CN112280806A - 一种通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法及其应用。本发明通过将酵母细胞接入发酵培养基中乳化培养：乳化发酵培养第3～6天每天添加橄榄油，得到乳化状菌液混合物；固液分离，得到的液体进行破乳分离，得到类神经酰胺提取物A和乳状水相；将乳状水相进行萃取分离，得到类神经酰胺提取物B；将得到的类神经酰胺提取物A和B合并，干燥，得到类神经酰胺提取物。该乳化发酵法能分泌大量类神经酰胺类物质Mels到发酵液中，故不需要任何衍生化过程，操作简单，提取分离方便、见效快且不受地区气候限制；最重要的是生产的类神经酰胺提取物安全性高，生产成本低、可大规模工业化生产、并可替代高成本的神经酰胺在化妆品等领域中应用。

Description

一种通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一种通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法及其应用。
背景技术
神经酰胺(Ceramide)，即N-脂酰神经鞘氨醇，是由神经鞘氨醇(Sphingosine)和长链脂肪酸缩合而成的一类酰胺类化合物，神经酰胺是一类化合物而不是一种化合物，主要存在于角质层的细胞膜和细胞间基质中。神经酰胺最早是从动物的神经鞘中分离得到，由此而得名。一八八四年德国医生Thudichunm发现在人脑中存在神经鞘脂质，近年来从许多植物中亦发现了神经酰胺。神经酰胺类化合物根据侧链基团、不饱和度以及羟基数目的不同分为神经鞘氨醇类、神经酰胺类、糖鞘脂类和鞘磷脂类，其中以神经酰胺类、糖鞘脂类为主。四类神经酰胺类化合物的组成分别是：⑴神经鞘氨醇类(亦称鞘氨醇类或神经醇类，Sphingoid)是最简单的鞘脂类化合物，也是其他鞘脂类化合物的基本部分(长链碱基部分)，它是鞘脂类化合物的特征性结构；⑵神经酰胺类(神经酰胺Ceramide)，即N-脂酰基鞘氨醇(N-Acyl sphingosine)，是由一分子鞘氨醇类与一分子脂肪酸类通过酰胺键结合的化合物：其中鞘氨醇部分、脂肪酸部分的碳链长度、不饱和度和羟基数目都不是固定的，目前发现的神经酰胺类按其饱和度和羟基数的不同至少有7种以上；⑶糖鞘脂类是指神经酰胺的1-位羟基与糖基(D-半乳糖或D-葡萄糖)以β-糖苷键结合形成的一类鞘脂类化合物，目前在植物魔芋中已鉴定出5个同分异构体的糖鞘脂类神经酰胺；⑷鞘磷脂类是指神经酰胺的1-位羟基与磷酸胆碱(或磷酸)以酯键结合而成的一类鞘脂类化合物。神经酰胺的结构特点是除酰胺结构外，还含有亲脂性的二条长链烷基和亲水性的二个羟基基团。神经酰胺主要具有以下作用与应用：在日化美容行业，神经酰胺用于加强抗衰老功能，令肌肤保持弹性，光滑细致，减少面部皱纹形成；具有屏障、保湿、持水等作用；在医学方面，神经酰胺在多种细胞因子、维生素D3、Fas及CD28配体等诱导生物效应中起重要信使作用，其介导细胞凋亡作用日益受到关注，具有抗肿瘤、免疫促进等生理活性，有着广泛的使用价值。目前，神经酰胺主要是通过动植物分离得到，存在产量很低、生产成本极高、应用上受到限制等问题。
甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸酯类(Mannosylerythritol lipids，Mels)是一类糖脂类生物表面活性剂成分，可作为高级生物表面活性剂。Mels具有与神经酰胺相似的空间结构，含有与神经酰胺相似的亲脂性的二条长链烷基和亲水性的二个或以上羟基基团。此外，Mels易于渗入皮肤角质层的细胞间隙，形成液体结晶，维持皮肤水分，起到保湿、润肤及皮肤屏障修复功效，具有与神经酰胺相似的部分功效。
但是，目前类神经酰胺的制备方法存在产量不高、难以大规模工业化生产等问题。因此，仍需对类神经酰胺MELs的制备方法进一步研究，以克服上述问题。
发明内容
