CN111394277A - 一种微生物转化制备雷帕霉素衍生物的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种微生物转化制备雷帕霉素衍生物的菌株及其应用。所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)F9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年06月19日，保藏编号为CGMCC NO.7764。所述菌株用于转化制备雷帕霉素衍生物。本发明获得了一株对雷帕霉素具有转化作用的细菌，该菌以雷帕霉素为底物，经培养得到C1产物,经核磁解析C1结构为43‑β‑D‑吡喃葡萄糖‑雷帕霉素，具有抗肿瘤作用。

Description

一种微生物转化制备雷帕霉素衍生物的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种微生物转化制备雷帕霉素衍生物的菌株及其应用。
背景技术
雷帕霉素(rapamycin),又名西罗莫司(sirolimus)，是含氮三烯大环内酯类化合物，由吸水链霉菌AY B-994或吸水链霉菌FC904发酵产生，具有免疫抑制、抗真菌、抗增殖和抗肿瘤作用。雷帕霉素在延长哺乳动物生命周期方面具有潜在作用。最新研究表明,雷帕霉素能恢复阿尔茨海默病(AD)实验小鼠的相应缺陷症状，恢复认知和记忆水平，降低大脑组织的损伤。雷帕霉素对AD病具有缓解作用。
目前通过化学半合成的方法对雷帕霉素进行结构改造获得一些衍生物，例如，雷帕霉素43位分别被羟乙氧基、甲氧乙氧基、四氮唑取代的衍生物依维莫司(everolimus，RADO01)、biolimus A9、zotarolimus均已作为药物支架的涂料应用于临床；依维莫司、替西罗莫司(temsirolimus，CCI-779，43位被丙二酯取代)及deforolimus(AP23573，43位被亚磷酸取代)正在作为mTOR抗肿瘤靶向药物在临床应用或正处于临床试验中，这些半合成的雷帕霉素衍生物在水溶性或无免疫抑制活性等方面优于雷帕霉素。
目前开发微生物转化是对化合物进行结构修饰的一条有效途径，针对结构复杂的化合物，产生化学半合成难以获得的新化合物。因此，申请人尝试采用微生物转化的方法以期获得新的雷帕霉素衍生物。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种微生物转化制备雷帕霉素衍生物的菌株及其应用。
本发明是这样实现的：
本发明首先提供了一株微生物转化制备雷帕霉素衍生物的菌株，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)F9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年06月19日，保藏编号为CGMCC NO.7764。
本发明还提供了上述菌株在制备雷帕霉素衍生物中的应用。
所述制备的方法，包括以下步骤：
(1)菌株培养
将菌株接种于保藏培养基，保存备用；
(2)种子培养
将菌株转接于种子培养基，28℃、220r/min振荡培养15～18h；
(3)转化培养
将菌株以3％的接种量接种于转化培养基，28℃、220r/min振荡培养24h时，加入转化底物雷帕霉素至终浓度为250ug/mL后在相同条件下继续培养48h，得到含雷帕霉素衍生物的转化液。
所述种子培养基和转化培养基(以g/100mL计)：可溶性淀粉2.4，葡萄糖0.1，酵母浸出汁0.3，蛋白胨0.3，K2HPO4·3H200.1,MgSO4·7H2O 0.05，pH自然。
所述转化底物雷帕霉素，母液为30mg/mL，以乙醇配制。
将所述转化液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，每次20min，合并萃取液，减压浓缩至浸膏，浸膏进行HP20ss树脂柱层析梯度洗脱，洗脱液为丙酮：水体积比＝45：55-50：50，HPLC检测，收集出峰组分减压浓缩至浸膏，浸膏再进行硅胶柱梯度洗脱，采用的洗脱液为甲醇：二氯甲烷体积比＝1:10-1:5，HPLC跟踪检测，收集出峰组分减压浓缩至干。制备得到雷帕霉素衍生物C1。化合物C1结构为43-β-D-吡喃葡萄糖-雷帕霉素。
