CN111793618A - 一种星孢菌素产生菌的选育及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种星孢菌素产生菌的选育及制备方法，通过链霉菌XDR‑UV‑10‑3发酵生产星孢菌素，其过程包括菌种的紫外诱变、斜面培养、种子液培养、摇瓶发酵培养、30L‑50L‑50L三联罐深层液体发酵培养，还包括星孢菌素HPLC检测方法，提供的链霉菌XDR‑UV‑10‑3具有高产星孢菌素的能力，其产星孢菌素的能力比现有技术中其他菌株有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。

Description

一种星孢菌素产生菌的选育及制备方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种星孢菌素产生菌的选育及制备方法。
背景技术：
星孢菌素(Staurosporine，抗生素AM-2282或STS)是一种天然产物，最初于1977年从细菌Streptomyces staurosporeus中分离出来。这是分离得到的50多种具有双吲哚化学结构的生物碱中的第一种。1994年，通过X射线分析和绝对立体化学构型，同时阐明了星孢菌素的化学结构。星孢菌素的主要生物活性是通过预防ATP与激酶的结合来抑制蛋白激酶。这是通过星孢菌素对激酶上的ATP结合位点的更强亲和力来实现的。星孢菌素是一种典型的ATP竞争性激酶抑制剂，因为它以高亲和力结合许多激酶，但选择性很小。在研究中，星孢菌素用于诱导细胞凋亡，在较低浓度下，根据细胞类型，星孢菌素诱导特定的细胞周期效应，阻止细胞在细胞周期的G1期或G2期。
近几十年，在新药研发中生物碱类化合物的比例日益增加，其中吲哚咔唑类化合物占到了1/3，所以，越来越多的化学家、生物学家和药理学家等研究工作者开始关注吲哚咔唑类生物碱。目前已报道星孢菌素相关的文献专利也不少:赵雪尔等(中国医药生物技术，2011年8月第6卷第4期：274-277)星形孢菌素生物合成途径的研究进展；浦小明等(微生物学通报，2009，36(11)：1631～1637)通过星孢菌素产生菌H41-38进行了发酵工艺条件优化，取得星孢菌素的发酵单位高达286.44ug/ml；盖翠娟等(中国抗生素杂志，2015，40(5)：325～329)对海洋链霉菌YB-24进行了诱变育种，取得生产星孢菌素发酵单位为3.883mg/l；庄以彬等(中国海洋药物，2011，30(2)：29～33)对海洋链霉菌进行复合诱变选育，取得星孢菌素发酵单位为9.06ug/ml；US7608420B2公开利用Streptomyces hygroscopicus C39280-450-9(ATCC 53730)发酵制备星孢菌素，发酵单位为392mg/l；US4107297A公开了星孢菌素产生菌Streptomyces sp.AM-2282(Streptomyces staurospreus nov.sp.NRRL11184)的形态学特征、培养特征和生理生化特征。
以上公开的文献和专利中星孢菌素的生产菌株虽然不少，但菌株比较原始，发酵单位水平低，不适合工业化生产。寻找高产星孢菌素生产菌株的工作还需要继续努力。
发明内容：
针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种星孢菌素产生菌的选育及制备方法。
一种星孢菌素产生菌的选育，包括以下步骤：
(1)菌种紫外诱变选育：采用15KW紫外灯，调整照射距离为15～20cm，照射前开启紫外灯预热30分钟，取50ul孢子悬液加入固态培养基平皿中，用三角涂布棒均匀涂开，打开平皿盖，分别照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，放置28℃暗箱中倒置培养5～8天，采用连续多次诱变的方法，在每次诱变之后选择3～5株较好的菌株继续诱变，挑选经过连续10次紫外诱变处理后的单菌落5株，进行摇瓶发酵；
(2)星孢菌素HPLC检测：通过HPLC检测发酵液中星孢菌素的含量，筛选出高产星孢菌素菌号：链霉菌XDR-UV-10-3。
具体地，链霉菌XDR-UV-10-3在固体培养基平皿中28℃培养5～8天后，菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径约2～6mm，菌落表面光滑，有沟纹，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈无色或淡黄色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期白色，后期转青灰色无可溶性色素。
一种星孢菌素产生菌的发酵制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基、种子液培养基、发酵培养基的配制：
斜面培养基(g/l)：麦芽浸粉5，葡萄糖4，酵母浸粉2，琼脂20，消前pH7.0～7.5，250mL规格的茄形瓶，装量50mL，经121℃灭菌30分钟，冷却至50～60℃左右摆斜面，待冷却凝固后放37℃培养箱空培1～2天；