本发明发明人在用优选的酵母菌种进行乳化发酵法培养时，研究发现在用发酵培养基培养得到的发酵液中检测出大量甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸酯类成分的存在，经粗提取和柱层析分离纯化后对其进行了1HNMR、13CNMR、MS分析鉴定，我们主要得到了Mel-A：甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯、Mel-B:甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯、Mel-C:甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯三种Mels成分，经过高效液相色谱测定，乳化发酵后的分离提取物中三种Mels成分含量在45％以上；三种Mels成分均含有与神经酰胺相似的空间结构，含有与神经酰胺相似的亲脂性的二条长链烷基和亲水性的二个或以上羟基基团。此外，我们还研究发现Mels易于渗入皮肤角质层的细胞间隙，形成液体结晶，维持皮肤水分，起到保湿、润肤及皮肤屏障修复功效，具有与神经酰胺相似的部分功效。根据这一创造性的研究成果，我们开发出了本发明的工艺方法。该方法解决了现有生物法制备类神经酰胺Mels工艺不成熟、原料成本高、产物产量低的问题；更重要的是解决了在化妆品领域用Mels替代高成本的神经酰胺，提高化妆品等产品效果的问题。该方法产量高、工艺简单、经济成本低、安全性高。
从而，本发明的首要目的在于提供一种通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法。
本发明的另一目的在于提供通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法的应用。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，包括如下步骤：
(1)将酵母细胞接入发酵培养基中乳化发酵培养：乳化发酵培养第3～6天每天添加橄榄油，得到乳化状菌液混合物；
(2)将步骤(1)得到的乳化状菌液混合物进行固液分离，将得到的液体进行破乳分离，得到类神经酰胺提取物和乳状水相；
(3)将步骤(2)得到的乳状水相进行萃取分离，得到类神经酰胺提取物；
(4)将步骤(2)和步骤(3)得到的类神经酰胺提取物合并，干燥，得到类神经酰胺提取物。
所述的酵母为假丝酵母(Candida antarctic)WHS112或蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis)DSMZ70725；
所述的发酵培养基中含有橄榄油。
步骤(1)中所述的酵母细胞优选通过如下步骤制备得到：将保存的酵母细胞活化，放大培养，得到二级种子培养液。
所述的活化的步骤优选如下：将保存的酵母细胞接种于种子培养基中，在26～30℃、180～220rpm的条件下培养至对数生长期或平台期，得到含活化的酵母细胞培养液。
所述的接种的接种量优选为相当于种子培养基体积的10％。
所述的培养的时间优选为46～50h；更优选为48h。
所述的条件优选为28℃、200～210rpm。
所述的含活化的酵母细胞的培养液中湿菌重为50～70g/L。
所述的扩大培养的步骤优选为：将活化的酵母细胞接种于种子培养基中，在26～30℃、180～220rpm的条件下培养至对数生长期或平台期，得到二级种子培养液。
所述的接种的接种量优选为相当于种子培养基体积的10％。
所述的培养的时间优选为46～50h；更优选为48h。
所述的条件优选为28℃、200～210rpm。
所述的二级种子培养液中湿菌重为50～70g/L。
上述活化和扩大培养步骤中所述的种子培养基的组成成分按质量百分比计，如下：蛋白胨0.2～0.8％，葡萄糖0.5～1.5％，酵母提取物0.1～0.5％，麦芽提取物0.1～0.5％，余量为蒸馏水；优选的组成成分按质量百分比计，如下：蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，酵母提取物0.3％，麦芽提取物0.3％，余量为蒸馏水。
步骤(1)中所述发酵培养基的组成成分按质量百分比计，如下：橄榄油5～15％，硝酸钠0.1～0.5％，硫酸镁0.01～0.05％，磷酸二氢钾0.01～0.05％，酵母提取物0.05～0.15％，余量为蒸馏水；优选的组成成分按质量百分比计，如下：橄榄油10.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，酵母提取物0.1％，余量为蒸馏水。
步骤(1)中所述的乳化发酵的时间优选为8天。
步骤(1)中所述的乳化发酵的条件优选如下：发酵培养基体积相当于发酵罐体积的40～60％，酵母细胞的接种量为发酵培养基体积的5～10％，温度为28～30℃，溶氧量为30％以上。
所述的溶氧量是通过将空气流速控制1.5～2vvm或者搅拌速度控制100～180rpm维持。
