JP2004321176A - ポリケタイドシンターゼ遺伝子、および紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法 - Google Patents
ポリケタイドシンターゼ遺伝子、および紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子において、1以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも1つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するDNA。当該DNAを含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌、特にシトリニン生産能を有する紅麹菌の、当該シトリニン合成能を破壊することが可能となる。
【選択図】 なし
Description
一方、これらの属に含まれる種のうちのいくつかの株では、シトリニン(Citrinin)という代謝物を生産することが知られている。過去には野生カビにより汚染された輸入米が大規模な中毒をひきおこした例が存在する。
現状では、特許文献1に記載の方法をはじめとする従来法の様に、偶然性と労力に頼るのではなく、確実にシトリニン非生産株を得る方法は未だ公表、実現されていない。
(a)配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質を提供する。
本発明は請求項2として、配列表の配列番号1に示した塩基配列で表わされる、請求項1記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子を提供する。
本発明は請求項3として、請求項1または2記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子を提供する。
本発明は請求項4として、請求項1〜3の何れか1項記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
本発明は請求項5として、以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質:
(a)配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質を提供する。
本発明は請求項6として、請求項1〜3のいずれか1項記載の遺伝子において、1以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも1つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するDNAを提供する。
本発明は請求項7として、ケトシンターゼ活性中心およびアシルキャリアータンパク質活性中心が欠失した請求項6記載のDNAを提供する。
本発明は請求項8として、以下の(a)〜(g)のいずれかのDNA:
(a)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の塩基配列からなるDNA;
(d)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の塩基配列からなるDNAを含むDNA;
(e)配列表の配列番号1における塩基番号3432〜5554の塩基配列からなるDNA;
(f)配列表の配列番号1における塩基番号3432〜5554の塩基配列からなるDNAを含むDNA;
(g)前記(a)〜(f)のいずれかのDNAと相補的な塩基配列を有するDNAを提供する。
本発明は請求項9として、以下の(a)〜(d)のいずれかのDNA:
(a)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の全部または一部分からなるDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA;
(b)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の全部または一部分の塩基配列に1以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも1つを有する塩基配列からなるDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA;
(c)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の全部または一部分からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA;
(d)前記(a)〜(c)のDNAと相補的な塩基配列を有するDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNAを提供する。
本発明は請求項10として、紅麹菌由来の請求項6〜9のいずれか1項記載のDNAを提供する。
本発明は請求項11として、請求項6〜10のいずれか1項記載のDNAを含む組換えベクターを提供する。
本発明は請求項12として、請求項11の組換えベクターが導入された紅麹菌を提供する。
本発明は請求項13として、請求項11の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、シトリニン合成能が破壊された、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株を提供する。
本発明は請求項14として、請求項11の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、ポリケタイドシンターゼ遺伝子が破壊された紅麹菌のシトリニン合成能破壊株を提供する。
本発明は請求項15として、請求項11の組換えベクターを紅麹菌に導入し、該紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊することを特徴とする、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法を提供する。
本発明は請求項16として、配列表の配列番号4の塩基配列を有する遺伝子を提供する。
本発明は請求項17として、以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質を提供する。
本発明は請求項18として、以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質:
(a)配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質を提供する。
また、本発明は、前記ポリケタイドシンターゼ遺伝子において、1以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも1つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された遺伝子を構成するDNAをはじめとする、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNAを含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌、特にシトリニン生産能を有する紅麹菌の、当該シトリニン合成能を破壊できるという有利な効果を有する。また、少なくとも当該DNAを含む組換えベクターによる、紅麹菌のシトリニン合成能の破壊は、紅麹菌の赤色色素生産を妨げることなく達成できるという有利な効果を有する。