种子液培养基(g/L)：花生饼粉10，玉米淀粉5，葡萄糖4，甘油10，酵母粉4，碳酸钙2，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵0.1，氯化钠0.1，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟。
发酵培养基(g/L)：甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟；
(2)斜面培养：接种权利要求1的高产星孢菌素菌即链霉菌XDR-UV-10-3至斜面培养基内，28±1℃培养5～8天，得到菌悬液；
(3)种子液培养：接种105～106cfu/ml菌悬液到种子液培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养20～30小时，此时得到种子液pH6.5～7.0，菌丝体菌浓10～15％(V/V)；
(4)选择摇瓶或30-50-50L三联罐培养：
A.选择摇瓶培养：吸取1～2ml种子液接入发酵培养基，培养温度28±1℃，250rpm转速振荡培养100～168小时，得到最终的发酵液；
B.选择30-50-50L三联罐培养：①在30L的种子罐中投入15L的步骤(1)中的种子液培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液30mL，搅拌转速100rpm，通气量1.0vvm，温度28±1℃培养20～30小时，此时种子液pH6.5～7.0，菌浓10～15％(V/V)；②配置发酵培养基(g/L)：玉米淀粉4，甘露醇5，棉籽饼粉3，黄豆饼粉3，麦芽浸粉1，甘油60，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉7，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，氯化钴0.002，L-色氨酸2，DL-蛋氨酸1，硫酸铵0.2，磷酸氢二铵0.2，氯化钠0.1；③发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入种子液3L，搅拌转速200～400rpm，通气量0.8～1.0vvm，28℃培养120小时，得到最终的发酵液；
通过HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量。
本发明有益效果：本发明提供一种星孢菌素产生菌的选育及制备方法，具有高产星孢菌素的能力，其产星孢菌素的能力有1304ug/ml比现有技术中其他菌株有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产；
本发明通过链霉菌XDR-UV-10-3发酵生产星孢菌素，其过程包括菌种的紫外诱变、斜面培养、种子液培养、摇瓶发酵培养、30L-50L-50L三联罐深层液体发酵培养，还包括星孢菌素HPLC检测方法。
主要摇瓶工艺流程①：甘油冻管→种子斜面→种子液摇瓶→发酵摇瓶；主要三联罐工艺流程②：甘油冻管→种子斜面→种子液摇瓶→30L种子罐→50L发酵罐；本发明中所采用的试剂、材料和仪器等都为普通市售品，容易购买。
附图说明：
图1为本发明的固体培养基平皿中的XDR-UV-10-3菌落示意图；
图2为本发明的种子液培养基中XDR-UV-10-3镜检菌丝形态示意图；
图3为本发明的星孢菌素HPLC色谱图；
图4为实施例3-9的星孢菌素含量示意图。
具体实施方式：
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过具体实施例及附图来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
如图1-4所示，本实施例的一种星孢菌素产生菌的选育，包括以下步骤：
(1)菌种紫外诱变选育：采用15KW紫外灯，调整照射距离为15～20cm，照射前开启紫外灯预热30分钟，取50ul孢子悬液加入固态培养基平皿中，用三角涂布棒均匀涂开，打开平皿盖，分别照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，放置28℃暗箱中倒置培养5～8天，采用连续多次诱变的方法，在每次诱变之后选择3～5株较好的菌株继续诱变，挑选经过连续10次紫外诱变处理后的单菌落5株，进行摇瓶发酵；
(2)星孢菌素HPLC检测：通过HPLC检测发酵液中星孢菌素的含量，筛选出高产星孢菌素菌号：链霉菌XDR-UV-10-3。
具体地，链霉菌XDR-UV-10-3在固体培养基平皿中28℃培养5～8天后，菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径约2～6mm，菌落表面光滑，有沟纹，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈无色或淡黄色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期白色，后期转青灰色无可溶性色素。
