JPH04230399A - 微生物の新規な免疫抑制発酵産物 - Google Patents

微生物の新規な免疫抑制発酵産物

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JPH04230399A
JPH04230399A JP3162866A JP16286691A JPH04230399A JP H04230399 A JPH04230399 A JP H04230399A JP 3162866 A JP3162866 A JP 3162866A JP 16286691 A JP16286691 A JP 16286691A JP H04230399 A JPH04230399 A JP H04230399A
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JP
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compound
medium
formula
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therapeutically effective
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JP3162866A
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English (en)
Inventor
Brian R Petuch
ブライアン　アール．ペタック
Byron H Arison
バイロン　エッチ．アリソン
Shieh-Shung Tom Chen
シイエー−シュング　トム　チェン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck and Co Inc
Original Assignee
Merck and Co Inc
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】１９８３年に米国ＦＤＡは非常に有効な抗
拒否反応薬剤であるシクロスポリンを認可し臓器移植手
術の分野に大変革を起こした。この薬剤は体の免疫系が
移植片の異種タンパク質を拒絶する莫大な量の自然保護
物質を産生することを阻害することによって作用する。 この薬剤は移植拒否反応を予防するのに有効であるが、
肝損傷、腎不全及び潰瘍を引き起こす欠点をもち多くの
場合非常に重篤なものである。シクロスポリンより１０
０倍以上有効であるといわれる新規なマクロライド免疫
抑制剤ＦＫ−５０６がＨ．タナカ等による欧州特許第０
１８４１６２号で開示された。この引例は一般名イムノ
マイシンとしても知られているＦＫ−５２０を含む関連
化合物も開示している。本発明の新規な化合物はイムノ
マイシンに関係がある。イムノマイシンと関連化合物は
　Ｍ．　Ｅ．クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）　等による欧州
特許第３２３０４２号にも開示されている。しかしなが
ら本発明は先行技術の化合物とは容易に区別される著し
い構造上の相違点を有する。
【０００２】本発明は基質としてイムノマイシンを用い
、ＡＴＣＣ５５０６０としてアメリカンタイプカルチュ
アコレクションから入手することができる既知の微生物
である枯草菌ＭＢ−４９７４の菌株を有する栄養培地の
発酵によって生産される一連の新規な巨環状ラクトン類
に関する。従って本発明の目的はこのような新規な化合
物及びこのような化合物を微生物学的に製造する方法を
提供することである。更に本発明の目的はこれらの化合
物を発酵ブイヨンから回収及び精製する方法を提供する
ことである。これらの物質は免疫抑制活性を有する。 更に本発明の目的は本発明の次の記述から明らかになる
であろう。
【０００３】本発明は式
【化３】 （式中Ｒは糖残基である。）を有する一連の新規な巨環
状クラトンに関する。
【０００４】“糖残基”とは、環炭素原子に低級アルキ
ルで任意に置換されヒドロキシ基を低級アルキル又は低
級アルカノイルで任意に置換することができるポリヒド
ロキシ５又は６員環状アセタールを意味する。好適な糖
残基はグルコピラノシル、ガラクトピラノシル、リボフ
ラノシル、アラビノフラノシル、マンノピラノシル、キ
シロフラノシル等である。
【０００５】本発明によれば調節された条件下で基質と
して大環ラクトンを用いて既知の微生物、枯草菌亜種Ｍ
Ｂ−４９７４の菌株を増殖させることによって製造され
る一連の新規な化合物が記載される。これらの化合物は
発酵によって得られ、本明細書に記載される通り実質的
に純粋な形で回収される。
【０００６】培養指定ＭＢ−４９７４はニュージャージ
イ、ラーウェイのメルクアンドカンパニー社の培養蒐集
にある。本明細書に記載される化合物を産生することが
できるこの培養の試料は１２３０１パークラウンドライ
ブ、ロックヴィル、Ｍｄ２０８５２のアメリカンタイプ
カルチュアコレクションの永久培養蒐集で入手すること
ができ、受け入れ番号ＡＴＣＣ５５０６０を指定されて
いる。
【０００７】本化合物は枯草菌ＭＢ−４９７４菌株によ
り以下に記載される条件下適当な水性栄養培地の好気性
発酵中にイムノマイシンから産生される。これらの巨環
状化合物を生産する本方法では多くの抗生物質の生産に
使用されるような水性培地が適当である。このような栄
養培地は微生物によって同化される炭素源及び窒素源及
び一般に低レベルの無機塩類を含有する。更に発酵培地
は微生物の発育及び所望の化合物の生産に必要な痕跡量
の金属を含有することができる。これらは通常炭素及び
窒素の複合源に十分な濃度で存在し、栄養源として使用
することができるが勿論所望により培地に別々に添加す
ることができる。