また、本発明は、紅麹菌のポリケタイドシンターゼの一部と推察される配列番号1における塩基番号3405〜6830の塩基配列を有するDNA、または当該塩基配列の一部分を有するDNAであって紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA、好ましくは配列番号1における塩基番号3432〜5554の塩基配列を有するDNA、を含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌、特にシトリニン生産能を有する紅麹菌の、当該シトリニン合成能を破壊できるという有利な効果を有する。また、当該DNAを含む組換えベクターによる、紅麹菌のシトリニン合成能の破壊は、紅麹菌の赤色色素生産を妨げることなく達成できるという有利な効果を有する。
さらに、本発明は、紅麹菌において多剤排出トランスポーターとして機能すると考えられる遺伝子、特に、菌体内で生産されたシトリニンの菌体外への排出に関与すると考えられる遺伝子を提供することを可能にする。
本発明の第1の態様は、配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子である。当該遺伝子は紅麹菌におけるポリケタイドシンターゼをコードする遺伝子であり、詳細には、紅麹菌におけるシトリニンの生合成に関与するポリケタイドシンターゼをコードする遺伝子である。
紅麹菌ゲノムから得られた配列番号1の塩基配列を有するDNAを日本DNAデータバンク提供のFASTA,BLASTによる相同性検索により解析した結果、当該DNAはポリケタイドシンターゼ遺伝子を含むものと推定された。特に、配列表の配列番号1における塩基番号3432〜5554の部分の塩基配列からなるDNAを含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊することができたことから、配列番号1の塩基配列を有するDNAは、シトリニン生合成に関与するポリケタイドシンターゼ遺伝子(以降、pksCTとも称する)を含むものと推定された。
好ましくは、当該ポリケタイドシンターゼ遺伝子は、配列表の配列番号1の塩基番号1684〜9520(途中、塩基番号2265〜2348のイントロンを含む)で、配列表の配列番号2に示される2584アミノ酸からなるタンパク質をコードする。
また、本発明のポリケタイドシンターゼ遺伝子は、その配列中に任意のイントロンを含んでいても良いし、イントロンを含んでいなくても良い。
さらに、配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子;配列表の配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子;並びに配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって配列表の配列番号1に示した塩基配列で表わされるポリケタイドシンターゼ遺伝子のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子も本発明の範囲内のものである。
前記遺伝子の取得方法においては、好ましくは、シトリニンを生合成している状態の紅麹菌からトータルmRNAまたはcDNAライブラリーを調製するのが好ましい。また、前記遺伝子の取得方法においては、PCR(RT−PCRを含む)に使用されるプライマーとしては、
KS1FRT:5’−GGAATTCTGCAGCCAGTGTGGCTATTCACC−3’
LC5RRT:5’−GGAATTCTGCAGAAGAGTAATGTCATTAGG−3’
の組み合わせが好ましい。
また、他のプライマーとしては、
F:5’−ATTGCTTGGGCTGCCAGTG−3’
R:5’−ATCAAAGTCCGGAAGCGC−3’
の組み合わせが好ましい。
また、配列番号1の塩基配列から想定される、プライマーとして適する任意の塩基配列、例えば、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子における糸状菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子のコンセンサス配列に相当する部分を有するDNAをプライマーとして使用することも可能である。
本発明のポリケタイドシンターゼ(PKSCT)におけるケトシンターゼ活性中心周辺配列、アシルトランスフェラーゼ活性中心周辺配列、およびアシルキャリアータンパク質活性中心周辺配列のアミノ酸配列はそれぞれ、DTACSS(KS活性中心周辺配列)、GHSFGE(AT活性中心周辺配列)およびGIDS(ACP活性中心周辺配列)であり、これらは、真菌類ポリケタイドシンターゼにおけるこれらの活性中心周辺配列を構成する典型的なアミノ酸配列である、DXACXS(KS活性中心周辺配列)、GHSXG(AT活性中心周辺配列)およびGXDS(ACP活性中心周辺配列)(Xは、真菌類ポリケタイドシンターゼにおいて厳密に保存されていないアミノ酸を示す。後述の場合も同様である)(Polyketide synthase gene pksM from Aspergillus terreus expressed during growth phase. Folia Microbiol. 42 (5):419−430.1997.参照)に対して良好な一致が認められた。
なお、本発明のポリケタイドシンターゼ(PKSCT)においては、他の真菌類ポリケタイドシンターゼに認められる場合のある、ACPドメインの下流に存在するチオエステラーゼ活性中心周辺配列(典型的なアミノ酸配列はGPYXLXGWSXXGである)または、非常に長い下流領域は認められなかった。
また、本発明の他の態様は、上記ポリケタイドシンターゼ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、すなわち、紅麹菌におけるポリケタイドシンターゼであり、特に、紅麹菌のシトリニン生合成に関与するポリケタイドシンターゼ(以降、当該タンパク質をPKSCTとも称する)である。当該組換えタンパク質の調製は、任意の公知の方法によって行うことができ、特に限定されるものではない。
上記理論に基づくと、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNAとして、本願発明のポリケタイドシンターゼ遺伝子において、1以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも1つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するDNAが挙げられる。かかるDNAが紅麹菌のゲノムDNAと相同組換えすることにより、ゲノム上のポリケタイドシンターゼ遺伝子が機能を有しないものに置き換えられ、その転写、翻訳産物がポリケタイドシンターゼとしての機能を有しないものとなるので、紅麹菌におけるシトリニン合成能が破壊されることが考えられる。
ここで、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子としては、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊されているのであれば特に限定されるものではないが、例えば、ポリケタイドシンターゼとしての機能するのに必須である、ケトシンターゼドメイン、アシルトランスフェラーゼドメイン、アシルキャリアータンパク質ドメインの少なくとも1つのドメインの機能が破壊されたものが挙げられる。破壊の態様としては特に限定されるものではないが、アミノ酸置換、欠失、挿入などにより活性を消失するような態様、ドメイン自体が欠失するような態様などが挙げられる。