一种星孢菌素产生菌的发酵制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基、种子液培养基、发酵培养基的配制：
斜面培养基(g/l)：麦芽浸粉5，葡萄糖4，酵母浸粉2，琼脂20，消前pH7.0～7.5，250mL规格的茄形瓶，装量50mL，经121℃灭菌30分钟，冷却至50～60℃左右摆斜面，待冷却凝固后放37℃培养箱空培1～2天；
种子液培养基(g/L)：花生饼粉10，玉米淀粉5，葡萄糖4，甘油10，酵母粉4，碳酸钙2，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵0.1，氯化钠0.1，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟。
发酵培养基(g/L)：甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟；
(2)斜面培养：接种权利要求1的高产星孢菌素菌即链霉菌XDR-UV-10-3至斜面培养基内，28±1℃培养5～8天，得到菌悬液；
(3)种子液培养：接种105～106cfu/ml菌悬液到种子液培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养20～30小时，此时得到种子液pH6.5～7.0，菌丝体菌浓10～15％(V/V)；
(4)选择摇瓶或30-50-50L三联罐培养：
A.选择摇瓶培养：吸取1～2ml种子液接入发酵培养基，培养温度28±1℃，250rpm转速振荡培养100～168小时，得到最终的发酵液；
B.选择30-50-50L三联罐培养：①在30L的种子罐中投入15L的步骤(2)中的种子液培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液30mL，搅拌转速100rpm，通气量1.0vvm，温度28±1℃培养20～30小时，此时种子液pH6.5～7.0，菌浓10～15％(V/V)；②配置发酵培养基(g/L)：玉米淀粉4，甘露醇5，棉籽饼粉3，黄豆饼粉3，麦芽浸粉1，甘油60，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉7，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，氯化钴0.002，L-色氨酸2，DL-蛋氨酸1，硫酸铵0.2，磷酸氢二铵0.2，氯化钠0.1；③发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入种子液3L，搅拌转速200～400rpm，通气量0.8～1.0vvm，28℃培养120小时，得到最终的发酵液；
(5)通过HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量。
本发明中所采用的试剂、材料和仪器等都为普通市售品，容易购买。
主要试剂及材料：
葡萄糖、玉米淀粉、甘露醇、甘油、酵母粉、麦芽浸粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、硫酸铵、硫酸锌、硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二铵、氯化钠、氯化钴、碳酸钙、L-色氨酸、DL-蛋氨酸；
载玻片，盖玻片，酒精灯，纱布，接种针，三角涂布器，250ml三角瓶，药匙，漏斗，电炉，计时器；
主要实验仪器：
YXQ-WY21-600卧式圆形压力蒸汽灭菌器；
SW-CJ-10超净工作台；
CX23LEDRFS1C型显微镜；
NV622ZH电子天平；
LRH-250生化培养箱；
ULTS1368超低温冰箱(-80℃)；
ZWY-2102C双层恒温培养振荡器；
PHS-3E实验室台式pH计；
TGL-16C高速离心机；
高效液相色谱仪器Waters Delta 600型；
30L-50L-50L三联微生物发酵罐；
TW5504S空压机。
实施例1：菌株来源
本发明的链霉菌XDR-UV-10-3是通过原始菌株，再经连续多次紫外诱变选育获得，现保藏于-80℃的超低温冰箱，其保藏编号为XDR-DE-GC-UV-10-3；
紫外诱变选育：采用15KW紫外灯，调整照射距离为15～20cm，照射前开启紫外灯预热30分钟。取50ul孢子悬液加入固态培养基平皿中，用三角涂布棒均匀涂开，打开平皿盖，分别照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，放置28℃暗箱中倒置培养5～8天。采用连续多次诱变的方法，在每次诱变之后选择3～5株较好的菌株继续诱变。挑选经过连续10次紫外诱变处理后的单菌落5株，进行摇瓶发酵，经HPLC检测发酵液中星孢菌素的含量，筛选出高产星孢菌素菌号：链霉菌XDR-UV-10-3；
固体培养基(g/l)：麦芽浸粉5，葡萄糖4，酵母浸粉2，琼脂20，调pH7.0～7.5，经121℃灭菌30分钟后，冷却至50～60℃倒平板，吸取50ul菌液涂布在固体培养基平皿上，放在28℃恒温培养箱培养，菌落培养5～8天；
