CN105018533B - 通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法及应用 - Google Patents

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本发明公开一种通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法及应用。该方法的步骤如下：将红曲霉菌种接种于基本发酵培养基中，进行好氧发酵，使得红曲霉菌种处于对数生长期或稳定期；接着补加碳源，该碳源在发酵培养基中的浓度为至少60g/L，继续好氧发酵；将发酵好的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性红曲黄色素。本发明通过采用高碳源直接发酵法方法，优化红曲霉菌的代谢，得到高色价以及高色调的胞外水溶性红曲黄色素，实现了天然水溶性红曲黄色素的生产。本发明可取代目前转化法生产红曲黄色素工艺，消除化学转化步骤的不良影响，得到纯天然红曲黄色素产品，不含人工改造结构成分，符合食品安全质量要求，应用前景广阔。

Description

通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法及应用
技术领域
本发明涉及红曲霉的发酵方法，特别涉及一种通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法及应用。
背景技术
红曲色素是一种天然色素，由红曲菌发酵生产，在中国、韩国和日本一直被作为天然的食用色素广泛用于饮料、酱、食用油、面包、糕点等领域，已有上千年历史。目前商品用红曲色素一般为混合色素，主要分为红、橙、黄三大类。已被证实鉴定的红曲色素有50多种，其中包含常见的六种胞内色素：2种红色素(Rubropunctamine、Monascorubramine)，2种橙色素(Rubropunctatine、Monascorubrine)和2种黄色素(Ankaflavine，Monascin)。近年来，有研究报道黄色素monascin和黄色素ankaflavin是降脂的有效成分，能显著降低血清TC、TG、低密度脂蛋白和胆固醇的水平；水溶性黄色素着色能力强，热稳定性、耐氧化剂和耐还原剂的性能好，故红曲黄色素的开发研究具有广阔的前景和重大的经济效益。
红曲霉液态发酵的红曲色素主要是胞内色素，这些色素易溶于乙醇、丙酮等极性较大的有机溶液，都是非水溶性的色素，在食品应用方面受到一定的限制。同时液态发酵面临两个瓶颈问题：一是发酵过程中菌体胞内产物的高浓度会导致产物的负反馈抑制；二是发酵结束后胞内发酵产物分离提取困难，产物纯化流程复杂，成本较高。因此，局部改变胞内色素分子结构及其发色性能，制备一系列衍生物，实现红曲色素溶解性能的改善，或者采用一种发酵技术实现胞外红曲色素的高产量输出，具有很好的应用前景及重大的市场开发价值。
现阶段，红曲红色素已实现工业化生产，但红曲黄色素仍处于开发研究阶段，并且色阶及色调值偏低。现有文献检索发现：红曲霉常规液态发酵，胞外黄色素产量一般在10AU/mL左右。Zhiqiang Hu等(Appl Microbiol Biotechnol，2012，94:81-89)中介绍，采用非离子表面活性剂进行萃取发酵红曲色素，实现了将胞内色素萃取到胞外表面活性剂胶束溶液，胞外黄色素色阶可达到50AU/mL，但其色调仅为2左右，即仍有较高含量的红色素和橙色素。采用萃取发酵使得胞外黄色素产量得到了一定的提高，但从表面活性剂中提取色素的食品安全性、回收技术成本、萃取到胞外黄色素的水溶性等方面仍需要深入的探索和研究。目前对直接发酵大量制备胞外水溶性红曲色素，并大幅度降低红曲红、橙色素的比例，得到高纯度黄色素的研究还没有相关的市场报道。
现有的发酵技术，所得的红曲色素基本上都是红曲红色素、橙色素以及黄色素的混合物。因此，亟需一种能高效获得红曲黄色素的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法。
本发明的另一目的在于提供所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，包括如下步骤：
(1)将红曲霉菌种接种于基本发酵培养基中，进行好氧发酵，使得红曲霉菌种处于对数生长期或稳定期；
(2)接着补加碳源，该碳源在发酵培养基中的浓度为至少60g/L，继续好氧发酵；
(3)将发酵好的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性红曲黄色素。
步骤(1)中所述的基本发酵培养基的组成如下：每100mL基本发酵培养基中，含葡萄糖5g、(NH4)2SO40.5g、KH2PO40.5g、KCl 0.05g、MgSO4·7H2O0.05g、FeSO4·7H2O 1.0mg、ZnSO4·7H2O 1.0mg、MnSO4·H2O 3.0mg，用蒸馏水定容至100ml，pH自然。
步骤(1)中所述的红曲霉菌种优选为红曲霉菌(Monascus anka)GIM 3.592或于2015年7月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC No.10910的红色红曲霉(Monascus ruber)WQ15。
步骤(1)中所述的红曲霉菌种在接种于基本发酵培养基时，优选为将红曲霉菌种进行活化、扩大培养后再接种入基本发酵培养基中。
所述的活化为常规的手段，如将红曲霉菌种划线于平板中进行培养。
