CN106220718B - 一种草菇热激蛋白VvHSP60及其应用 - Google Patents

一种草菇热激蛋白VvHSP60及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种草菇热激蛋白VvHSP60及其应用，所述热激蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。应用于转入大肠杆菌中使宿主获得对温度胁迫的耐受性。本发明将含有该读码框的核苷酸序列转入适合的宿主体内，可使宿主表达热激蛋白并提高宿主细胞的耐热性和耐冷性，具有良好的应用前景。

Description

一种草菇热激蛋白VvHSP60及其应用
技术领域
本发明属于热激蛋白领域，特别涉及一种草菇热激蛋白VvHSP60及其应用。
背景技术
草菇[Volvariella volvacea(Bull.)Singer]是一种原产于中国热带、亚热带地区的美味食用菌，隶属于担子菌纲、伞菌目、光柄菇科、小包脚菇属，其菌丝体的最适生长温度为32-35℃。由于草菇属高温菇种，其菌丝体或子实体在常规0-4℃的冷藏条件下便会出现低温自溶现象，表现为组织变软、液化、腐烂等。草菇这种不耐低温的特性，严重影响了其菌种的低温保藏、子实体的采后贮藏与运输，阻碍了草菇产业的快速发展。
热激蛋白(Heat shock protein,HSP)是一类在有机体受到高温、缺氧、饥饿、低温、重金属离子等逆境胁迫后大量表达的蛋白，它是生物短期适应逆境胁迫的不可缺少的组分，对减轻逆境胁迫造成的细胞伤害起到很大的作用。生物体在比正常生长温度高5℃以上的环境下生长时(即热激条件)，大部分正常蛋白质的合成被抑制，而分子量从8kDa至110kDa的热激蛋白被迅速地诱导合成(Lindquist S,Craig EA.The heat shock proteins[J].Annu Rev Genet,1988,2:631-637.)。关于HSP的分类标准，目前获得普遍认同的是按照SDS电泳的表观分子量大小把HSP分为6大类：HSP100(ClpB/A/C)族，HSP90(HtpG)族，HSP70(DnaK)族，HSP60(GroEL)族，HSP40(DnaJ)及小分子量热激蛋白smHSP(IbpA/B)。按照热激蛋白的类型又可将其分为诱导型和组成型两类：诱导型的HSP主要在受到外界环境的刺激下被诱导表达，具有保护细胞的功能；组成型的HSP在正常生理状态下表达，与细胞的分化、发育密切相关。目前已经确定热激蛋白定位于生物体细胞的多种细胞器，包括叶绿体、细胞质、线粒体及内膜系统等。植物热激蛋白的细胞定位，则根据其不同产生器官或不同的生物阶段来区分。热激蛋白具有产生瞬时性，高度保守性，交叉耐受性，具有可被多种逆境诱导等特点。研究表明，热激蛋白在细胞中可以担当“分子伴侣”，与正在合成的多肽结合，帮助其正确折叠；同时可以引导新生肽穿过细胞器膜结构，使蛋白定位于细胞的不同部位；在高温或其它外界胁迫下，可以阻止变性蛋白的聚集或阻止不可逆的蛋白变性，或有利于蛋白质在受胁迫变性之后的复性，因此HSPs在生物体抵抗外界胁迫中的作用不言而喻。
热激蛋白的出现与细胞耐胁迫潜力的发挥有关，它的出现为生物体提供了一种暂时的保护机制。研究表明，真菌中HSP的诱导合成有助于提高其耐热性，如Lindquist等发现细胞内大量表达的HSP104对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的耐热性大幅度提高具有积极作用(Lindquist S,Gina K.Heat shock protein 104expression issufficient for thermotolerance in yeast[J].Proc Nat l Acad Sci USA,1996,9:5301-5306.)；金承涛等通过研究认为，酿酒酵母耐热菌株HU-TY-1的强耐热性与HSP72和HSP84的组成性合成密切相关(金承涛,曾云中,吴雪昌等.耐热酵母菌株HU-TY-l的耐热机理初探[J].浙江大学学报,2001,28(6):676-681.)。但是目前关于热激诱导真菌HSP合成提高其抗冷性的研究尚未见报道，此类研究在植物中已取得阶段性的进展：如宫伟娜的实验结果显示，紫茎泽兰(Ageratina adenophora)的4个热激蛋白基因HSP17.6、HSP60、HSP70及HSP90在其幼苗茎、叶中的表达都受到热激的诱导，并且经热激处理后紫茎泽兰对低温胁迫的抗性明显增强(宫伟娜.低温胁迫过程中入侵植物紫茎泽兰热激蛋白的作用[D].北京:中国农业科学院,2009.)；Collins的研究指出，绿豆(Vigna radiata)下胚轴经40℃热激处理3h后诱导合成了9种HSP，其中有两个蛋白(70kDa和79kDa)与热激诱导抗冷性有关，可减轻后续的冷胁迫(2.5℃)对细胞膜的损伤，并能有效降低电解质的渗漏(Collins GG,Nie XL,Saltveit ME.Heat shock proteins and chilling sensitivity of mung beanhypocotyls[J].J Exp Bot,1995,46(288):795-802.)。研究证明，虽然热激是诱导HSPs产生的主要因素，但是在一定条件下冷胁迫也可以诱导相关热激蛋白的产生。
