KR101649582B1 - 미생물 분리배양 장치 및 미생물 배양 폐배지 재사용 방법 - Google Patents

미생물 분리배양 장치 및 미생물 배양 폐배지 재사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 분리배양 장치 및 미생물 배양 폐배지 재사용 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물 배양 후 버려지는 폐배지의 재사용을 통한 이산화탄소의 저감뿐만 아니라 여러 유용한 생리활성물질을 생산할 수 있기 때문에 친환경적이며, 까다로운 폐배지의 처리과정에 있어 비용절감 효과가 우수한 매우 경제적인 미생물 배양 폐배지 재사용 방법 및 이에 사용할 수 있는 미생물 분리배양 장치에 관한 것이다.

Description

미생물 분리배양 장치 및 미생물 배양 폐배지 재사용 방법{Device for microorganism isolation culture and re-use method of waste microbial culture medium}
본 발명은 미생물 분리배양 장치 및 미생물 배양 폐배지 재사용 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물 배양 후 버려지는 폐배지의 재사용을 통한 이산화탄소의 저감뿐만 아니라 여러 유용한 생리활성물질을 생산할 수 있기 때문에 친환경적이며, 까다로운 폐배지의 처리과정에 있어 비용절감 효과가 우수한 매우 경제적인 미생물 배양 폐배지 재사용 방법 및 이에 사용할 수 있는 미생물 분리배양 장치에 관한 것이다.
산업화 시대 이후 증가 되는 대기 중 온실가스 농도에 의해 지구 온난화는 빠르게 진행되고 있다. 이에 따라 지구 온난화의 요소 중 가장 큰 영향을 주고 있는 이산화탄소 저감을 위한 연구 개발이 매우 시급한 실정이다. 현재까지 이산화탄소의 포집 및 보관(CCS: Carbon dioxide Capture and Storage)을 위해 다양한 방법으로 해결하고자 노력하였다. 주로 사용되는 기술 중 하나인 화학적 포집 방식으로 이산화탄소 포집제가 그 핵심이지만, 이산화탄소와 반응시켜 다른 화학물질을 전환시킨 후 급속히 포화된 포집제의 재생에 대해 많은 에너지가 소모되는 단점이 있다. 또한 물리적 흡수 방법도 있는데, 그 중 하나인 이온성 액체를 이용한 방식으로 큰 유기 양이온과 작은 무기 음이온으로 구성된 액체로 증기압이 거의 없어 환경 친화적인 공정이 된다. 이산화탄소 가스가 이온성 액체에 대한 흡수열은 약 11 kJ/mol로서 화학 결합보다는 물리적 수착이라고 생각할 수 있다. 이온성 액체의 점도가 높아 용매의 손실이 적은 이점이 있지만 물질 전달이 느린 단점이 있다.
하지만 생물학적 이산화탄소 저감 방법은 광합성을 통하여 진행되며, 지금까지 지구의 생태계를 기반으로 진행되었던 방법으로 친환경적이라 할 수 있다. 특히 광합성 세균을 이용한 이산화탄소 저감 방법은 지금까지의 생물 공정산업에서 활용하는 세균을 활용하기 때문에 공정개발이 쉬울 뿐만 아니라 배양공정 조건이 용이하며, 빠르게 성장하기 때문에 성장 기간이 긴 식물보다 효율적이며, 대량 배양에 있어 조류에 비해 쉽게 배양을 할 수 있는 장점이 있다. 또한 다양한 분자생물학적 기법을 이용하기 편리하다는 장점이 있다.
종래 기술들 중 등록특허 10-0490641(공개일자: 2005년05월19일)에는 다중 광생물반응기 및 이를 이용한 광합성 미생물 배양방법에 관한 것으로, 구체적으로 균체 및 배양액을 담을 수 있는 한 개 이상의 균체성장용 배양영역; 및 상기 균체성장용 배양영역에 접하여 설치되고, 유용산물을 생산할 수 있는 균체 및 배양액을 담을 수 있는 한 개 이상의 유용산물 생산용 배양영역으로 이루어진 것에 관하여 기재하고 있다.
한편, 미생물이 배양된 후 버려지는 폐배지는 감염성 폐기물로 분류되어 감염성폐기물 수거용기에 보관하여야 하며, 감염성 폐기물이 포함된 용기는 허가된 감염성 폐기물 처리업체가 직접 수거하여 처리토록 하기 때문에 폐배지의 처리 절차가 까다롭고 처리비용이 비싸며 배양시 생성된 이산화탄소로 인한 환경오염의 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 미생물 배양 후 버려지는 폐배지의 재사용을 통한 이산화탄소의 저감뿐만 아니라 여러 유용한 생리활성물질을 생산할 수 있기 때문에 친환경적이며, 까다로운 폐배지의 처리과정에 있어 비용절감 효과가 우수한 매우 경제적인 미생물 배양 폐배지 재사용 방법 및 이에 사용할 수 있는 미생물 분리배양 장치를 제공하려는 목적이 있다.
본 발명은 미생물 배양된 폐배지에 광합성 세균을 접종하여 폐배지에 포함된 이산화탄소 저감과 생리활성물질 및 유기산을 생산하는 단계;를 함유하는 미생물 배양 폐배지 재사용 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 배지는 YPD(Yeast extract 0.5~2 중량%, Peptone 1~3 중량% 및 Dextrose 1~3 중량%를 포함), LB(Luria-Bertani; Yeast extract 0.1~1 중량%, Tryptone 0.5~2 중량% 및 NaCl 0.5~2 중량%를 포함), SD(0.1~1 중량% Yeast nigtrogen base without amino acid, 0.1~1 중량% casamino acid 및 0.1~1 중량% glucose를 포함) 또는 M9(Na2HPO4·7H2O 0.5~5 g/l, KH2PO4 5~15 g/l, NaCl 1~10 g/l 및 NH4Cl 0.5~5 g/l를 포함)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 광합성세균은 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 및 로도박터 스페로이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 이산화탄소를 생성하는 미생물을 포함하는 미생물 배양기; 광합성 세균을 포함하는 세균 배양기; 및 상기 미생물 배양기와 세균 배양기 사이를 연결하고, 미생물 배양기와 세균 배양기의 기체 흐름을 가능하게 하는 연결배양로; 를 포함하는 미생물을 이용한 미생물 분리배양 장치를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연결배양로는 미생물 배양기의 이산화탄소를 세균 배양기로 공급할 수 있다.
나아가, 본 발명은 알코올 생성균주를 배양했던 폐배지에 광합성 세균을 접종하여 폐배지를 재배양하는 단계; 및 재배양한 폐배지에 알코올 생성균주를 추가배양하여 알코올을 생산하는 단계; 를 포함하는 미생물 배양 폐배지 재사용 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 알코올 생성균주는 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 광합성 세균은 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관:국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 및 로도박터 스페로이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 배양, 재배양 및 추가배양은 25 ~ 35 ℃, 150 ~ 200 rpm 및 빛 조건에서 10 ~ 150 시간 동안 배양할 수 있다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명의 용어 "배지"는 미생물들의 배양에 적합한 에너지원, 탄소원, 질소원, 무기염류, 생장소(growth factor) 등을 포함하여 조제될 수 있다. 이 미생물들의 배양에 적합한 에너지원, 탄소원, 질소원, 무기염류, 생장소(growth factor) 등은 당업계에 공지되어 있는데, 구체적으로는 대한민국 특허출원 제19950031490호, 대한민국 특허출원 제 1019910018012호, 대한민국 특허출원 제1019940001029호, 대한민국 특허출원 제019990050363호, 대한민국 특허 출원 제1020060049936호, 문헌(김재범, 산업용 배지를 이용한 고핵산 효모의 고농도 세포 유가배양, 2001, 동의대 석사학위 논문) 등에 개시된 바를 참조할 수 있다. 이러한 배지는 우유, 감자, 혈액, 토마토 분쇄액, 쌀겨 분쇄물, 두유, 당밀 등 천연물을 사용한 자연배지이거나, 영양 성분을 인위적으로 조성한 합성배지일 수 있으며, 고체배지이거나 액체배지일 수 있다.
또한, 본 발명의 용어 "광합성 세균"이란 일반적으로 고등식물과 같이 빛 에너지를 이용하여 탄소 동화작용을 행하는 세균을 말한다.
나아가, 본 발명의 용어 "폐배지"는 미생물 배양물을 의미하며, 배양 원액 자체뿐만 아니라 배양 원액을 농축한 액상의 농축물(즉,농축액) 또는 분말상의 농축물을 포함하는 포괄적인 의미이다.