步骤(1)中所述的第3～6天每天添加橄榄油的添加量如下：第3天按29～31g/L发酵液体积计算、第4天按59～61g/L发酵液体积计算、第5天按89～91g发酵液体积计算、第6天按58～60g/L发酵液体积计算；优选地，：第3天按30g/L发酵液体积计算、第4天按60g/L发酵液体积计算、第5天按90g发酵液体积计算、第6天按60g/L发酵液体积计算。其中，第3天的发酵液的体积为发酵培养基和接种的酵母细胞体积总和，第4-6天的发酵液的体积为发酵培养基、接种的酵母细胞体积和添加入橄榄油体积总和。
步骤(1)中所述的乳化状菌液混合物中湿菌重为80～100g/L。
步骤(2)中所述的固液分离的方式为离心或过滤；优选为离心；更优选为通过沉降式离心机进行离心。。
所述的离心的转速优选为5000～12000r/min；更优选为9000～10000r/min。
所述的破乳的方法优选为离心；更优选通过管式双水相离心机进行离心。
所述的离心的转速优选为10000～20000r/min；更优选为15000～16000r/min。
步骤(3)中所述的萃取分离的具体步骤优选如下：将乳状水相和有机溶剂混合，进行萃取，静置分层后取有机相，回收有机溶剂。
所述的有机溶剂的用量优选为按相当于所述乳状水相的体积的40～60％计。
所述的有机溶剂优选为乙酸乙酯、石油醚、正已烷和环已烷中的至少一种。
步骤(4)中所述的类神经酰胺提取物含有三种或超过三种与神经酰胺相似的亲水结构和亲脂结构的成分：Mel-A:甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯、Mel-B:甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯、Mel-C:甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯。
所述通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法在工业化制备类神经酰胺中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明利用橄榄油为唯一碳源，首次采用乳化发酵法制备类神经酰胺Mels，并在化妆品领域用Mels的提取物替代高成本的神经酰胺，大大降低神经酰胺类化妆品产品的生产成本。
2、本发明乳化发酵后的分离提取物中的三种Mels成分均含有与神经酰胺相似的空间结构：含有与神经酰胺相似的亲脂性的二条长链烷基和亲水性的二个或以上羟基基团，研究发现Mels易于渗入皮肤角质层的细胞间隙，形成液体结晶，维持皮肤水分，起到保湿、润肤及皮肤屏障修复功效，具有与神经酰胺相似的部分功效。
3、本发明生产工艺的代谢产物中没有发现毒素的存在，Mels不需单个成分提纯，可将粗分的Mels提取物直接应用于化妆品中，保证了产品的安全性。
4、由于本发明优选的酵母菌能分泌大量类神经酰胺类物质Mels到发酵液中，三种Mels成分含量在45％以上，故不需要任何衍生化过程，操作简单，提取方便。
5、本发明提供生产工艺的微生物发酵周期短、见效快且不受地区气候限制。
6、利用本发明工艺生产类神经酰胺类物质Mels，将大大降低经济成本，推动类神经酰胺Mels大规模工业化生产。
附图说明
图1是Mels的结构NMR解析图；图中，A为Mel-A的结构NMR解析图，B为Mel-B的结构NMR解析图，C为Mel-C的结构NMR解析图；A～C中，左图的横坐标为15到-2ppm、间距为1，中间图的横坐标为220到-10，间距为10。
图2是Mels的结构MS表征图；图中，A为Mel-A的结构MS表征图，B为Mel-B的结构MS表征图，C为Mel-C的结构MS表征图。
图3是Mels的化学结构图；图中，A为Mel-A的化学结构图，B为Mel-B的化学结构图，C为Mel-C的化学结构图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中涉及的种子培养基由如下按质量百分比计的原料制备得到：蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，酵母提取物0.3％，麦芽提取物0.3％，余量为蒸馏水；
发酵培养基由如下按质量百分比计的原料制备得到：橄榄油10.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.03％，酵母提取物0.1％，余量为蒸馏水。
实施例1乳化发酵制备类神经酰胺Mels之一
