CN104120090B

CN104120090B - 一种毒三素链霉菌及其应用

Info

Publication number: CN104120090B
Application number: CN201310140368.3A
Authority: CN
Inventors: 冯军; 张喜全; 胡莎莎; 吴勇; 顾鸽青; 薛春佳; 徐宏江; 付辉; 施伟
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2033-04-23
Also published as: CN104120090A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体而言涉及一种毒三素链霉菌及其应用。本发明提供一种新的毒三素链霉菌，其分类命名为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI‑2012406，由中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2013059，保藏日期为2013年2月25日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。本发明还公开了毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI‑2012406在制备链丝菌素中的应用。

Description

一种毒三素链霉菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种新的微生物及其应用，尤其涉及一种毒三素链霉菌及其在制备链丝菌素中的应用。

背景技术

链丝菌素（Streptothticin）是一类N-糖苷类抗生素，是最早发现的抗生素之一，其中链丝菌素F由Waksman 和Woodruff于1942年从淡紫灰色链霉菌（Streptomyces lavendulae）的培养基中首先发现（Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 49:207-210, 1942）。

链丝菌素共包含7个化合物（式Ⅰ），各化合物的结构类似，是差一个β-赖氨酸的同系物，都包含一分子D-古洛糖胺（D-gulosamine），一分子链里定内酰胺（Streptolidinelactam）和数量不等（1~7 个）的β-赖氨酸。

链丝菌素具有较强的抑菌作用（Antibiotiki (Moscow), 10(12): 1066-9,1965；Antibiotiki (Moscow) 14(1): 48-51, 1969；Fiziologicheski Aktivnye Veshchestva, 12: 93-6, 1980；Meditsinskaya Parazitologiya i Parazitarnye Bolezni, 49(1): 52-5, 1980），现已作为用于多种病害的防治的农药抗生素，如淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces lavendulae var．hainanensis）发酵而得的中生菌素（ZL200310103250.X）。

Ysuke Swada等人报道了从淡紫灰色链霉菌（Streptomyces lavendulae）OP-2菌株发酵液中得到链丝菌素C（Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 26(3): 885-892,1978）；杨春平等人报道了从冬青卫矛植株中分离的淡紫灰色链霉菌YDG17菌株发酵液中得到链丝菌素D、F（农药学学报, 10(1): 53-60, 2008）；姬志勤等人报道了从秦岭链霉菌（Streptomyces qinlingensis）发酵液中得到链丝菌素D、F（J. Antibiot., 61(11): 660-667, 2008）；张文娟等人报道了从秦岭地区土壤中分离的灰色链霉菌（Streptomyces griseus）NYS-4 菌株发酵液中得到链丝菌素A~F（农药学学报, 14(4): 371-376, 2012）；Mosin, V.A.等人公开了用灰色链霉菌 420菌株制备链丝菌素C和D的方法（RU2144292）；Shigeyoshi Miyashiro等人报道了从Streptomyces nojiriensis C-13菌株发酵液中得到链丝菌素D、E、F（J. Antibiot. (Tokyo), 36(12): 1638-1643, 1983）；Yang Mo Goo等人报道了从Streptomycesspp. SNUS 8810-111发酵液中得到链丝菌素D（Archives of Pharmacal Research, 19(2):153-159, 1996）；Keeratipibul, Suwimon等人报道了从泰国土壤中分离的链霉菌发酵液中得到链丝菌素B~F（Journal of Fermentation Technology: 62(1), 19-28, 1984）；Yosuke Sawada等人报道了从链霉菌StreptomycesNT 1009菌株发酵液中得到链丝菌素B（Journal of Fermentation Technology: 55(3),290-294, 1977）。

发明内容

本发明第一方面提供一种毒三素链霉菌，其分类命名为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406，保藏编号为CCTCC NO: M 2013059。

所述菌株由中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）保藏，保藏日期为2013年2月25日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

所述菌株是从中国云南省泸沽湖边草丛的土壤中分离获得的。

所述菌株的16S rDNA序列长度为1434bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

本发明另一方面提供毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406在制备链丝菌素中的应用。优选的，其中所述链丝菌素为链丝菌素B、链丝菌素C或链丝菌素D。

本发明再一方面提供链丝菌素的制备方法，其包括以下步骤：

(a) 将毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406置于三角瓶中进行种子培养，(b) 将步骤(a)获得的种子培养液转自发酵罐进行发酵，