더불어, 본 발명의 용어 "최소배지"는 균이 요구하는 영양 물질이 최소한 한 가지 이상 결핍되어 있는 배지로서, 어느 생물의 야생형의 세포가 증식될 수 있는 합성배지로 필요 최소한의 조성을 가진 것을 의미한다.
본 발명은 미생물 배양 후 버려지는 폐배지의 재사용을 통한 이산화탄소의 저감뿐만 아니라 여러 유용한 생리활성물질을 생산할 수 있기 때문에 친환경적이며, 까다로운 폐배지의 처리과정에 있어 비용절감 효과가 우수한 매우 경제적인 미생물 배양 폐배지 재사용 방법 및 이에 사용할 수 있는 미생물 분리배양 장치를 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 미생물의 분리배양을 통해 미생물에서 생성되는 이산화탄소를 실시간으로 고정화할 수 있는 공정 시스템을 제공할 수 있으며, 이를 통해 미생물로부터 원하고자하는 생성물을 얻음과 동시에 로도박터 스페로이드에서는 이산화탄소 저감과 그에 따라 생성되는 유용한 유기화합물을 얻을 수 있고, 이러한 유용 유기화합물을 다시 대장균 또는 사카로마이세스 세레비제의 탄소원 또는 영양원으로 활용될 수 있는 연속공정이 가능하기 때문에 폐배지의 재사용 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 미생물 분리배양 장치의 단면도이다.
도 2는 사카로마이세스 세레비제 및 로도박터 스페로이드의 분리배양을 통한 이산화탄소에 대해 가스 크로마토그래피를 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다(R-S:로도박터 스페로이드 및 사카로마이세스 세레비제의 분리배양, sis-S:사카로마이세스 세레비제만 배양(대조군), R-SD:로도박터 스페로이드만 배양(대조군)).
도 3은 대장균 및 로도박터 스페로이드의 분리배양을 통한 이산화탄소에 대해 가스 크로마토그래피를 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다(R-E:로도박터 스페로이드 및 대장균의 분리배양, sis-E:대장균만 배양(대조군), R-M9:로도박터 스페로이드만 배양(대조군)).
도 4는 상기 도 2의 방법으로 배양되어 얻어지는 세포에 대한 건조중량으로, 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 분리배양에 대한 건조중량에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(R-S=>R:로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 분리배양에서의 로도박터 스페로이드의 건조중량, R-SD=>R: 동일조건에서 로도박터 스페로이드만 배양한 경우의 로도박터 스페로이드의 건조중량, RS=>: 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 분리배양에서 사카로마이세스 세레비제의 건조중량, sis-S=>S:동일조건에서 사카로마이세스 세레비제만 배양한 경우의 사카로마이세스 세레비제의 건조중량).
도 5는 상기 도 4의 방법으로 배양되어 얻어지는 세포에 대한 건조중량으로, 로도박터 스페로이드와 대장균의 분리배양에 대한 건조중량에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.(R-E=>R:로도박터 스페로이드와 대장균의 분리배양에서 로도박터 스페로이드의 건조중량, R-M9=>R:동일조건에서 로도박터 스페로이드만 배양한 경우의 로도박터 스페로이드의 건조중량, R-E=>E:로도박터 스페로이드와 대장균의 분리배양에서 대장균의 건조중량, sis-E=>E:동일조건에서 대장균만 배양한 경우의 대장균의 건조중량)
도 6은 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균과 로도박터 스페로이드의 분리배양을 통한 박테리오클로로필의 함량에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.(R-E: 로도박터 스페로이드와 대장균 분리배양, R-M9: 동일 조건에서 로도박터 스페로이드만 배양, R-S: 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 분리배양, R-SD: 동일조건에서 로도박터 스페로이드만 배양)
도 7은 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균과 로도박터 스페로이드의 분리배양을 통한 카로테노이드의 함량에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.(R-E: 로도박터 스페로이드와 대장균 분리배양, R-M9: 동일 조건에서 로도박터 스페로이드만 배양, R-S: 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 분리배양, R-SD: 동일조건에서 로도박터 스페로이드만 배양)
도 8은 실험예 2-1에서 사카로마이세스 세레비제의 배지 종류와 균주에 따른 글루코스 소비율 분석한 결과이다.
도 9는 실험예 2-2에서 사카로마이세스 세레비제의 배지 종류와 균주에 따른 사카로마이세스 세레비제의 건조중량에 대한 분석한 결과이다.
도 10은 실험예 2-3에서 사카로마이세스 세레비제의 배지 종류와 균주에 따른 사카로마이세스 세레비제의 에탄올 생산에 대한 분석한 결과이다.
도 11은 재사용된 배지에서의 로도박터 스페로이드의 배양된 모습을 나타낸 사진이다(used YPD:사카로마이세스 세레비제 폐배지, used LB:대장균 폐배지).
도 12는 상기 도 11의 재사용된 배지에서 성장한 로도박터 스페로이드의 투과전자현미경(TEM) 이미지이다(used YPD:사카로마이세스 세레비제 폐배지, used LB:대장균 폐배지).
도 13은 재사용된 배지에서 성장한 로도박터 스페로이드의 이산화탄소 저감 효율을 크로마토그래피(gas chromatography)를 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 재사용된 YPD 배지에 배양한 로도박터 스페로이드에 따른 말산의 농도에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 재사용된 LB 배지에 배양한 로도박터 스페로이드에 따른 젖산의 농도에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균의 최소배지인 SD배지와 M9배지를 로도박터 스페로이드의 배양에 재사용할 때의 세포성장(건조중량)에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(sist: 로도박터 스페로이드의 배지인 sistrom’s media 배지에서 배양한 결과, Used M9: 대장균을 배양했던 배지, Used SD: 사카로마이세스 세레비제를 배양했던 배지).
도 17은 상기 도 16에 따른 박테리오클로로필의 함량에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(sist: 로도박터 스페로이드의 배지인 sistrom’s media 배지에서 배양한 결과, Used M9: 대장균을 배양했던 배지, Used SD: 사카로마이세스 세레비제를 배양했던 배지).
도 18은 상기 도 16에 따른 카로티노이드의 함량에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(sist: 로도박터 스페로이드의 배지인 sistrom’s media 배지에서 배양한 결과, Used M9: 대장균을 배양했던 배지, Used SD: 사카로마이세스 세레비제를 배양했던 배지).
도 19는 사카로마이세스 세레비제를 SD배지에서 배양을 한 후 다시 글루코스만 첨가하여 폐배지를 재사용하는 방식으로 최종 2회까지 재사용했을 때의 첨가된 글루코스 농도와 생성된 에탄올의 농도 그리고 에탄올 생성 효율에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20은 도 22의 실험 절차를 도식화한 그림이다.
도 21은 상기 도 19의 실험 절차를 도식화한 그림이다.
도 22은 사카로마이세스 세레비제를 SD배지에서 배양을 한 후 사용된 SD배지를 로도박터 스페로이드의 배양에 사용하고나서 다시 다시 글루코스만 첨가하여 사용했던 배지를 재사용하는 방식으로 최종 2회까지 재사용했을 때의 첨가된 글루코스 농도와 생성된 에탄올의 농도 그리고 에탄올 생성 효율에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 미생물이 배양된 후 버려지는 폐배지는 감염성 폐기물로 분류되어 감염성폐기물 수거용기에 보관하여야 하며, 감염성 폐기물이 포함된 용기는 허가된 감염성 폐기물 처리업체가 직접 수거하여 처리토록 하기 때문에 폐배지의 처리 절차가 까다롭고 처리비용이 비싸며 배양시 생성된 이산화탄소로 인한 환경오염의 문제점이 있었다.
이에 본 발명에서는 미생물 배양된 폐배지에 광합성 세균을 접종하여 폐배지에 포함된 이산화탄소 저감과 생리활성물질 및 유기산을 생산하는 단계;를 함유하는 미생물 배양 폐배지 재사용 방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해, 미생물 배양 후 버려지는 폐배지의 재사용을 통한 이산화탄소의 저감뿐만 아니라 여러 유용한 생리활성물질을 생산할 수 있기 때문에 친환경적이며, 까다로운 폐배지의 처리과정에 있어 비용절감 효과가 우수한 매우 경제적인 미생물 배양 폐배지 재사용 방법 및 이에 사용할 수 있는 미생물 분리배양 장치를 제공하는 효과가 있다.