ここでのそれぞれのドメインは、各ドメインの活性に必須の部分として既に述べたような活性中心を有する。よって、好ましくは、破壊の態様としては、ケトシンターゼ活性中心、アシルトランスフェラーゼ活性中心、アシルキャリアータンパク質活性中心の少なくとも1つの活性中心が破壊されたものが挙げられる。
さらなる本発明のDNAとして、配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の一部分であって、紅麹菌ゲノム中のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こし得るDNAが挙げられ、好ましくは、配列表の配列番号1における塩基番号3432〜5554の一部分であって、紅麹菌ゲノム中のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こし得るDNAが挙げられる。
本発明のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであっても、組換えベクターとして紅麹菌に導入された場合に、当該DNAは紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こし、紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊し得ることを、当業者は理解するであろう。
好ましくは、本発明の組換えベクターに使用されるベクターとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子(E.coli由来)に、A.nidulans由来のtrpC遺伝子のプロモーター、ターミネーターを繋げた遺伝子をマーカーに持つベクターpCSN43、pCSN44(Fungal Genetic Stock Centerから入手可能)等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
組換えベクターの紅麹菌への導入は、たとえばカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの一般的な方法で実施でき、特に限定されるものではない。好ましくは、組換えベクターの紅麹菌への導入は、プロトプラスト法である。
当該配列番号4の塩基配列を有する遺伝子は、塩基番号316〜377および1462〜1511にイントロンを含んでおり、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。よって、本発明の好ましい態様は、配列表の配列番号4の塩基配列を有する遺伝子であって、イントロン(塩基番号316〜377および1462〜1511)を含まない遺伝子である。
当該配列番号4の塩基配列を有する遺伝子は、配列番号1の塩基配列を有するDNAを日本DNAデータバンク提供のFASTA,BLASTによる相同性検索により解析した結果見出されたものであり、当該配列番号4の塩基配列を有する遺伝子産物は、Candida albicansにおいてアゾール系抗真菌剤に対する耐性に関与している多剤排出トランスポーター(multidrug efflux transporter)(FLU1)のアミノ酸配列34%の相同性を有していた。このことから、配列表の配列番号4の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質は、FLU1がコードするタンパク質と類似の機能、すなわち、アゾール系抗真菌剤に対する耐性に関与する多剤排出トランスポーターの機能を有することが推察される。
ここで、ミコフェノール酸は、縮合2環式構造を有しており、その一方の環がフェノール性水酸基を有するベンゼン環であり、他方の環が酸素原子を有する複素環である化合物である。一方、紅麹菌が生産するシトリニンも縮合2環式構造をゆうしており、その一方の環がフェノール性水酸基を有するベンゼン環であり、他方の環が酸素原子を有する複素環である点で、ミコフェノール酸とその化学構造が類似している。
よって、配列表の配列番号4の塩基配列を有する遺伝子(以下、多剤排出トランスポーター遺伝子とも称する)がコードするタンパク質は、好ましくは、多剤排出トランスポーター活性を有しており、より好ましくは、シトリニンを菌体外に排出するシトリニン排出活性を有する。なお、本明細書において、紅麹菌において生産されたシトリニンが、菌体内から菌体外へ排出される場合に、シトリニン排出活性が認められたとする。
また、当該遺伝子がコードするタンパク質は、シトリニンだけでなく、アゾール系抗真菌剤を菌体外に排出することが考えられるので、当該遺伝子をシトリニンまたはアゾール系抗真菌剤の耐性遺伝子である形質転換マーカーとして使用することが可能となる。また、当該遺伝子を改変することにより、多様なアゾール系化合物または他の物質に対する耐性マーカーとして使用することも可能である。
さらに、当該遺伝子がコードするタンパク質は、シトリニンまたはアゾール系抗真菌剤を菌体外に排出すると考えられるので、当該タンパク質で輸送されない化合物をスクリーニングすること、または当該タンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングすることによる抗真菌剤の開発に使用することが可能である。
また、本発明の多剤排出トランスポーター遺伝子は、その配列中に任意のイントロン(配列番号4における塩基番号316〜377および1462〜1511と同じであっても良いし、異なっていても良い)を含んでいても良いし、イントロンを含んでいなくても良い。
また、配列表の配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子も本発明の範囲内のものである。かかる遺伝子は、任意の公知の方法で、適宜、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、挿入等を行うことにより得ることができる。
さらに、配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子;配列表の配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子;並びに配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって配列表の配列番号1に示した塩基配列で表わされる多剤排出トランスポーター遺伝子のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子も本発明の範囲内のものである。
また、本発明の他の態様は、上記多剤排出トランスポーター遺伝子によってコードされるタンパク質であり、すなわち、紅麹菌における多剤排出トランスポーターとして機能するタンパク質であり、特に、シトリニン排出活性を有するタンパク質である。当該組換えタンパク質の調製は、任意の公知の方法によって行うことができ、特に限定されるものではない。
好ましくは、本発明の組換えベクターに使用されるベクターとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子(E.coli由来)に、A.nidulans由来のtrpC遺伝子のプロモーター、ターミネーターを繋げた遺伝子をマーカーに持つベクターpCSN43、pCSN44(Fungal Genetic Stock Centerから入手可能)等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
紅麹菌菌体中のシトリニンの定量
