CN112574932B - 一株Pseudozyma属产油菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物菌种领域，涉及一株产油菌，特别是指一株Pseudozyma属产油菌株及其应用。所述菌株已于2020年11月2日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.20993。本申请筛选到的一株产油菌株，其最适培养基组成浓度为葡萄糖69.2g/L、蛋白胨1.8g/L、酵母膏10g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，pH5.5；最适发酵条件为28℃、160r/min条件下，以15%的接种量进行接种，发酵120h，在此条件下所得发酵结果较为理想，较优化前油脂产量提高了155.1%。且从实验结果可以看出，接种量与摇床转速对产油菌PMD‑A的生长和胞内油脂积累影响较大。

Description

一株Pseudozyma属产油菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物菌种领域，涉及一株产油菌，特别是指一株Pseudozyma属产油菌株及其应用。
背景技术
产油微生物是指那些胞内油脂占其生物总量20%以上的菌株，由其发酵所得的微生物油脂又被称为单细胞油脂（SCO），其组成与植物油类似，主要为中性脂、游离脂肪酸、磷脂及不皂化物，因其特殊功能而具有潜在的工业开发价值。目前，利用发酵法生产微生物油脂作为制备生物柴油的油料资源受到越来越多的关注。迄今为止，对产油微生物研究仍以酵母菌和霉菌为主。其中，中科院赵宗保所带领的科研团队对油脂酵母、圆红冬孢酵母、发酵性丝孢酵母等10多种产油酵母在产油机理、菌种选育、培养条件优化、生物质转化利用等方面进行了深入研究；国外油脂研究中心对卷枝毛霉和高山被孢霉利用碳源合成油脂的作用机制进行研究。国内福建师范大学微生物工程研究所、南开大学等研究单位对深黄被孢霉在菌株诱变、发酵条件优化、中试生产等方面进行研究，使变异株不论在菌体油脂含量还是油脂产量上均有很大程度的提高。而由本实验室筛选并鉴定的Pseudozyma属产油菌株，利用其进行发酵产油脂的研究还未见报道。因此，可把Pseudozyma属产油菌株发酵产油脂作为一种新的微生物油脂资源，其研究具有深远的意义。
发明内容
本发明提出一株Pseudozyma属产油菌株及其应用，并进一步探讨了碳源浓度、氮源种类及浓度对Pseudozyma属产油菌株脂肪酸组成含量的影响。
本发明的技术方案是这样实现的：
一株Pseudozyma属产油菌株，所述菌株已于2020年11月2日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.20993，分类名为Pseudozymaaphidis，保藏地址：中国北京。
上述的Pseudozyma属产油菌株的培养方法，其特征在于：将Pseudozyma属菌株菌液按照10-20%的接种量，接种到培养基中培养，培养条件为pH5-7，于28℃、140r/min培养，发酵120h。
所述培养基中的原料浓度为：葡萄糖40-80g/L、氮源0.4g/L、酵母膏10g/L、磷酸二氢钾2.0-3.0g/L，pH5-7，其中氮源为硫酸铵、尿素或蛋白胨。
上述的Pseudozyma属菌株在作为工程菌发酵高产油脂中的应用，其油脂脂肪酸组成类似植物油，可以作为生产生物柴油的原料油，当油脂饱和脂肪酸含量高时，制备生物柴油时可获得高的生物柴油十六烷值和较高的氧化安定性以及能降低NOX的排放；而油脂不饱和脂肪酸含量高时，可获得较高的低温流动性。因此，可以通过优化培养基的组成，改变其碳氮源的组成、浓度来改变菌体油脂的组成含量，为进一步生产出符合国标的生物柴油提供优质的原料油脂。
所述发酵条件为：在25-31℃、140-160r/min条件下，以10-20%种子液浓度的接种量进行接种，接种到发酵培养基中进行发酵，发酵时间为120h。
所述发酵培养基中的原料浓度为：葡萄糖69.2g/L、氮源1.8g/L、酵母膏10g/L、磷酸二氢钾3.0g/L，pH5.5，其中氮源为蛋白胨。
所述工程菌通过调节发酵培养基中葡萄糖或氮源的浓度实现调整发酵产油脂的类型和含量的目的。
