CN110157634A - 一种少动鞘氨醇单胞菌及其应用 - Google Patents

一种少动鞘氨醇单胞菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucinobilis)YZ‑4及其在油脂降解中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏号为CCTCC M2018920。本发明从土壤中分离出的少动鞘氨醇单胞菌，营养需求简单，适应环境能力强，是一种新型微生物资源，能够有效降解餐厨垃圾中的特殊成分油脂，可开发为餐厨垃圾快速降解菌剂，具有广阔的应用前景。

Description

一种少动鞘氨醇单胞菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种餐厨垃圾中油脂的降解菌，特别涉及少动鞘氨醇单胞菌及其在降解油脂中的应用。
(二)背景技术
随着中国餐厨垃圾日产量增长速率快速提高，我国传统的焚烧、填埋技术已经不能解决餐厨垃圾降解效率低、占地面积大、环境污染严重等问题，造成了我国正处于“垃圾围城”的困境。由此，堆肥技术在餐厨垃圾处理上的应用已经亟不可待。但由于餐厨垃圾主要成分油脂难降解的特性，使得油脂的降解成为餐厨垃圾堆肥化应用的关键限速步骤，所以引进外来菌源特异性降解油脂的手段在餐厨垃圾的快速降解中尤为重要。
田兴平等(CN102586112A)将芽孢杆菌属与假单胞菌属作为脂肪降解菌与淀粉降解菌、纤维素降解菌、蛋白质降解菌作为菌剂降解餐厨垃圾，10天后得到垃圾降解率为78％；宋建国等(CN 103756941A)将地衣芽孢杆菌作为脂肪降解菌与其他降解菌协同作用餐厨垃圾，最后得到餐厨垃圾减量率为91％；Li，T等(Waste Manag34(12):2641-6)将芽孢杆菌与假单胞菌接入餐厨垃圾，42d堆肥完成时，垃圾降解率达85-90％；就餐厨垃圾堆肥减量来看，接种微生物能够为中国围城的餐厨垃圾的处理提供一个良好的思路，但耗时长的弊端也成为其中一个关键问题。而在堆肥过程中，外来微生物是否提高了油脂的降解率、从而克服餐厨垃圾降解过程中的限速步骤也未有具体研究。
另一方面，Joo等(Environ Pollut,156(3):891-6)引入链状假丝酵母处理餐厨垃圾与原油污染土壤混合物，经过13天的堆肥，发现石油烃类物质降解率达到84％，比未接种的对照组提高了36％；李华芝等(华东师范大学学报(自然科学版),2011(2):126-133.)将4种芽孢杆菌制成菌剂投入餐厨垃圾24h后，发现粗脂肪减少了30.7％，比未接种的对照组提高了29.3％。筛选微生物资源来降解油脂、恢复原油污染土地的工作在国内外已有报道，但将微生物投入餐厨垃圾处理中、真正应用到生活中还较少。
因此为了高效降解油脂，解除餐厨垃圾在降解过程的限制，加速餐厨垃圾的堆肥化进程，提高发酵效率，缩短发酵时间，降低处理成本，筛选能够适应不同环境、与其他菌种具有良好协同作用的菌株具有重要价值和实际意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种油脂降解菌--少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucinobilis)YZ-4及其在油脂降解中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株能够高效降解油脂的微生物——少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucinobilis)YZ-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2018920，保藏日期：2018年12月24日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
本发明少动鞘氨醇单胞菌CCTCC NO:M2018920是从腐殖土中经过一次富集，在含有唯一碳源——食用油的无机盐培养基经过七轮驯化，通过筛选培养基平板初筛，然后转接至含油培养基中复筛获得的。
本发明筛选得到的能够高效降解油脂的少动鞘氨醇单胞菌YZ-4，在LB固体平板上培养14h，菌落呈黄色，突起，表面光滑圆润，电子显微镜下，细胞形态呈杆状，无荚膜、鞭毛、芽孢。通过分子生物学鉴定，结合Biolog微生物鉴定结果，认为该菌株属于鞘氨醇单胞菌属的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucinobilis)。
本发明还提供一种少动鞘氨醇单胞菌YZ-4在降解油脂中的应用，所述的应用为：以少动鞘氨醇单胞菌YZ-4经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以油脂为底物，于无机盐培养基中，在30-65℃(优选37℃)、150r/min条件下进行降解反应，实现对油脂的降解；所述油脂为餐厨垃圾中的油脂或食用调和油。所述湿菌体加入量以无机盐培养基体积计为5-25g/L(优选15g/L)；所述油脂加入量以无机盐培养基体积计为20-100g/L(优选60g/L)。
所述无机盐培养基的组成为：硫酸铵1.5g/L、氯化钠2g/L、十二水合磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、七水合硫酸镁0.5g/L，溶剂为去离子水，pH4-9(优选pH6)。
