS5基因花粉管的表型图，图6B为检测PbrCalS5基因表达水平图，图6C为花粉管长度统计图；

图7为实施例6中敲低PbrCalS5基因花粉管细胞壁中胼胝质含量统计图，其中图7A为测量花粉管细胞壁胼胝质含量位置示意图，图7B为花粉管细胞壁胼胝质含量统计图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明提供了梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5，所述梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明中，所述梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5优选的来源于砀山酥梨花粉管，所述梨胼胝质合成酶PbrCalS5基因包含5766bp的开放阅读框。

在本发明中所述梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5通过如下方法获得：从砀山酥梨花粉管中提取获得植物总RNA；将所述RNA通过反转录获得cDNA；以所述cDNA为模板，用特异正向引物F1和特异反向引物R1扩增获得所述梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5。在本发明中，所述正向引物F1的序列如SEQ ID No.3所示，具体为5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGTCAAACCTGGATCCGCC-3’；

所述反向引物R1的序列如SEQ ID No.4所示，具体为5’-GCCCTTGCTCACCATGGATCCGTTTGACTTGTGCTTCTTCCCAC-3’。

在本发明中，所述砀山酥梨花粉管优选采用培养3h的花粉管，所述砀山酥梨的RNA优先采用植物多糖多酚总RNA试剂盒(成都福记，中国)法进行提取，无其他特殊限定。

在本发明中所述反转录采用本领域常规放大，优选的采用赛默飞(Thermo，美国)反转录试剂盒进行，具体方法步骤参照所述试剂盒的说明书。

本发明在获得所述cNDA后，以获得的cDNA为模板，用正向引物F1和反向引物R1扩增获得所述梨胼胝质合成酶PbrCalS5的基因序列。在本发明中所述正向引物F1的序列如SEQ ID No.3所示；所述反向引物R1的序列如SEQ ID No.4所示。在本发明具体实施过程中，所述扩增体系优选为50μL体系，所述扩增体系包括1μg模板DNA，

Max Super-Fidelity DNA Polymerase，

Max Buffer，10.0μM正向引物和10.0μM的反向引物。本发明中所述的

Max Super-Fidelity DNA Polymerase优选的购自Vazyme。本发明中所述扩增反应的程序优选为：95℃预变性3min；35个扩增循环，包括95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸6min，；循环完成后72℃延伸10min，之后在20℃保温。

本发明在扩增获得所述梨胼胝质合成酶PbrCalS5后，优选的将扩增获得的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳、回收后测序验证获得所述梨胼胝质合成酶PbrCalS5的核苷酸序列(如图2所示)。

本发明还提供了所述的梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PbrCalS5编码的蛋白质包括1922个氨基酸。本发明所述的蛋白质定位在细胞膜，属于膜蛋白；该蛋白能够显著促进花粉管细胞壁中胼胝质的合成，从而促进花粉管生长。

本发明提供了所述的梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5或所述的蛋白质在促进花粉管生长方面的应用。

在本发明中，所述植物优选为砀山酥梨，包括以下步骤：1)提供所述梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5；2)提供所述梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5的反义寡核苷酸引物、正义寡核苷酸引物；3)将所述反义寡核苷酸引物和正义寡核苷酸引物分别转入花粉管细胞，分别获得敲低梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5表达后的花粉管和未敲低梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5表达后的花粉管。在本发明中，所述反义寡核苷酸引物的序列如SEQ ID No.5所示，具体为C*T*C*GTTGTCGAACACC*T*C*A；所述正义寡核苷酸引物的序列如SEQ ID No.6所示，具体为T*G*A*GGTGTTCGACAAC*G*A*G。

在本发明中，所述的花粉培养基优选的为含有Ca(NO3)₂ 0.55mM，H₃BO₃ 1.60mM，MgSO₄ 1.60mM，KNO₃ 1.00mM，蔗糖440.00mM和MES 5.00mM的终浓度，Tris调pH至6.0-6.2。所述花粉培养优选的为120rpm 26℃摇床。

本发明中，在所述获得敲低PbrCalS5表达量的检测验证后，优选的进行花粉管长度统计，见图6。本发明中所述梨花粉管培养采用本领域常规的方法即可。

本发明在获得所述敲低PbrCalS5表达量的花粉管后，优选的对花粉管细胞壁中胼胝质含量进行染色测定和统计，见图7A、图7B。

下面结合具体实施例对本发明提供的梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其在促进花粉管生长方面的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

梨PbrCalS5基因全长cDNA的克隆

通过筛选梨全长cNDA文库筛选到一个胼胝质合成酶基因PbrCalS5，根据同源臂重组特点和PbrCalS5基因的序列，用Primer premier 5.0设计引物，以‘砀山酥梨’花粉管cDNA为模板进行PCR扩增全长。详细步骤如下：

研究材料砀山酥梨种植在南京农业大学国家梨工程中心，其苗龄为10年。摘取大蕾期的花苞进行花药分离，在室内对花药进行干燥散粉，在2mL离心管内进行花粉培养3h，观察花粉管生长，使用离心机12000rpm离心3min，吸出上清，离心管及管底样品立即用液氮速冻。参照植物多糖多酚总RNA提取试剂盒的操作手册进行。提取完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA的质量，并用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的浓度和质量。

cDNA第一条链的合成参照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit的操作手册进行。所得的第一链cDNA用于PbrCalS5基因的扩增。PCR按以下程序完成：95℃预变性3min；35个扩增循环，包括95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸6min，循环完成后72℃延伸10min，之后在20℃下保温。扩增完成后，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测到单一目的条带的PCR产物，按照胶回收试剂盒(购自诺唯赞，中国)使用说明提取步骤，回收特异目的条带。