100mlヘンネベルク(Henneberg)液体培地(グルコース 5.0%;ペプトン 0.75%;NH4H2PO4 0.2%;KNO3 0.05%;MgSO47H2O 0.01%;CaCl22H2O 0.2%)入りの500ml容のバッフルフラスコにヘンネベルクアガープレート(上記ヘンネベルク液体培地にさらに2%の寒天を含む)で培養しておいた、紅麹菌の高シトリニン生産株であるYAW1株、または紅麹菌の低シトリニン生産株であるHU391株の菌糸片をアガーごと(1.5cm×1.5cm角)植菌し、28℃、120spmで培養し、経時的に菌体をそれぞれブフナー漏斗で回収し、乾燥機(100℃)で乾燥させた菌体を液体窒素と共に、乳鉢で菌体をすりつぶして粉状乾燥菌体とした。特に示されない限りは、後述の実施例における紅麹菌の培養条件は実施例1に準じて行われた。
培養2日目頃からシトリニンの生産が認められ、培養7日目では、高シトリニン生産株であるYAW1株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約1200ppmであり、低シトリニン生産株であるHU391株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約30ppmであった。また、培養10日目では、高シトリニン生産株であるYAW1株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約1500ppmであり、低シトリニン生産株であるHU391株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約10ppmであり、いずれにおいても、シトリニンの生産が認められた。
RT−PCRによるポリケタイドシンターゼ遺伝子のスクリーニング
(1)紅麹菌菌糸体からのトータルRNAの抽出
100mlヘンネベルク液体培地入りの500ml容のバッフルフラスコにヘンネベルクアガープレートで培養しておいた高シトリニン生産株であるYAW1株または低シトリニン生産株であるHU391株の菌糸片をagarごと(1.5cm×1.5cm角)植菌し、培養7日目の菌体をそれぞれブフナー漏斗とろ紙によりろ過して集菌した。約50mgの菌体を液体窒素で凍結させ、乳鉢で粉状になるまですりつぶして凍結紛状菌体を得た。QIAGEN社のRNeasy Plant Mini Kitを使用して、該凍結紛状菌体からRNAを抽出し、トータルRNAを得た。抽出条件は、RNeasy Plant Mini Kitに添付されるマニュアルに記載の条件に従った。得られたトータルRNAは20μlのDEPC処理水に懸濁された。
高シトリニン生産株であるYAW1株および低シトリニン生産株であるHU391株のトータルRNAは、それぞれ以下の組成で、37℃.30分間反応を行うことによりDNaseI(RNaseフリー)処理された。
組成:トータルRNA 24.5μl;1M Tris−HCl(pH7.5)2.5μl;25mM MgCl2 20μl;RNaseインヒビター 1μl;およびDNaseI(RNaseフリー)2μl(合計50μl)。
反応終了後、RNeasy Plant Mini Kitでクリーンアップを行った。クリーンアップの条件は添付のマニュアルに記載の条件に従った。
DNaseI(RNaseフリー)処理後の、シトリニン高生産株であるYAW1株のトータルRNAを鋳型に、以下の組成で、TAKARA社のmRNA Selective PCR Kit Ver.1.1を使用してRT−PCRを行った。RT−PCR処理条件は、50℃で15分処理を1回行った後、85℃30秒、40℃1分、72℃1分の処理を30サイクル行い、次いで、72℃7分の処理を1回行った。処理後に得られた反応液を2%アガロースゲル(agarose L03:タカラバイオ株式会社)で電気泳動を行った。プライマーとしては、各種糸状菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子のコンセンサス配列を参考にして作成された下記のプライマーの組み合わせを使用した場合に増幅産物が確認された。
組成:Master mix 38μl;AMV Rtase 1μl;AMV optimized taq 1μl;KS1FRT(foward)1μl;LC5RRT(reverse)1μl;および鋳型RNA 3μl(合計45μl)。
Master mixの組成:2×mRNAバッファー 25μl;MgCl2 10μl;dNTP/アナログ 5μl;RNaseインヒビター 1μl;DH2O 4μl(合計45μl)。
プライマー
KS1FRT:5’−GGAATTCTGCAGCCAGTGTGGCTATTCACC−3’
LC5RRT:5’−GGAATTCTGCAGAAGAGTAATGTCATTAGG−3’
ノザンハイブリダイゼーションによる遺伝子断片の転写解析
上述のRT−PCR増幅産物が、シトリニン高生産株であるYAW1株およびシトリニン低生産株であるHU391株において転写されているのか、およびこの増幅産物を含む遺伝子の転写に差があるのかを調べるために、ノザンハイブリダイゼーションによる転写解析を行った。
蒸留水74mlに、アガロース1.2g、10×電気泳動用緩衝液(MOPSバッファー)10mlを加え、ゲルを溶解した後、16mlのホルムアルデヒドを加え混合し、サブマリン型電気泳動ゲルを作成した。泳動バッファーは1×MOPSバッファーを用いた。上述の方法で調製された、DNaseI(RNaseフリー)処理後のトータルRNA溶液6μl、10×MOPS 2.5μl、ホルムアルデヒド4μl、ホルムアミド12.5μlを混合し、65℃、5分加熱後、氷中で急冷し、泳動用色素液を2.5μl加え、50Vで約2時間泳動を行った。この際分子量マーカーを同時に泳動した。分子量マーカーの部分は切り取り、エチジウムブロマイド溶液で染色し移動距離を測定した。
トランスファーは、Hybond−N+ブロッティングメンブレン(AMERSHAM BIOSCIENCES社)の使用説明書に記載の方法に従った。電気泳動で分離したRNAをトランスファーによりナイロンメンブレンに移した。トランスファーバッファーは20×SSC(20×SSC:3M NaCl、0.3Mクエン酸ナトリウム)を用い、12時間以上行った。ブロットしたメンブレンを蒸留水で洗浄した後、3MM(Whatman社)ろ紙にはさんで乾燥させ、ラップに包んでUVを5分間照射しRNAを固定化した。
プローブとしてKS1FRTおよびLC5RRTを用いたRT−PCRで増幅されたDNA断片を鋳型として、ランダムプライマーラベリングキット(タカラバイオ株式会社)を用いてDNAプローブを作成した。エッペンドルフチューブに約1μgの鋳型DNA断片とランダムプライマー2μlを入れ、滅菌水で14μlにメスアップして反応液を調整し、これを95℃、3分間加熱後、氷中で急冷した。以降の操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行い、[α−32P]dCTP(AMERSHAM BIOSCIENCES社)でラベルされたDNAプローブを調製した。
上述の方法でRNAが固定化されたメンブレンおよびDNAプローブを用いてノザンハイブリダイゼーション処理を行った。まず、メンブレンをRapid−hyb buffer(AMERSHAM BIOSCIENCES社)に充分浸し、65℃、30分間、プレハイブリダイゼーションを行った後、調製したDNAプローブを加えてさらに65℃、2時間振とうを行いハイブリダイゼーションを行った。反応終了後、バッファーを捨て、洗浄液(0.5×SSC、0.1% SDS)200mlで、65℃、10分間洗浄を行った。この操作をもう一度繰り返し、メンブレンから洗浄液を良く除いた後ラップフィルムに包み、シグナルをX線フィルムに−80℃、1時間感光させて現像を行った。