상기 폐배지 재사용 방법은 광합성 세균인 로도박터 스페로이드가 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성된 이산화탄소를 탄소원으로 이용하여 이산화탄소를 고정화함으로써, 상기 폐배지 내에서 로도박터 스페로이드에 의한 이산화탄소 저감을 기반으로 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질 및 유기산의 생성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 배지는 통상적으로 미생물 배양 배지에 첨가할 수 있는 물질을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 이스트 익스트렉트(yeast extract), 트립톤(tryptone) 및 펩톤(peptone)을 포함하는 영양성분을 함유하는 합성 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 YPD(Yeast extract 0.5~2 중량%, Peptone 1~3 중량% 및 Dextrose 1~3 중량%를 포함), LB(Luria-Bertani; Yeast extract 0.1~1 중량%, Tryptone 0.5~2 중량% 및 NaCl 0.5~2 중량%를 포함), SD(0.1~1 중량% Yeast nigtrogen base without amino acid, 0.1~1 중량% casamino acid 및 0.1~1 중량% glucose를 포함) 또는 M9(Na2HPO4·7H2O 0.5~5 g/l, KH2PO4 5~15 g/l, NaCl 1~10 g/l 및 NH4Cl 0.5~5 g/l를 포함)일 수 있다.
또한, 액체배지를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 배지에 의해 배양될 수 있는 미생물은 원핵세포 및/또는 효모라면 특별히 제한하지 없으나, 바람직하게는 대장균 속 및/또는 효모(yeast)속 미생물을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 속 미생물로 대장균(Escherichia coli) 및/또는 효모(yeast)속 미생물로 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)를 포함할 수 있다.
상기 대장균 속 미생물인 대장균(Escherichia coli)과 효모(yeast)속 미생물은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)는 현재 가장 대표적으로 사용되고 있는 산업용 균주로써 그 활용 분야가 의약, 식품, 화학, 에너지 등에서 매우 다양하게 사용되고 있으며, 이를 기반으로 비슷한 배양과 성장 패턴을 갖는다면, 충분히 활용 가능할 것으로 판단되기 때문에 가장 대표되는 두 가지 미생물을 본 발명에 사용하였다.
나아가, 상기 미생물은 성장을 통해 이산화탄소를 생성하기 때문에 생성된 이산화탄소의 저감 효율과 그로 인한 유기물의 생산에 대한 분석이 보다 용이하였으며, 배양 조건이 혐기, 호기 모두에서 가능하기 때문에 본 연구의 방법적 부분에서도 적합할 것으로 판단된다.
상기 광합성 세균은 고등식물과 같이 빛에너지를 이용하여 탄소 동화작용을 행하는 통상의 세균이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 클로로비움속 세균(Chlorobium sp.), 크로마튬속 세균(Chromatium sp.), 로도스피릴륨속 세균(Rhodospirillum sp.), 로돕센도모나스속 세균(Rhodopsendomonas sp.), 로도박터속 세균(Rhodobacter sp.) 및 로돕슈도모나스속 세균(Rhodopseudomonas sp.)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 및 로도박터 스페로이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일)는 로도박터 스페로이드(기탁기관: 미생물자원센터, 기탁번호: KCTC 1434, 기탁일자: 1984년)를 친주로 하여 N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N`-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 수득한 변이균주로써, 로도박터 스페로이드에 비하여 생물 및 동물세포의 성장 촉진능이 향상되어 현저하게 뛰어난 미생물 생리활성능을 가진다. 본 발명에 적용시 다른 종류의 로도박터 스페로이드보다 이산화탄소를 이용한 다양한 유기물질 생산성이 우수하여 이를 통한 폐배지의 재사용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.
실험예 4 내지 5에서 확인할 수 있듯이, 상기 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일)를 미생물이 배양된 폐배지에 접종함으로써 폐배지에 포함된 이산화탄소를 저감하고 이를 통해 생리활성물질 및 유기산을 생산량을 향상시킴으로써 폐배지를 재사용하는데 매우 바람직함을 알 수 있다.
상기 폐배지의 이산화탄소 저감은 로도박터 스페로이드가 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성된 이산화탄소를 탄소원으로 이용하여 이산화탄소를 고정화함으로써 나타나는 효과이며, 이는 폐배지에서 배양된 로도박터 스페로이드의 세포 건조중량을 측정함으로써 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성된 이산화탄소를 탄소원으로 이용하였는지 확인할 수 있다(실험예 4 및 도 13 참조).
더불어, 상기 폐배지 내에서 로도박터 스페로이드에 의한 이산화탄소 저감을 기반으로 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질 및 유기산의 생성을 향상시킬 수 있다(실험예 5, 도 14 내지 15 참조).
상기 생리활성물질은 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질이며, 바람직하게는 박테리오클로로필 및/또는 카로테노이드를 포함할 수 있다.
상기 유기산은 로도박터 스페로이드 유래 유기산이면 그 종류를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 말산 또는 젖산일 수 있다.
또한, 이산화탄소를 생성하는 미생물을 포함하는 미생물 배양기; 광합성 세균을 포함하는 세균 배양기; 및 상기 미생물 배양기와 세균 배양기 사이를 연결하고, 미생물 배양기와 세균 배양기의 기체 흐름을 가능하게 하는 연결배양로; 를 포함하는 미생물을 이용한 미생물 분리배양 장치를 제공한다.
이를 통해 배지에 포함된 미생물 배양시 생성되는 이산화탄소를 바로 고정화시킴으로써 폐배지 내의 이산화탄소 저감 효과가 있으며, 상기 이산화탄소를 광합성 세균 배양기의 탄소원으로 제공하여 미생물 유래 생리활성물질 및 유기산의 생산량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일구현예인 도 6은 실시예 1에 따른 미생물 분리배양 장치를 나타내는 단면도로서, 이산화탄소를 생성하는 미생물을 포함하는 미생물 배양기(10); 광합성세균을 포함하는 세균 배양기(20); 및 미생물 배양기(10)와 세균 배양기(20) 사이를 연결하고, 미생물 배양기(10)와 세균 배양기(20)의 기체 흐름을 가능하게 하는 연결배양로(30);를 포함한다.
먼저, 미생물 배양기(10)는 이산화탄소를 생성하는 미생물을 배양하는 것으로서, 상기 미생물은 이산화탄소를 생성하는 미생물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 대장균 또는 사카로마이세스 세레비제를 포함할 수 있다.
상기 미생물 배양기의 부피는 제한이 없지만, 바람직하게는 대량 배양을 위한 것일 수 있으며, 멸균 가능한 내열 유리병 또는 삼각플라스크를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 미생물 배양기(10)는 미생물로부터 발생한 이산화탄소를 유로에 유출시키기 위한 개폐수단(21)을 더 포함할 수 있으며, 이를 통해 이산화탄소의 유출을 조절할 수 있다. 상기 개폐수단은 통상적으로 기체를 조절하는 개폐수단이면 이에 제한되지 않지만, 바람직하게는 밸브 또는 레버를 포함할 수 있다.
다음, 세균 배양기(20)는 미생물로부터 발생한 이산화탄소를 유로를 통해 유입시키기 위한 개폐수단(22)을 더 포함할 수 있으며, 상기 개폐수단(21)은 통상적으로 기체를 조절하는 개폐수단이면 이에 제한되지 않지만, 바람직하게는 밸브 또는 레버를 포함할 수 있다.
상기 세균 배양기의 부피는 제한이 없지만, 바람직하게는 대량 배양을 위한 것일 수 있으며, 멸균 가능한 내열 유리병 또는 삼각플라스크를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 세균 배양기에 포함하는 세균은 고등식물과 같이 빛에너지를 이용하여 탄소 동화작용을 행하는 통상의 광합성 세균이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 클로로비움속 세균(Chlorobium sp.), 크로마튬속 세균(Chromatium sp.), 로도스피릴륨속 세균(Rhodospirillum sp.), 로돕센도모나스속 세균(Rhodopsendomonas sp.), 로도박터속 세균(Rhodobacter sp.) 및 로돕슈도모나스속 세균(Rhodopseudomonas sp.)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 및 로도박터 스페로이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
다음으로, 미생물 배양기와 세균 배양기 사이를 연결하고, 미생물 배양기와 세균 배양기의 기체 흐름을 가능하게 하는 연결배양로(30)를 설명한다.
상기 연결배양로(30)는 미생물 배양기와 세균 배양기의 기체 흐름을 가능하게 미생물 배양기와 세균 배양기 사이를 연결하는 통로로서, 길이, 직경 및 재질은 제한이 없으나, 바람직하게는 튜브일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 유리관 또는 실리콘튜브일 수 있다.