(c) 离心步骤(b)获得的发酵液，并将上清液进行纯化以获得链丝菌素。

关于步骤(a)和(b)的培养基，可使用合成培养基、半合成培养基或天然培养基。培养基优选含有碳源、氮源以及其它营养源。其中碳源可为阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、肌醇、鼠李糖、棉籽糖、甘露糖醇、甘露糖、蜜二糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、水杨苷、黄嘌呤、甲壳质、淀粉、糊精、甘油、植物油等；氮源可为肉提取物、蛋白胨、蛋白粉、棉籽粉、大豆粉、花生粉、鱼粉、玉米浆、酵母抽提物、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿酸等；至于其它营养源可适当添加一些无机盐类，例如磷酸盐类（例如磷酸二氢钾）、钾（例如溴化钾）、钙（例如碳酸钙）、锌、锰、铁之类的金属盐、以及硫酸镁、氯化钠等，必要时可添加例如醇类和硅化合物等作为消泡剂。这些成分可预先一次性地加入培养基中，或者间歇或连续地加入培养基中。在本发明的一个具体实施方案中，培养基的组成为葡萄糖、胰蛋白大豆肉汤和CaCO₃。

其中步骤(a)的种子培养方式优选采用振荡培养，培养温度为25-30℃，优选为28℃；转速为180-250 r/min，优选为220 r/min；培养时间为35-45小时，优选为40小时。

其中步骤(b)的发酵培养方式优选采用通气搅拌培养，培养温度为25-30℃，优选为28℃；搅拌速度为400-600 r/min，优选为500 r/min；培养时间为40-50小时，优选为45小时；培养期间的pH值为约6.5-约7.5，优选为约7.0。

其中步骤(c)获得的链丝菌素为链丝菌素B、链丝菌素C或链丝菌素D。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明链丝菌素的制备方法包括以下步骤：

(a) 将毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406置于三角瓶中进行种子培养，培养方式为振荡培养，培养温度为25-30℃；转速为180-250 r/min；培养时间为35-45小时，

(b) 将步骤(a)获得的种子培养液转自发酵罐进行发酵，培养方式为通气搅拌培养，培养温度为25-30℃；搅拌速度为400-600 r/min；培养时间为40-50小时；培养期间的pH值为约6.5-约7.5，(c) 离心步骤(b)获得的发酵液，并将上清液进行纯化以获得链丝菌素B、链丝菌素C或链丝菌素D。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明链丝菌素的制备方法包括以下步骤：

(a) 将毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406置于三角瓶中进行种子培养，培养方式为振荡培养，培养温度为28℃；转速为220 r/min；培养时间为40小时，

(b) 将步骤(a)获得的种子培养液转自发酵罐进行发酵，培养方式为通气搅拌培养，培养温度为28℃；搅拌速度为500 r/min；培养时间为45小时；培养期间的pH值为约7.0，(c) 离心步骤(b)获得的发酵液，并将上清液进行纯化以获得链丝菌素B、链丝菌素C或链丝菌素D。

本发明链丝菌素的制备方法工艺优良，产率较高，适合工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，然而，本发明中实施例仅用于阐明，不限制本发明的范围。

实施例1：毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406的生物学特性

将从中国云南省泸沽湖边草丛中采集的土壤样品取1g放入装有10mL无菌水的三角瓶中，在210r/min转速下震荡15分钟，静置15分钟后取上层液稀释1000倍后取0.1mL均匀涂布在高氏一号培养基上，于28℃培养箱中培养5天，即得菌株。

1）形态学特性

菌落形态：观察在高氏一号培养基上的形态，从而来判断形态特征。在高氏一号培养基上生长旺盛，圆形菌落直径3~10mm，气丝粉色，基丝浅褐色，孢子皮粉色，无可溶性色素。

微观形态：用放大400倍和1000倍的光学显微镜直接检验放在玻片上的孢子链形态。在酵母麦芽提取物琼脂培养基（麦芽提取物，英国Oxoid公司）上培养7、14和21天后观测。从底物中大量的分支菌丝中生出气生菌丝体，气丝生长到一定阶段成为孢子丝，孢子丝成长链状，气丝粉色，粉状，基丝浅褐色，断裂，孢子粉色，圆形，无可溶性色素。