⑴菌种活化：将-80℃冰箱中保存的优选酵母菌种假丝酵母(Candida antarctic)WHS112取出，量取1.00mL菌种加入含10.00mL种子培养基的100.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内、200rpm震荡培养48h，得活化的一级种子培养菌悬液，含湿菌重约62g/L。
⑵种子扩增：将上述所得活化的一级种子培养菌悬液10.00mL接种于含100.00mL种子培养基的500.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内、210rpm震荡培养48h，得二级种子培养菌悬液，含湿菌重65g/L。
⑶乳化发酵：向清洁消毒好的100L发酵罐内加入50L发酵培养基，并向发酵培养基中接入4L二级种子培养菌悬液，进行乳化发酵培养，维持培养温度28～30℃，pH不控制，空气流速1.5～2vvm或搅拌速度为150rpm(维持溶氧30％以上)。
⑷乳化发酵培养：在乳化发酵培养的第3～6天分别向发酵罐内添加1620g、3337g、5306g、3840g橄榄油。
⑸发酵放罐：乳化发酵培养8天后，得乳化状发酵培养菌悬液约70L，此时乳化状菌悬液中湿菌重为92g/L，发酵液约占罐总体积70％，将所得乳化状发酵培养菌悬液从罐内放出。
⑹菌液分离：将所得乳化状发酵培养菌悬液于沉降式离心机中进行菌液分离，离心分离条件为9000r/min，得到除去菌体的发酵液体56L。
⑺破乳分离：将上述所得除去菌体的发酵液体移入管式双水相离心机中，以15000r/min高速离心，进行破乳及油水初步分离，分取油相，即得类神经酰胺Mels提取物Ⅰ约9.3kg；分出的乳状水相约46L
⑻萃取分离：将步骤⑺中分出的乳状水相置于100L萃取罐中，加入20L 60～90℃的石油醚，继续破乳、振摇萃取并静置分层，分取石油醚层；石油醚层减压回收石油醚；余下的油状物即得类神经酰胺Mels提取物Ⅱ约3.2kg。
⑼合并干燥：将步骤⑺中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅰ与步骤⑻中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅱ合并，并进行脱水干燥，得类神经酰胺Mels提取物11.6kg。
实施例2乳化发酵制备类神经酰胺Mels之二
⑴菌种活化：将-80℃冰箱中保存的优选酵母菌种蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis)DSMZ70725取出，量取1.00mL菌种加入含10.00mL种子培养基的100.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，200rpm震荡培养48h，得活化的一级种子培养菌悬液，含湿菌重约65g/L。
⑵种子扩增：将上述所得活化的一级种子培养菌悬液10.00mL接种于含100.00mL种子培养基的500.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，210rpm震荡培养48h，得二级种子培养菌悬液，含湿菌重66g/L。
⑶乳化发酵：向清洁消毒好的100L发酵罐内加入50L发酵培养基，并向发酵培养基中接入4L二级种子培养菌悬液，进行乳化发酵培养，维持培养温度28～30℃，pH不控制，空气流速1.5～2vvm或搅拌速度为150rpm(维持溶氧30％以上)。
⑷乳化发酵培养：在乳化发酵培养的第3～6天分别向发酵罐内添加1620g、3337g、5306g、3840g橄榄油。
⑸发酵放罐：乳化发酵培养8天后，得乳化状发酵培养菌悬液约75L，此时乳化状菌悬液中湿菌重为95g/L，发酵液约占罐总体积70％，将所得乳化状发酵培养菌悬液从罐内放出。
⑹菌液分离：将上述所得乳化状发酵培养菌悬液于沉降式离心机中进行菌液分离，离心分离条件为9500r/min，得除去菌体的发酵液体59L。
⑺破乳分离：将上述所得除去菌体的发酵液体移入管式双水相离心机中，以16000r/min高速离心，进行破乳及油水初步分离，分取油相，即得类神经酰胺Mels提取物Ⅰ约10.8kg；分出的乳状水相约47L。
⑻萃取分离：将步骤⑺中分出的乳状水相置于100L萃取罐中，加入25L 60～90℃的石油醚，继续破乳、振摇萃取并静置分层，分取石油醚层；石油醚层减压回收石油醚；余下的油状物即得类神经酰胺Mels提取物Ⅱ约3.6kg。