所述的扩大培养为常规的手段，具体操作如下：从活化好的红曲霉菌种从平板上接种于种子培养基中进行培养增殖，每50mL种子培养基接种3～5个培养4～7天的单菌落、27～34℃、150～250rpm培养24～32h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液。
所述的扩大培养的步骤更优选如下：将活化好的红曲霉菌种从平板上接种于种子培养基中进行培养增殖，每50mL培养基接种3～5个培养6天的单菌落、30℃、180rpm培养28h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液。
所述的种子培养基的组成如下：每100mL种子培养基中含葡萄糖2g，酵母浸粉0.3g，鱼粉蛋白胨1.0g，KCl 0.05g，KH2PO40.4g，FeSO4·7H2O 1.0mg，用蒸馏水定容至100mL，pH自然。
步骤(1)中所述的好氧发酵的时间如下：当红曲霉菌种的接种量为体积百分比5～10％时，好氧发酵的时间为2～4天；优选为接种量为体积百分比8％时，好氧发酵的时间为3天。
步骤(1)、(2)中所述的好氧发酵的条件为：27～34℃、150～250rpm振荡培养；更优选为30℃、180rpm振荡培养。
步骤(2)中所述的碳源在发酵培养基中的浓度优选为60～300g/L。
步骤(2)中所述的碳源优选为葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一种。
步骤(2)中所述的好氧发酵时间为6～16天。
步骤(3)中所述的固液分离的方法优选为离心。
所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法在制备红曲黄色素中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过采用高碳源直接发酵法方法，优化红曲霉菌的代谢，得到高色价以及高色调的胞外水溶性红曲黄色素，实现了天然水溶性红曲黄色素的生产。本发明可取代目前转化法生产红曲黄色素工艺，消除化学转化步骤的不良影响，得到纯天然红曲黄色素产品，不含人工改造结构成分，符合食品安全质量要求，应用前景广阔。
附图说明
图1是高碳源浓度(补加300g/L)下红曲发酵与常规发酵胞外色素的波长扫描图。
图2是高碳源浓度(补加60g/L葡萄糖)下红曲发酵与常规发酵胞外色素的波长扫描图。
图3是高碳源发酵红曲菌Monascus anka GIM 3.592胞外色素特征波长色价柱形图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)种子液的制备：将划线于平板上的红色红曲霉(Monascus ruber)WQ15(保藏编号为CGMCC No.10910)种子接种于灭菌的种子培养基(葡萄糖1g，酵母浸粉0.15g，鱼粉蛋白胨0.5g，KCl 0.025g，KH2PO40.2g，FeSO4·7H2O 0.5mg，用蒸馏水定容至50mL，pH自然)中进行培养增殖，50ml种子培养基接种5个培养6天的单菌落，30℃、180rpm培养30h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液。
(2)高碳源发酵：将步骤(1)得到的种子液按8％接种量(V/V)接种到基本发酵培养液(葡萄糖1.25g，(NH4)2SO40.125g，KH2PO40.125g，MgSO4·7H2O0.0125g，KCl 0.0125g，FeSO4·7H2O 0.25mg，ZnSO4·7H2O 0.25mg，MnSO4·H2O0.75mg，用蒸馏水定容至25mL，pH自然)中，30℃、180rpm发酵培养3天；然后补加300g/L的葡萄糖(即补加了7.5g葡萄糖)，发酵培养15天，离心、抽滤得上清液(即胞外红曲色素)，检测胞外的色素浓度。
(3)常规发酵：将步骤(1)得到的种子液按8％接种量(V/V)接种到基本发酵培养液(葡萄糖1.25g，(NH4)2SO40.125g，KH2PO40.125g，MgSO4·7H2O0.0125g，KCl 0.0125g，FeSO4·7H2O 0.25mg，ZnSO4·7H2O 0.25mg，MnSO4·H2O0.75mg，用蒸馏水定容至25mL，pH自然)中，发酵培养15天，离心、抽滤得上清液(即胞外红曲色素)，检测胞外的色素浓度。
结果如图1所示，高碳源发酵胞外液用紫外分光光度计测定特征波长350、470、510nm处的吸光度分别为134.90、6.52、1.15AU/mL，得到高碳源发酵胞外红曲黄色调为117.30(AU350/AU510)，表明黄色素纯度高，胞外黄色素产量是常规发酵(10.00AU350/mL)的13.49倍。
实施例2
(1)种子液的制备：同实施例1步骤(1)。
(2)高碳源发酵：本上与实施例1步骤(2)相同，区别仅在于本实施例补加的是甘油，取代了实施例1补加的葡萄糖，甘油的补加量按每升基本发酵培养液加入300g甘油计算。
(3)常规发酵：同实施例1步骤(3)。
结果如图1所示，高碳源发酵胞外液用紫外分光光度计测定特征波长350、470、510nm处的吸光度分别为68.27、4.98、0.65AU/mL，得到发酵胞外红曲黄色调为105.03，表明黄色素纯度高，胞外黄色素产量是常规发酵(10.00AU350/mL)的6.83倍。
实施例3
(1)种子液的制备：同实施例1步骤(1)。
(2)高碳源发酵：基本上与实施例1步骤(2)相同，区别仅在于本实施例补加的是蔗糖，取代了实施例1补加的葡萄糖，蔗糖的补加量按每升基本发酵培养液加入300g蔗糖计算。
(3)常规发酵：同实施例1步骤(3)。