实施例2

砀山酥梨不同组织中梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5的qPCR分析

为了分析砀山酥梨PbrCalS5基因对不同组织的响应模式，使用qPCR技术对PbrCalS5基因的表达模式进行分析。根据PbrCalS5基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用Primer primier 5.0软件设计出扩增基因整个编码区的上、下游PCR引物。采用砀山酥梨的根、茎、叶、花粉管、花柱和果实为材料，利用试剂盒提取RNA，cDNA第一条链的合成参照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作手册进行。20μL的反应体系包括：10μL 2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞，中国)，5μL灭菌超纯水，1μL cDNA，2μL正向引物，F2：5’-GATGAAGTTGAAGAGAGTGACGCT-3’(SEQ ID No.7)，2μL反向引物，R2：5’-GGTTTTCGGGTTTCCCTTCT-3’(SEQ ID No.8)。(以UBQ为内参，序列如下：UBQ-F:5’-CCCTTCACTTGGTTCTCCGT-3’(SEQ ID No.9)；UBQ-R:5’-TAATCAGCAAGCGTGCGACC-3’(SEQ ID No.10))。

qPCR的程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min，25℃保温5min。

以砀山酥梨不同组织为材料，组织定位实验结果表明PbrCalS5基因在茎、叶、花粉管、花柱和果实中均有表达，如图3所示，其中PbrCalS5在花粉管中表达最高。

实施例3

砀山酥梨花粉管生长中梨胼胝质合成酶PbrCalS5基因的qRT-PCR分析

为了分析砀山酥梨中PbrCalS5基因对花粉管生长的响应模式，使用Real-timePCR技术对PbrCalS5基因的表达模式进行分析。根据PbrCalS5基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用Primer primier 5.0软件设计出扩增基因整个编码区的上、下游PCR引物。在花粉培养后的3h、6h、9h和12h分别收集样品。采用试剂盒提取RNA，cDNA第一条链的合成参照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作手册进行。20μL的反应体系包括：10μL SYBR Green，5μL灭菌超纯水，1μL cDNA，2μL正向引物，F2：5’-GATGAAGTTGAAGAGAGTGACGCT-3’(SEQ ID No.7)，2μL反向引物，R2：5’-GGTTTTCGGGTTTCCCTTCT-3’(SEQ ID No.8)。(以PbrUBQ为内参，序列如下：PbrUBQ-F：5’-CCCTTCACTTGGTTCTCCGT-3’(SEQ ID No.9)；PbrUBQ-R:5’-TAATCAGCAAGCGTGCGACC-3’(SEQID No.10))。

qRT-PCR的程序如下：94℃预变性3min；94℃变性3s，60℃退火10s，72℃延伸30s，50个循环；72℃延伸3min，40℃保温30s。

以不同培养时间的砀山酥梨花粉管为材料，随着时间的增加，PbrCalS5基因的相对表达量逐渐上升，如图4所示，表明PbrCalS5基因参与花粉管生长。

实施例4

梨胼胝质合成酶PbrCalS5蛋白的亚细胞定位

本实施例所用表达载体为p1300-35S：GFP，根据载体图谱及PbrCalS5基因的核苷酸序列，在基因序列前后分别加入载体同源臂序列以及XbaI和BamHI酶切位点。

以砀山酥梨花粉管的cDNA为模板，用加入同源臂序列和酶切位点的引物扩增，所用PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸6min，35个循环；72℃延伸10min。酶切位点的引物序列如下所示：

F1：5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGTCAAACCTGGATCCGCC-3’(SEQ ID No.3)；

R1：5’-GCCCTTGCTCACCATGGATCCGTTTGACTTGTGCTTCTTCCCAC-3’(SEQ ID No.4)。

PbrCalS5基因在3′去除了终止密码子，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利用凝胶试剂盒(诺唯赞，中国)回收目的条带，与表达载体进行连接，采用热激法转化到大肠杆菌DH5α中。用基因特异性引物进行PCR检测，呈阳性的菌液进行测序，得到正确的重组目的载体命名为35S-PbrCalS5-GFP。应用热激法将重组载体35S-PbrCalS5-GFP和对照空载35S-GFP分别转入农杆菌GV3101中。

采用烟草叶片瞬时转化法，具体操作方法：

1)将鉴定正确的农杆菌液，在相应抗性(卡那和利福平)的LB液体培养基中进行扩培，28～30℃摇床，200～220rpm，振荡培养过夜；

表1烟草叶片表皮细胞瞬时转化诱导液配制方法

2)收集菌液，倒掉上清，根据菌量可多收集，倒扣离心管沥干液体；

3)加入诱导液，重悬菌液，OD₆₀₀＝0.8左右；

4)室温24-26℃，避光，在摇床上进行摇晃诱导3h以上；

5)通过1mL注射器从本生烟草背面注射，暗处理24h后正常培养；

6)2-3天后通过激光共聚焦显微镜观察。

通过将35S-PbrCalS5-GFP和对照空载35S-GFP农杆菌分别注射到烟草的表皮细胞中，通过检测GFP荧光的位置来确定PbrCalS5蛋白定位的定位情况，结果如图5所示，PbrCalS5-GFP在烟草表皮细胞中的瞬时表达，绿色荧光与细胞膜染料FM4-64重叠，且未在细胞其他地方发现绿色荧光。结果表明，PbrCalS5是一个膜定位蛋白。

实施例5

梨胼胝质合成酶PbrCalS5在促进花粉管生长中的应用

为了鉴定花粉管生长是否与敲低PbrCalS5基因表达量有关，将对照系和敲低PbrCalS5基因表达的花粉管在摇床正常培养，摇床温度25～27℃，转速100-120rpm，培养2h后显微镜观察并拍照记录花粉管生长状态。