⑼合并干燥：将步骤⑺中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅰ与步骤⑻中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅱ合并，并进行脱水干燥，得类神经酰胺Mels提取物13.2kg。
实施例3乳化发酵制备类神经酰胺Mels之三
⑴菌种活化：将-80℃冰箱中保存的优选酵母菌种假丝酵母(Candida antarctic)WHS112取出，量取1.00mL菌种加入含10.00mL种子培养基的100.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，200rpm震荡培养48h，得活化的一级种子培养菌悬液，含湿菌重约63g/L。
⑵种子扩增：将上述所得活化的一级种子培养菌悬液10.00mL接种于含100.00mL种子培养基的500.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，200rpm震荡培养48h，得二级种子培养菌悬液，含湿菌重64g/L。
⑶乳化发酵：向清洁消毒好的200L发酵罐内加入100L的发酵培养基，并向发酵培养基中接入8L二级种子培养菌悬液，进行乳化发酵培养，维持培养温度28～30℃，pH不控制，空气流速1.5～2vvm或搅拌速度为170rpm(维持溶氧30％以上)。
⑷乳化发酵培养：在乳化发酵培养的第3～6天分别向发酵罐内添加3240g、6675g、10612g、7680g橄榄油。
⑸发酵放罐：乳化发酵培养8天后，得乳化状发酵培养菌悬液约142L，此时乳化状菌悬液中湿菌重为91g/L，发酵液约占罐总体积71％，将所得乳化状发酵培养菌悬液从罐内放出。
⑹菌液分离：将上述所得乳化状发酵培养菌悬液于沉降式离心机中进行菌液分离，离心分离条件为10000r/min，得除去菌体的发酵液体113L。
⑺破乳分离：将上述所得除去菌体的发酵液体移入管式双水相离心机中，以16000r/min高速离心，进行破乳及油水粗步分离，分取油相，即得类神经酰胺Mels提取物Ⅰ约18.2kg；分出的乳状水相约93L
⑻萃取分离：将步骤⑺中分出的乳状水相置于200L萃取罐中，加入40L乙酸乙酯，继续破乳、振摇萃取并静置分层，分取乙酸乙酯层；石油醚乙酸乙酯层减压回收乙酸乙酯；余下的油状物即得类神经酰胺Mels提取物Ⅱ约6.1kg。
⑼合并干燥：将步骤⑺中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅰ与步骤⑻中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅱ合并，并进行脱水干燥，得类神经酰胺Mels提取物22.5kg。
实施例4类神经酰胺Mels成分的分离、纯化、鉴定及定量
(1)Mels成分的分离
所得到的类神经酰胺Mels提取物，采用硅胶柱层析法进行分离纯化：将5×70cm的玻璃层析柱洗净烘干，并用氯仿润湿。用氯仿浸泡200目硅胶，除去杂质，湿法装柱，用氯仿平衡。Mels提取物粗样品溶于氯仿，缓慢上样，样品先用氯仿洗脱，再用氯仿和甲醇按照体积比例进行梯度洗脱，即氯仿：甲醇＝10:1、10:2、10:3、10:4、和10:5逐步洗脱，控制洗脱速率为2.0mL/min。每管收集30mL。分离后的各组分，用TLC鉴定，并将相同组份合并，得到三个较纯样品合并流份。
(2)Mels成分的纯化
将收集得到的三个较纯样品合并流份，分别低温挥发浓缩，浓缩液于1～5℃冰箱中放置析晶，即得到三个类神经酰胺Mels成分A、B、C，纯度分别为98.89％、99.12％、98.36％。
(3)结构鉴定
首先利用薄层色谱(TLC)检测，对发酵后类神经酰胺Mels提取物进行初步快速检测；进一步利用上述柱层析法分离得到了A、B、C三个Mels成分：Mel-A、Mel-B和Mel-C，并利用核磁共振(NMR)和质谱(MS)手段表征了三者的结构。
①NMR结构解析：利用NMR(1HNMR、13CNMR)方法将分离的Mels进行结构的表征，结果如图1所示(其中A为：Mel-A的结构NMR解析，B为：Mel-B的结构NMR解析，C为：Mel-C的结构NMR解析)；
②MS表征：利用高分辨质谱-HRESI(Q-TOF)进一步对发酵产物中Mels进行结构的表征，结果如图2所示(其中A为：Mel-A的结构MS表征；B为：Mel-B的结构MS表征；C为：Mel-C的结构MS表征)。由图2可知：Mel-A分子量为676.4034，并且，我们得到的Mel-A的分子式为C34H60O13；Mel-B分子量为634.3938，并且，我们得到的Mel-B的分子式为C32H58O12；Mel-C分子量为634.3938，并且，我们得到的Mel-C的分子式为C32H58O12，Mel-B与Mel-C互为同分异构体；