种子液培养基(g/L)：花生饼粉10，玉米淀粉5，葡萄糖4，甘油10，酵母粉4，碳酸钙2，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵0.1，氯化钠0.1，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟。每个种子摇瓶接种1个单菌落，28±1℃转速250rpm振荡培养20～30小时。
发酵液培养基(g/L)：甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟。将吸取1～2ml种子液接入发酵培养基，培养温度28±1℃，转速250rpm，培养100～168小时。
实施例2：链霉菌XDR-UV-10-3主要生物学特征。
参照《国际链霉菌计划》《链霉菌鉴定手册》《放线菌的分类与鉴定》等有关内容进行实验，菌落颜色的判断参照德国RAL K7色卡中的颜色进行对照。
菌株培养学特征：菌株XDR-UV-10-3在固体培养基平皿中28℃培养5～8天后，菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径约2～6mm，菌落表面光滑，有沟纹；基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈无色或淡黄色；气生菌丝白色，产孢丰富，前期白色，后期转青灰色无可溶性色素，结果见图1；
菌丝的形态学特征：将菌株XDR-UV-10-3接种于种子液培养基中28℃培养24小时后涂片在光学显微镜下40×100倍油镜观察，结果如图2；
实施例3：摇瓶培养：
(1)斜面培养基(g/L)：麦芽浸粉5，葡萄糖4，酵母浸粉2，琼脂20，消前pH7.0～7.5，250mL规格的茄形瓶，装量50mL，经121℃灭菌30分钟，冷却至50～60℃左右摆斜面，待冷却凝固后放37℃培养箱空培1～2天后，接种一环孢子菌丝体至斜面，28±1℃培养5～8天；
(2)种子液培养基(g/L)：花生饼粉10，玉米淀粉5，葡萄糖4，甘油10，酵母粉4，碳酸钙2，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵0.1，氯化钠0.1，消前pH7.0～7.5，250mL规格的三角摇瓶，装量25mL，121℃灭菌30分钟。接种105～106cfu/ml菌悬液到种子液培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养20～30小时，此时培养液pH6.5～7.0，菌丝体菌浓10～15％(V/V)。
(3)发酵培养基(g/L)：甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，消前pH7.0～7.5，250mL规格的三角摇瓶，装量25mL，121℃灭菌20分钟。将种子液以5～10％(V/V)的接种量接入。在28±1℃，250rpm振荡培养120小时。
经HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，测得3组平均含量为545ug/ml。
(4)色谱检测方法：采用反相高效液相色谱法测定发酵产物中星孢菌素含量。Staurosporine标准品为美国Sigma公司产品，纯度≧99.9％，。高效液相色谱仪为Waters生产的，型号为Delta 600型，色谱柱为C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温35℃，检测波长为254nm，流动相甲醇：水：氨水＝85:20:0.1(v/v/v)，流动相流速为0.5ml/分钟，进样量5μl。星孢菌素在254nm处有最大吸收，在6.6分钟左右有特征吸收峰，如图3；
实施例4：摇瓶培养：
(1)斜面培养基和培养条件同实施例3中步骤(1)；
(2)种子液培养基和培养条件同实施例3中步骤(2)；
(3)发酵培养基(g/L)：甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，L-色氨酸1，DL-蛋氨酸0.5，消前pH7.0～7.5，250mL规格的三角摇瓶，装量25mL，121℃灭菌30分钟。将种子液以5～10％(V/V)的接种量接入。在温度28±1℃，250rpm振荡培养120小时。
经HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，测得3组平均含量为649ug/ml。
实施例5：摇瓶培养：
(1)斜面培养基和培养条件同实施例3中步骤(1)；
(2)种子液培养基和培养条件同实施例3中步骤(2)；
(3)发酵培养基(g/L)：玉米淀粉3，黄豆饼粉2，甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，L-色氨酸1，DL-蛋氨酸0.5，硫酸铵0.1，磷酸氢二铵0.1，消前pH7.0～7.5，250mL规格的三角摇瓶，装量25mL，121℃灭菌30分钟。将种子液以5～10％(V/V)的接种量接入。在温度28±1℃，250rpm振荡培养120小时。
经HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，测得3组平均含量为852ug/ml。