正常状态下HSP60以稳定状态存在于线粒体和细胞质中，受到胁迫时其在细胞质中HSP70的协助下迅速从细胞质转移到线粒体基质中，可以修复线粒体基质中的变性蛋白从而保持线粒体的功能，起到抗细胞凋亡的作用或者通过维持线粒体的氧化磷酸化功能防止细胞凋亡。
目前人们对植物和动物体内HSPs的研究已经比较深入，关于微生物中的HSPs也有了一些研究。研究表明，真菌中HSP的诱导合成有助于提高其耐热性，但是目前关于热激诱导真菌HSP合成提高其抗冷性的研究尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种草菇热激蛋白VvHSP60及其应用，将含有该蛋白读码框的核苷酸序列转入适合的宿主体内，可使宿主表达热激蛋白并提高宿主细胞的耐热性和耐冷性，具有良好的应用前景。
本发明提供了一种草菇热激蛋白VvHSP60，所述热激蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明提供了一种编码草菇热激蛋白VvHSP60的基因，所述基因的序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提供了一种草菇热激蛋白VvHSP60的基因设计的引物，所述引物序列如下：
HSP60-F：5’-CGGATCCGATGCACCGTCTCTCCACCTC-3’；
HSP60-R：5’-GGAATTCCCTTGTCCTTCTCCGGCGCAT-3’。
本发明提供了一种含草菇热激蛋白VvHSP60基因的载体。
所述载体为pET32a(+)/VvHSP60。
本发明提供了一种细胞、组织或微生物，转入上述载体。
本发明提供了一种草菇热激蛋白VvHSP60的应用，应用于转入大肠杆菌中使宿主获得对温度胁迫的耐受性。
本发明以草菇低温敏感菌株V23和耐低温菌株VH3为材料，根据草菇表达谱中热激蛋白VvHSP60基因的同源物种中该基因的登录号，在NCBI中查找获得其编码区序列，在草菇全基因组中进行序列信息比对，之后在GenBank中通过blastx比对DNA序列，按照真核生物去除内含子的原则(GT-AG)去除可能的内含子，获得草菇热激蛋白VvHSP60基因的核苷酸编码区序列。开放阅读框(Open reading frame,ORF)分析结果显示：草菇VvHSP60共存在9个潜在的编码区，其ORF共1689bp，如SEQ ID NO.2所示。编码563个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。运用生物信息学方法进一步分析草菇VvHSP60的核苷酸序列和氨基酸序列，序列分析表明：该基因属于HSP60基因家族；多序列比对的进化树结果表明，草菇VvHSP60蛋白氨基酸序列与同为草腐菌的双孢蘑菇(XP_006455860.1)、木腐菌的平菇(KDQ33327.1)以及鬼伞科的灰盖鬼伞(XP_001835743.1)的HSP60都有较近的亲缘关系；草菇VvHSP60蛋白分子量为59.33kDa，等电点(pI,isoelectric point)为5.46，不稳定指数(instability index)为29.44，属于稳定蛋白，总平均亲水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)为-0.071，属于可溶性蛋白；草菇VvHSP60存在信号肽，属于分泌蛋白，其编码蛋白在线粒体和细胞质内发挥生物学作用，同时跨膜结构分析表明该蛋白为双向跨膜蛋白；结构域分析结果显示，草菇VvHSP60的第22-206位氨基酸残基和第379-552位氨基酸残基包含分子伴侣赤道结构域(GroEL-like equatorial domain)，第194-387位氨基酸残基包含分子伴侣顶端结构域(GroEL-like apical domain)，根据伴侣蛋白的分类，草菇VvHSP60属于Ⅰ类伴侣蛋白。