상기 미생물 분리배양 장치는 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성되는 이산화탄소를 바로 고정화시킴으로써 폐배지 내의 이산화탄소 저감 효과를 수득할 수 있으며, 이를 탄소원으로 하여 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질 및 유기산의 생산량을 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 미생물 분리배양 장치는 미생물 배양으로 인해 생성되는 이산화탄소를 세균 배양기로 유입하여 광합성 세균의 배양에 사용함으로써 미생물의 배양 및 광합성 세균의 배양을 향상시킬 수 있다.
나아가, 이산화탄소를 생성하는 미생물을 배양하는 미생물 배양기에 배양하는 단계; 광합성세균을 세균 배양기에 배양하는 단계; 및 상기 미생물 배양기에서 생성된 이산화탄소를 연결배양로를 통해 세균 배양기로 공급하는 단계;를 포함하는 미생물 분리배양 장치를 이용한 미생물 배양 폐배지의 재사용 방법을 제공한다.
이를 통해 대장균(Escherichia coli) 또는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)에서 생성되는 이산화탄소를 실시간으로 고정화할 수 있는 공정 시스템을 제공할 수 있으며, 상기 두 가지 균주인 대장균(Escherichia coli) 또는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)를 분리 배양하면 연속 공정이 가능할 수 있다. 따라서 대장균 또는 사카로마이세스 세레비제에서 원하고자 하는 생성물을 얻음과 동시에 로도박터 스페로이드에서는 이산화탄소 저감과 그에 따라 생성되는 유용한 유기화합물을 얻을 수 있고 또한 이러한 유용 유기화합물을 다시 대장균 또는 사카로마이세스 세레비제의 탄소원 또는 영양원으로 활용될 수 있는 연속공정이 가능하다.
상기 분리배양 방법은 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성된 이산화탄소가 로도박터 스페로이드가 배양된 배양용기에 연결된 유로를 통해 이동하여, 이산화탄소가 로도박터 스페로이드에 의해 동시에 고정화됨으로써 이산화탄소의 저감 효율을 높이는 것이다. 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성된 이산화탄소의 고정화를 통해 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질 및 유기산의 생성이 향상되어 폐배지를 재사용할 수 있다(도 1 참조).
구체적으로, 실시예 1에서 확인할 수 있듯이, 실질적인 이산화탄소의 저감에 대한 대조군은 분리배양의 조건에서 각각 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균을 접종하지 않은 배지 상태로 존재하는 경우와 로도박터 스페로이드를 접종하지 않아 그냥 배지만 있는 경우를 비교하도록 하였다(도 2 내지 3 참조). 그 결과, 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균과 로도박터 스페로이드를 분리배양했을 때, 대조군과 비교시 이산화탄소가 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균에 의해 생성된 이산화탄소가 로도박터 스페로이드에 의해 감소한 결과이다.
한편, 실질적으로 로도박터 스페로이드가 사카로마이세스 세레비제 및 대장균 배양시 생성된 이산화탄소를 고정화하는데 있어서 이산화탄소의 탄소를 탄소원으로 사용하였는지를 확인하기 위해서 세포의 건조중량을 측정하여 확인한 결과, 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균이 함께 분리배양된 경우에서 세포의 건조중량이 더 많이 증가 것을 확인할 수 있었다(도 4 내지 5 참조). 따라서, 동일한 배지 내에서 성장한 로도박터 스페로이드의 무게에서 더 많은 중량이 나가는 이유는 같은 동일조건에서 오직 이산화탄소 농도만의 차이이기 때문에 보다 많은 이산화탄소의 고정화로 인한 건조중량의 증가로 판단될 수 있다.
이론상의 이유로 보면, 상기 실시예 2의 미생물 배양된 폐배지에 광합성 세균을 접종하여 폐배지에 포함된 이산화탄소를 저감하는 이산화탄소 고정효율이 미생물 분리배양에 의한 이산화탄소 고정효율보다 높을 것 같았으나, 실제로는 그렇지 않았으며 실제로는 미생물의 분리배양에 의한 이산화탄소 고정효율이 더 높았다.
구체적으로, 상기 미생물 분리배양 방법과 실시예 2에 나타난 폐배지 재사용 방법은 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성된 이산화탄소를 로도박터 스페로이드가 이를 탄소원으로 하여 이산화탄소를 고정화시켜 이산화탄소 저감효율을 높이며, 이를 통해 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질의 생성을 증가시켜 폐배지의 재사용을 가능하게 한다는 효과 및 목적은 동일하다. 그러나, 미생물 분리배양 방법은 실시예 2의 폐배지 재사용 방법과 달리, 폐배지에 포함된 미생물 배양시 생성되는 이산화탄소를 연통된 유로를 통해 로도박터 스페로이드가 배양된 배양용기로 유출시켜 사용가능하게 한다는 점에서 차이가 있으며, 이를 통해 각각의 배양용기에서 분리되어 배양되어 지기 때문에 미생물 간의 간섭에 의한 효과를 배제할 수 있기 때문이라고 예상된다. 따라서 폐배지의 재사용을 위한 미생물 분리배양 장치 및 이를 이용한 분리배양 방법은 폐배지의 재사용 방법에 있어서, 매우 우수한 효과가 있는 것이라 할 수 있다.
나아가, 미생물의 분리배양은 대장균 또는 사카로마이세스 세레비제 등과 같은 함께 배양되는 미생물에서 원하고자하는 생성물을 얻음과 동시에 로도박터 스페로이드를 통한 실시한 이산화탄소 고정화와 그에 따라 생성된 유용 유기화합물을 다시 함께 배양되는 미생물의 탄소원 또는 영양분으로 이용됨으로써 연속 공정이 가능한 시스템으로서의 장점을 갖는다.
더불어, 본 발명은 알코올 생성균주를 배양했던 폐배지에 광합성 세균을 접종하여 폐배지를 재배양하는 단계; 및 재배양한 폐배지에 알코올 생성균주를 추가배양하여 알코올을 생산하는 단계; 를 포함하는 미생물 배양 폐배지 재사용 방법을 제공한다.
먼저, 알코올 생성균주를 배양했던 폐배지에 광합성 세균을 접종하여 폐배지를 재배양한다.
상기 알코올 생성균주는 이산화탄소를 생성하는 미생물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 재배양은 통상적으로 광합성 세균을 배양하는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 25 ~ 35 ℃ 및 100 ~ 250 rpm으로 5 ~ 300 시간 동안 배양할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 27 ~ 33 ℃ 및 150 ~ 200 rpm으로 10 ~ 150 시간 동안 배양할 수 있다.
만약, 25 ℃ 미만 및/또는 35 ℃를 초과하는 온도에서 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 속도가 저해되거나 생성물의 생성이 저해되는 문제가 발생할 수 있다.
만약, 100 rpm 미만에서 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 속도가 저해되거나 생성물의 생성이 저해되는 문제가 발생할 수 있으며, 250 rpm를 초과하여 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 속도가 저해되거나 생성물의 생성이 저해되거나 과도한 교반으로 과도한 거품이 생성되는 문제가 발생할 수 있다.
만약, 10 시간 미만으로 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 미비하거나 생성물의 생성이 미비한 문제가 발생할 수 있으며, 150 시간을 초과하여 배양할 경우, 세포가 사멸되거나 생성물의 생성이 감소 또는 생성물이 다른 물질로 변환되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 광합성 세균은 고등식물과 같이 빛에너지를 이용하여 탄소 동화작용을 행하는 통상의 세균이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 클로로비움속 세균(Chlorobium sp.), 크로마튬속 세균(Chromatium sp.), 로도스피릴륨속 세균(Rhodospirillum sp.), 로돕센도모나스속 세균(Rhodopsendomonas sp.), 로도박터속 세균(Rhodobacter sp.) 및 로돕슈도모나스속 세균(Rhodopseudomonas sp.)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 및 로도박터 스페로이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 재배양 이후 세포제거와 pH 조절 및 필터링과 글루코스를 첨가하여 사카로마이세스 세레비제를 재접종하여 동일한 조건에서 배양한 결과, 사카로마이세스 세레비제는 첨가되는 글루코스의 양에 대비하여 에탄올을 생성하는데 재사용하는 배지에서 처음 로도박터 스페로이드를 배양 후 다시 사카로마이세스 세레비제를 배양하였을 때는 보다 높은 에탄올 수율을 나타내었다(도 22 참조).