本申请菌株的微生物学特征：细胞呈柱形两头略尖，经苏丹黑B染色后能看见清晰的脂肪粒。细胞大小为5-21.5×1.5-2μm，菌落为白色，表面干燥，不光滑，有皱褶凸起；
生理生化特征：碳源同化试验证明其能利用蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖，对蔗糖、葡萄糖、木糖利用情况相对更好。氮源同化试验证明其能利用蛋白胨、硫酸铵、尿素、硝酸钠，对硝酸钠利用情况稍差。
本发明具有以下有益效果：本申请筛选得到的一株产油菌PMD-A经测序分析为Pseudozyma属产油菌株，其最适培养基组成浓度为葡萄糖69.2g/L、蛋白胨1.8g/L、酵母膏10g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，pH5.5；最适发酵条件为28℃、160r/min条件下，以15%的接种量进行接种，发酵120h，在此条件下所得发酵结果较为理想，较优化前油脂产量提高了155.1%。且从实验结果可以看出，接种量与摇床转速对产油菌PMD-A的生长和胞内油脂积累影响较大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请菌落及苏丹黑染色显微镜照片。
图2为产油菌PMD-A的生长曲线。
图3为不同葡萄糖浓度下的产油结果。
图4为不同蛋白胨浓度下的发酵结果。
图5为发酵培养基不同初始pH下的产油结果。
图6为响应面曲面图。
图7为不同接种量下的发酵结果。
图8为不同发酵时间下的产油结果。
图9为不同发酵温度下的产油结果。
图10为不同摇床转速下的发酵结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料：产油菌株PMD-A，商丘师范学院生物与食品学院实验室从山楂树下土壤中筛选，其菌落及染色照片如图1所示，并于2020年11月2日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.20993，分类名为Pseudozyma aphidis。在YEPD固体斜面培养基上，于28 ℃活化培养72 h。
培养基：
固体斜面培养基：葡萄糖20g/L, 蛋白胨20g/L, 琼脂粉20g/L, 酵母膏10g/L, pH自然, 115℃湿热灭菌30min。
液体种子培养基：葡萄糖20g/L, 酵母膏10g/L, (NH4)2SO4 3g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L, pH自然, 115℃湿热灭菌20min。
初始发酵培养基：葡萄糖40g/L, 酵母膏10g/L, (NH4)2SO4 2g/L, KH2PO4 2g/L,pH 6.0，115℃湿热灭菌20min。
实施例
本申请产油菌株PMD-A的种子液的制备方法为：在液体种子培养基中接种两环活化菌体，于28 ℃、140 r/min摇床培养6 h~30 h。
发酵方法为：接种10%液体种子液，于28 ℃、140 r/min摇床培养120 h。
本申请采用的分析方法为：
1、菌体生物量测定：菌体干重法。
2、残糖测定：3、5—二硝基水杨酸法。
3、油脂含量测定：酸热法结合有机溶剂提取法
油脂百分含量(%)=
Figure 908535DEST_PATH_IMAGE001
G—总重减烧杯的重量，即油脂质量(g)
2—体积加倍
W—样品质量(g)
油脂系数：l00g葡萄糖转化为油脂的质量。
3、油脂脂肪酸分析
油脂样品中加入过量的0.5M氢氧化钾/甲醇溶液，65℃回流50min，冷却后加入四倍量的13％三氟化硼－甲醇溶液[三氟化硼乙醚溶液：无水甲醇= 4:10(W/W)回流加热5min，冷却后加入少量石油醚（沸程30～60℃），再加入适量的双蒸水，使脂肪酸甲酯被萃取进入石油醚层，石油醚层经洗涤后作为气相色谱的进样样品。
以商品化的长链脂肪酸甲酯为标样，气相色谱数据处理采用归一法。
仪器：GC9790气相色谱仪（浙江温岭福立分析仪器有限公司），江申色谱工作站（大连江申分离公司）。色谱柱：FFAP 石英毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25μm)；柱温：120 ℃维持2min后以15℃/min升至150℃，再以5℃/min升至200℃维持5min；鉴定器：FID，温度250℃，H2 30 ml/min，空气 300 ml/min；进样器温度：250℃；载气：N2 12cm/s，进样量：0.5μl。