2）培养学特性

参照Shirling和Gottlieb（Int. J. Syst. Bacteriol, 16：313-340, 1996）的方法，对该菌株的生长、一般培养特点和碳的利用情况进行观察。染色用Kelly，The ISCC-NBSCOLOR CHARTS Standard sample NO 2106, 1964中的颜色图谱作为标准进行描述。

将菌株在28℃，在酵母麦芽提取物琼脂培养基（ISP 2）、燕麦片培养基（ISP 3）、无机盐淀粉琼脂培养基（ISP 4）、葡萄糖天门冬素琼脂培养基（ISP 5）、酪蛋白培养基（ISP7）、察氏琼脂培养基和马丁氏培养基上都生长良好。其菌落形态肉眼观察为典型链霉菌，表1记录了它们在不同琼脂培养基上的生长特征：

。

3）生理生化特性

明胶液化；淀粉水解强（粉色菌落周围产生浅黄色透明斑，加碘液不变色，周围培养基变蓝色）；在纤维素上微弱生长；牛奶凝固后胨化；在酪氨酸培养基上产黑色素；硫化氢产生阳性。

4）碳源利用

该菌株可很好地利用L-鼠李糖，甘露糖，D-蔗糖，棉子糖，麦芽糖，甘露醇，D-果糖，D-阿拉伯糖和D-半乳糖。

5）16S rDNA序列测定及系统进化分析

用sgF和sgR 引物扩增得到16S rDNA序列并测序：sgF（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）；sgR(5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

经测定，该菌株16S rDNA大小为1434bp，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。将该序列在GenBank数据库作blast比较，然后将相关序列从GenBank数据库调入MEGA进行比对，选择Kimura2-parameter（Kimura，1980）计算进化距离，构建Neighbor-Joining（N-J）树，并进行Bootstrap分析，证明该菌株与一株Streptomyces toxytricini strain NRRLB-5426（毒三素链霉菌）同源性较高（99%），综合其他生物学特征鉴定该菌株为毒三素链霉菌属，命名为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406，并于2013年2月15日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）进行保藏，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2013059。

实施例2：链丝菌素的制备及纯化

1）链丝菌素的制备

a）种子培养基的组成

葡萄糖30g、胰蛋白大豆肉汤30g、CaCO₃5g、蒸馏水1000ml，用适量盐酸或氢氧化钠调节pH为7.0。

b）发酵培养基的组成

葡萄糖30g、胰蛋白大豆肉汤30g、CaCO₃ 5g、蒸馏水1000ml，用适量盐酸或氢氧化钠调节pH为7.0。

c）链丝菌素的制备

将-20℃保存的毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406在无菌条件下接种于5个含有种子培养基100ml的750ml三角瓶中，在28℃以220r/min振荡培养40小时，得种子培养液。将300ml的种子培养液接种于装有经高温灭菌的3L发酵培养基的5L发酵罐中。该发酵罐的工作参数是：温度28℃，搅拌速度500 r/min，pH约7.0，视泡沫情况加入消泡剂。经45小时培养，从发酵罐中可获得2.5L液体培养物。

2）链丝菌素的纯化

a）发酵液固液分离

发酵液离心30min，转速：4000r/min，收集发酵上清液。

b）阳离子交换树脂纯化

所得发酵上清液直接通过FPC3500 阳离子交换树脂（罗门哈斯公司）柱，依次用蒸馏水、0.3mol/L NaCl、1 mol/L NaCl、1 mol/L NaCl和0.5%H₂SO₄洗脱，用HPLC检测，链丝菌素在1 mol/L NaCl 以及1 mol/L NaCl和0.5%H₂SO₄洗脱中出现，主要存在于1 mol/L NaCl和0.5%H₂SO₄洗脱液中，合并含有链丝菌素的洗脱液，此时样品pH＜1.0。

c）阴离子交换树脂纯化

取阳离子交换树脂纯化后所得洗脱液通过Dowex 1×8 阴离子交换树脂（陶氏化学公司）柱，用蒸馏水洗脱，链丝菌素不吸附直接漏出或被蒸馏水洗脱下来，合并含有链丝菌素的漏出液和蒸馏水洗脱液，此时样品pH为中性。