在正常培养条件下，将PbrCalS5基因敲低的花粉管及对照的花粉管的长度统计，结果如图6所示。其中：图6A为花粉管形态图，图6B是正常培养条件下处理组和对照组中PbrCalS5基因表达量检测。图6C是正常培养条件下花粉管长度统计图。结果表明，正常培养条件下PbrCalS5基因表达量降低后花粉管长度明显比对照组短(图6)

1.细胞转染试剂Lipofectamine 2000介导瞬时转化花粉管步骤如下：

(1)合成反义寡核苷酸引物和正义寡核苷酸引物干粉分别用蒸馏水稀释为1mm/L。根据需求培养适当体积的花粉，水合30-45min后观察，配制转染体系如下，混匀后置于25℃培养箱孵育15min；

表2转染体系方案

(2)加入540μL预培养的花粉培养液，25℃120rpm摇床中继续培养2h；

(3)使用NiKON ECLIPSE E100显微镜进行观察并拍照记录(图6A)；

(4)12000rpm离心3min，轻倒上清，液氮速冻，-80℃保存样品。

2.PbrCalS5基因相对表达量检测

按照上述方法得到实验样品，采用试剂盒提取RNA(成都福记，中国)，cDNA第一条链的合成参照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作手册进行。20μL的反应体系包括：10μL SYBR Green，5μL灭菌超纯水，1μL cDNA，2μL正向引物，F2：5’-GATGAAGTTGAAGAGAGTGACGCT-3’(SEQ ID No.7)，2μL反向引物，R2：5’-GGTTTTCGGGTTTCCCTTCT-3’(SEQ ID No.8)。(以PbrUBQ为内参，序列如下：PbrUBQ-F：5’-CCCTTCACTTGGTTCTCCGT-3’(SEQ ID No.9)；PbrUBQ-R:5’-TAATCAGCAAGCGTGCGACC-3’(SEQID No.10))。

qRT-PCR的程序如下：94℃预变性3min；94℃变性3s，60℃退火10s，72℃延伸30s，50个循环；72℃延伸3min，40℃保温30s。检测PbrCalS5基因相对表达量，发现PbrCalS5的表达量显著下降(图6B)。

3.梨花粉管长度统计

IPWin32软件统计花粉管的长度，GraphPad Prism 6.01进行绘图(图6C)。

实施例6

敲低PbrCalS5表达抑制花粉管生长功能的检测

在PbrCalS5表达量降低后，梨花粉管的生长受到抑制，表明PbrCalS5具有促进花粉管生长的能力。为了鉴定敲低PbrCalS5基因表达后的花粉管生长是否和胼胝质含量有关，将对照组和实验组进行苯胺蓝染色，观察梨花粉管细胞壁中胼胝质含量，并拍照统计荧光强度值。

在正常培养条件下，将PbrCalS5基因敲低的花粉管及对照的花粉管进行苯胺蓝染色并统计花粉管细胞壁荧光强度，结果如图7所示。其中：图7A为PbrCalS5基因敲低的花粉管及对照的花粉管苯胺蓝染色图，图7B是正常培养条件下PbrCalS5基因敲低的花粉管及对照的花粉管细胞壁染色荧光强度统计图。结果表明，正常生长条件下PbrCalS5基因敲低的花粉管荧光强度明显比对照的荧光强度低，说明PbrCalS5基因敲低后花粉管细胞壁的胼胝质含量显著降低(图7)。

1.0.01％苯胺蓝水溶液染色

(1)处理结束后的花粉管样品采用低转速3000rpm离心3min收集，吸出上清，管中预留100μL左右液体；

(2)加入1×PBS，清洗/离心3次；

(3)加入500μL 4％多聚甲醛室温固定2h以上；

(4)重复(2)步骤；

(5)加入0.01％溶于1×PBS的苯胺蓝溶液中染色，锡箔纸包裹。

2.花粉管细胞壁胼胝质含量检测

使用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM800，德国)观察花粉管细胞壁苯胺蓝染色荧光，ZEN软件进行荧光强度分析统计，GraphPad Prism 6.01进行绘图。

由上述实施例可知，本发明提供的梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5，经生物学功能验证具有促进植物花粉管生长的作用，敲低PbrCalS5表达量所述的胼胝质合成酶基因PbrCalS5能够有效的降低植树花粉管细胞壁的胼胝质含量，从而抑制了花粉管生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其编码基因和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5766

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcaaacc tggatccgcc aggccctagc gggccgcagg ggctgacgag aaggccgtcg 60