实施例6：摇瓶培养：
(1)斜面培养基和培养条件同实施例子(3)中步骤(1)；
(2)种子液培养基和培养条件同实施例子(3)中步骤(2)；
(3)发酵培养基(g/L)：玉米淀粉3，甘露醇5，棉籽饼粉2，黄豆饼粉2，麦芽浸粉1，甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，氯化钴0.002，L-色氨酸1，DL-蛋氨酸0.5，硫酸铵0.1，磷酸氢二铵0.1，氯化钠0.1，消前pH7.0～7.5，250mL规格的三角摇瓶，装量25mL，121℃灭菌30分钟。将种子液以5～10％(V/V)的接种量接入。在温度28±1℃，250rpm振荡培养120小时。
经HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，测得3组平均含量为1053ug/ml。
实施例7：30-50-50L三联罐培养：
(1)斜面培养基和培养条件同实施例3中步骤(1)；
(2)种子液培养基和培养条件同实施例3中步骤(2)；
(3)30L种子罐中种子液培养基同实施例子3中步骤(2)中种子液培养基，在30L的种子罐中投入15L的种子液培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液30mL，搅拌转速100rpm，通气量1.0vvm，温度28±1℃培养20～30小时，此时种子液pH6.5～7.0，菌浓10～15％(V/V)；
(4)发酵培养基同实施例6中步骤(3)中发酵培养基；发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入种子罐种子液3L。搅拌转速200～400rpm(转速在前3天逐渐从200rpm升至300rpm)，通气量0.8～1.0vvm，28℃培养120小时。经HPLC方法检测发酵液中的星孢菌素的含量，测得3组平均含量为1149ug/ml。
实施例8：30-50-50L三联罐培养：
(1)斜面培养基和培养条件同实施例3中步骤(1)；
(2)种子液培养基和培养条件同实施例中步骤(2)；
(3)30L种子罐中种子液培养基同实施例3中步骤(2)中种子液培养基，在30L的种子罐中投入15L的种子液培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌20分钟，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液100mL，搅拌转速100rpm，通气量1.0vvm，温度28±1℃培养20～30小时，此时种子液pH6.5～7.0，菌浓10～15％(V/V)；
(4)发酵培养基(g/l)：玉米淀粉4，甘露醇5，棉籽饼粉3，黄豆饼粉3，麦芽浸粉1，甘油60，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉7，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，氯化钴0.002，L-色氨酸2，DL-蛋氨酸1，硫酸铵0.2，磷酸氢二铵0.2，氯化钠0.1，发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入种子罐种子液3L。搅拌转速200～400rpm(转速在前3天逐渐从200rpm升至300rpm)，通气量0.8～1.0vvm，28℃培养120小时。经HPLC方法检测发酵液中的星孢菌素的含量，测得3组平均含量为1251ug/ml。
实施例9：30-50-50L三联罐培养：
(1)斜面培养基和培养条件同实施例3中步骤(1)；
(2)种子液培养基和培养条件同实施例3中步骤(2)；
(3)30L种子罐中种子液培养基同实施例3中步骤(2)中种子液培养基，在30L的种子罐中投入15L的种子液培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌20分钟，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液100mL，搅拌转速100rpm，通气量1.0vvm，温度28±1℃培养20～30小时，此时种子液pH76.5～7.0，菌浓10～15％(V/V)；
(4)发酵培养基(g/l)：玉米淀粉4，甘露醇5，棉籽饼粉3，黄豆饼粉3，麦芽浸粉1，甘油80，花生饼粉25，葡萄糖5，酵母粉7，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，氯化钴0.002，L-色氨酸2，DL-蛋氨酸1，硫酸铵0.2，磷酸氢二铵0.2，氯化钠0.1，发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入种子罐种子液3L。搅拌转速200～400rpm(转速在前3天逐渐从200rpm升至300rpm)，通气量0.8～1.0vvm，28℃培养120小时。经HPLC方法检测发酵液中的星孢菌素的含量，测得3组平均含量为1304ug/ml。