所述催化剂按如下方法制备：将少动鞘氨醇单胞菌YZ-4接种至LB液体培养基中，37℃，200rpm培养12-14h，获得种子液；将种子液以体积浓度1％的接种量转接至装有100mLLB液体培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，150rpm培养12-14h，获得发酵液，将发酵液在4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体；LB培养基组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明从腐殖土中分离出了一株高效降解油脂的少动鞘氨醇单胞菌CCTCC NO:M2018920，其环境适应能力强，营养需求简单，可在餐厨垃圾堆肥中生存并高效降解其重要组成成分油脂。少动鞘氨醇单胞菌YZ-4耐酸性，在pH5.0-7.5条件下对油脂均有良好降解效率，最适pH为6.0；少动鞘氨醇单胞菌YZ-4耐高温，在30-65℃反应条件下均能达到50％以上油脂降解率，在50-65℃油脂降解率达到80％以上，最适温度为50℃。，对食用调和油降解率能达到80％以上，对餐厨垃圾中的粗脂肪降解率达到70％以上。
(四)附图说明
图1为菌株YZ-4菌落正面(A)和背面(B)形态图；
图2为菌株YZ-4的SEM电镜扫描图，A为放大9000倍菌株的表面结构，B为放大12000倍菌株的表面结构；
图3为菌株YZ-4的系统发育树；
图4为不同pH(A)、接种量(B)、底物浓度(C)、温度(D)条件下，菌株YZ-4对油脂的降解率变化。
图5为少动鞘氨醇单胞菌YZ-4对餐厨垃圾中粗脂肪的降解曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株YZ-4的筛选
1、培养基：
富集培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、食用调和油5g/L、6g/L吐温80，溶剂为去离子水，pH自然。115℃，灭菌30min。
驯化培养基组成：磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钠1g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。121℃灭菌20min。
油脂筛选培养基组成：硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、琼脂20g/L、食用调和油乳化液12mL/L，溶剂为去离子水，pH自然。121℃灭菌20min。其中食用调和油乳化液以食用调和油与20g/L聚乙烯醇水溶液以体积比1:3的比例用高压匀浆机乳化(压强为0.4MPa)两次所得。
无机盐培养基组成：硫酸铵1.5g/L、氯化钠2g/L、十二水合磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、七水合硫酸镁0.5g/L，溶剂为去离子水，pH自然。121℃灭菌20min。
斜面培养基/纯化培养基(YPD培养基)组成：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。115℃灭菌30min。
LB培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。121℃灭菌20min。
2、试验方法：
取样富集：从浙江工业大学的食堂附近腐殖土中采样，各称取5g土样(湿重)接种于含有50mL富集培养基的250mL三角摇瓶中，于30℃、150rpm的摇床上培养72h。
驯化：用三层纱布过滤富集的样品，取25mL菌液于含5g/L食用调和油的驯化培养基中，于37℃、150rpm的摇床上培养4d；取25mL在5g/L食用调和油的驯化培养基驯化4d后的培养液于含10g/L食用调和油的驯化培养基中，于37℃、150rpm的摇床上培养4d；以4d为一个周期，每个周期驯化完成后，取25mL培养液于驯化培养基中，每轮递加含油量5g/L，直至于含25g/L食用调和油的培养基中驯化完成。
稀释涂布：取1mL驯化后的菌液于9mL生理盐水中进行梯度稀释，分别取稀释104-107的稀释液100μL涂布于油脂筛选培养基平板上，并在28℃恒温培养箱中培养3-4d。
纯化保藏：用接种环挑取油脂筛选平板上周围出现明显透明圈的单菌落，在纯化培养基上划线纯化，直至显微镜下的细胞形态一致。挑取纯化后的单菌落于斜面培养基上，37℃培养1-2d，4℃冰箱保藏待用。
降解率测定：将斜面保藏的菌株各挑取一环接入装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm培养12-14h，获得种子液；取1mL种子液转接至装有100mL LB液体培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，200rpm培养12-14h，获得发酵液。发酵液在4℃、8000rpm离心10min，得到湿菌体。将湿菌体以10g/L的接种量接种于装有50mL含40g/L食用调和油的无机盐培养基的250mL三角摇瓶中，37℃，150rpm反应7d。反应完成后，用50mL正庚烷萃取反应液两次，收集有机溶剂-油层于已恒重的烧杯中，75℃烘箱蒸干正庚烷，直至恒重，用分析天平称量重量，计算降解率。最后获得具有较高降解率的复筛菌株YZ-4，进行斜面保藏。
实施例2：菌株YZ-4的鉴定
1、菌落形态观察：
用接种环少量挑取实施例1斜面保藏菌种，YPD平板划线，37℃培养1-2d，其菌落形态见图1。菌落呈黄色，突起，表面光滑圆润。
2、SEM扫描电镜观察：
细胞形态呈杆状，无荚膜、鞭毛、芽孢(图2)。