aggagcgcag ccaccaccac cttctccact gaggtgttcg acaacgaggt ggtcccttcc 120

gctctcgcct ccatcgctcc catcctccga gtggccaacg agatcgagaa cgagcgtcct 180

cgcgtcgcct atctctgtcg gttctatgcg ttcgagaagg cgcaccgact ggatccgagc 240

tccagcggcc gtggcgtccg ccagttcaag acttcgctcc tccaacgact cgagagggac 300

aatgcatcaa gtctgaattc tcgggttaaa aacacagatg acagagaaat taaaagcttc 360

tatcagcaat attataagca ttatgtcaga gctcttgacc agggcgagca ggctgacaga 420

gcccaactgg gaaaagccta ccgcactgcc ggagtccttt ttgaagtgct ttgcgctgtt 480

aacaagactg agaaagttga tgaagttgct cctgagatta ttgcggctgc taaagatgtc 540

caagaaaaga cagaaattta tgctccctat aacattcttc ctttggattc tgctggtgct 600

acacagtcta tcatgcaact tgaagaggtt aaggctgcag tcggtgcact attgaacact 660

cgtggtttga actggcctac tgcattggag aacagtcaca aagctggcga tctcgacctc 720

cttgattggc tgagggccat gtttggattc cagaaagaca acgtcaggaa ccagagggag 780

catttgatat ccctactcgc aaatcctcat ataaggcttc atcccaaacc cgaacctctt 840

aataagatgg atgatcgagc tgttgataaa gttatgggaa aactttttaa gaactacaaa 900

acgtggtgca aatttttggg aagaaaacat agtttgaggc ttccccaagg tcagcaagaa 960

attcagcaaa ggaagatact gtatatgggc ttatatcttc tcatctgggg tgaagcagcg 1020

aatgtccgct ttatgccaga atgtctgtgc tatatttttc ataatatggc atatgaactc 1080

catggcctgt tggctggaaa tgtcagcatc gttactgggg aaaatataaa gccttcttat 1140

ggtggggatg atgaggcttt tttacggaaa gttataaccc ctttataccg tgtaattgaa 1200

aaggaagcca agaagagcga aaatggaaaa gctcctcaca tagcttggtg caactatgac 1260

gatctcaatg aatatttctg gtcgtctgat tgcttctctc ttggttggcc catgcgtgat 1320

gatggtgatt ttttcaaatc aacgcgtgac ttggtgcagg gaagaaaggg ctctagaaga 1380

aaatctggaa gcacaggaaa atcgtatttt attgaaactc ggacattttg gcacattttt 1440

cgaagttttg acaggttttg gaccttttac atactggctc tacaggctat gctcattgtt 1500

gcttttagag ggatttcacc attggatatt tttcaaaaga atgtcttaag agatctatca 1560

agtattttca tcacagcagc atttcttcgc gtccttcaaa gcattttgga tattgttttg 1620

aacttcccgg gatatcatag gtggaggttc actgatgtgc tgcgaaatat tctcaagata 1680

attgttagtc ttgcatgggc aatcattctt cctctgtttt atgtgcattc attccagaat 1740

gcccctaaac aagttatgga tttactgtca ttccttaaga atatcaatgg tgttcctcct 1800

ttatacctca tggctgttgc agtatatttg ctgccaaatt tattaggagc agttttgttc 1860

cttttcccgc tgctccgacg ttggattgaa aactcagact ggcatatcat taggttcctt 1920

ttgtggtggt cacagccaag aatctatatt gggaggggaa tgcatgaaag tcaatttgcc 1980

cttattaagt acactatttt ttgggtgctg cttttggctt gcaagtttac agttagctat 2040

cttatccaga taaggccgtt ggtgaagcca actagagaca ttatgaacat tcgtcgtgta 2100

gattatcaat ggcatgaatt tttccctaac gctcaaaaca actatggagc agttgtgtca 2160

ctctgggcac cagtagtctt ggtttatttg atggacactc aaatatggta tgctatcttt 2220

cagactttgt atggtggtgt tgttggcgca tttgatcgcc taggagagat tcgaacactg 2280

ggtatgctaa gatcaaggtt ccagtctcta cccggtgcat tcaacacata cctagtgcct 2340

tcagataagt caacaaaaag gggattctct ttctcaaagc gtttcgtgga gattacagca 2400

agcagaagaa gtgaagctgc aaagtttgct cagttgtgga atgaagtgat ctgtagcttc 2460

cgtgaggaag atctcataaa tgacagggag atggatttac tgctagttcc gtattcatca 2520

gatcccagcc tgaagataat tcagtggccg cccttcttgc ttgctagcaa aatcccaata 2580

gcattagata tggcagttca atttaaatcg aaggactccg atctctggaa gcggatatgt 2640

gcggatgaat atatgaaatg tgctgtgatt gaatgttatg aatctttcaa acatatcctt 2700

agtactctgg tagttggaga caatgagaaa aggataattg gcatcatcgt gaaggaaatt 2760

gaaagtaaca tttcaaagaa tacatttctt gtaaatttta gaatgggttc tttgcccact 2820

ctttgcaaga aatttgtaga gcttgtgggg atcttgaaag atggtgacgc attcaagcga 2880

tcttcagtgg tgttgttgct tcaagatatg ctggaagtag tcactcgtga tatgatggtg 2940

aatgagatcc gagagttggt tgaagttggt catagtagca aggacgctgg aaggcaactc 3000