ノザンハイブリダイゼーションの結果を図1に示す。図1のレーン1はシトリニン低生産株であるHU391株、レーン2はシトリニン高生産株であるYAW1株である。シトリニン低生産株であるHU391株、シトリニン高生産株であるYAW1株のいずれにおいても、8kb付近にバンドが検出されたが、シトリニン低生産株であるHU391株よりもシトリニン高生産株であるYAW1株の方が強いシグナルを示した。ここで、トータルRNAを回収した時点で、いずれの菌株においてもシトリニンが生産されていること、シトリニン低生産株であるHU391株よりもシトリニン高生産株であるYAW1株の方が菌体内シトリニンの量が多いことを考慮すると、KS1FRTおよびLC5RRTを用いたRT−PCRで増幅されたDNA断片はシトリニン生合成に関連する遺伝子の断片である可能性が示唆された。
RT−PCR増幅産物周辺領域のクローニング
実施例2で得られたKS1FRTおよびLC5RRTを用いたRT−PCRで増幅されたDNA断片を含む遺伝子をクローニングするために、該増幅されたDNA断片の周辺領域のクローニングを行った。
100mlヘンネベルク液体培地入りの500ml容のバッフルフラスコにヘンネベルクアガープレートで培養しておいた高シトリニン生産株であるYAW1株または低シトリニン生産株であるHU391株の菌糸片をアガーごと(1.5cm×1.5cm角)植菌し、培養7日目の菌体をそれぞれブフナー漏斗とろ紙によりろ過して集菌した。約1000mgの菌体を液体窒素で凍結させ、乳鉢で粉状になるまですりつぶして凍結紛状菌体を得た。該凍結紛状菌体から、Zolan ME、Mol Cell Biol 1986 Jan;6(1):195−200の方法でゲノムDNAの抽出を行った。最終的に、HU391株の菌体1gから、約600μgのゲノムDNAが得られ、これをTE(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)で0.5μg/μl溶液とした。
クローニングに適切な長さにゲノムDNAを切断すべく、各種制限酵素を用いて以下の通り、ゲノムDNAの切断処理を行った。ゲノムDNA(0.5μg/μl)30μl、制限酵素10μl、制限酵素バッファー10μl、RNase(2mg/ml)2μlおよび滅菌蒸留水50μl(トータル100μl)をチューブに取り、37℃、オーバーナイトでゲノムDNAの制限酵素処理を行った。制限酵素は、BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SacI、SalI、XbaIまたはXhoIを使用した。
切断処理後、エタノール沈殿して最終12μlに懸濁し、mupid用EM−10ゲルを用いて電気泳動を約50分間行った。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し撮影を行った後、ナイロンメンブレンにトランスファーを行った。トランスファーの方法は前述の、実施例3(2)に記載された通りである。トランスファー後、メンブレンを2×SSCで5分間洗浄し、UV固定を5分間行った。サザンハイブリダイゼーション解析用プローブは、前述の実施例3(3)で調製されたものを使用し、ハイブリダイゼーションは、前述の実施例3(4)に記載された方法で行った。
実施例4の(1)で得られたHU391株のゲノムDNA(0.5μg/μl)18μl、BamHI(株式会社ニッポンジーン)20μl、Bバッファー(株式会社ニッポンジーン)20μlおよび滅菌蒸留水142μl(トータル200μl)をチューブに取り、37℃、オーバーナイトでゲノムDNAのBamHI処理を行った。この処理をチューブ5本分行った。
各チューブについてエタノール沈殿後、約12μlの滅菌蒸留水に懸濁し、電気泳動を行った。エチジウムブロマイドで染色後撮影を行い、約4kb付近のゲルをカッターナイフで切り出した。泳動の乱れを予想して、予想されるゲルの位置からさらに上とさらに下の部分も切り出した。それぞれ切り出したゲルについてウルトラフリーDA(日本ミリポア)を用いてゲル中のDNAを回収した。この溶液をさらにエタノール沈殿し、乾燥後8μlの滅菌蒸留水に懸濁した。この内3μlを電気泳動し、メンブレンにトランスファーしてサザンハイブリダイゼーション解析を行うことにより、ゲルから抽出したDNA中に目的の断片が含まれているのかどうかを確認した。サザンハイブリダイゼーション解析用プローブとして、前述の実施例3(3)で調製されたものを使用し、ハイブリダイゼーションは、前述の実施例3(4)に記載された方法で行った。解析の結果、切り出したゲル3片の中で最もシグナルが強く、かつコントロールのシグナルと同等以上の強さがあるDNA溶液をプラスミドベクターpUC19とのライゲーション反応に用いることとした。
クローニングに使用するプラスミドベクターpUC19は、BamHI、CIAP処理を行ったものを電気泳動し、バンドをゲルから切り出してDNA抽出したものを使用した。pUC19(1.4μg/μl)4μl、K buffer(タカラバイオ株式会社)4μl、BamHI(タカラバイオ株式会社)4μl、および蒸留水38μlの組成(合計50μl)で、37℃、2時間反応を行った。反応後エタノール沈殿を行い、DNAペレットを乾燥して乾燥DNAを得た。当該乾燥DNAに、10×CIP buffer(タカラバイオ株式会社)10μl、CIP(タカラバイオ株式会社)2μl、および蒸留水88μlを加え(合計100μl)、50℃で、30分間反応を行った。反応後、フェノール抽出を2回行い、さらにクロロホルム抽出を1回行った。抽出液をエタノール沈殿し、DNAペレットを乾燥後、15μlの蒸留水に溶解し、プラスミドベクターpUC19液を調製した。
実施例4(3)で得られたBamHI断片を含むDNA溶液3.5μl、上記実施例4(4)で調製されたプラスミドベクターpUC19液5μlおよびライゲーションキットI液(タカラバイオ株式会社)8.5μlをチューブに入れ(合計17μl)、16℃で30分間処理して、BamHI断片含有プラスミドベクターpUC19を得た。
実施例4(4)で得られたBamHI断片含有プラスミドベクターpUC19を用いて、大腸菌(E.coli)XL−10 GOLD(STRATAGENE社)の形質転換処理を行った。形質転換処理は、添付されたマニュアルに記載の条件に従って行った。形質転換後、X−gal、IPTG入りのLBampプレートにスプレッドして、37℃、オーバーナイト培養した。出現した白色コロニーをコロニーシートを貼り付けたプレートにそれぞれ植菌し、さらに37℃、オーバーナイト培養した。
出現したコロニーの面をナイロンメンブレンに貼り付けて、約1分後に剥がし、菌体面を上にして、1%SDS溶液を染み込ませたろ紙を該菌体面に5分間のせ、このろ紙を剥がした後、次いで、変性用バッファー(1.5M NaCl,0.5M NaOH)を染み込ませたろ紙を該菌体面に5分間のせ、このろ紙を剥がした後、次いで、中和用バッファー(1.5M NaCl,0.5M Tris,1mM EDTA(pH 7.4))を染み込ませたろ紙を該菌体面に5分間のせ、このろ紙を剥がした後、次いで、2×SSCを染み込ませたろ紙を該菌体面にのせ5分後に剥がした。続いて、2×SSC中で該ナイロンメンブレン上に残留している菌体をすすぎ落とし、風乾後、UV固定を5分間行った。さらに、2×SSC中で菌体をすすぎ落とした。このナイロンメンブレンに対して、実施例3(3)で調製されたプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション処理を行った。ハイブリダイゼーションは、実施例3(4)に準じて行った。
約5000コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行ったところ、10のクローンがポジティブシグナルを示した。