특히, 대조군(도 19)과 비교시, 첨가된 글루코스의 농도를 측정한 값보다 생성된 에탄올 수율이 더 높게 나옴으로써 사카로마이세스 세레비제에 의한 에탄올의 생성에 있어서 로도박터 스페로이드가 생성한 유기물질이 배지 내에 첨가하여 사카로마이세스 세레비제가 에탄올을 생산할 때의 탄소원으로 작용한 것으로 보인다. 즉, 사카로마이세스 세레비제를 배양했던 최소배지인 SD배지를 로도박터 스페로이드의 배양에 재사용하여 SD배지의 영양성분을 증가시킴으로써, 다시 사카로마이세스 세레비제가 에탄올을 생성하는데 있어서 향상된 효율을 얻을 수 있는 것이다.
영양배지가 아닌 최소배지에서 배양된 사카로마이세스 세레비제의 폐배지에 로도박터 스페로이드를 배양시킴으로써 더 상승한 에탄올 생산 및 수득율을 얻었다는 것은 본 발명의 폐배지 재사용 방법이 효과가 우수함을 증명하는 것이다.
결국, 버려지는 폐배지를 로도박터 스페로이드를 이용하여 재사용하고, 다시 사카로마이세스 세레비제에 의한 에탄올 생산에 도움이 되기 때문에 보다 효율적이며, 폐배지의 재사용이 가능한 친환경적인 효과가 있다.
다음으로, 재배양한 폐배지에 알코올 생성균주를 추가배양하여 알코올을 생산한다.
상기 알코올 생성균주는 이산화탄소를 생성하는 미생물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 알코올은 C1 ~ C5의 알코올일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
상기 추가배양은 통상적으로 미생물을 배양하는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 25 ~ 40 ℃ 및 100 ~ 250 rpm으로 5 ~ 150 시간 동안 배양할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 27 ~ 37 ℃ 및 150 ~ 200 rpm으로 10 ~ 100 시간 동안 배양할 수 있다.
만약, 25 ℃ 미만 및/또는 40 ℃를 초과하는 온도에서 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 속도가 저해되거나 생성물의 생성이 저해되는 문제가 발생할 수 있다.
만약, 100 rpm 미만에서 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 속도가 저해되거나 생성물의 생성이 저해되는 문제가 발생할 수 있으며, 250 rpm를 초과하여 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 속도가 저해되거나 생성물의 생성이 저해되거나 과도한 교반으로 과도한 거품이 생성되는 문제가 발생할 수 있다.
만약, 5 시간 미만으로 배양할 경우, 알코올 생성균주의 성장 미비하거나 생성물의 생성이 미비한 문제가 발생할 수 있으며, 150 시간을 초과하여 배양할 경우, 세포가 사멸되거나 생성물의 생성이 감소 또는 생성물이 다른 물질로 변환되는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 알코올 생성균주는 발효과정을 통해서 에탄올을 생성하며, 상기 에탄올은 산소가 없는 곳에서 특정 효모(yeast, Saccharomyces cerevisiae)를 이용할 수 있다. 또한, 상기 효모는 글루코스(glucose, C6H12O6)를 소화하는 과정(대사작용)에서 생성되는 부산물 중 하나로 에탄올을 생산하며, 상기 에탄올이 만들어지면서 동시에 이산화탄소(CO2)도 발생할 수 있다.
상기 글루코스는 탄수화물 대사의 중심적 화합물로서 그 이용 경로는 매우 복잡하며, 에너지원으로서 분해되는 경로는 특히 중요하다. 글루코스는 먼저 헥소키나아제의 작용으로 글루코스-6-인산이 되고, 해당과정을 거쳐서 피루브산으로 분해된다. 또한 호기적 조건에서는 TCA회로를 거쳐서 이산화탄소와 물로 분해된다. 글루코스는 이러한 세포호흡을 통해 분해되어 에너지를 생산하고, 그 에너지는 ATP의 형태로 저장된다. 이 에너지는 발효·호흡 등에 사용되어 지기 때문에, 본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 사카로마이세스 세레비제가 폐배지에서 재배양될 때 에탄올을 생성하기 위한 에너지원으로 글루코스를 첨가하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균과 로도박터 스페로이드의 분리배양을 통한 이산화탄소의 고정화
사카로마이세스 세레비제 또는 대장균은 성장하면서 이산화탄소를 생성한다. 따라서 이들 미생물들이 성장하면서 생성하는 이산화탄소를 바로 고정화할 수 있도록 로도박터 스페로이드와 연결된 분리배양 시스템을 구성하였다.
1-1. 분리배양 시스템
우선, 100 ㎖ 배양용기에 하기 표 1에 나타낸 sistrom’s 배지를 60 ㎖ 넣고 아르곤가스 퍼징을 7분 한 후, 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)로 20초간 퍼징을 하였다.
상기 배양용기에 로도박터 스페로이드를 5% 접종하고, 30 ℃, 180 rpm, 빛 조건에서 24시간 배양을 진행한 것과 사카로마이세스 세레비제를 SD(0.67% Yeast nigtrogen base without amino acid, 0.5% casamino acid, 0.5% glucose)배지에 5% 접종한 후 25 ㎜ 실리콘 튜브를 각각의 배양용기에 연결을 하여 사카로마이세스 세레비제 배양시 생성되는 이산화탄소가 로도박터 스페로이드로 이동하여 바로 고정화될 수 있도록 하였고, 30 ℃, 180 rpm, 빛 조건에서 배양하였다. 또한 이러한 실험은 정확한 결과를 위해서 3개의 샘플씩 준비해서 진행하였다.
도 1은 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균의 분리배양을 위한 장치를 나타내는 단면도이다.
KH2PO4 2.72 g
(NH4)2SO4 0.5 g
Succinic acid 4 g
L-glutamic acid 0.1 g
L-Aspartic acid 0.04 g
NaCl 0.5 g
Nitrilotriacetic acid 0.2 g
MgSO4.7H2O 0.3 g
CaCl2.2H2O 0.033 g
FeSO4.7H2O 0.0002 g
(NH4)6Mo7O24(1%solution) 0.2 ㎖
미량원소용액 / 100 ㎖ EDTA 1.765 g 0.1 ㎖
ZnSO4 · 7H2O 10.95 g
FeSO4 · 7H2O 5 g
MnSO4 · H2O 1.54 g
CuSO4 · 5H2O 0.392 g
Co(NO3)2 · 6H2O 0.248 g
H3BO3 0.114 g
비타민 용액 / 100 ㎖ Nicotinic acid 1 g 0.1 ㎖
Thiamine HCl 0.5 g
Biotin 0.01 g
Casamino acid 2 g
최종부피 1 ℓ
1-2. 분리배양 시스템에 의한 이산화탄소 고정화
상기 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균을 12, 24, 48 및 72시간 동안 분리배양하여 배양용기에 있는 이산화탄소의 농도를가스 크로마토그래피를 통해 분석하였다.
분석 방법은 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)의 퍼징으로 인해 처음 배양용기에 들어 있는 이산화탄소의 양을 60/80 carbonxen-1000 컬럼(Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC(gas chromatography(DS 6200, Donam Instrument INC. Korea)를 이용하여 분석하였다. 그리고 배양 시간에 따른 감소 되는 이산화탄소의 양을 측정하였다.
대장균 또한 같은 방식을 통해 로도박터 스페로이드와 분리배양이 되도록 하였으며, 대장균에 이용한 배지는 하기 표 2에 나타낸 M9배지를 사용하였다. 그리고 실질적인 이산화탄소의 저감에 대한 대조군은 분리배양의 조건에서 각각 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균을 접종하지 않은 배지 상태로 존재하는 경우와 로도박터 스페로이드를 접종하지 않아 그냥 배지만 있는 경우를 비교하도록 하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
그 결과 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균에 의해 생성된 이산화탄소가 로도박터 스페로이드에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
1M MgSO4 (sterile) 2 ㎖
20% glucose (sterile) 20 ㎖
1M CaCl2 (sterile) 0.1 ㎖
M9 salts Na2HPO4·7H2O 1.765 g 200 ㎖
KH2PO4 10.95 g
NaCl 5 g
NH4Cl 1.54 g
최종부피 1 ℓ
멸균함
최종부피 1 ℓ
1-3. 분리배양 시스템에 의한 이산화탄소 고정화의 확인
한편 실질적으로 로도박터 스페로이드가 사카로마이세스 세레비제 및 대장균 배양시 생성된 이산화탄소를 고정화하는 있어 이산화탄소의 탄소를 탄소원으로 사용하였는지를 확인하기 위해서 세포의 건조중량을 측정하였다.
