CN101186933A - 一种产碱杆菌的培养及用于腈水解制备羟基乙酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株新近从土壤中分离的腈水解酶产生菌Alcaligenes sp.ECU0401的培养及其用于催化羟基乙腈水解制备羟基乙酸的方法。该方法以羟基乙腈为起始原料，以通过在发酵培养基中进行扩增培养得到的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401细胞为生物催化剂，在一定条件下进行羟基乙腈水解反应，得到产物羟基乙酸。本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。

Description

一种产碱杆菌的培养及用于腈水解制备羟基乙酸的方法

技术领域

本发明涉及一株产碱杆菌及其用途，尤其是用于制备羟基乙酸的方法。

技术背景

羟基乙酸(HOCH₂COOH)是最简单的α-羟基酸，广泛地应用于日化、纺织和医药等行业，不仅可以作为家用和工业用的清洗剂，还可以用作粘接剂、焊接剂、破乳剂和涂料的配料及合成多种农药、医药和化学助剂，市场需求量大。水解法合成羟基乙酸的方法有两种：化学法和生物法。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能将腈水解生成相应的羧酸和氨，具有选择性好、反应条件温和及产品纯度高等优点，明显优于化学法水解。

美国专利U.S.P.3,940,316和U.S.P6,037,155利用ArthrobaterNSSC 104，Bacillus，Bacterium，Brevibacterium，Micrococcus及Variovoraxspp.将羟基乙腈水解合成羟基乙酸。日本专利JP 61,277,649报道Rhodococcus rhodochrous ATCC 33025菌株和Gordonateme MA-1菌株能将羟基乙腈水解为羟基乙酸，其转化率接近100％。专利U.S.P.6,416,980利用Acidovorax facilis 72W及变异株的腈水解酶合成羟基乙酸，野生菌有酰胺生成，变异株转化的产物浓度可以累积达1 M。中国专利CN1772912A报道的乳酪短杆菌(Brevibacterium casei) CGMCC No.0887经过长期的诱变育种，酶活力单位可以达到10万单位/mL发酵液。这些酶法合成羟基乙酸所显示的优越性，为替代化学法展示了良好的应用前景。但是现有的腈水解酶对羟基乙腈耐受性比较差，筛选新的腈水解酶菌株成为当务之急。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种产碱杆菌及其制备羟基乙酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

发明人从华东理工大学校园内的土壤中，经初筛、复筛及分离纯化得到一株腈水解酶菌株，经过表型鉴定和16S rDNA鉴定，该菌株为产碱杆菌Alcaligenes sp.，编号为Alcaligenes sp.ECU0401。本发明所说的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401是一种属于产碱杆菌属的菌种，该菌株己于2007年4月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2009，已申请专利CN200710040563.3(申请号)。

筛选方法包括如下步骤：

采集了不同环境条件下400份土壤样品，利用羟基乙腈为唯一氮源进行两轮液体富集培养，筛选腈水解酶产生菌。通过反复筛选，分离得到一株高活力的腈水解酶产生菌。

本发明的菌种具有如下的微生物学特征：

1.形态特征：

(1)细胞的形态：球形

(2)细胞的大小：0.5～1.2×0.5～2.6μm；

(3)掷胞子的形成：无；

2.在各种培养基上的生长状态：

(1)牛肉浸膏明胶穿刺培养(20℃，6天)：

不液化明胶；

(2)牛肉浸膏琼脂平板培养(30℃，2天)：

菌落的形态：圆形，白色，菌落表面隆起平滑、有光泽、菌落粘稠；

菌落的大小：2～4mm；

3.生理生化特征：

(1)硝酸盐利用(28℃，5天)：利用；

(2)对氧的需求：好气；

(3)胞外类淀粉化合物产生：不产生；

(4)尿素水解：阳性；

(5)甲基红试验：阴性；

(6)碳源同化：

阳性：麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘油、淀粉和肌醇；

阴性：乳糖；

(7)碳源发酵：不发酵碳源；

(8)生长pH范围：4.0～9.0；

(9)生长最适宜温度：20～50℃。

根据“伯杰细菌鉴定手册”提供的鉴定方法和上述的试验结果表明，该菌种属于产碱杆菌(Alcaligenes sp.)。但又与以前报道的产碱杆菌有明显的不同，其主要不同之处在于：催化羟基乙腈具有较高的活性和转化率。

经16S rDNA鉴定，确认该菌株为产碱杆菌菌(Alcaligenes sp.)，编号为Alcaligenes sp.ECU0401

本发明的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401可以用于催化羟基乙腈生产羟基乙酸，包括如下步骤：

1.菌株的培养

摇瓶培养：将所说的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401采用本领域常规的方法，在发酵培养基中进行扩增培养24～36h，温度20～45℃；

再以该培养液做为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1～10％(v/v)，接种至200mL发酵培养基中，在20～50℃下100～160rpm的摇床上培养24～48h，离心、洗涤得到静息细胞；