tttgctggaa ctgatgcaaa acctgcaata ttgttccctc ctccagttac agcacagtgg 3060

gaagaacaga tcagacgcct ccatctgctg ctaacagtta aggaatctgc cattgacgta 3120

ccaacaaacc tagaagcacg tagaaggatt gcatttttta caaattcatt gttcatggat 3180

atgcctcgtg ctccccgcgt ccgtaaaatg ctttcattca gcatcatgac gccatactac 3240

agtgaggaga ctctgtattc caaatcggac cttgagatgg aaaatgaaga cggtgtatca 3300

atcatatact acttacagaa gattttcccg gatgaatgga ataacttcat ggagcgactt 3360

aattgtaaaa aggatagtga aatatgggag aatgaagaga acgttttgca gcttcgtcat 3420

tgggtctcct tacgaggaca aacgctctgc aggactgtta gaggaatgat gtattaccga 3480

cgagctctga agcttcaggc ttttcttgac atggccaatg aaaccgagat actagatggc 3540

tacaaagcaa tcacggttcc accagaagaa gaaaagaaaa gccagagatc tctttatgct 3600

caattagaag cagtggctga ccttaaattc acctatgttg ctacctgcca aaactatggc 3660

aatcagaaac gcagtggaga tcgacgcgca acagacatct tgaatctgat ggttaattat 3720

ccttctcttc gggttgcata tatcgatgaa gttgaagaga gtgacgctgc tagtggaaag 3780

gtgcaaaagg tttactattc tgtcttggtc aaagctgttg acaatcatga tcaggaaata 3840

tatcgtataa agttgcctgg ttcggcgaag attggagaag ggaaaccgga aaaccagaac 3900

catgctataa tttttactcg aggagaagct cttcaggcca ttgacatgaa ccaggacaat 3960

tacttagaag aagcatttaa aatgagaaac cttcttgaag aatttaatga ggaccacgga 4020

gtacgtcctc cttcaatttt aggtgttcgt gagcatatct ttactggaag tgtttcttca 4080

ttggcctggt ttatgtcaaa tcaggaaatg agctttgtga ccataggtca aagagttctt 4140

gcaagacctt tgaagatccg cttccactat ggacacccag atgtctttga tagaatcttc 4200

cacattactc gtggtggcat gagcaaggct tcccgtggca tcaatctgag cgaggacatc 4260

tttgctggtt ttaattcaac gttaaggcga gggaatgtta ctcaccatga atacattcaa 4320

gttgggaagg gtagagatgt tgggctcaac caaatctctc tctttgaagc taaagttgct 4380

tgtggtaatg gagagcaaac gcttagcagg gatatctatc gcttagggca ccgttttgac 4440

ttctttcgca tgttgtcctt ctatttttcg acaatagggt tttacatcag cgcaatgttg 4500

gttgtcctta cagtctatgc atacttatac ggcagacttt acttgtcatt aagtggaatg 4560

gaaaagacaa ttgtgaacta tgccgccacc aggggaaata atgttctaca agcagccatg 4620

gcttcccaat ctattttcca attaggtctt ttgacttcct tgcccatgat catggaaatt 4680

ggactagaaa gagggttcag aactgcgtta ggggacatga taattatgca gctgcaacta 4740

gcatccgttt tcttcacctt ctctcttggc accaaagttc attattatgg tcgaactgtg 4800

ctgcacggcg gtgctaaata cagagcaact ggtcgtggct ttgttgtccg gcatgaaaag 4860

tttgccgaga attacaggat gtactcaagg agtcattttg tgaaaggcct tgaacttatg 4920

gtactgctta taatttatca gatatacggt tcagcagtaa ctggtacaat atcatatatc 4980

ttcgtcacat tctccatgtg gttcttagtg gtttcgtggc tgtttgctcc cttcctgttt 5040

aacccttcgg gatttgaatg gcaaaagata gtcgaagatt gggatgattg gacaaaatgg 5100

ataagtagcc atggtggtat tggtgtgcca gcgaccaaga gctgggagtc ttggtgggat 5160

gaggaacagg aacacctgca gcacactggg gttttgggac gattttggga gattgttctt 5220

tctctgcgct tctttctctt ccagtatgga attgtgtacc atctaaatgt ggccaggggt 5280

gataaaagca tcatggttta tggtctgtca tggctggtca ttgtcgctgt gatgatcatc 5340

ctaaaggttg tgtcgttggg aagaaagagg ttcagtgcag atttccagct gatgttcagg 5400

cttctcaagt tgttcctgtt tattgggttt gtcgtcacta ttggaatgct tttcgctttc 5460

ctcagtctta ctgttggtga catctttgtg agcttattgg ccttcttgcc cacgggatgg 5520

gcgctactaa tgatatcaca agcgtgcaag ccattggtga aggcgctagg aatgtgggga 5580

tctgtcaaag ctctagcaag agggtacgag tacgtgatgg ggatcactat acttgcacca 5640

gtagttgttc ttgcatggtt cccatttgtc tcggagttcc agaccaggct gctattcaac 5700

caagctttca gccgagggct tcagatccaa cgtattctta ctggtgggaa gaagcacaag 5760

tcaaac 5766

<210> 2

<211> 1922

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Asn Leu Asp Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Leu Thr