건조중량은 각각의 샘플에서 세포가 배양된 배지에서 10 ㎖씩 채취하여 7000 rpm, 4 ℃에서 20분 동안 원심분리를 하여 세포만을 수거한 후, 다시 멸균수로 2회 세척을 한 후 - 50 ℃에서 48시간 동안 동결건조하였다. 그 결과를 도 4 내지 5에 나타냈다.
도 4 내지 5에서 확인되는 바와 같이, 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균이 함께 분리배양된 경우에서 세포의 건조중량이 더 많이 증가 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 동일한 배지 내에서 성장한 로도박터 스페로이드의 무게에서 더 많은 중량이 나가는 이유는 같은 동일조건에서 오직 이산화탄소 농도만의 차이이기 때문에 보다 많은 이산화탄소의 고정화로 인한 건조중량의 증가로 판단될 수 있다.
실험예 1: 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균과 로도박터 스페로이드의 분리배양을 통한 박테리오 클로로필과 카로테노이드의 분석
상기 실시예 1에서 배양된 로도박터 스페로이드가 동시 배양을 통해 보다 많은 이산화탄소 고정화를 통하여 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질인 박테리오클로로필과 카로테노이드를 측정하였다.
1-1. 박테리오클로로필의 확인
박테리오클로로필을 측정하기 위하여 배양액 10 ㎖을 3000 rpm, 10분 동안 원심분리하여 세포만 회수하고, 아세톤 : 메탄올 : 배지 = 7 : 2 : 1의 부피비로 넣어준 뒤, 빛을 차단시키고 1시간 동안 반응시킨 후 UV spectrophotometer를 통해 772 ㎚에서 흡광도 측정을 하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균과 함께 분리배양된 로도박터 스페로이드의 조건에서 보다 높은 박테리오클로로필의 농도를 확인할 수 있었다.
1-2. 카로티노이드의 확인
카로티노이드 함량을 측정하기 위하여 배양액을 10000 rpm, 20분 동안 원심분리 후 세포를 멸균수로 2번 세척하고 - 50 ℃에서 48시간 동안 동결건조 하였다. 건조된 세포에 3 mol HCl을 넣어주고 28 ℃에서 100 rpm으로 30분 동안 반응시키고, 10000 rpm, 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 아세톤을 넣고 28 ℃에서 100 rpm으로 30분 동안 반응시키고, 10000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다. UV spectrophotometer를 통해 480 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며 하기 수학식 1을 이용하여 카로티노이드의 함량을 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
Figure 112014075904284-pat00001
도 7에서 확인되는 바와 같이, 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균과 함께 분리배양된 로도박터 스페로이드의 조건에서 보다 높은 카로테노이드의 농도를 확인할 수 있었다.
실험예 2: 사카로마이세스 세레비제와 로도박터 스페로이드의 연결 분리배양에서 사용되는 배지와 사카로마이세스의 균주 차이에 따른 효과 분석
상기 실시예 1에서 배양된 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 연결된 분리배양에서 사용된 사카로마이세스 세레비제의 최소 배지인 SD배지에 들어간 배지의 성분은 0.67 중량% 아미노산이 없는 효모 질소 바탕(Yeast nitrogen base wihtout amono acids)(DifcoTM), 0.5 중량% 카제인가수분해물(Casamino acid)(BactoTM) 및 0.5 중량% 글루코스(glucose)를 포함하는 배지를 사용하였다.
상기 카제인가수분해물(Casamino acid)는 우라실(uracil)을 포함하지 않으며, 아미노산을 보강할 수 있는 영양분이기 때문에 최소 배지 성분에 카제인가수분해물이 첨가되더라도 우라실에 대한 영양 요구성 돌연변이는 성장에 영향을 받는다.
상기 사카로마이세스 세레비제[Matα pep4:: HIS3 prb1 can1 his 3 ura 3-52]는 우라실에 대한 영양 요구성 돌연변이로서 배지 내에 우라실이 없는 경우 성장에 영향을 받는다. 따라서, 우라실에 대한 영영 요구성 사카로마이세스 세레비제가 로도박터 스페로이드와 함께 연결된 분리배양에서 에탄올의 생산, 글루코스의 소비양 및 이산화탄소의 발생량에 대한 분석을 통한 영향력 분석을 수행하였으며, 아미노산이 첨부되지 않은 경우와 우라실에 대한 영양 요구성 사카로마이세스에 pYES2 벡터가 형질전환되어 우리실의 영향을 받지 않은 균주를 사용하였을 때의 결과에 대해 분석하고자 하였다.
2-1. 사카로마이세스 세레비제의 배지 종류와 균주에 따른 글루코스 소비율 분석
우라실에 대한 영양요구성 돌연변이인 사카로마이세스 세레비제와 로도박터 스페로이드의 연결된 분리배양에서 사용된 사카로마이세스 세레비제의 최소배지인 SD배지에서 0.67 중량% 아미노산이 없는 효모 질소 바탕(DifcoTM) 및 0.5 중량% 글루코스를 포함하는 배지에서의 로도박터 스페로이드와 연결 배양한 경우(도 1과 같은 장치 이용)와 0.67 중량% 아미노산이 없는 효모 질소 바탕(DifcoTM), 0.5 중량% 글루코스 및 0.5 중량% 카제인가수분해물(BactoTM)을 포함하는 배지에서 우라실에 대한 영양 요구성 돌연변이인 wild type 사카로마이세스 세레비제(Chung, B. H., Seo, D. J. & Nam, S. W. High-level secretory production of recombinant human lipocortin-I by Saccharomyces cerevisiae. Proc Biochem 35:97-101 (1999)에 기재되어 있는 것과 동일한 것 사용) 또는 pYES2 벡터(Cat.no. V825-20, Invitrogen Corporation, USA)로 형질전환한 사카로마이세스 세레비제를 연결배양시켰다.
배양 조건과 방식은 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 진행하였으며, 배양 시간은 72 시간 동안 배양하였다. 최종 배양 후 사카로마이세스 세레비제가 배양된 배양액에 대해 HPLC(High-performance liguid chromatograph; Waters, Mailford, MA, USA) 분석을 통해 글루코스에 대한 농도를 측정하였으며, 초기 배양 시작했을 때의 글루코스 농도 대비 소비된 글루코스 농도에 대해 비교하였다. 그 결과 도 8에 나타냈다.
도 8에서 확인되는 바와 같이, 로도박터 스페로이드와 연결배양한 사카로마이세스 세레비제의 경우(R-S), 배지의 카제인가수분해물의 유무와 관계없이, 사카로마이세스 세레비제의 타입(wild type 및 pYES2 형질전환)에 상관없이 모두 글루코스 100%가 소모된 것을 확인할 수 있었다.
하지만, 로도박터 스페로이드가 함께 연결 배양되지 않은 경우(M-S), wild type 사카로마이세스 세레비제의 경우, 카제인가수분해물을 포함하지 않는 배지에서는 78%의 글루코스 소비율을 보였으며, 카제인가수분해물을 포함하는 배지에서는 84%의 글루코스 소비율을 나타났다.
한편, pYES2로 형진전환된 사카로마이세스 세레비제의 경우, 우라실에 대한 영향을 받지 않기 때문에 로도박터 스페로이드와 연결 배양이 되지 않은 경우에도 100%의 글루코스 소비율을 확인할 수 있었다.
따라서, 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 연결 배양에서 우라실에 대한 영양 요구성 돌연변이인 wild type은 우라실이 없는 경우, 글루코스의 소비율이 100%미만이었지만, 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제를 연결 배양하였을 경우, 글루코스 소비율을 높이는 영향을 주는 것으로 판단되었다.
이로 인해, 로도박터 스페로이드의 배양에 있어서 생성되는 가스는 사카로마이세스 세레비제의 성장에 영향을 주는 요인으로 판단된다.
2-2. 사카로마이세스 세레비제의 배지 종류와 균주에 따른 사카로마이세스 세레비제의 건조중량에 대한 분석
상기 실험예 2-1에서 얻어진 사카로마이세스 세레비제의 최종 배양 후 10 ㎖의 배양액을 원심분리하여 세포만 수거한 수 증류수를 통해 2번 세척을 한 후 동결 건조기를 통해 세포를 건조하여 무게를 측정하였다. 그 결과를 도 9에서 나타냈다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 연결 배양의 경우가 연결 배양하지 않은 경우보다 높은 건조 중량을 확인할 수 있었다.