化合物C1具有抑制人胃癌细胞MGC80-3，人肾癌细胞769-p，人食管癌细胞ECA109，人前列腺癌细胞PC-3，人非小肺癌细胞A549，人黑色素瘤细胞A375等活性。可用于制备抑制肿瘤细胞药物。
本发明具有如下优点：本发明获得了一株对雷帕霉素具有转化作用的细菌，该菌以雷帕霉素为底物，经培养得到C1产物,经核磁解析C1结构为43-β-D-吡喃葡萄糖-雷帕霉素，具有抗肿瘤作用。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为空白对照1发酵产物HPLC图。
图2为空白对照2发酵产物HPLC图。
图3为菌株F9转化雷帕霉素的转化产物的HPLC图。
具体实施方式
1材料与方法
1.1菌株
从永安的土壤样品中分离到1200多株不同的微生物菌株，获得了一株对雷帕霉素具有转化作用的细菌，编号F9。
菌株的生理生化特性如下：
Figure BDA0002401268680000031
根据菌株的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析，所述菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
1.2菌株培养
细菌F9接种于营养琼脂，28℃培养24h，贮存4℃备用。
1.3转化培养
种子培养基和转化培养基(％)：可溶性淀粉2.4，葡萄糖0.1，酵母浸出汁0.3，蛋白胨0.3，K2HPO4·3H200.1,MgSO4·7H2O 0.05，pH自然(对配置水没有严格要求，自来水也可)。
细菌F9接种于种子培养基，28℃、220r/min振荡培养15～18h,以3％的接种量接种于转化培养基，28℃、220r/min振荡培养24h时，加入转化底物雷帕霉素(母液：30mg/mL，乙醇配制)至终浓度为250ug/mL后在相同条件下继续培养48h，收集转化液。转化液用等体积乙酸乙酯提取2次，每次20min，乙酯层40℃减压浓缩至干，用乙醇溶解后进行HPLC检测。
1.4转化产物的HPLC检测
检测仪：岛津10AD；色谱柱：ODS，5um；
流动相：甲醇-水(78：22)；检测波长：277nm，柱温：40℃。
1.5对照实验
1.5.1F9代谢产物的检测(空白对照1)
F9接种于种子培养基，28℃、220r/min振荡培养15～18h，以3％的接种量接种于转化培养基，28℃、220r/min振荡培养48h，收集发酵液，照1.3法抽提、检测。
1.5.2转化培养基对雷帕霉素的影响(空白对照2)
雷帕霉素(母液30mg/ml，乙醇配制)加入转化培养基至终浓度250ug/ml，28℃、220r/min振荡培养48h，收集培养液，照1.3法抽提、检测。
1.6转化产物C1的分离纯化
转化液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，每次20min；合并萃取液，40℃减压浓缩至浸膏。浸膏进行hp20ss树脂柱层析(丙酮：水(45：55—50：50)梯度洗脱，HPLC检测，收集所需的组分减压浓缩至浸膏。浸膏再进行硅胶柱(300目)层析，甲醇：二氯甲烷(1:10-1:5)梯度洗脱，HPLC跟踪检测，收集所需组分，40℃减压浓缩至干。
2 F9转化雷帕霉素的结果
2.1对照实验
F9发酵48h后发酵液抽提物HPLC分析(图1)，转化培养基添加雷帕霉素48h培养液抽提物的HPLC分析(图2)，均未见雷帕霉素转化产物。说明在菌株不加转化底物的情况下不产生转化产物，不加菌株仅有底物的情况下也不产生转化产物。
2.2 F9转化雷帕霉素的产物分析
F9转化雷帕霉素产生转化产物(图3)C1，经高分辨质谱分析，C1分子量[M+Na]+1098.5935，比雷帕霉素多161。
经核磁共振谱图分析其分子结构式如下，为43-β-D-吡喃葡萄糖-雷帕霉素。13C-NMR(DMSO-d6)d 99.62,78.31,76.86,76.72,70.13,61.09.1H-NMR(500MHz)d4.84(s,1H),4.37(s,1H),4.28(d,1H),3.67(m,1H),3.54(m,1H),3.46(m,1H),3.13(m,1H),3.05(m,1H),3.05(m,1H)。该结构目前无法通过化学半合成方法制备。
Figure BDA0002401268680000051