发酵罐扩大培养：在5L发酵罐中加入适量(50-70％，v/v)的发酵培养基，基于发酵培养基体积的接种量为1～10％(v/v)，接种至5L发酵罐中，通气量1∶0.1～1∶1(vvm)，搅拌转速200～400rpm，温度20～45℃，时间18～120h，离心、洗涤得到静息细胞。

所说的发酵培养基可采用常规的培养基，其组分和含量如下：

乙酸铵5～15g，蛋白胨5～20g，酵母膏5～20g，KH₂PO₄ 1～10g，NaCl0.1～2g，MgSO₄ 0.1～2g，诱导剂I 0.01～1g，生长素G 0.01～0.1g，水1000mL，pH 4.0～9.0。

所述的诱导剂(I)包括但不限于：α-氨基丙腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈、乙腈、丁腈、4-氯-3-羟基丁腈、2，3-二氰基吡嗪，羟基乙腈、苯乙腈或/和己内酰胺；

所述的生长素(G)包括但不限于：CaCl₂、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄、FeSO₄·7H₂O、MgSO₄、MnSO₄·H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、NiSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O、生物素、泛酸钙、叶酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黄素、维生素B₁、对氨基苯甲酸钠或/和盐酸吡哆醛。

2.静息细胞催化羟基乙腈水解生产羟基乙酸

将收获的静息细胞，以1～100g湿重/L悬浮于pH为4.0～8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入羟基乙腈，使其浓度为10～200mM，在20～50℃和100～160rpm的恒温摇床上振荡反应2～24h，羟基乙酸的含量用HPLC进行分析。

腈水解酶的活力单位定义：每分钟水解羟基乙腈产生1μmol羟基乙酸所需要的酶量。

3.海藻酸钠固定化细胞催化羟基乙腈水解生产羟基乙酸

将海藻酸钠固定化细胞，以1～200g湿重/L悬浮于pH为4.0～8.0的Tris-HCl缓冲溶液中，加入羟基乙腈，使其浓度为10～200mM，在20～50℃和100～160rpm的恒温摇床上振荡反应2～24h，羟基乙酸的含量用HPLC进行分析。

附图说明

图1是利用Alcaligenes sp.ECU0401静息细胞催化羟基乙腈生产羟基乙酸的反应进程曲线；

图2是固定化细胞催化的多批反复水解反应的结果。

符号说明

附图2中，◇游离细胞，○固定化细胞。

具体实施方式

通过下述典型的实施例将有助于理解本发明，但不能限制本父母的内容。

实施例1微生物摇瓶培养

将从土壤中分离并保藏的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401(保藏号：CGMCC No.2009)接种至50mL种子培养基(甘油10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH₂PO₄ 2g，NaCl 1g，MgSO₄ 0.2g，水1000mL，pH 8.0)中预培养15h，以该培养液做为种子液，以5％的接种量接种至200mL发酵培养基(乙酸铵15g，蛋白胨10g，酵母膏6g，KH₂PO₄ 2g，NaCl2g，MgSO₄ 0.4g，生长素FeSO₄·7H₂O 0.5g，诱导剂苯乙腈0.2g，水1000mL，pH 8.0)中，在30℃下160rpm摇床上培养48h。

实施例2腈水解酶菌株活性比较

将分离得到的Alcaligenes sp.ECU0401与Rhodococcus erythropolis1.2362、Rhodococcus rhodochrous ECU1201和Rhodococcus ruber 4.1187的腈水解酶菌株活性进行比较。将上述的四株菌的静息细胞分别悬浮于100mL磷酸钾缓冲溶液中，加入羟基乙腈，终浓度分别为20mM，在30℃和160rpm的恒温摇床振荡反应30min，立即在上清液中加入2 MH₂SO₄酸化至pH为1.0～2.0终止反应，将反应液以10,000×g离心15min，除去细胞，HPLC检测分析，发现Alcaligenes sp.ECU0401腈水解对羟基乙腈活性较高。利用离子色谱分析反应液，没有发现可能出现的副产物乙醛酸、甲酸及草酸，产物羟基乙酸没有被代谢。

表1腈水解酶菌株活性比较

菌株	相对活力，％
		Alcaligenes sp.ECU0401	100
Rhodococcus erythropolis 1.2362	86
		Rhodococcus rhodochrous ECU1201	84
Rhodococcus ruber 4.1187	62