4、响应面分析
采用Box-Behnken Design实验设计方法，根据前期单因素优化的发酵结果，以油脂系数为指标（因变量），分别以葡萄糖浓度X1，蛋白胨浓度X2，KH2PO4浓度X3，pH值X4为实验因素（自变量），进行回归分析。各因素及实验水平的设计见表1。
表1 试验设计的因素和水平
Figure 622413DEST_PATH_IMAGE003
实施效果例
1、菌株的分析及表征
产油菌株PMD-A的核酸序列如SEQ ID No.1所示，与NCBI数据库比对，初步判定此产油菌是一株Pseudozyma属菌株。
微生物学特征：细胞呈柱形两头略尖，经苏丹黑B染色后能看见清晰的脂肪粒，细胞大小为5-21.5×1.5-2μm，菌落为白色，表面干燥，不光滑，有皱褶凸起。
生理生化特征：碳源同化试验证明其能利用蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖，对蔗糖、葡萄糖、木糖利用情况相对更好。氮源同化试验证明其能利用蛋白胨、硫酸铵、尿素、硝酸钠，对硝酸钠利用情况稍差。
2、菌龄的确定
每隔3h取液体种子培养基测定产油菌株PMD-A的菌体生物量，以此确定其生长曲线；根据生长曲线对Pseudozyma属菌株PMD-A进行培养，进一步确定其接种的时间，即为种龄。
从图2a可以看出，产油菌PMD-A的对数生长期为12h~27h，在此阶段菌体生长旺盛。由图2b可以看出，液体种子培养18h进行接种，发酵结束所得的菌体生物量、油脂产量、油脂含量及油脂系数均为最大，其最大值分别为10.94g/L、3.44g/L、31.44%及8.7。因此，确定此Pseudozyma属菌株的液体种子培养时间(即种龄)为18h。
3、Pseudozyma属产油菌株培养基组成的优化
3.1不同葡萄糖浓度对菌体产油脂的影响
在每升发酵培养基中分别添加30g、40g、60g、80g、100g葡萄糖作为Pseudozyma属菌株发酵产油脂的碳源，接种发酵5d，比较不同的葡萄糖浓度对菌体产油脂的影响，结果如图3所示。
由图3可以看出，在30g/L~100g/L的葡萄糖浓度范围内，随着葡萄糖浓度的升高，菌体的生物量、油脂产量、油脂含量及油脂系数均先增加后减少；而发酵液中的残糖逐渐增加。葡萄糖浓度较低时，发酵液中残糖所剩很少，但油脂含量相对较低，不利于菌体胞内油脂的积累；而葡萄糖浓度偏高时，发酵结束后残糖浓度偏高，油脂系数相对偏低，说明在高葡萄糖浓度条件下菌体生长受到抑制，不利于胞内油脂的积累，对底物利用率降低，使培养成本增加。因此，选择在葡萄糖浓度为60g/L条件下进行发酵，所得油脂产量、油脂系数、油脂含量均最大，其最大值分别为3.84g/L、8.81、31.63%；在此条件下进行发酵，菌体对底物利用情况较好。
3.2不同氮源对菌体产油脂的影响
在发酵培养基中分别添加蛋白胨、尿素、硫酸铵，令其含氮量均为0.4g/L，接种发酵5d，比较Pseudozyma属菌株在不同氮源条件下发酵产油脂的情况，结果如表2所示。
表2不同氮源的发酵结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
由表2可见，以尿素为氮源的菌体生物量最大，达到13.97g/L；以蛋白胨为氮源的菌体油脂产量、油脂系数均最大，最大值为3.88、8.56g/L；硫酸铵为氮源的菌体油脂含量最大，达到30.56%，而其油脂产量、油脂含量相对较高。以上结果表明，以蛋白胨作为氮源培养Pseudozyma属菌株时，菌体生长较快，且有利于其体内积累油脂；硫酸铵虽有利于油脂的合成但不利于菌体的生长；而尿素虽有利于菌体的生长，但是不利于油脂的合成且对底物的利用率较低。因此，选择蛋白胨作为发酵培养基的氮源对此菌发酵产油脂较为有利。
4、Pseudozyma属产油菌株发酵培养基的优化
4.1不同氮源浓度对菌体产油脂的影响
在发酵培养基中分别添加0.9g/L、1.8g/L、3.5g/L、5.3g/L及7.1g/L的蛋白胨作为Pseudozyma属菌株发酵产油脂的氮源，接种发酵5d，测定其产油脂各项指标，结果如图4所示。