3、分子鉴定：
模板准备：挑取单菌落于装有20μL无菌ddH2O的EP管中，沸水煮10min，12000rpm离心1min，上清液作为DNA模板。以27F(5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCA-3')和1492R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')为正向和反向引物，PCR扩增16S rDNA序列。
PCR扩增体系为(50μL)：引物27F和1492R各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 22μL，MasterMix酶25μL。
PCR反应条件：预变性95℃5min，变性95℃40s，退火55℃30s，延伸72℃2min，35个循环，72℃10min，4℃保存。
将所得序列(SEQ ID NO.1)在NCBI网站上用BLAST检索，选出与该序列相似性较高的rDNA序列，利用MEGA7软件Align by clustalw自动分析，按1000次重复产生邻近连接树(NJ系统发育树)(图3)，结果显示菌株YZ-4与少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.SZL-1)同源性最高(homology,99％/bp,based on 16S rDNA)。
4、Biolog微生物生理生化鉴定
利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统对菌株进行了94种表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株YZ-4接种于BUG平板培养基(BIOLOGUNIVERSAL GROWTH AGAR)，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(IF-A)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至91％T/IF-A。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog GENⅢ微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h、24h、36h、48h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。
经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株YZ-4可较强利用39种碳源，对其他32种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株对11种化学物质敏感。Biolog系统给出36h鉴定结果，菌株YZ-4与Sphingomonas paucinobilis相似性为0.726。
表1.菌株YZ-4对Biolog GENⅢ板上71种碳源的利用能力
Notes:+,positive；-,negative；B,borderline
表2.菌株YZ-4对Biolog GENⅢ板上23种化学物质的化学敏感性
Notes:+,positive；-,negative；B,borderline
结合形态学鉴定、分子生物学与Biolog微生物生理生化鉴定，初步鉴定该菌株YZ-4为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucinobilis)，命名为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucinobilis)YZ-4。此菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018920，保藏日期为2018年12月24日。
实施例3：少动鞘氨醇单胞菌YZ-4在降解食用调和油中的应用
1、培养基：
同实施例1。
2、实验方法：
将斜面保藏的菌株YZ-4挑取一环于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm培养12-14h，获得种子液；将种子液1mL转接至装有100mL LB液体培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，150rpm培养12-14h，获得发酵液。将发酵液在4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体备用。
pH优化：无机盐培养基分别用HCl、NaOH调整pH(4、5、6、7、8、9)，按照10g/L的接种量接种湿菌体于含40g/L食用调和油的无机盐培养基中，37℃，150rpm反应7d，用50mL正庚烷萃取反应液两次，收集有机溶剂-油层于已恒重的烧杯中，75℃烘箱蒸干正庚烷，直至恒重，用分析天平称量重量，计算降解率。
接种量优化：按照5g/L、10g/L的、15g/L、20g/L、25g/L的接种量分别接种湿菌体于含40g/L食用调和油的无机盐培养基(pH6.0)中，37℃，150rpm反应7d，用50mL正庚烷萃取反应液两次，收集有机溶剂-油层于已恒重的烧杯中，75℃烘箱蒸干正庚烷，直至恒重，用分析天平称量重量，计算降解率。