d）大孔吸附树脂脱色

取阴离子交换树脂纯化所得合并溶液通过XAD1600大孔吸附树脂（罗门哈斯公司）柱，用蒸馏水洗脱，链丝菌素不吸附直接漏出或被蒸馏水洗脱下来，主要存在于蒸馏水洗脱液中。合并含链丝菌素的漏出液和蒸馏水洗脱液，得链丝菌素粗品。

e）阳离子交换柱纯化

为了得到高纯度的样品，将步骤d）获得的链丝菌素粗品用AKTA exploer（GEHealthcare 公司）进行梯度洗脱纯化，条件如下：

阳离子交换柱：Source 30S（25×150mm）（GE公司）

检测波长：210nm

流动相：A) 0.05 mol/L NaH₂PO₄，pH=4.0；B) 0.05 mol/L NaH₂PO₄+1 mol/LNaCl，pH=4.0

流速：8mL/min

梯度洗脱方法：

表2中，在4个柱体积的洗脱时间内，A相从100%逐渐降至67%，B相从0逐渐升至33%；之后的25个柱体积的洗脱时间内，A相从67%逐渐降至50%，同时B相从33%逐渐升至50%；再之后的4个柱体积的洗脱时间内，A相从50%逐渐降至0%，同时B相从50%逐渐升至100%。

收集：收集试管为10mL/管，收集主峰进行分析，合并纯度在98%以上的样品，依次得链丝菌素D、链丝菌素C 、链丝菌素B。

f）反相柱脱盐

将步骤e纯化所得的链丝菌素D、链丝菌素C、链丝菌素B分别经XT30反相柱（3cm×20cm）（罗门哈斯公司）水洗脱盐，后经冷冻干燥得链丝菌素D （176.18mg）、链丝菌素C（164.40mg）、链丝菌素B （48.50mg）。

<110> 上海医药工业研究院

江苏正大天晴药业股份有限公司

<120> 一种毒三素链霉菌及其应用

<130> 2013001

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）SIPI-2012406

<400> 1

caggggcggc gtgcttacca tgcaagtcga acgatgaacc tccttcggga ggggattagt 60

ggcgaacggg tgcctttacg gtgggcaatc tgcccttcac tctgggacaa gccctgcaaa 120

cggggtctaa taccggatac gactgcggaa ggcatcttcc gcggtggaaa gctccggcgg 180

tgaaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac caaggcgacg 240

acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc 360

gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga agcgaaagtg 420

acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480

gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggcca gtcacgtcgg 540

atgtgaaagc ccgaggctta acctcgggtc tgcattcgat acgggctggc tagagtgtgg 600

taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg 660

gtggcgaagg cggatctctg ggccattact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720

acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgttg ggaactaggt gttggcgaca 780

ttccacgtcg tcggtgccgc agctaacgca ttaagttccc cgcctgggga gtacggccgc 840

aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa 900

ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatat accggaaaca tccagagatg 960

ggtgccccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct gtgttgccag catgcccttc 1080

ggggtgatgg ggactcacag gagaccgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg 1140

tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaatg 1200

agctgcgata ccgtgaggtg gagcgaatct caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt 1260

ctgcaactcg accccatgaa gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacatg gcgaaagtcg gtaacacccg 1380

aagccggtgg cccaaccctt gtggagggag ccgtcgaagg tggagcggga gggg 1434

Claims

1.一种毒三素链霉菌，其分类命名为毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)SIPI-2012406，保藏编号为CCTCC NO:M 2013059，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1的毒三素链霉菌在制备链丝菌素中的应用。

3.权利要求2的应用，其中所述链丝菌素为链丝菌素B、链丝菌素C或链丝菌素D。

4.一种链丝菌素的制备方法，其包括以下步骤：

(a)将毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)SIPI-2012406置于三角瓶中进行种子培养，

(b)将步骤(a)获得的种子培养液转自发酵罐进行发酵，

(c)离心步骤(b)获得的发酵液，并将上清液进行纯化以获得链丝菌素。

5.权利要求4的方法，其中步骤(a)的培养方式为振荡培养，培养温度为25-30℃；转速为180-250r/min；培养时间为35-45小时。

6.权利要求4的方法，其中步骤(b)的培养方式为通气搅拌培养，培养温度为25-30℃；搅拌速度为400-600r/min；培养时间为40-50小时；培养期间的pH值为6.5-7.5。

7.权利要求4的方法，其中步骤(c)获得的链丝菌素为链丝菌素B、链丝菌素C或链丝菌素D。