특히 카제인가수분해물가 없는 배지에서 배양한 사카로마이세스 세레비제와 연결 배양하지 않은 로도박터 스페로이드의 경우, 사카로마이세스 세레비제의 건조 중량이 0.14 g/ℓ지만, 카제인가수분해물를 포함하는 배지에서 배양한 사카로마이세스 세레비제와 연결 배양하지 않은 로도박터 스페로이드의 경우, 사카로마이세스 세레비제의 건조 중량은 0.20 g/ℓ로 확인할 수 있었다.
이로 인해, 카제인가수분해물에 의한 영향으로 판단할 수 있었으며, 사카로마이세스 세레비제와 로도박터 스페로이드가 연결 배양한 경우, 카제인가수분해물 포함 여부에 따라 사카로마이세스 세레비제의 건조중량에는 차이가 없으며, 이는 소모되는 글루코스의 차이에 따른 영향으로 판단된다.
또한, 형질전환된 사카로마이세스 세레비제의 경우, 로도박터 스페로이드와 연결배양한 경우가 보다 높은 건조중량을 확인할 수 있었다. 따라서 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제를 연결 배양한 경우가 보다 높은 건조 중량을 확인할 수 있었다.
2-3. 사카로마이세스 세레비제의 배지 종류와 균주에 따른 사카로마이세스 세레비제의 에탄올 생산에 대한 분석
상기 실험예 2-1에서 얻어진 사카로마이세스 세레비제의 최종 배양 후 사카로마이세스 세레비제가 배양된 배양액을 HPLC 분석을 통해 에탄올에 대한 농도를 측정하였으며, 그 결과 도 10에 나타냈다.
도 10에서 확인되는 바와 같이, 로도박터 스페로이드와 연결 배양한 사카로마이세스 세레비제의 경우가 로도박터 스페로이드와 연결 배양하지 않은 사카로마이세스 세레비제보다 높은 에탄올을 확인할 수 있었다. 특히, 카제인가수분해물을 포함하는 배지에서 배양한 경우가 카제인가수분해물을 포함하지 않는 배지에서 배양한 경우보다 높은 에탄올 생산량을 확인할 수 있었다.
한편, pYES2로 형질전환한 사카로마이세스 세레비제의 경우는 로도박터 스페로이드와 연결 배양 유무에 따른 큰 영향이 없었으며, 그 이유로는 소모된 글루코스의 양이 동일하기 때문에 큰 영향을 주지 않은 것으로 판단된다. 하지만, 우라실에 대한 영양 요구성 사카로마이세스 세레비제의 경우, 로도박터 스페로이드와 사카로마이세스 세레비제의 연결 배양이 글루코스 소모와 건조중량뿐만 아니라 에탄올 생산 수율에 있어서도 생산 향상의 영향을 주는 것으로 판단된다.
따라서, 로도박터 스페로이드와 연결 배양한 사카로마이세스 세레비제는 영양분의 부족에 의한 성장 저해에 대해 필요 영양분에 대한 보충 또는 대체 효과를 내는 것으로 판단된다.
실시예 2: 재사용된 배지에서의 로도박터 스페로이드 변이균주의 배양
사카로마이세스 세레비제를 YPD(Yeast extract 1%, Peptone-2%, Dextrose-2%) 배지에서 30℃ 및 180 rpm에서 48시간 배양한 것과 대장균을 LB(Luria-Bertani; Yeast extract-0.5%, Tryptone-1%, NaCl-1%) 배지에서 37 ℃ 및 180 rpm에서 24시간 동안 배양하였다.
사카로마이세스 세레비제 및 대장균을 배양한 후, 세포를 제거한 후 필터링과 멸균 처리를 하여 50 ㎖ 배양용기에 30 ㎖씩 넣고, 7분간의 아르곤 퍼징을 한 후 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)로 20초 퍼징을 진행하였다.
상기 혼합가스를 퍼징한 폐배지에 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 또는 로도박터 스페로이드(기탁기관: 미생물자원센터, 기탁번호: KCTC 1434, 기탁일자: 1984년)를 5% 접종하여 30℃, 180 rpm 및 빛 조건에서 36시간, 84시간 또는 132시간 동안 배양하였다. 로도박터 스페로이드 변이균주의 배양된 모습을 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 사카로마이세스 세레비제 및 대장균의 배양 폐배지에서 배양된 로도박터 스페로이드 변이균주의 농도가 시간이 지남에 진해지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 재사용 배지에서 성장한 로도박터 스페로이드 변이균주의 투과전자현미경 관찰
상기 실시예 2에서 배양된 로도박터 스페로이드 변이균주에 대하여 배양 시간에 따른 세포 내부의 모습을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 투과전자현미경 관찰용 샘플 제작과정은 다음과 같다.
1) 사카로마이세스 세레비제 및 대장균의 배양 폐배지에서 각각 36시간, 84시간 또는 132시간 동안 배양된 로도박터 스페로이드 변이균주에 대하여 10 ㎖의 배양액을 7000rpm 및 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 하였다.
2) 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 이용하여 2회 세척한 후 2.5% 글루타르알데하이드에 현탁하여 2시간 동안 4℃에서 반응을 시켜 로도박터 스페로이드 변이균주 세포를 고정하였다.
3) 원심분리를 하여 모은 세포에 2%의 아가(agar) 용액을 넣어 세포와 아가 용액이 잘 섞이면서 굳어지도록 하였다. 그 후, 인산완충용액(PBS, 1M, pH 7.4)으로 4℃에서 10분 동안 반응시켜 2회 세척을 한 후 1% 오스뮴테트로옥사이드(OsO4)로 4℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다.
4) 다시 인산완충용액으로 4℃에서 10분 반응을 시키며 2회 세척을 한 후 50%, 70%, 80% 및 90%의 에탄올 용액으로 각각 15분씩 반응을 시켜준 후, 100% 에탄올 용액으로 15분씩, 3회 반응시켰다.
5) 산화프로필렌(propylen oxide)용액으로 10분씩, 2회 반응시켜준 후 산화프로필렌 : 에폰(epon) 혼합물이 1 : 1의 부피비로 혼합된 용액에 1시간 30분 반응 시킨 후, 다시 1 : 3의 부피비로 혼합된 용액으로 오랫동안(overnight) 반응시켰다.
6) 에폰 혼합물(epon mixture) 용액으로 2시간 반응시켜준 후 포매(embedding) 하여 37℃에서 24시간, 45℃에서 24시간 및 60℃에서 48시간 두어서 굳어지도록 하였다.
7) 포매(embedding) 후 초박막절편기(Ultramicrotome; Leica ultracut uct, Leica, Germany)를 이용하여 60 ~ 100 ㎚의 두께로 미세 절단을 한 후, 아세트산우라닐(uranyl acetate)로 30분간 1차 염색하고 세척하여 납 시트레이트(lead citrate)로 26분간 2차 염색한 후 다시 세척하여 투과전자현미경(TEM: Transmission electron microscope; H-7650, Hitachi, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 세포 내부에 둥근 모양을 갖는 PHB(polyhydroxybutyrate)의 형상을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 재사용된 배지에서 성장한 로도박터 스페로이드 변이균주의 이산화탄소 저감 분석
상기 실시예 2에서 배양된 로도박터 스페로이드 변이균주의 성장에 따른 이산화탄소 저감 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)의 퍼징으로 인해 처음 배양용기에 들어 있는 이산화탄소의 양을 60/80 carbonxen-1000 컬럼(Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC(gas chromatography(DS 6200, Donam Instrument INC. Korea)를 이용하여 분석하였다. 그리고 배양 시간에 따른 감소 되는 이산화탄소의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 재사용된 LB 배지 및 YPD 배지에서 모두 이산화탄소가 초기 보다 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 사카로마이세스 세레비제 및 대장균의 배양시 생성되는 이산화탄소가 로도박터 스페로이드 변이균주에 의해 감소함을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 재사용된 배지에서 성장한 로도박터 스페로이드로 인한 유기산 증가
상기 실시예 2에서 재사용된 배지에서 성장한 로도박터 스페로이드(기탁기관: 미생물자원센터, 기탁번호: KCTC 1434, 기탁일자: 1984년)에 의해 폐배지의 영양분이 증가하는지 확인하였다.
구체적으로, 각각의 재사용된 YPD배지와 LB배지를 Rspack KC-811(직경×높이= 8㎜×300㎜, Showa Denko, Tokyo, Japan) 컬럼이 장착된 HPLC(High-performance liguid chromatograph; Waters, Mailford, MA, USA)를 이용하여 배지의 성분을 분석하였다. 그 결과를 도 14 내지 15에 나타내었다.