底物浓度优化：以20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L的浓度向无机盐培养基(pH6.0)中添加食用调和油，按照15g/L接种量分别接种湿菌体于不同底物浓度无机盐培养基中，37℃，150rpm反应7d，用50mL正庚烷萃取反应液两次，收集有机溶剂-油层于已恒重的烧杯中，75℃烘箱蒸干正庚烷，直至恒重，用分析天平称量重量，计算降解率。
温度优化：按照15g/L接种量分别接种湿菌体于含60g/L食用调和油的无机盐培养基中，于30-65℃(以5℃为一个梯度)，150rpm反应7d，用50mL正庚烷萃取反应液两次，收集有机溶剂-油层于已恒重的烧杯中，75℃烘箱蒸干正庚烷，直至恒重，用分析天平称量重量，计算降解率。
其中：
A：接种前油脂含量，g；
B：反应后油脂含量，g。
各优化结果见图4。
少动鞘氨醇单胞菌YZ-4在食用调和油降解过程中最适菌体接种量为15g/L；最适底物浓度为60g/L。
我国餐厨垃圾pH在5.0-6.0之间变化，在餐厨垃圾好氧堆肥工艺中常采用堆肥温度为50-60℃。结果表明，少动鞘氨醇单胞菌YZ-4在pH5.0-7.5均有良好降解效率，其最适pH为6.0，耐酸性；且少动鞘氨醇单胞菌YZ-4在30-65℃反应条件下均能达到50％以上油脂降解率，在50-65℃油脂降解率达到80％以上，最适温度为50℃，说明少动鞘氨醇单胞菌YZ-4耐高温。
实施例4：少动鞘氨醇单胞菌YZ-4在降解餐厨垃圾中粗脂肪的应用
1、培养基：
同实施例1。
2、实验方法：
湿菌体制备：同实施例3。
餐厨垃圾预处理：收集浙江工业大学精弘食堂餐厨垃圾，使用粉碎机(FSJ-N05A6)均质粉碎。
实验组：将均质的餐厨垃圾称取200g(湿重)于500mL摇瓶中，接种1％(湿重)YZ-4湿菌体，50℃，150rpm反应。
对照组：将均质的餐厨垃圾称取200g(湿重)于500mL摇瓶中，50℃，150rpm反应。
粗脂肪含量测定方法：称量空浸提杯质量(m1g)，浸提杯中倒入50ml石油醚(沸点为30～60℃)，搭好装置(脂肪测定仪SOX406)，称取一定质量的样品(n g)，置于滤纸筒中，使滤纸筒浸于石油醚中，打开冷凝水，打开加热器，设置温度40℃，时间200min。加热完毕后，拧上旋塞，以50℃使石油醚挥发，30min后取出浸提杯，60℃烘箱20min，取出浸提杯并称量质量(m2g)。
其中粗脂肪含量(％湿重)＝(m2-m1)/n×100
分别称取对照组与实验组反应1d-7d的样品进行粗脂肪含量测定，所得结果如图5。
结果表明，未接种的餐厨垃圾自然发酵，油脂降解能力较低，不高于20％；接种少动鞘氨醇单胞菌YZ-4的餐厨垃圾在反应第7d，油脂降解率达到76％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种少动鞘氨醇单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucinobilis)
<400> 1
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Claims (7)

1.少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucinobilis)YZ-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2018920，保藏日期：2018年12月24日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
2.一种权利要求1所述少动鞘氨醇单胞菌YZ-4在降解油脂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述油脂为食用调和油或餐厨垃圾中的油脂。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以少动鞘氨醇单胞菌YZ-4经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以油脂为底物，于无机盐培养基中，在30-65℃、150r/min条件下进行降解反应，实现对油脂的降解。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述湿菌体加入量以无机盐培养基体积计为5-25g/L；所述油脂加入量以无机盐培养基体积计为20-100g/L。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述无机盐培养基的组成为：硫酸铵1.5g/L、氯化钠2g/L、十二水合磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、七水合硫酸镁0.5g/L，溶剂为去离子水，pH 4-9。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将少动鞘氨醇单胞菌YZ-4接种至LB液体培养基中，37℃，200rpm培养12-14h，获得种子液；将种子液以体积浓度1％的接种量转接至装有100mL LB液体培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，150rpm培养12-14h，获得发酵液，将发酵液在4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体；LB培养基组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
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