1 5 10 15

Arg Arg Pro Ser Arg Ser Ala Ala Thr Thr Thr Phe Ser Thr Glu Val

20 25 30

Phe Asp Asn Glu Val Val Pro Ser Ala Leu Ala Ser Ile Ala Pro Ile

35 40 45

Leu Arg Val Ala Asn Glu Ile Glu Asn Glu Arg Pro Arg Val Ala Tyr

50 55 60

Leu Cys Arg Phe Tyr Ala Phe Glu Lys Ala His Arg Leu Asp Pro Ser

65 70 75 80

Ser Ser Gly Arg Gly Val Arg Gln Phe Lys Thr Ser Leu Leu Gln Arg

85 90 95

Leu Glu Arg Asp Asn Ala Ser Ser Leu Asn Ser Arg Val Lys Asn Thr

100 105 110

Asp Asp Arg Glu Ile Lys Ser Phe Tyr Gln Gln Tyr Tyr Lys His Tyr

115 120 125

Val Arg Ala Leu Asp Gln Gly Glu Gln Ala Asp Arg Ala Gln Leu Gly

130 135 140

Lys Ala Tyr Arg Thr Ala Gly Val Leu Phe Glu Val Leu Cys Ala Val

145 150 155 160

Asn Lys Thr Glu Lys Val Asp Glu Val Ala Pro Glu Ile Ile Ala Ala

165 170 175

Ala Lys Asp Val Gln Glu Lys Thr Glu Ile Tyr Ala Pro Tyr Asn Ile

180 185 190

Leu Pro Leu Asp Ser Ala Gly Ala Thr Gln Ser Ile Met Gln Leu Glu

195 200 205

Glu Val Lys Ala Ala Val Gly Ala Leu Leu Asn Thr Arg Gly Leu Asn

210 215 220

Trp Pro Thr Ala Leu Glu Asn Ser His Lys Ala Gly Asp Leu Asp Leu

225 230 235 240

Leu Asp Trp Leu Arg Ala Met Phe Gly Phe Gln Lys Asp Asn Val Arg

245 250 255

Asn Gln Arg Glu His Leu Ile Ser Leu Leu Ala Asn Pro His Ile Arg

260 265 270

Leu His Pro Lys Pro Glu Pro Leu Asn Lys Met Asp Asp Arg Ala Val

275 280 285

Asp Lys Val Met Gly Lys Leu Phe Lys Asn Tyr Lys Thr Trp Cys Lys

290 295 300

Phe Leu Gly Arg Lys His Ser Leu Arg Leu Pro Gln Gly Gln Gln Glu

305 310 315 320

Ile Gln Gln Arg Lys Ile Leu Tyr Met Gly Leu Tyr Leu Leu Ile Trp

325 330 335

Gly Glu Ala Ala Asn Val Arg Phe Met Pro Glu Cys Leu Cys Tyr Ile

340 345 350

Phe His Asn Met Ala Tyr Glu Leu His Gly Leu Leu Ala Gly Asn Val

355 360 365

Ser Ile Val Thr Gly Glu Asn Ile Lys Pro Ser Tyr Gly Gly Asp Asp

370 375 380

Glu Ala Phe Leu Arg Lys Val Ile Thr Pro Leu Tyr Arg Val Ile Glu

385 390 395 400

Lys Glu Ala Lys Lys Ser Glu Asn Gly Lys Ala Pro His Ile Ala Trp

405 410 415

Cys Asn Tyr Asp Asp Leu Asn Glu Tyr Phe Trp Ser Ser Asp Cys Phe

420 425 430

Ser Leu Gly Trp Pro Met Arg Asp Asp Gly Asp Phe Phe Lys Ser Thr

435 440 445

Arg Asp Leu Val Gln Gly Arg Lys Gly Ser Arg Arg Lys Ser Gly Ser

450 455 460

Thr Gly Lys Ser Tyr Phe Ile Glu Thr Arg Thr Phe Trp His Ile Phe

465 470 475 480

Arg Ser Phe Asp Arg Phe Trp Thr Phe Tyr Ile Leu Ala Leu Gln Ala

485 490 495

Met Leu Ile Val Ala Phe Arg Gly Ile Ser Pro Leu Asp Ile Phe Gln

500 505 510

Lys Asn Val Leu Arg Asp Leu Ser Ser Ile Phe Ile Thr Ala Ala Phe

515 520 525

Leu Arg Val Leu Gln Ser Ile Leu Asp Ile Val Leu Asn Phe Pro Gly

530 535 540

Tyr His Arg Trp Arg Phe Thr Asp Val Leu Arg Asn Ile Leu Lys Ile

545 550 555 560

Ile Val Ser Leu Ala Trp Ala Ile Ile Leu Pro Leu Phe Tyr Val His

565 570 575

Ser Phe Gln Asn Ala Pro Lys Gln Val Met Asp Leu Leu Ser Phe Leu

580 585 590

Lys Asn Ile Asn Gly Val Pro Pro Leu Tyr Leu Met Ala Val Ala Val

595 600 605

Tyr Leu Leu Pro Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Phe Leu Phe Pro Leu