ポジティブシグナルを呈した10のクローンについて、コロニーダイレクトPCRを行い、増幅断片が含まれているか否かの確認を行った。コロニーダイレクトPCRは、PCR Tips(秀潤社)の方法に従って行った。すなわち、TaKaRa Ex Taq(商標:タカラバイオ株式会社製)(5U/μl)0.5μl、プライマー溶液(KS1FRT:100pmol/μl)1μl、プライマー溶液(LC5RRT:100pmol/μl)1μl、10×Ex Taqバッファー(タカラバイオ株式会社製、添付のものを使用、マグネシウムを含む。)5μl、dNTPミクスチャー(タカラバイオ株式会社製、各2.5mM)5μlおよび滅菌蒸留水37.5μl(トータル50μl)を含む溶液にコロニーから採取した大腸菌を少量懸濁した。前記溶液を94℃で5分間1回処理した後、94℃で30秒、60℃で30秒、続いて72℃で30秒の一連のサイクルを30サイクル行い、次いで72℃で7分間処理した。この処理で得られた反応液を10μl電気泳動し、増幅の有無を確認した。予想される約400bpにバンドが観察されることにより、増幅されていたものと認められた。
コロニーダイレクトPCRを行った結果、10のクローンのうちの1つのクローンで遺伝子断片の増幅が認められ、このクローンが目的クローンと推察された。
実施例4(7)で得られた、遺伝子断片の増幅が認められた1つのクローンについて、pks遺伝子の探索・同定を主眼として塩基配列の決定・配列の解析を行った。塩基配列の決定には、Thermo SequenaseTM fluorescent labelled primer cycle sequence kit with 7−deaza dGTP(AMERSHAM BIOSCIENCE社)を用い、付属のマニュアル通りにサンプルを調製した。なお使用したプライマーは、M13−40 forward primer(5’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC−3’)、M13 reverse primer(5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC−3’)。シークエンスゲル電気泳動装置はALFred DNA Sequencer(AMERSHAM BIOSCIENCE社)を用い、ゲルはLong Ranger Gel(FMC Bio Products)を付属マニュアル通りに作製した。
解析の結果、当該クローンの遺伝子断片は、配列番号1の塩基番号1684〜9520よりなるORFの一部(1684〜3905)を含んでいることが明らかとなった。この領域に加えて、ORFの上流約1200塩基に存在するXbaIサイトまでの領域、およびそのさらに上流約500塩基の遺伝子配列を決定し、最終的に配列番号1の塩基配列における塩基番号1〜3905の塩基配列を決定した。当該配列を有するDNA断片含有プラスミドpSI1は、受託番号FERM P−19193の下、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。当該クローンの塩基配列をGENETYX−WINを使用して解析したところ、この配列を決定した領域はは遺伝子の上流領域約1.7kbをカバーするものであったので、続いてこの下流領域のクローニングを行った。また、BLASTを用いてホモロジー検索を行ったところ、Gibberella fujikuroi polyketide synthaseと最も高い相同性を示した。
実施例4でクローニングされた遺伝子断片は目的遺伝子の上流約1.7kbをカバーするもので、その下流領域をクローニングすべく以下の実験を行った。
(1)EcoRI/SalI処理されたゲノムDNAを用いたクローニング
実施例4(1)で得られたシトリニン低生産株HU391株のゲノムDNAを2種類の制限酵素の組み合わせで処理したDNA断片について、実施例4(2)と同じ方法でサザンハイブリダイゼーション解析を行ったところ、EcoRIおよびSalIを併用して処理した場合に、約7kb付近にシグナルを検出できたので、このEcoRI/SalI断片をクローニングすることとした。クローニングは、制限酵素としてEcoRIおよびSalIを使用したこと、約7kb付近のEcoRI/SalI断片を抽出したことを除き、実施例4(1)〜(8)の方法に準じて行った。
形質転換体約2000コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行ったところ、1つのクローンがポジティブシグナルを示し、このポジティブシグナルを呈した1つのクローンについて、コロニーダイレクトPCRを行ったところ、1つのクローンで遺伝子断片の増幅が認められ、このクローンが目的クローンと推察された。
前記処理(1)により得られたクローンについて、実施例4(8)の方法に準じて塩基配列の決定を行った。当該クローンの遺伝子断片は、配列番号1の塩基配列における塩基番号2278〜9134の塩基配列を有していた。当該配列を有するDNA断片含有プラスミド pSI2は、受託番号 FERM P−19194の下、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
解析の結果、実施例5で得られた遺伝子断片は、実施例4で得られた遺伝子断片と一部重複していることが確認できた。実施例4および5から明らかとなった目的遺伝子断片は、配列番号1の塩基番号1〜9134を有していた。当該DNAは、ポリケタイドシンターゼ遺伝子の一部分と推定された。
また、実施例4および5の結果から、目的遺伝子のORFの推定を行ったところ、実施例4および5でクローニングされたDNA断片はORFの下流領域をカバーできていないことが明らかとなった。
実施例5でクローニングされた遺伝子断片の下流領域をクローニングすべく以下の実験を行った。
(1)KpnI処理されたゲノムDNAを用いたクローニング
実施例4(1)で得られたシトリニン低生産株HU391株のゲノムDNAをKpnIで処理したDNA断片について、実施例4(2)と同じ方法でサザンハイブリダイゼーション解析を行ったところ、約4.2kb付近にシグナルを検出できたので、このKpnI断片をクローニングすることとした。クローニングは、制限酵素としてKpnIを使用したこと、約4.2kb付近のKpnI断片を抽出したこと、およびプローブとしてEcoRI/SalI断片の3’領域の配列に基づいてデザインされた
F:5’−ATTGCTTGGGCTGCCAGTG−3’
R:5’−ATCAAAGTCCGGAAGCGC−3’
の二つのプライマーを用いたPCRにより増幅された配列番号1の塩基番号8918−9407からなる断片を使用したこと、コロニーPCRの際に上記二つのプライマーを用いたことを除き、実施例4(1)〜(8)の方法に準じて行った。
形質転換体約1100コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行ったところ、9つのクローンがポジティブシグナルを示し、このポジティブシグナルを呈した1つのクローンについて、コロニーダイレクトPCRを行ったところ、1つのクローンで遺伝子断片の増幅が認められ、このクローンが目的クローンと推察された。
前記処理(1)により得られたクローンについて、実施例4(8)の方法に準じて塩基配列の決定を行った。当該クローンの遺伝子断片は、配列番号1の塩基配列における塩基番号8786〜12697の塩基配列を有していた。当該配列を有するDNA断片含有プラスミド pSI3は、受託番号 FERM P−19613の下、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