实施例3利用Alcaligenes sp.ECU0401生长细胞

催化羟基乙腈水解生产羟基乙酸

配制种子培养基(甘油10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH₂PO₄ 2g，NaCl 1g，MgSO₄ 0.2g，水1000mL，pH 8.0)，在1L摇瓶中装入200mL种子培养基，培养种子液。再配制发酵培养基(乙酸铵15g，蛋白胨10g，酵母膏6g，KH₂PO₄ 2g，NaCl 2g，MgSO₄ 0.4g，生长素FeSO₄·7H₂O0.5g，诱导剂苯乙腈0.2g，水1000mL，pH 8.0)。在5L发酵罐中装入3L发酵培养基，消毒后接入5％的种子液，进行发酵培养24h，加入100mM羟基乙腈，不同时间取样HPLC分析，当羟基乙酸分析得率为96％时继续补加经过氢氧化钠中和处理的羟基乙腈溶液100mM和10g的乙酸铵，当产物羟基乙酸累积浓度达到3M左右时，停止补料，继续反应使底物羟基乙腈消耗完，当底物残留浓度＜0.02％，终止反应。整个培养及反应过程时间为64h，转化率＞99.0％，羟基乙酸浓度3.05M，羟基乙酸产率＞98.0％。

实施例4利用Alcaligenes sp.ECU0401静息细胞催化

                 羟基乙腈生产羟基乙酸

将实施例1得到的细胞进行离心(10,000×g，15min)，称取湿重10g的静息细胞，将静息细胞悬浮于1000mL磷酸钾缓冲溶液中，分别加入羟基乙腈，终浓度为200mM，在30℃和160rpm的恒温摇床振荡反应，将反应液以10,000×g离心15min，除去细胞，HPLC检测分析。发酵优化后，腈水解酶活性明显地提高，转化200mM的羟基乙腈，反应8h后羟基乙酸的分析得率＞99.0％，可见Alcaligenes sp.ECU0401能耐受较高的底物浓度。其反应进程曲线如图1所示。

实施例5利用固定化细胞催化羟基乙腈生产羟基乙酸

在底物羟基乙腈浓度为100mM(0.41％w/v)的1000mL反应体系中，加入海藻酸钠固定化细胞100g，在30℃、160rpm的条件下反应8h，重复操作36次，以游离细胞为对照。结果如图2所示，固定化催化剂可反复回用36次以上，达到了令人满意的效果，具有潜在的工业应用价值。

实施例6腈水解酶蛋白序列

本发明的腈水解酶经过纯化后对其蛋白进行测序，结果如下：

MQTRKIVRAGAVQAASPNYDLATGVDKTIELARQARDEGCDLIVFGETWLPGYP

FHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFQRIAQAARTLGIFIALGYSERSGGS

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Claims (11)

1.一种生物催化产生羟基乙酸的方法，其特征在于通过腈水解酶催化羟基乙腈水解得到羟基乙酸，包括如下步骤：

(1)将产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401在发酵培养基中进行扩增培养，经过离心得到静息细胞；

(2)将收获的静息细胞作为生物催化剂，悬浮于pH为4.0～8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入羟基乙腈，在25～50℃反应2～24h，然后从反应产物中收集羟基乙酸；

所述的腈水解酶是通过培养一株保藏号为CGMCC No.2009的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401而得到。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401 CGMCC No.2009的培养获得腈水解酶的条件如下：

(1)培养基组成：乙酸铵5～15g，蛋白胨5～20g，酵母膏5～20g，KH₂PO₄ 1～10g，NaCl 0.1～2g，MgSO₄ 0.1～2g，诱导剂0.01～1g，生长素0.01～0.1g，水1000mL，pH 4.0～9.0；

(2)发酵条件：通气量1∶0.1～1∶1(vvm)，搅拌转速200～400rpm，温度20～45℃，时间18～120h。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的诱导剂包括但不限于α-氨基丙腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈、乙腈、丁腈、4-氯-3-羟基丁腈、2，3-二氰基吡嗪，羟基乙腈、苯乙腈或己内酰胺。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的生长素包括但不限于：CaCl₂、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄、FeSO₄·7H₂O、MgSO₄、MnSO₄·H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、NiSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O、生物素、泛酸钙、叶酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黄素、维生素B₁、对氨基苯甲酸钠或盐酸吡哆醛。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的羟基乙腈的浓度为10～200mM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸钾缓冲溶液中的静息细胞含量为1～100g湿重/L。

7.将培养得到的Alcaligenes sp.ECU0401的静息细胞进行海藻酸钠固定化，将得到的固定化细胞作为生物催化剂水解羟基乙腈。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，羟基乙腈的浓度为10～200mM。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，海藻酸钠固定化细胞在Tris-HCl溶液中的含量为1～200g湿重/L，在25～50℃反应2～24h，然后从反应产物中收集羟基乙酸。

10.如权利要求1和权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的生物催化剂中腈水解酶由300～400个氨基酸序列组成。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的腈水解酶由下述氨基酸序列组成：

MQTRKIVRAGAVQAASPNYDLATGVDKTIELARQARDEGCDLIVFGETWLPGYP

FHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFQRIAQAARTLGIFIALGYSERSGGS

LYLGQCLIDDKGQMLWSRRKLKPTHVERTVFGEGYARDLIVSDTELGRVGALWE

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