3转化产物的抗肿瘤效果
3.1实验材料
人胃癌细胞MGC80-3(上海细胞库)，人肾癌细胞769-p(上海细胞库)，人食管癌细胞ECA109(上海细胞库)，人前列腺癌细胞PC-3(上海细胞库)，人非小肺癌细胞A549(上海细胞库)，人黑色素瘤细胞A375(上海细胞库)，胎牛血清(hyclone)，F12培养基(hyclone)1640培养基(hyclone)。
3.2实验步骤
3.2.1样品制备
分别将样品(HPLC纯化产物)溶解在DMSO中使得溶度达到2mM，再分别稀释使得终浓度为10uM、5uM、2.5uM、1.25uM、0.625uM、0.3125uM、0.15625uM、0.078125uM。
3.2.2细胞培养
取处于指数增长期的肿瘤细胞分别种在96孔板里(细胞浓度为105个/ml，100ul/孔)，培养24hr其贴壁后，加100ul/孔带药新鲜培养基,每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔。继续培养至72hr，终止培养。
3.2.3SRB检测(SRB测定参考文V.Vichai and K.Kirtikara；
Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening,NatureProtocols,vol.1,no.3,pp.1112–1116,2006.)
将终止培养的细胞，每孔加10％TCA 50ul，4℃条件固定1hr。用蒸馏水冲洗5遍，自然晾干后每孔加入4mg/ml SRB溶液50ul，室温下染色30min，弃上清，用1％乙酸冲洗5遍以去除非特异性结合的染料。每孔加入150ul 10mM Tris溶液，震荡5分钟，在540波长下酶标仪测OD值，并计算抑制率。通过对抑制率的换算,使用SPSS软件计算出IC50值。
抑制率(％)＝(对照组OD值-测试组OD值)/对照组OD值×100％
3、结果与分析
Figure BDA0002401268680000061
Figure BDA0002401268680000071
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (5)

1.一株微生物转化制备雷帕霉素衍生物的菌株，其特征在于：为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)F9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年06月19日，保藏编号为CGMCC NO.7764。
2.一种如权利要求1所述的菌株在制备雷帕霉素衍生物中的应用。
3.根据权利要求2所述的菌株在制备雷帕霉素衍生物中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌株培养
将菌株接种于保藏培养基，保存备用；
(2)种子培养
将菌株转接于种子培养基，28℃、220r/min振荡培养15～18h；
(3)转化培养
将菌株以3％的接种量接种于转化培养基，28℃、220r/min振荡培养24h时，加入转化底物雷帕霉素至终浓度为250ug/mL后在相同条件下继续培养48h，得到含雷帕霉素衍生物的转化液。
所述种子培养基和转化培养基，以g/100mL计：可溶性淀粉2.4，葡萄糖0.1，酵母浸出汁0.3，蛋白胨0.3，K2HPO4·3H20 0.1,MgSO4·7H2O 0.05，pH自然。
4.根据权利要求3所述的菌株在制备雷帕霉素衍生物中的应用，其特征在于：所述转化底物雷帕霉素，母液为30mg/mL，以乙醇配制。
5.根据权利要求3所述的菌株在制备雷帕霉素衍生物中的应用，其特征在于：将所述转化液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，每次20min，合并萃取液，减压浓缩至浸膏，浸膏进行HP20ss树脂柱层析梯度洗脱，洗脱液为丙酮：水体积比＝45：55-50：50，HPLC检测，收集出峰组分减压浓缩至浸膏，浸膏再进行硅胶柱梯度洗脱，采用的洗脱液为甲醇：二氯甲烷体积比＝1:10-1:5，HPLC跟踪检测，收集出峰组分减压浓缩至干。
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