610 615 620

Leu Arg Arg Trp Ile Glu Asn Ser Asp Trp His Ile Ile Arg Phe Leu

625 630 635 640

Leu Trp Trp Ser Gln Pro Arg Ile Tyr Ile Gly Arg Gly Met His Glu

645 650 655

Ser Gln Phe Ala Leu Ile Lys Tyr Thr Ile Phe Trp Val Leu Leu Leu

660 665 670

Ala Cys Lys Phe Thr Val Ser Tyr Leu Ile Gln Ile Arg Pro Leu Val

675 680 685

Lys Pro Thr Arg Asp Ile Met Asn Ile Arg Arg Val Asp Tyr Gln Trp

690 695 700

His Glu Phe Phe Pro Asn Ala Gln Asn Asn Tyr Gly Ala Val Val Ser

705 710 715 720

Leu Trp Ala Pro Val Val Leu Val Tyr Leu Met Asp Thr Gln Ile Trp

725 730 735

Tyr Ala Ile Phe Gln Thr Leu Tyr Gly Gly Val Val Gly Ala Phe Asp

740 745 750

Arg Leu Gly Glu Ile Arg Thr Leu Gly Met Leu Arg Ser Arg Phe Gln

755 760 765

Ser Leu Pro Gly Ala Phe Asn Thr Tyr Leu Val Pro Ser Asp Lys Ser

770 775 780

Thr Lys Arg Gly Phe Ser Phe Ser Lys Arg Phe Val Glu Ile Thr Ala

785 790 795 800

Ser Arg Arg Ser Glu Ala Ala Lys Phe Ala Gln Leu Trp Asn Glu Val

805 810 815

Ile Cys Ser Phe Arg Glu Glu Asp Leu Ile Asn Asp Arg Glu Met Asp

820 825 830

Leu Leu Leu Val Pro Tyr Ser Ser Asp Pro Ser Leu Lys Ile Ile Gln

835 840 845

Trp Pro Pro Phe Leu Leu Ala Ser Lys Ile Pro Ile Ala Leu Asp Met

850 855 860

Ala Val Gln Phe Lys Ser Lys Asp Ser Asp Leu Trp Lys Arg Ile Cys

865 870 875 880

Ala Asp Glu Tyr Met Lys Cys Ala Val Ile Glu Cys Tyr Glu Ser Phe

885 890 895

Lys His Ile Leu Ser Thr Leu Val Val Gly Asp Asn Glu Lys Arg Ile

900 905 910

Ile Gly Ile Ile Val Lys Glu Ile Glu Ser Asn Ile Ser Lys Asn Thr

915 920 925

Phe Leu Val Asn Phe Arg Met Gly Ser Leu Pro Thr Leu Cys Lys Lys

930 935 940

Phe Val Glu Leu Val Gly Ile Leu Lys Asp Gly Asp Ala Phe Lys Arg

945 950 955 960

Ser Ser Val Val Leu Leu Leu Gln Asp Met Leu Glu Val Val Thr Arg

965 970 975

Asp Met Met Val Asn Glu Ile Arg Glu Leu Val Glu Val Gly His Ser

980 985 990

Ser Lys Asp Ala Gly Arg Gln Leu Phe Ala Gly Thr Asp Ala Lys Pro

995 1000 1005

Ala Ile Leu Phe Pro Pro Pro Val Thr Ala Gln Trp Glu Glu Gln Ile

1010 1015 1020

Arg Arg Leu His Leu Leu Leu Thr Val Lys Glu Ser Ala Ile Asp Val

1025 1030 1035 1040

Pro Thr Asn Leu Glu Ala Arg Arg Arg Ile Ala Phe Phe Thr Asn Ser

1045 1050 1055

Leu Phe Met Asp Met Pro Arg Ala Pro Arg Val Arg Lys Met Leu Ser

1060 1065 1070

Phe Ser Ile Met Thr Pro Tyr Tyr Ser Glu Glu Thr Leu Tyr Ser Lys

1075 1080 1085

Ser Asp Leu Glu Met Glu Asn Glu Asp Gly Val Ser Ile Ile Tyr Tyr

1090 1095 1100

Leu Gln Lys Ile Phe Pro Asp Glu Trp Asn Asn Phe Met Glu Arg Leu

1105 1110 1115 1120

Asn Cys Lys Lys Asp Ser Glu Ile Trp Glu Asn Glu Glu Asn Val Leu

1125 1130 1135

Gln Leu Arg His Trp Val Ser Leu Arg Gly Gln Thr Leu Cys Arg Thr

1140 1145 1150

Val Arg Gly Met Met Tyr Tyr Arg Arg Ala Leu Lys Leu Gln Ala Phe

1155 1160 1165

Leu Asp Met Ala Asn Glu Thr Glu Ile Leu Asp Gly Tyr Lys Ala Ile

1170 1175 1180

Thr Val Pro Pro Glu Glu Glu Lys Lys Ser Gln Arg Ser Leu Tyr Ala

1185 1190 1195 1200

Gln Leu Glu Ala Val Ala Asp Leu Lys Phe Thr Tyr Val Ala Thr Cys

1205 1210 1215

Gln Asn Tyr Gly Asn Gln Lys Arg Ser Gly Asp Arg Arg Ala Thr Asp

1220 1225 1230

Ile Leu Asn Leu Met Val Asn Tyr Pro Ser Leu Arg Val Ala Tyr Ile

1235 1240 1245

Asp Glu Val Glu Glu Ser Asp Ala Ala Ser Gly Lys Val Gln Lys Val

1250 1255 1260

Tyr Tyr Ser Val Leu Val Lys Ala Val Asp Asn His Asp Gln Glu Ile

1265 1270 1275 1280

Tyr Arg Ile Lys Leu Pro Gly Ser Ala Lys Ile Gly Glu Gly Lys Pro

1285 1290 1295

Glu Asn Gln Asn His Ala Ile Ile Phe Thr Arg Gly Glu Ala Leu Gln

1300 1305 1310

Ala Ile Asp Met Asn Gln Asp Asn Tyr Leu Glu Glu Ala Phe Lys Met

1315 1320 1325

Arg Asn Leu Leu Glu Glu Phe Asn Glu Asp His Gly Val Arg Pro Pro

1330 1335 1340

Ser Ile Leu Gly Val Arg Glu His Ile Phe Thr Gly Ser Val Ser Ser

1345 1350 1355 1360

Leu Ala Trp Phe Met Ser Asn Gln Glu Met Ser Phe Val Thr Ile Gly

1365 1370 1375

Gln Arg Val Leu Ala Arg Pro Leu Lys Ile Arg Phe His Tyr Gly His

1380 1385 1390

Pro Asp Val Phe Asp Arg Ile Phe His Ile Thr Arg Gly Gly Met Ser

1395 1400 1405

Lys Ala Ser Arg Gly Ile Asn Leu Ser Glu Asp Ile Phe Ala Gly Phe

1410 1415 1420

Asn Ser Thr Leu Arg Arg Gly Asn Val Thr His His Glu Tyr Ile Gln

1425 1430 1435 1440

Val Gly Lys Gly Arg Asp Val Gly Leu Asn Gln Ile Ser Leu Phe Glu

1445 1450 1455

Ala Lys Val Ala Cys Gly Asn Gly Glu Gln Thr Leu Ser Arg Asp Ile

1460 1465 1470

Tyr Arg Leu Gly His Arg Phe Asp Phe Phe Arg Met Leu Ser Phe Tyr

1475 1480 1485