将获得的草菇VvHSP60基因序列，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与骨架载体pET-32a(+)连接构建得到原核表达载体pET-32a(+)/VvHSP60，转入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导进行异源表达，提取表达蛋白经SDS-PAGE电泳分析，结果显示得到蛋白分子量约为60kDa的融合蛋白，与预期结果吻合。
转基因大肠杆菌经高温(50℃)热激处理和低温(4℃)处理后，通过对大肠杆菌活力的测定，结果表明草菇VvHSP60蛋白的异源表达，可以显著提高大肠杆菌对高温和低温的耐受力，如图5和图6所示，且对大肠杆菌中其它蛋白有较好的保护作用。
有益效果
本发明获得了草菇热激蛋白VvHSP60基因的完整开放读码框及热激蛋白的氨基酸序列，将含有该读码框的核苷酸序列转入适合的宿主体内，可使宿主表达热激蛋白并提高宿主细胞的耐热性和耐冷性，实验证明转基因大肠杆菌过量表达该热激蛋白后，其耐热性和耐冷性得到显著提高，推测该基因转入其它生物中也可提高宿主的耐热性和耐冷性。
附图说明
图1为pET-32a(+)质粒图谱；
图2为扩增全长VvHSP60基因PCR产物检测；
图3为酶切pET-32a(+)/VvHSP60检测；
图4为pET-32a-VvHSP60重组表达蛋白产物的SDS-PAGE电泳图；
图5为高温(50℃)条件下转入VvHSP60基因的大肠杆菌存活率比较；
图6为低温(4℃)条件下转入VvHSP60基因的大肠杆菌存活率比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。1.1.1试验材料
1.1.1.1大肠杆菌菌株
大肠杆菌(E.coli)菌株TOP10购自生工生物工程(上海)有限公司，大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.1.2表达载体
pET-32a(+)购自生工生物工程(上海)有限公司，全长5900bp，携带有氨苄(Amp)抗性基因。质粒图如图1所示。
1.1.2试验培养基
LB培养基，购于MD BIO INC。
1.1.3试剂
SDS-PAGE电泳蛋白Marker，购自LIFE SCIENCE。
限制性内切酶EcoR I和BamH I购自TAKARA BIOTECHNOLOGY。
蛋白保护剂Protease Inhibitor Cocktail购自SIGMA。
SDS-PAGE凝胶试剂盒购自PROMOTON。
SDS-PAGE染色脱色试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司。
1.1.4仪器
PCR仪，凝胶成像系统，低温高速离心机，电泳仪，超净工作台，自动高压蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，冰箱，微量移液器，超纯水仪。
1.1.5常用溶液的配制
1.1.5.1氨苄青霉素储存液：
将1g氨苄青霉素溶解于10mL去离子水中，使终浓度达到100mg/mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。
1.1.5.2IPTG：
将IPTG配制成24mg/mL(100mM)的水溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。
1.1.5.3PBS缓冲液：
NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 1.76mmol/L，加蒸馏水定容至1000mL，调PH值至7.2-7.4。
1.1.5.4电极缓冲液(Running Buffer)：
Tris 3.1g，甘氨酸18.8g，SDS 1g，加蒸馏水定容至1L。
实施例1
草菇VvHSP60基因的获得、分析及表达载体构建
(1)获得草菇热激蛋白VvHSP60的核苷酸序列
根据草菇表达谱中热激蛋白VvHSP60基因的同源物种Piriformospora indicaDSM 11827中该基因的登录号CCA78084.1，在NCBI中查找获得其编码区序列，在草菇全基因组中进行序列信息比对，之后在GenBank中通过Blastx比对DNA序列，按照真核生物去除内含子的原则(GT-AG)去除可能的内含子，获得草菇热激蛋白VvHSP60基因的核苷酸编码区序列。(2)开放阅读框(ORF)分析
对获得的核苷酸序列进行开放阅读框(Open reading frame,ORF)分析，结果显示草菇VvHSP60共存在9个潜在的编码区，其ORF共1689bp，如SEQ ID NO.2所示，编码563个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。