解析の結果、実施例6で得られた遺伝子断片は、実施例5で得られた遺伝子断片と一部重複していることが確認できた。実施例4、5および6から明らかとなった目的遺伝子断片は、配列番号1の塩基配列を有していた。配列番号1の塩基配列を有するDNAは、ポリケタイドシンターゼ遺伝子を含むものと推定された。この配列番号1の塩基配列を有するDNAを解析した結果、該DNAがコードするであろうと推定されるタンパク質(ポリケタイドシンターゼ)は、塩基番号 1684〜9520のORFを有し(塩基番号2265〜2348のイントロンを含む)、当該遺伝子中にケトシンターゼ活性中心(KS)(塩基番号3402〜3404)、アシルトランスフェラーゼ活性中心(AT)(塩基番号4737〜4739)、およびアシルキャリアータンパク質活性中心(ACP)(塩基番号6831〜6833)を有しているものと推定された。ORFの前後には、TATAボックス(配列番号1の塩基番号1676〜1680)、ポリアデニル化シグナル(配列番号1の塩基番号9570〜9574)がそれぞれ存在しているものと推定された。当該DNAがコードするポリケタイドシンターゼのアミノ酸配列は配列表の配列番号2に示される。図3には、実施例4〜6でクローニングされたDNAフラグメント(3本のラインで示される)およびポリケタイドシンターゼ遺伝子のORF(ORF中、KSはケトシンターゼドメイン、ATはアシルトランスフェラーゼドメイン、ACPはアシルキャリアータンパク質ドメイン)が示される。なお、図3中、AおよびBのラインはコロニーハイブリダイゼーションにおいて使用されたプローブの位置を示し、黒色矢印はポリケタイドシンターゼ遺伝子ORFを示す。また、図3中、斜線矢印はmultidrug efflux transporterと推定されるORF(配列番号4の塩基配列により示され、当該塩基配列は、配列番号1の塩基番号9731〜11479に対応する。また、当該ORFがコードするアミノ酸配列は配列表の配列番号3に示される。
紅麹菌IFO30873株におけるポリケタイドシンターゼ遺伝子破壊株の構築
(1)pCSN44を用いた紅麹菌IFO30873株の形質転換系の確立
ベクターとしてpCSN44を用いて、紅麹菌IFO30873株の形質転換が可能であることの確認を行った。
使用されたpCSN44は、ハイグロマイシン耐性遺伝子(E.coli由来)にアスペルギルス ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来trpC遺伝子のプロモーター、ターミネーターをつなげた遺伝子をマーカーとして有するベクターであり、ファンガルジェネティックストックセンター(Fungal Genetic Stock Center:FGSC)から入手した。pCSN44は、滅菌水中、1.4μg/μlの濃度に調製されたものを使用した。
また、紅麹菌IFO30873株のハイグロマイシン感受性を調べたところ、MIC200μg/mlであった。
これを28℃で培養したところ、5日目にポジティブコロニーが5〜10個生育しているのが確認できた。
上述の方法により得られた紅麹菌IFO30873株の形質転換体と思われるポジティブコロニーのうち2つをピックアップして、ベクターが紅麹菌ゲノム内に組み込まれているかどうかの確認を行った。まず、簡易的にポジティブコロニーについて、選択圧をかけた液体培地(ヘンネベルク培地、200μg/mlのハイグロマイシンBを含む)で培養を行った。ポジティブコロニーのゲノムDNAを抽出した。紅麹菌IFO30873株を用いたこと、培地として、上記選択圧をかけた液体培地を使用したことを除き、培養条件、ゲノムDNAの抽出は、実施例4(1)の方法に従って行われた。形質転換株から得られたゲノムDNAを鋳型とし、pCSN44に含まれるハイグロマイシンB耐性遺伝子のORFの部分をコードする、下記のプライマー(hphFおよびhphR)を用いてPCRを行った。
使用したプライマー
hphF:5’−AAGTTCGACAGCGTCTCC−3’
hphR:5’−AAGCATCAGCTCATCGAG−3’
PCRは、94℃30秒後、30サイクルの94℃30秒、51℃1分、72℃30秒の反応後、72℃7分間の処理の条件で行った。また、負のコントロールとして、形質転換処理を行っていない紅麹菌IFO30873株をヘンネベルク培地で実施例4(1)の方法に従って培養し、ゲノムDNAの抽出を行い、これを鋳型としてPCRを行った。また、正のコントロールとしてpCSN44を鋳型としてPCRを行った。これらについて、PCRにより得られた増幅物を回収し、電気泳動して、予想される500bpに増幅産物を確認することにより、増幅物のシグナルの確認を行った。
なお、上記培養条件で培養した場合、菌体回収時点において、2つの形質転換体のいずれについてもIFO30873株と同程度の赤色色素が生産されていることが目視により確認できた。
実施例4〜6の結果から明らかとなった配列番号1の塩基配列を有するDNAに含まれるポリケタイドシンターゼ遺伝子における、ケトシンターゼドメイン(KS)、アシルトランスフェラーゼドメイン(AT)、およびアシルキャリアータンパク質ドメイン(ACT)、並びに制限酵素切断部位の配置は図3のAに示される通りであった。よって、相同組換えによる遺伝子破壊が可能なベクターを構築すべく、ポリケタイドシンターゼ遺伝子においてケトシンターゼドメインおよびアシルキャリアータンパク質ドメインが欠失したSphI/KpnIフラグメントを作成し、pCSN44ベクターに導入することにより、ポリケタイドシンターゼ遺伝子破壊用ベクターpCT1を作成した。
SphI/KpnIフラグメントの調製方法、平滑末端処理方法、pCSN44の調製(EcoRI処理)方法、ライゲーション方法は以下の通りである。
pSI1(1.4μg/μl)15μl、SphI(タカラバイオ株式会社)6μl、KpnI(タカラバイオ株式会社)6μl、10×K buffer(タカラバイオ株式会社)6μl、および蒸留水87μlの組成(合計100μl)で、37℃、2時間反応を行った。反応後エタノール沈殿を行い、DNAペレットを乾燥させ乾燥DNAを得た。
当該乾燥DNAに、10×T4 buffer 10μl、0.1%BSA 10μl、dNTP 10μl、蒸留水69μlおよびT4 DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)1μlを添加し、37℃、5分間反応を行った。反応後、フェノール/クロロホルム抽出を2度行った。抽出液のエタノール沈殿を行い、この反応液をアガロースゲル電気泳動し、臭化エチジウムで染色後、約2kbのバンドをゲルごとカッターナイフで切り出し、EASY TRAP VER.2(タカラバイオ株式会社)を用いてゲルからDNAを抽出した。抽出方法は添付のマニュアルに従った。最終的に20μlのDNA抽出液(pSI1のSphI/KpnI処理フラグメント抽出液)とした。
pCSN44(1.4μg/μl)15μl、H buffer(タカラバイオ株式会社)12μl、EcoRV(タカラバイオ株式会社)6μl、および蒸留水87μlの組成で、37℃、2時間反応を行った。反応後エタノール沈殿を行い、DNAペレットを乾燥させ、乾燥DNAを得た。
当該乾燥DNAに、10×CIP buffer(タカラバイオ株式会社)12μl、CIP(タカラバイオ株式会社)2μlおよび蒸留水96μlを添加し、50℃で、30分間反応を行った。反応後フェノール抽出を2回行い、さらにクロロホルム抽出を1回行った。抽出液をエタノール沈殿し、DNAペレットを乾燥後、15μlの蒸留水に溶解した(pCSN44のEcoRV処理液)。
生育してきた白コロニーを3mlのLB+Amp培地に植菌し、37℃で16時間振とう培養を行った。この培養液から、Flexi Prep Kit(AMERSHAM BIOSCIENCES社)を用いてプラスミドを抽出した。方法は添付のマニュアルに従った。