由图4所示，蛋白胨浓度在0.9g/L~7.1g/L的范围内，随着其浓度的增加Pseudozyma属菌株发酵所得的油脂产量、油脂含量、油脂系数均先增加再减少；当浓度达到1.8g/L时，菌体发酵情况最好；油脂产量、油脂含量及油脂系数均达到最大，最大值分别为4.0g/L、30.18%及8.9；而在蛋白胨浓度为0.9g/L和1.8g/L的条件下发酵所得的菌体生物量变化不大。蛋白胨浓度低不利于菌体生长，而蛋白胨浓度偏高也会抑制菌体的生长及菌体胞内油脂的积累。因此，选择蛋白胨浓度为1.8g/L作为此菌发酵的氮源浓度。
4.2不同无机盐浓度对菌体产油脂的影响
改变发酵培养基中的无机盐浓度，分别在培养基中添加磷酸二氢钾1 g/L、2 g/L、3 g/L和4g/L。接种发酵5d后测定菌体产油脂各项指标，结果如表3所示。
表3 不同磷酸二氢钾浓度下的发酵结果
Figure 526784DEST_PATH_IMAGE005
由表3可见，磷酸二氢钾浓度在1.0g/L~3.0g/L的范围内，随着无机盐浓度的升高，Pseudozyma属菌株的菌体生物量、油脂产量、油脂含量及油脂系数均不断增大；当无机盐浓度为3.0g/L时，菌体生物量、油脂产量、油脂含量及油脂系数均达到最大值，分别为14.6g/L、4.6g/L、31.47%和10.19，说明在此无机盐浓度下有利于菌体的生长和油脂的合成，且菌体对底物的利用率较高；当无机盐浓度大于3.0g/L时，其菌体生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数均随着无机盐浓度的升高而降低，说明无机盐浓度高于3.0g/L时不利于菌体的生长和油脂的生成，菌体对底物的转化能力较差，造成资源的浪费。因此，确定此菌发酵培养基中的磷酸二氢钾的适宜浓度为3.0g/L。
5、培养基对Pseudozyma属产油菌株油脂脂肪酸组成的影响
分别在葡萄糖浓度为30g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L条件下进行发酵，采用气相色谱法测定Pseudozyma属产油菌株油脂脂肪酸组成，结果如表4所示。
表4 不同葡萄糖浓度下的油脂脂肪酸组成
Figure 509213DEST_PATH_IMAGE007
由表4分析得出，葡萄糖浓度在60g/L~100g/L范围内油脂脂肪酸组成均以棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)为主，三种脂肪酸含量大于65%，与植物油组成相似；随着葡萄糖浓度的增加，其饱和脂肪酸含量略有降低但相差不大，分别为42.82%、41.33%、41.2%。当葡萄糖浓度为30g/L时，其油脂饱和脂肪酸含量相对较高，达到57.61%，但其油脂产量相对较低；其多不饱和脂肪酸二十碳二烯酸含量为13.69%，而其他浓度条件下，此脂肪酸不含或含量很低。当碳源浓度为40g/L时，油脂饱和脂肪酸含量最低，为17.35%；但十七碳烯酸(C17:1)含量达到54.92%，而其他浓度条件下此脂肪酸不含或含量很低。
6、不同氮源种类对油脂脂肪酸的影响
比较在含氮量相同的条件下，分别以硫酸铵、尿素、蛋白胨为氮源进行发酵，采用气相色谱法测定油脂脂肪酸组成，结果如表5所示。
表5 不同氮源种类下的油脂脂肪酸组成
Figure DEST_PATH_IMAGE008
由表5可知，三种氮源发酵所得的油脂均以棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸为主要脂肪酸，四种脂肪酸含量均大于65%，此脂肪酸组成与植物油相似，主要以C16和C18为主，尤其是硫酸铵为氮源时其四种脂肪酸含量可达78.27%，而其他两种氮源在相同条件下的四种脂肪酸含量相差不多。以尿素为氮源时油脂中饱和脂肪酸含量最高，达到70.96%；以蛋白胨为氮源时油脂中不饱和脂肪酸含量最高，可达55.29%。以蛋白胨为氮源时更易获得不饱和脂肪酸含量高的微生物油脂。
7、不同氮源浓度对油脂脂肪酸的影响
利用气相色谱法测定Pseudozyma属产油菌株在蛋白胨浓度分别为0.9g/L、1.8g/L、3.5g/L、5.3g/L及7.1g/L下的油脂脂肪酸组成，结果如表6所示。
表6不同蛋白胨浓度下的油脂脂肪酸含量