(3)设计全长基因特异性引物扩增全长基因
根据SEQ ID NO.2，利用DNAMAN 7.0确定编码区核苷酸序列的非酶切位点，确定两端所用限制性内切酶为BamH I和EcoR I，所有全长上游引物序列F的5’端加入BamH I序列CGGATCCG，下游引物序列R的3’端加入EcoR I序列GGAATTCC，设计全长特异引物扩增基因完整的读码框。
引物设计序列为：
HSP60-F：5’-CGGATCCGATGCACCGTCTCTCCACCTC-3’；
HSP60-R：5’-GGAATTCCCTTGTCCTTCTCCGGCGCAT-3’。
HSP60-F引物划线处为BamH I的酶切位点，HSP60-R引物划线处为EcoR I的酶切位点，引物用无菌双蒸水稀释备用。
利用常规PCR扩增技术扩增目的片段，反应体系如下：
PCR反应条件如下：94℃，3min；94℃30s，65℃30s，72℃3min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
扩增结束后取PCR扩增产物2μL在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，观察结果，PCR扩增出一条1700bp左右的条带，与预期结果吻合，如图2所示。
将剩余PCR产物进行回收纯化，操作按试剂盒说明进行。
(4)构建表达载体
将上一步回收纯化的产物和质粒pET-32a分别经BamH I和EcoR I双酶切后，37℃保温3h，进行连接。反应体系如下：
PCR产物酶切体系：
构建载体酶切体系：
酶切之后用PCR纯化试剂盒进行酶切产物回收，将回收的产物进行连接反应，构建重组表达载体pET-32a-VvHSP60。16℃保温4h，连接反应体系如下：
将连接产物转化大肠杆菌TOP10，经过菌落PCR验证后送菌样至生工测序，测序的结果与克隆全长比对匹配。提取测序成功的菌样的质粒pET-32a-VvHSP60，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。
(5)生物信息学分析
通过Blastn对获得的基因序列进行比对，发现该序列与HSP60的基因相似度最大，初步鉴定此基因为草菇VvHSP60蛋白基因。
利用Mega6.0将比对得到的氨基酸序列构建进化树，草菇VvHSP60蛋白氨基酸序列与同为草腐菌的双孢蘑菇(XP_006455860.1)、木腐菌的平菇(KDQ33327.1)以及鬼伞科的灰盖鬼伞(XP_001835743.1)的HSP60都有较近的亲缘关系。
Protparam软件在线分析结果表明，草菇VvHSP60蛋白分子量为59.33kDa，等电点(pI，isoelectric point)为5.46，不稳定指数(instability index)为29.44，属于稳定蛋白，总平均亲水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)为-0.071，属于可溶性蛋白。
SignalP 4.1Server分析结果显示，草菇VvHSP60存在信号肽，属于分泌蛋白，通过TargetP1.1Serve和PSORTB进行的亚细胞定位显示，所编码蛋白在线粒体和细胞质内发挥生物学作用，且与分子伴侣蛋白HSP60的细胞质定位一致，利用TMHMM Server进行跨膜结构预测分析表明该蛋白为双向跨膜蛋白。
InterProScan进行的结构域分析显示，草菇VvHSP60的第22-206位氨基酸残基和第379-552位氨基酸残基包含分子伴侣赤道结构域(GroEL-like equatorial domain)，第194-387位氨基酸残基包含分子伴侣顶端结构域(GroEL-like apical domain)，根据伴侣蛋白的分类，草菇VvHSP60属于Ⅰ类伴侣蛋白。
SOPMA软件预测在草菇VvHSP60的二级结构中，α-螺旋占44.05％，延伸链占18.12％，无规则卷曲占27.89％，β-转角占9.95％，因此草菇VvHSP60二级结构为mixed型。Swiss-model预测的三级结构主要由螺旋和卷曲构成，折叠和线圈占少量比例，这与二级结构预测相吻合。
由上述分析结果推断，所获得的草菇热激蛋白VvHSP60基因序列为HSP60家族一员。
实施例2
草菇VvHSP60基因原核表达及蛋白功能验证
(1)接种含有pET-32a-VvHSP60的大肠杆菌BL21单菌落于100mL含有50μg/mL Amp的LB液体培养基中，在220rpm 37℃下培养至OD600达到0.6-0.8，然后使用浓度为1mM的IPTG加入到100mL液体LB中，在220rpm 37℃下继续培养4h，以达到优化诱导培养条件的目的。同时将空载体pET-32a转化BL21作为对照。