上記方法により、配列番号1の塩基配列において、3732〜5854の部分を有するDNAを含むpCSN44ベクター、すなわち、pCT1ベクターを構築した。pCT1ベクターの構造は図4のAに示される。
使用されたベクターpCT1であることを除き、実施例7(1)の方法に従って紅麹菌IFO30873株の形質転換処理が行われた。該処理により、1つのポジティブコロニーを取得することができた。
上記(4)で得られたポジティブコロニーについて、実施例7(2)の方法に従ってポジティブコロニーの確認を行った。ただし、使用したプラーマーは以下の通りである。
使用されたプライマー
KS1FRT:5’−GGAATTCTGCAGCCAGTGTGGCTATTCACC−3’
hphR:5’−AAGCATCAGCTCATCGAG−3’
確認の結果、(4)で得られたポジティブコロニーについては、上記プライマーの組み合わせで約3.0kbあたりに増幅産物が確認できた。
実施例7(4)で得られた紅麹菌IFO30873株のpCT1による形質転換体、およびIFO30873株について、実施例1に記載された方法に従って7日間培養を行って、それぞれのシトリニン生産量をHPLCにより分析を行った。HPLCでは、検出されたピークにより定量する手法を採用しているが、このピークがシトリニン以外の物質に起因する場合も考えられるので、同じサンプルについて、別の定量方法である抗体検出法でもさらに分析を行った。抗体検出法には、リダスクリーン ファースト シトリニン(RIDASCREEN FAST Citrinin:r−pharm社製)が使用された。抗体検出法における測定は、当該キットに添付のマニュアルに従って行われた。
菌体が回収された時点において、紅麹菌IFO30873株および実施例7(4)で得られた紅麹菌IFO30873株のpCT1による形質転換体のいずれにおいても、目視により、菌体中に赤色色素の生産されていることが認められた。
いずれの測定方法を用いた場合でも、紅麹菌IFO30873株のpCT1による形質転換体では、野生株であるIFO30873株の数千分の1程度のシトリニン生産能しか有していないことが明らかとなった。このことから、配列番号1の塩基配列における塩基番号3432〜5554の部分を有するDNA、すなわち、ポリケタイドシンターゼ遺伝子においてケトシンターゼドメインおよびアシルキャリアータンパク質ドメインが欠失した変異遺伝子を含むベクターpCT1は、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊できることが明らかとなった。
Claims (18)
- 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子:
(a)配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質。 - 配列表の配列番号1に示した塩基配列で表わされる、請求項1記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子。
- 請求項1または2記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子。
- 請求項1〜3の何れか1項記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子を含む組換えベクター。
- 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質:
(a)配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1〜3のいずれか1項記載の遺伝子において、1以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも1つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するDNA。
- ケトシンターゼ活性中心およびアシルキャリアータンパク質活性中心が欠失した請求項6記載のDNA。
- 以下の(a)〜(g)のいずれかのDNA:
(a)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の塩基配列からなるDNA;
(d)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の塩基配列からなるDNAを含むDNA;
(e)配列表の配列番号1における塩基番号3432〜5554の塩基配列からなるDNA;
(f)配列表の配列番号1における塩基番号3432〜5554の塩基配列からなるDNAを含むDNA;
(g)前記(a)〜(f)のいずれかのDNAと相補的な塩基配列を有するDNA。 - 以下の(a)〜(d)のいずれかのDNA:
(a)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の全部または一部分からなるDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA;
(b)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の全部または一部分の塩基配列に1以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも1つを有する塩基配列からなるDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA;
(c)配列表の配列番号1における塩基番号3405〜6830の全部または一部分からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA;
(d)前記(a)〜(c)のDNAと相補的な塩基配列を有するDNAであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なDNA。 - 紅麹菌由来の請求項6〜9のいずれか1項記載のDNA。
- 請求項6〜10のいずれか1項記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項11の組換えベクターが導入された紅麹菌。
- 請求項11の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、シトリニン合成能が破壊された、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株。
- 請求項11の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、ポリケタイドシンターゼ遺伝子が破壊された紅麹菌のシトリニン合成能破壊株。
- 請求項11の組換えベクターを紅麹菌に導入し、該紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊することを特徴とする、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法。
- 配列表の配列番号4の塩基配列を有する遺伝子。
- 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質。 - 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質:
(a)配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列表の配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質。
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