Figure DEST_PATH_IMAGE010
由表6可知，蛋白胨浓度的大小对油脂脂肪酸组成影响很大，除了蛋白胨浓度为0.9g/L、3.5g/L时其油脂中棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和油酸四种脂肪酸含量总和大于65%外，其余浓度条件下C16和C18含量相对较低，尤其是浓度在5.3g/L时，油脂中不含有棕榈酸、硬脂酸、油酸三种脂肪酸，而十五碳烯酸含量达到32.79%，花生四烯酸(C20:4)含量可达28.91%，此脂肪酸在蛋白胨其他浓度条件下不存在。蛋白胨浓度在1.8g/L-5.3g/L范围内，随着蛋白胨浓度的增加油脂饱和脂肪酸含量逐渐增加，分别为15.79%、38.69%和52.02%。而蛋白胨浓度为0.9g/L时其饱和脂肪酸含量最高，达到76.39%，尤其是棕榈酸含量明显要高于其他浓度的棕榈酸含量，可达47.05%；蛋白胨浓度分别在1.8g/L和7.1g/L时，其饱和脂肪酸含量相对较低，但其十七碳烯酸含量相对较高，分别为64.98和71.57%。据研究报道，奇数碳链的脂肪酸具有较强的抗癌活性。
8、发酵培养基初始pH对菌体产油脂的影响
设置发酵培养基初始pH分别为4.0、5.0、自然(5.8)、6.0、7.0、8.0，在此条件下接种发酵5d，发酵结束后提取油脂，结果如图5所示。
由图5可见，发酵培养基初始pH偏低或偏高均不利于菌体生长及油脂的合成。当初始pH达到6时菌体生物量、油脂产量、油脂含量及油脂系数均为最大，其值分别为14.77g/L、4.83g/L、32.71%及10.55；在此条件下发酵结果略高于初始pH自然(5.8)条件下的发酵结果。
9、响应面法优化发酵培养基结果分析
9.1响应面实验结果
以油脂系数为指标，分别以葡萄糖浓度X1，蛋白胨浓度X2，KH2PO4浓度X3，pH值X4为实验因素进行Box-Behnken Design实验，结果如表7所示。
表7 响应面实验结果
Figure 510536DEST_PATH_IMAGE011
Figure DEST_PATH_IMAGE012
9.2响应面结果分析
根据表7的实验结果，用Design Expert软件进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程的模型如下：Y=9.21+1.32X1-1.09X2+0.84X3-1.08X4+0.35X1X2+1.64X1X3+0.94X1X4-0.96X2X3-0.55X2X4-1.41X3X4-2.37X1 2-0.28X2 2-1.27X3 2-1.62X4 2 ( R2为0.9897，R2 ADJ为0.9795）
式中：Y为酵母细胞中油脂系数，X1、X2、X3、X4分别代表葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和pH的编码值。由二次回归方程可知，发酵培养基组成对该酵母发酵产油脂的油脂系数影响程度为葡萄糖>蛋白胨>pH> KH2PO4。
预测模型的方差分析结果如表8所示。
表8方差分析结果
Figure DEST_PATH_IMAGE014
注: * 为显著( P < 0. 05); * * 为极显著(P < 0. 01）
由表8方差结果分析可知，所建立的回归模型极显著(P< 0.0001)，失拟项不显著(P=0.1188>0.05)，说明模型可信。对预测模型的拟合度进行检验，该模型的决定系数R2为0.9897，校正决定系数R2 ADJ为0.9795，反映模型置信度的变异系数(CV)为4.58%，说明该试验用的二次回归模型拟合度较好，可用于分析和预测发酵培养基成分（自变量）对酵母发酵所得油脂系数（因变量）的影响情况，且该模型方程能够很好地反映真实的实验值。同时方差分析结果表明，除了交互项中，葡萄糖和蛋白胨，蛋白胨和pH以及二次项中蛋白胨对响应值影响显著外，其他项均为极显著。
响应面图形是响应值对X1、X2、X3、X4四因素所构成的三维立体空间的曲面图。由上述二次多元回归方程可知，此方程二次项系数均为负值，说明抛物线的开口向下，必然存在极大值点。由此模型得到的响应面曲面图（如图6）可知，交互作用的两因素呈现出山丘曲面，说明存在极大值。因此，模型与二次多元回归方程分析结论一致。
9.3响应面优化结果及实验验证