(2)提取原核表达蛋白质进行SDS-PAGE电泳
①蛋白样品制备
将步骤(1)得到的菌体进行离心，去除上清，在收集菌体的管内加入25mLPBS，10μLProtease Inhibitor Cocktail，转移至50mL离心管中，混匀，放入冰水中，将烧杯垫高至探头不能再往下深入进离心管，探头不可贴在离心管壁上。超声破碎的工作条件为：工作3s，间歇5s，全程20-30min，工作电压300V。破碎过程中不可产生气泡，不可使探头发热。超声破碎后倒入白色50mL离心管中，4℃，8000r/min离心20min，取上清，冰上放置。
②SDS-PAGE凝胶电泳
按照试剂盒配置胶，分离胶约为4.22mL，浓缩胶约为1.5mL，选用15孔的胶板制胶，样品上样量为15μL，Maker上样量为7.5μL。进行SDS-PAGE电泳时，内槽电极液要使用现配制的，外槽的电极液可回收利用，浓缩胶电压设为100V，分离胶电压设为140V。电泳结果如图4所示，在接近60kDa处出现一条明显的蛋白条带，其表达量显著高于空载体对照组，表明草菇热激蛋白VvHSP60在大肠杆菌中异源表达成功。
(3)草菇VvHSP60蛋白耐热功能的研究
取1mL步骤(1)中诱导后的菌液进行50℃高温处理60min，分别在0、15、30、45、60min的时间点取100μL的处理菌液，用含Amp的LB液体培养基进行稀释(6×106cells/mL)后涂于含有Amp的LB平板，37℃过夜培养后统计平板所长出的菌落数量，通过菌落计数测定大肠杆菌的存活能力。
分析结果显示：高温处理45min时，pET-32a-VvHSP60的细胞存活率开始出现明显的下降，存活率为47％，但仍远高于此时空载体的存活率20％。经过高温处理60min后，对照组的死亡率达到85％，而pET-32a-VvHSP60的死亡率为67％，如图5所示。由此可以看出，过量表达草菇热激蛋白VvHSP60的大肠杆菌细胞的存活率要显著高于转空载体的对照组细胞，说明草菇VvHSP60基因的转入表达可以显著增强大肠杆菌对高温的耐受力。
(4)草菇VvHSP60蛋白耐冷功能的研究
取步骤(1)中诱导后的菌液100μL，用含Amp的LB液体培养基进行稀释(6×106cells/mL)后涂于含有Amp的LB平板，4℃低温处理8d，分别在0、2、4、6、8d时间点将平板取出于37℃过夜培养，统计平板上所长出的菌落数量，通过菌落计数测定大肠杆菌的存活能力。
分析结果显示，到低温处理6d时空载体的死亡率达到50％，而pET-32a-VvHSP60的细胞存活率为69％。经过低温处理8d后，对照组的存活率仅为40％，而转基因的大肠杆菌的存活率达到57％，如图6所示。由此可以看出，过量表达草菇热激蛋白VvHSP60可以显著提高大肠杆菌细胞对低温的耐受性，对大肠杆菌具有一定的保护作用。
上述实验结果进一步证明，本发明获得的完整基因开放读码框为草菇VvHSP60基因的开放读码框，其在大肠杆菌中表达的蛋白能显著增强大肠杆菌对高温和低温的耐受性。

Claims (1)

1.一种草菇热激蛋白VvHSP60在提高宿主的耐冷性中的应用，其特征在于：应用于将含有草菇热激蛋白VvHSP60基因载体转入大肠杆菌中使宿主获得对低温胁迫的耐受性；所述的草菇热激蛋白VvHSP60基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述草菇热激蛋白VvHSP60的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的草菇热激蛋白VvHSP60基因引物序列如下：
HSP60-F：5’-CGGATCCGATGCACCGTCTCTCCACCTC-3’；
HSP60-R：5’-GGAATTCCCTTGTCCTTCTCCGGCGCAT-3’；
所述载体为pET32a(+)/VvHSP60。
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CN1324243A (zh) * 1998-01-23 2001-11-28 国家犹太医疗及研究中心 使用热激蛋白治疗炎性疾病的方法
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Heat shock protein 60, mitochondrial [Leucoagaricus sp. SymC.cos];Hu,H.等;《Genbank database》;20160225;ACCESSION NO. KXN92706 *
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