本发明提供的新的链霉菌XDR-UV-10-3具有高产星孢菌素的能力，其产星孢菌素的能力有1304ug/ml，比现有技术中其他菌株有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产；
本发明通过链霉菌XDR-UV-10-3发酵生产星孢菌素，其过程包括菌种的紫外诱变、斜面培养、种子液培养、摇瓶发酵培养、30L-50L-50L三联罐深层液体发酵培养，还包括星孢菌素HPLC检测方法。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种星孢菌素产生菌的选育，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种紫外诱变选育：采用15KW紫外灯，调整照射距离为15～20cm，照射前开启紫外灯预热30分钟，取50ul孢子悬液加入固态培养基平皿中，用三角涂布棒均匀涂开，打开平皿盖，分别照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，放置28℃暗箱中倒置培养5～8天，采用连续多次诱变的方法，在每次诱变之后选择3～5株较好的菌株继续诱变，挑选经过连续10次紫外诱变处理后的单菌落5株，进行摇瓶发酵；
(2)星孢菌素HPLC检测：通过HPLC检测发酵液中星孢菌素的含量，筛选出高产星孢菌素菌号：链霉菌XDR-UV-10-3。
2.根据权利要求1所述的一种星孢菌素产生菌的选育，其特征在于，所述链霉菌XDR-UV-10-3在固体培养基平皿中28℃培养5～8天后，菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径约2～6mm，菌落表面光滑，有沟纹，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈无色或淡黄色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期白色，后期转青灰色无可溶性色素。
3.一种星孢菌素产生菌的发酵制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)斜面培养基、种子液培养基、发酵培养基的配制：
斜面培养基(g/l)：麦芽浸粉5，葡萄糖4，酵母浸粉2，琼脂20，消前pH7.0～7.5，250mL规格的茄形瓶，装量50mL，经121℃灭菌30分钟，冷却至50～60℃左右摆斜面，待冷却凝固后放37℃培养箱空培1～2天；
种子液培养基(g/L)：花生饼粉10，玉米淀粉5，葡萄糖4，甘油10，酵母粉4，碳酸钙2，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵0.1，氯化钠0.1，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟。
发酵培养基(g/L)：甘油40，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，消前pH7.0～7.5，三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌30分钟；
(2)斜面培养：接种权利要求1的高产星孢菌素菌即链霉菌XDR-UV-10-3至斜面培养基内，28±1℃培养5～8天，得到菌悬液；
(3)种子液培养：接种105～106cfu/ml菌悬液到种子液培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养20～30小时，此时得到种子液pH6.5～7.0，菌丝体菌浓10～15％(V/V)；
(4)选择摇瓶或30-50-50L三联罐培养：
A.选择摇瓶培养：吸取1～2ml种子液接入发酵培养基，培养温度28±1℃，250rpm转速振荡培养100～168小时，得到最终的发酵液；
B.选择30-50-50L三联罐培养：①在30L的种子罐中投入15L的步骤(1)中的种子液培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液30mL，搅拌转速100rpm，通气量1.0vvm，温度28±1℃培养20～30小时，此时种子液pH6.5～7.0，菌浓10～15％(V/V)；②配置发酵培养基(g/L)：玉米淀粉4，甘露醇5，棉籽饼粉3，黄豆饼粉3，麦芽浸粉1，甘油60，花生饼粉20，葡萄糖5，酵母粉7，碳酸钙3，硫酸镁1，硫酸亚铁0.05，硫酸锌0.002，氯化钴0.002，L-色氨酸2，DL-蛋氨酸1，硫酸铵0.2，磷酸氢二铵0.2，氯化钠0.1；③发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃灭菌30分钟，待冷却至28℃后接入种子液3L，搅拌转速200～400rpm，通气量0.8～1.0vvm，28℃培养120小时，得到最终的发酵液；
(5)通过HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量。
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