Phe Ser Thr Ile Gly Phe Tyr Ile Ser Ala Met Leu Val Val Leu Thr

1490 1495 1500

Val Tyr Ala Tyr Leu Tyr Gly Arg Leu Tyr Leu Ser Leu Ser Gly Met

1505 1510 1515 1520

Glu Lys Thr Ile Val Asn Tyr Ala Ala Thr Arg Gly Asn Asn Val Leu

1525 1530 1535

Gln Ala Ala Met Ala Ser Gln Ser Ile Phe Gln Leu Gly Leu Leu Thr

1540 1545 1550

Ser Leu Pro Met Ile Met Glu Ile Gly Leu Glu Arg Gly Phe Arg Thr

1555 1560 1565

Ala Leu Gly Asp Met Ile Ile Met Gln Leu Gln Leu Ala Ser Val Phe

1570 1575 1580

Phe Thr Phe Ser Leu Gly Thr Lys Val His Tyr Tyr Gly Arg Thr Val

1585 1590 1595 1600

Leu His Gly Gly Ala Lys Tyr Arg Ala Thr Gly Arg Gly Phe Val Val

1605 1610 1615

Arg His Glu Lys Phe Ala Glu Asn Tyr Arg Met Tyr Ser Arg Ser His

1620 1625 1630

Phe Val Lys Gly Leu Glu Leu Met Val Leu Leu Ile Ile Tyr Gln Ile

1635 1640 1645

Tyr Gly Ser Ala Val Thr Gly Thr Ile Ser Tyr Ile Phe Val Thr Phe

1650 1655 1660

Ser Met Trp Phe Leu Val Val Ser Trp Leu Phe Ala Pro Phe Leu Phe

1665 1670 1675 1680

Asn Pro Ser Gly Phe Glu Trp Gln Lys Ile Val Glu Asp Trp Asp Asp

1685 1690 1695

Trp Thr Lys Trp Ile Ser Ser His Gly Gly Ile Gly Val Pro Ala Thr

1700 1705 1710

Lys Ser Trp Glu Ser Trp Trp Asp Glu Glu Gln Glu His Leu Gln His

1715 1720 1725

Thr Gly Val Leu Gly Arg Phe Trp Glu Ile Val Leu Ser Leu Arg Phe

1730 1735 1740

Phe Leu Phe Gln Tyr Gly Ile Val Tyr His Leu Asn Val Ala Arg Gly

1745 1750 1755 1760

Asp Lys Ser Ile Met Val Tyr Gly Leu Ser Trp Leu Val Ile Val Ala

1765 1770 1775

Val Met Ile Ile Leu Lys Val Val Ser Leu Gly Arg Lys Arg Phe Ser

1780 1785 1790

Ala Asp Phe Gln Leu Met Phe Arg Leu Leu Lys Leu Phe Leu Phe Ile

1795 1800 1805

Gly Phe Val Val Thr Ile Gly Met Leu Phe Ala Phe Leu Ser Leu Thr

1810 1815 1820

Val Gly Asp Ile Phe Val Ser Leu Leu Ala Phe Leu Pro Thr Gly Trp

1825 1830 1835 1840

Ala Leu Leu Met Ile Ser Gln Ala Cys Lys Pro Leu Val Lys Ala Leu

1845 1850 1855

Gly Met Trp Gly Ser Val Lys Ala Leu Ala Arg Gly Tyr Glu Tyr Val

1860 1865 1870

Met Gly Ile Thr Ile Leu Ala Pro Val Val Val Leu Ala Trp Phe Pro

1875 1880 1885

Phe Val Ser Glu Phe Gln Thr Arg Leu Leu Phe Asn Gln Ala Phe Ser

1890 1895 1900

Arg Gly Leu Gln Ile Gln Arg Ile Leu Thr Gly Gly Lys Lys His Lys

1905 1910 1915 1920

Ser Asn

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaacacgg gggactctag aatgtcaaac ctggatccgc c 41

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccttgctc accatggatc cgtttgactt gtgcttcttc ccac 44

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgttgtcg aacacctca 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgaggtgttc gacaacgag 19

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgaagttg aagagagtga cgct 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggttttcggg tttcccttct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccttcactt ggttctccgt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatcagcaa gcgtgcgacc 20

Claims

1.梨胼胝质合成酶PbrCalS5，其特征在于，其为如下a）或b)中的任一种：

a）其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

b）将SEQ ID NO.2 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物合成胼胝质相关的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的梨胼胝质合成酶PbrCalS5的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其为如下1)~2)中的任一种：

1）其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2）与SEQ ID No.1具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上同源性，且编码合成胼胝质相关蛋白的DNA分子。

4. 扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物对；优选的，所述的引物对为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌。

6. 含有权利要求2或3所述基因的反义寡核苷酸引物，其特征在于，其引物序列如SEQID No.5。

7. 含有权利要求2或3所述基因的正义寡核苷酸引物，其特征在于，其引物序列如SEQID No.6。

8.权利要求1所述的胼胝质合成酶PbrCalS5，和/或，权利要求2或3所述的基因，和/或权利要求5所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌，和/或，权利要求6所述的反义寡核苷酸引物中的至少一种在调控花粉管生长中的应用；优选的，所述植物为梨；更优选为砀山酥梨。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供权利要求2或3所述的梨胼胝质合成酶PbrCalS5的基因；

2）对所述的梨胼胝质合成酶PbrCalS5的基因设计反义寡核苷酸引物；

3）将所述反义寡核苷酸引物转入花粉管细胞，获得敲低梨胼胝质合成酶基因PbrCalS5表达后的花粉管。

10.一种促进/抑制花粉管生长的方法，其特征在于，其为如下A）或B)中的任一种：

A）促进花粉管生长的方法：

所述方法包括提高花粉管中权利要求1所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性；

优选的，所述提高花粉管中权利要求1所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性通过提高花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的编码基因的表达量来实现；

B）抑制花粉管生长的方法：

所述方法包括降低花粉管中权利要求1所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性；

优选的，所述降低花粉管中权利要求1所述的合成酶PbrCalS5的含量和/或活性通过敲低花粉管中所述的合成酶PbrCalS5的编码基因的表达量来实现。