③结构鉴定：通过上述NMR结构解析、MS表征并结合其它化学方法确定，本发明的类神经酰胺Mels提取物中主含的三个成分是：MEL-A为甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯，Mel-B为甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯，Mel-C为甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯；结果如图3所示。
(4)类神经酰胺Mels各成分定量
①将实施例1中得到的类神经酰胺Mels提取物通过高效液相色谱法进行含量测定，测得Mel-A(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯)含量为12.95％，测得Mel-B(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯)含量为17.14％，测得Mel-C(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯)含量为21.45％；三种Mels成分的总含量为51.54％。
②将实施例2中得到的类神经酰胺Mels提取物通过高效液相色谱法进行含量测定，测得Mel-A(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯)含量为23.85％，测得Mel-B(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯)含量为20.98％，测得Mel-C(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯)含量为23.35％；三种Mels成分的总含量为68.08％。
③将实施例3中得到的类神经酰胺Mels提取物通过高效液相色谱法进行含量测定，测得Mel-A(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯)含量为16.84％，测得Mel-B(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯)含量为18.37％，测得Mel-C(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯)含量为21.76％；三种Mels成分的总含量为56.97％。
对比例1
基本按实施例2制备，与实施例2的区别仅在于：步骤⑷乳化发酵培养中，橄榄油的添加为一次性添加，添加的量与实施例2添加的总量相同。乳化发酵培养8天后，得的乳化状菌悬液中湿菌重为70g/L；得到的类神经酰胺Mels提取物8.9kg，远远低于实施例2的效果(湿菌重为95g/L，得到的类神经酰胺Mels提取物13.2kg)。
对比例2
基本按实施例2制备，与实施例2的区别仅在于：步骤⑷乳化发酵培养中，橄榄油的添加为在乳化发酵培养的第3和第5天分别向发酵罐内添加，添加的量分别为5000g和9100g。乳化发酵培养8天后，得的乳化状菌悬液中湿菌重为85g/L；得到的类神经酰胺Mels提取物10.3kg。
对比例3
基本按实施例2制备，与实施例2的区别仅在于：步骤⑷乳化发酵培养中，橄榄油的添加为在乳化发酵培养的第3～6天分别向发酵罐内添加，添加的量分别为3530g。乳化发酵培养8天后，得的乳化状菌悬液中湿菌重为88g/L；得到的类神经酰胺Mels提取物10.7kg。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将酵母细胞接入发酵培养基中乳化发酵培养：乳化发酵培养第3～6天每天添加橄榄油，得到乳化状菌液混合物；
(2)将步骤(1)得到的乳化状菌液混合物进行固液分离，将得到的液体进行破乳分离，得到类神经酰胺提取物和乳状水相；
(3)将步骤(2)得到的乳状水相进行萃取分离，得到类神经酰胺提取物；
(4)将步骤(2)和步骤(3)得到的类神经酰胺提取物合并，干燥，得到类神经酰胺提取物；
所述的酵母为假丝酵母(Candida antarctic)WHS112或蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis)DSMZ70725；