结果如图1所示，高碳源发酵胞外液用分光光度计测定特征波长350、470、510nm处的吸光度分别为108.15、5.29、1.04AU/mL，得到发酵胞外红曲黄色调为104.00，表明黄色素纯度高，胞外黄色素产量是常规发酵(10.00AU350/mL)的10.81倍。
实施例4
(1)种子液的制备：同实施例1步骤(1)。
(2)高碳源发酵：基本上与实施例1步骤(2)相同，区别仅在于本实施例补加60g/L葡萄糖，发酵天数为6天，取代了实施例1补加的300g/L的葡萄糖，发酵天数15天。
(3)常规发酵：基本上与实施例1步骤(3)相同，区别仅在于本实施例发酵天数为6天，取代实施例1发酵天数15天。
结果如图2所示，高碳源发酵胞外液用分光光度计测定特征波长350、470、510nm处的吸光度分别为53.80、2.90、1.04AU/mL，得到发酵胞外红曲黄色调为51.73，表明黄色素纯度高，胞外黄色素产量是常规发酵(7.95AU350/mL)的6.76倍。
实施例5
(1)种子液的制备：基本上与实施例1步骤(1)相同，区别仅在于本实施例使用的是菌株是Monascus anka GIM 3.592(已在文献“Shi K,Song D,Chen G,et al.Controllingcomposition and color characteristics of Monascus pigments by pH and nitrogensources in submerged fermentation[J].Journal of bioscience andbioengineering.2015,120(2):145-154”中公开)，取代了实施例1使用的红色红曲霉(Monascus ruber)WQ15。
(2)高碳源发酵：同实施例1步骤(2)。
(3)常规发酵：同实施例1步骤(3)。
结果如图3所示，高碳源发酵胞外液用分光光度计测定特征波长350、470、510nm处的吸光度分别为16.77、2.86、1.20AU/mL，得到发酵胞外红曲黄色调为13.98，表明黄色素纯度高，胞外黄色素产量是常规发酵(5.96AU350/mL)的2.81倍。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将红曲霉菌种接种于基本发酵培养基中，进行好氧发酵，使得红曲霉菌种处于对数生长期或稳定期；
（2）接着补加碳源，该碳源在发酵培养基中的浓度为60～300 g/L，继续好氧发酵；
（3）将发酵好的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性红曲黄色素；
步骤（1）中所述的红曲霉菌种为红曲霉菌（Monascus anka ）GIM 3.592或于2015年7月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为 CGMCC No. 10910的红色红曲霉（Monascus ruber）WQ15。
2.根据权利要求1所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的基本发酵培养基的组成如下：每100mL基本发酵培养基中，含葡萄糖5 g、（NH4）2SO4 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、KCl 0.05 g 、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeSO4·7H2O1.0mg、ZnSO4·7H2O 1.0 mg、MnSO4·H2O 3.0 mg，用蒸馏水定容至100ml，pH 自然。
3.根据权利要求1所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的红曲霉菌种在接种于基本发酵培养基时，是将红曲霉菌种进行活化、扩大培养后再接种入基本发酵培养基中。
4.根据权利要求3所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，其特征在于：
所述的扩大培养的操作如下：将活化好的红曲霉菌种从平板上接种于种子培养基中进行培养增殖，每50 mL种子培养基接种3～5个培养4-7天的单菌落、27～34℃、150～250rpm培养24～32h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液；
所述的种子培养基的组成如下：每100mL种子液中含葡萄糖 2 g，酵母浸粉0.3g，鱼粉蛋白胨1.0 g，KCl 0.05 g，KH2PO4 0.4 g ，FeSO4·7H2O 1.0 mg，用蒸馏水定容至 100 mL，pH自然。
5.根据权利要求1所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的好氧发酵的时间如下：当红曲霉菌种的接种量为体积百分比5～10%时，好氧发酵的时间为2～4天。
6.根据权利要求1所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，其特征在于：步骤（1）、（2）中所述的好氧发酵的条件为：27～34℃、150～250rpm振荡培养；
步骤（2）中所述的好氧发酵时间为6～16天。
7.根据权利要求1所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一种。
8.权利要求1～7任一项所述通过高碳源发酵获得胞外水溶性红曲黄色素的方法在制备红曲黄色素中的应用。
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