도 14에 확인되는 바와 같이, 사카로마이세스 세레비제의 배양 후 재사용한 YPD 배지의 경우, 로도박터 스페로이드가 성장하면서 배지 내의 말산(malic acid)의 양이 증가하였다.
도 15에 확인되는 바와 같이, 대장균 배양 후 재사용되는 LB배지에서는 젖산(Lactic acid)의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 사카로마이세스 세레비제 또는 대장균의 최소 배지를 로도박터 스페로이드의 배양에 재사용할 때의 성장과 이의 효과 분석
영양분이 비교적 풍부한 LB와 YPD 배지를 사용하고 난 후 그 폐배지에 다시 로도박터 스페로이드를 배양하였을 때는 충분히 배양이 가능하였다. 따라서 보다 적은 영양분이 있는 배지인 최소 배지에서도 로도박터 스페로이드의 충분한 배양의 가능성에 대한 평가와 배지 내의 영양성분의 증가에 대한 확인을 하였다.
3-1. 최소 배지에서의 로도박터 스페로이드의 성장
상기 실시예 1에서 진행했던 사카로마이세스 세레비제와 대장균의 최소배지인 SD배지와 M9배지의 배양했던 배지를 재사용하여 로도박터 스페로이드를 배양하였다.
구체적으로, 실시예 1의 배양 후 배양에 사용했던 SD 배지와 M9배지를 원심분리를 통해 세포를 제거하고 순수 배지만을 얻은 후 필터링을 통해 이물질을 제거하였다. 이후 배지의 pH를 보정하기 위해 KOH를 사용하여 pH 7.0으로 만든 후 100 ㎖ 배양용기에 60 ㎖의 배지를 넣고 아르곤 가스로 7분 동안 퍼징을 한 후 다시 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)로 20초 동안 퍼징을 하였다. 상기 혼합가스를 퍼징한 배지에 로도박터 스페로이드 배양액을 5% 접종한 후 30℃, 180rpm 및 빛 조건에서 배양하였다. 또한 대조군으로 sistrom’s 배지를 사용하여 동일한 방법으로 배양을 진행하였다.
재사용배지 및 대조군의 배양 후, 원심분리를 통한 세포 수거를 통해 건조 중량을 확인하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에서 확인되는 바와 같이, 세포의 건조중량을 확인하였을 때 재사용된 M9배지에서는 로도박터 스페로이드가 잘 성장하지 않았지만, 재사용된 SD배지에서는 로도박터 스페로이드가 성장함을 확인할 수 있었다.
3-2. 박테리오클로로필 및 카로테노이드의 분석
상기 최소배지에서의 로도박터 스페로이드의 성장에 따른 박테리오클로로필 및 카로테로이드의 함량을 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 측정 결과는 도 17 내지 18에 나타냈다.
도 17 내지 18에서 확인되는 바와 같이, 실시예 3-1의 세포 건조중량의 결과와 비슷한 양상을 보였으며, 재사용된 SD배지에서 로도박터 스페로이드에 의한 박테리오클로로필 및 카로테노이드의 함량 또한 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 재사용된 M9배지의 경우는 그 영양성분이 너무 적기 때문에 로도박터 스페로이드가 충분한 성장이 되지 않은 결과라고 판단된다.
실시예 4: 배양시스템
사카로마이세스 세레비제는 대표적인 에탄올 생산 균주이다. 본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 사카로마이세스 세레비제를 배양했던 최소배지인 SD배지를 로도박터 스페로이드의 배양에 재사용하여 SD배지의 영양성분을 증가시킴으로써, 다시 사카로마이세스 세레비제가 에탄올을 생성하는 데 있어 더욱 높은 효율을 얻을 수 있도록 하고자 하였다.
구체적으로, 실시예 1의 SD배지와 동일한 SD배지와 사카로마이세스 세레비제를 100 ㎖ 배양용기에서 배양액을 5% 접종한 후 30℃ 및 180 rpm으로 48시간 배양하였다. 배양한 상태에서 원심분리를 통해 세포를 제거하고 수산화칼륨을 이용하여 pH를 7.0으로 조절한 후 필터링을 한 후 다시 로도박터 스페로이드를 배양하기 위해 아르곤 가스로 7분 퍼징한 후 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)로 20초 퍼징을 한 후 로도박터 스페로이드 배양액 5%를 접종하여 30℃, 180rpm 및 빛이 있는 조건에서 48시간 배양하였다. 이후 상술한 바와 동일한 방법으로 세포를 제거하고 수산화칼륨을 이용하여 pH를 조절한 후 필터링하였다.
이후 0.5% 글루코스를 첨가하고 사카로마이세스 세레비제 배양액 5% 접종하여 한 후 30℃ 및 180 rpm으로 48시간 배양하였으며, 상술한 바와 같은 실험 방식으로 배지를 버리지 않고 재사용되도록 실험을 진행하였다(도 20 참조).
또한, 대조군으로 사카로마이세스 세레비제를 동일 조건으로 배양을 하였으며, 사카로마이세스 세레비제를 배양 후 로도박터 스페로이드의 배양으로 사용하지 않고 상술한 바와 동일한 조건 처리 후 다시 사카로마이세스 세레비제를 배양하도록 하였으며, 동일한 방법으로 3회 실시하였다(도 19 참조).
상기 재사용의 재사용 결과를 확인하기 위해서, 배지 성분 분석을 상기 실험예 5와 동일한 방법으로 HPLC를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 20 및 도 22에 나타내었다.
도 19 및 도 22에서 확인되는 바와 같이, 사카로마이세스 세레비제는 첨가되는 글루코스의 양에 대비하여 에탄올을 생성하는데 재사용하는 배지에서 처음 로도박터 스페로이드를 배양 후 다시 사카로마이세스 세레비제를 배양하였을 때보다 높은 에탄올 수율을 나타냈다.
특히, 첨가한 글루코스의 농도를 측정한 값보다 생성된 에탄올 수율이 더 높게 나옴으로써 사카로마이세스 세레비제가 에탄올의 생성에 있어 로도박터 스페로이드가 생성한 유기물질이 배지 내에 첨가되어 사카로마이세스 세레비제가 에탄올을 생산할 때의 탄소원으로 작용을 한 것으로 판단된다.
하지만, 다시 배양을 진행되었을 때는 재사용한 배지의 에탄올의 농도의 증가에 의한 영향으로 인해 보다 높은 수율의 에탄올 생산은 보이지 않았다. 하지만, 버려지는 배지를 로도박터 스페로이드를 이용하여 재사용하고, 다시 사카로마이세스 세레비제의 에탄올 생산에 도움이 되기 때문에 보다 효율적이며 재사용이 가능한 친환경적인 시스템 개발로 판단된다.

Claims (10)

  1. 미생물이 배양된 폐배지에 광합성 세균을 접종하는 단계; 및
    접종된 광합성 세균이 폐배지에 포함된 이산화탄소를 탄소원으로 이용하여 이산화탄소를 고정화(carbon dioxide fixation)함으로써 이산화탄소를 저감하고 생리활성물질 및 유기산을 생산하는 단계;를 함유하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폐배지는 사용된 YPD(Yeast extract 0.5~2 중량%, Peptone 1~3 중량% 및 Dextrose 1~3 중량%를 포함), 사용된 LB(Luria-Bertani; Yeast extract 0.1~1 중량%, Tryptone 0.5~2 중량% 및 NaCl 0.5~2 중량%를 포함), 사용된 SD(0.1~1 중량% Yeast nigtrogen base without amino acid, 0.1~1 중량% casamino acid 및 0.1~1 중량% glucose를 포함) 또는 사용된 M9(Na2HPO4·7H2O 0.5~5 g/l, KH2PO4 5~15 g/l, NaCl 1~10 g/l 및 NH4Cl 0.5~5 g/l를 포함)인 것을 특징으로 하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 광합성세균은 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 및 로도박터 스페로이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 알코올 생성균주를 배양했던 폐배지에 광합성 세균을 접종하여 폐배지를 재배양하는 단계; 및
    재배양한 폐배지에 알코올 생성균주를 추가배양하여 알코올을 생산하는 단계;
    를 포함하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 알코올 생성균주는 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 광합성 세균은 로도박터 스페로이드 변이균주(기탁기관: 국립농업과학원 농업유전자원센터, 기탁번호: KACC91572P, 기탁일자: 2010년 8월 12일) 및 로도박터 스페로이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 배양, 재배양 및 추가배양은 25 ~ 35 ℃, 150 ~ 200 rpm 및 빛이 있는 조건에서 10 ~ 150 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물이 배양된 폐배지의 재사용 방법.
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