所述的发酵培养基中含有橄榄油。
2.根据权利要求1所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的第3～6天每天添加橄榄油的添加量如下：第3天按29～31g/L发酵液体积计算、第4天按59～61g/L发酵液体积计算、第5天按89～91g发酵液体积计算、第6天按58～60g/L发酵液体积计算；其中，第3天的发酵液的体积为发酵培养基和接种的酵母细胞体积总和，第4-6天的发酵液的体积为发酵培养基、接种的酵母细胞体积和添加入橄榄油体积总和。
3.根据权利要求1所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述发酵培养基的组成成分按质量百分比计，如下：橄榄油5～15％，硝酸钠0.1～0.5％，硫酸镁0.01～0.05％，磷酸二氢钾0.01～0.05％，酵母提取物0.05～0.15％，余量为蒸馏水；进一步如下：橄榄油10.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，酵母提取物0.1％，余量为蒸馏水。
4.根据权利要求3所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的酵母细胞通过如下步骤制备得到：将保存的酵母细胞活化，放大培养，得到二级种子培养液；
步骤(1)中所述的乳化发酵的条件如下：发酵培养基体积相当于发酵罐体积的40～60％，酵母细胞的接种量为发酵培养基体积的5～10％，温度为28～30℃，溶氧量为30％以上；
步骤(1)中所述的乳化发酵的时间为8天。
5.根据权利要求4所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
所述的活化的步骤如下：将保存的酵母细胞接种于种子培养基中，在26～30℃、180～220rpm的条件下培养至对数生长期或平台期，得到含活化的酵母细胞培养液；
所述的扩大培养的步骤为：将活化酵母细胞接种于种子培养基中，在26～30℃、180～220rpm的条件下培养至对数生长期或平台期，得到二级种子培养液；
所述的活化和所述的扩大培养中所用到的种子培养基的组成成分按质量百分比计，如下：蛋白胨0.2～0.8％，葡萄糖0.5～1.5％，酵母提取物0.1～0.5％，麦芽提取物0.1～0.5％，余量为蒸馏水；
所述的溶氧量是通过将空气流速控制1.5～2vvm或者搅拌速度控制100～180rpm维持。
6.根据权利要求1所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的固液分离的方式为离心或过滤；
步骤(2)中所述的破乳的方法为离心；
步骤(3)中所述的萃取分离的具体步骤如下：将乳状水相和有机溶剂混合，进行萃取，静置分层后取有机相，回收有机溶剂。
7.根据权利要求6所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
所述的固液分离的方式为离心时，离心的转速为5000～12000r/min；
所述的破乳的方法为离心时，离心的转速为10000～20000r/min。
8.根据权利要求6所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
所述的有机溶剂的用量按相当于所述乳状水相的体积的40～60％计；
所述的有机溶剂为乙酸乙酯、石油醚、正已烷和环已烷中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的类神经酰胺提取物含有三种或超过三种与神经酰胺相似的亲水结构和亲脂结构的成分；进一步为甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸酯类；进一步为甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯、甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯和甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯。
10.权利要求1～9任一项所述的通过乳化发酵制备类神经酰胺的方法在工业化制备类神经酰胺中的应用。
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