由响应面分析确定最佳工艺参数为葡萄糖69.2g/L，蛋白胨1.8g/L,磷酸二氢钾3.0g/L,最佳pH5.5。为验证模型的准确性，在此培养基组成最优条件下，进行3次平行实验，实验结果如下：菌体生物量实测平均值为14.85g/L，油脂含量的实测平均值为33.00%，油脂产量的实测平均值为4.90g/L，油脂系数实测平均值11.68，与模型的预测值11.59接近，进一步说明此回归模型可靠。
10、接种量对菌体产油脂的影响
以发酵液体积的2%、5%、10%、15%及20%的种子液进行接种，发酵培养5d后测定产油各项指标，结果如图6所示。
由图7可见，接种量偏低，不利于菌体快速繁殖进而导致最终油脂产量偏低；接种量偏高，虽能使菌体快速繁殖，但在有限的营养条件下会使菌体发酵后劲不足且易使菌体老化自溶，因此，也会导致油脂产量降低。因此，选择15%的接种量进行发酵，可使菌体生物量、油脂产量、油脂含量及油脂系数达到最大，其最大值分别为15.32g/L、6.56g/L、42.83%及14.27。相对于初始发酵pH，优化发酵培养基接种量对菌体生长和油脂积累影响较大。
11、发酵时间对菌体产油脂的影响
在28℃、140r/min条件下，以15%的接种量进行接种，分别发酵48h、72h、96h、120h、144h，发酵结束后测定产油脂各项指标，结果如图8所示。
由图8可知，在发酵时间48h~144h范围内，随着发酵时间的增加菌体生物量逐渐增多；而油脂产量、油脂含量及油脂系数先增大后降低。当发酵120h时，菌体的油脂产量、油脂含量及油脂系数均达到最大，其最大值分别为6.7g/L、42.89%及14.68。当发酵144h时，虽然菌体生物量达到最大，但油脂产量和油脂含量均降低，说明菌体的生长消耗了菌体胞内部分油脂。
12、发酵温度对菌体产油脂的影响
分别以22℃、25℃、28℃、31℃、34℃作为发酵温度，在140r/min，15%的接种量条件下进行接种，发酵120h测定产油脂各项指标，结果如图9所示。
由图9可知，温度偏低或温度偏高均不利于菌体的生长和胞内油脂的合成，过低的发酵温度对菌体胞内油脂的积累有明显的抑制作用，这可能与合成油脂的某些关建酶有关。当发酵温度达到28℃时，其菌体生物量、油脂产量及油脂系数均达到最大，其最大值分别为15.93g/L、6.87g/L及14.73；而其胞内油脂含量略低于31℃条件下的菌体油脂含量，为43.15%。因此，选择28℃作为菌体的发酵温度所得发酵结果较为理想。
13、摇床转速对菌体产油脂的影响
在28℃条件下，分别以100r/min、120r/min、140r/min、160r/min及180r/min作为摇床转速，并以15%的接种量进行接种，发酵120h测定产油脂各项指标，结果如图10所示。
由图10可知，在100r/min~180r/min的摇床转速范围内，随着转速的增加，菌体生物量逐渐增大；而其油脂产量、油脂含量及油脂系数均先增加后降低。在转速达到160r/min时达到最大，最大值分别为7.69g/L、43.66%及15.56，其菌体生物量略低于180r/min条件下的菌体生物量，为17.61g/L；而其油脂含量明显高于180r/min条件下的菌体油脂含量。说明摇床转速对菌体生长影响较大。过高的摇床转速虽有利于菌体的生长，但不利于菌体胞内油脂的合成；而过低的摇床转速不利于菌体的生长同时也抑制菌体胞内油脂的积累。
14、优化前后菌体产油脂的比较
对菌体的营养条件和发酵条件进行优化，比较优化前后的发酵结果如表9所示。
表9 优化前后的发酵结果比较
Figure DEST_PATH_IMAGE015
由表9可知，优化后的菌体生物量、油脂产量、油脂产量及油脂系数较优化前均有不同程度的提高。菌体生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数分别比优化前提高了62.7%、155.1%、56.8%和103.6%。
综上：本实验室通过筛选获得了一株Pseudozyma属产油菌株，通过对其培养条件的单因素优化和响应面实验的回归分析，得到最适菌株生长和胞内油脂积累的培养条件，其最适培养基组成浓度为葡萄糖69.2g/L、蛋白胨1.8g/L、酵母膏10g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，pH5.5；实验验证结果显示油脂系数的实测值11.68，与回归模型的理论预测值11.59接近，进一步证明该回归模型可靠，可用响应面法优化产油酵母的发酵培养基。其最适发酵条件为28℃、160r/min条件下，以15%的接种量进行接种，发酵120h，在此条件下所得发酵结果较为理想，较优化前油脂产量提高了155.1%。且从实验结果可以看出，接种量与摇床转速对Pseudozyma属菌株的生长和胞内油脂积累影响较大。综合实验结果，可以认为Pseudozyma属菌株是一株很有开发潜力的产油菌株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<213> Pseudozyma aphidis
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agagggaaga gcaccaagat tgaaagctgg cgtcttcggc gtccgcattg taatctcaag 60
aagtgttttc cgcttcggac catgcctaag tcccttggaa aagggcatca tagagggtga 120
taatcccgta catggcatgg agcgcccgaa gctttgtgat acgctttcta agagtcgagt 180
tgtttgggaa tgcagctcaa aatgggtggt aaatgccatc taaggctaaa tattggggag 240
agaccgatag cgaacaagta cagtgatgga aagatgaaaa gaactttgaa aagagagtta 300
aacagtacgt gaaattgcca aaagggaagg gtaggaggtc agagatgcgg cctaggattc 360
agccttgctt ttgcttggtg tttttcctag attgcaggcc aacgtcggtt ttgggcactg 420
gagaatggtg gaaggaatgt ggcacctctc ggggtgtgtt atagccttct actggataca 480
gcgaccgaga ccgaggacag cagcgtactc gcaagagcgg gccttcgggc acctttacgc 540
ttagggcgtt ggcataatgg 560

Claims (7)

1.一株Pseudozyma属产油菌株，其特征在于：所述菌株已于2020年11月2日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.20993，分类名为Pseudozyma aphidis。
2.权利要求1所述的Pseudozyma属产油菌株的培养方法，其特征在于：将Pseudozyma属菌株菌液按照10%的接种量，接种到培养基中培养，培养条件为pH5-7，于28℃、140r/min培养，发酵120h。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养基中的原料浓度为：葡萄糖40-80g/L、氮源中氮含量0.4g/L、酵母膏10g/L、磷酸二氢钾2.0-3.0g/L，pH5-7，其中氮源为硫酸铵、尿素或蛋白胨。
4.权利要求1所述的Pseudozyma属菌株在作为工程菌发酵高产油脂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵条件为：在25-31℃、140-160r/min条件下，以10-20%种子液浓度的接种量进行接种，接种到发酵培养基中进行发酵，发酵时间为96-144h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基中的原料浓度为：葡萄糖30-100g/L、氮源0.9-7.1g/L、酵母膏10g/L、磷酸二氢钾3.0g/L，pH5.5，其中氮源为蛋白胨。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述工程菌通过调节发酵培养基中葡萄糖或氮源的浓度实现调整发酵产油脂的类型和含量的目的。
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