【０００８】一般に糖例えばデキストロース、スクロー
ス、マルトース、ラクトース、デキストラン、セレロー
ス、コーンミール、オート麦粉等の炭水化物及びデンプ
ンが栄養培地中適当な同化炭素源である。培地中に利用
される炭素源の正確な量は幾分培地中の他の成分に依存
するが、通常培地の０．５〜５重量％の炭水化物量が十
分適していることが見い出される。これらの炭素源は個
々に使用することができるが、いくつかの炭素源を同一
培地中で混合してもよい。
【０００９】酵母加水分解物、酵母自己分解物、酵母細
胞、トマトペースト、コーンミール、オート麦粉、大豆
ミール、カゼイン加水分解物、酵母エキス、コーン浸漬
液、醸造可溶成分、綿実粉、肉エキス等の種々の窒素源
は本化合物の生産で枯草菌ＭＢ−４９７４によって容易
に同化される。種々の窒素源は単独で又は培地の０．２
〜６重量％の量で混合して使用することができる。
【００１０】培地中に混入することができる栄養無機塩
類はナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウ
ム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩素、炭酸等のイオン
を生じることができる慣用の塩である。またコバルト、
マンガン等の金属も痕跡包含される。以下に及び実施例
に記載される培地は使用することができる種々の培地を
単に例示するものであり、限定するものではないことは
特記すべきである。
【００１１】次は枯草菌ＭＢ−４９７４の菌株を発育さ
せるのに適当な培地の具体例である。 　　培地１ 　　　　デキストロース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ　　　
　デキストリン（フィッシャ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０．０ｇ　　　　牛肉エキス（デイフ
コ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３．０ｇ　　　　酵母分解物（アルダミンｐＨ，　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ　　　
　　　　　　　イースト　Ｐｒｏｄ．）　　　　ＮＺア
ミンタイプＥ（シェフフィールド）　　　　　　　　５
．０ｇ　　　　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．０５ｇ　　　　リン酸緩衝液　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２ｍｌ　　　　ＣａＣＯ３　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．５ｇ　　　　蒸留水　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１０００ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　ｐＨ７．０〜７．２リン酸緩衝液：ＫＨ２ＰＯ４　
　　　９１．０ｇＮａ２ＨＰＯ４　　　９５．０ｇ 蒸留水　　　　１０００ｍｌ ｐＨ７．０
【００１２】 　　培地２ 　　　　酵母エキス（ディフコ）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４．０ｇ　　　　麦芽エ
キス（ディフコ）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１０．０ｇ　　　　デキストロース　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４．０ｇ　　　　蒸留水　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０００ｍｌ　　　　寒天　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　２０ｇ　　　　　　　　　　　　　　
　　ｐＨ７．２
【００１３】 　　培地３ 　　　　基礎培地 　　　　　　スクロース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０３
ｇ　　　　　　Ｋ２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．２５ｇ　　　　　　グルコース　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１０ｇ　　　　　　Ｌ−アスパラギン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．８ｇ　　　　　　カザミノ酸（ディフコ）　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１
ｇ　　　　　　ＭｇＣｌ２　・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
．１２ｇ　　　　　　微量元素ミックス　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２ｍｌ　　　　　　蒸留水　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　７００ｍｌ　　　　　　寒天　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２２．０ｇ基礎培地７００ｍｌ当たりの
滅菌後添加物ＣａＣｌ２　溶液　１００ｍｌ（２９．５
ｇ／　蒸留水１０００ｍｌ）ＫＨ２ＰＯ４溶液　１００
ｍｌ（０．５ｇ／蒸留水１０００ｍｌ）Ｔｒｅｓ溶液　
１００ｍｌ（蒸留水１０００ｍｌ中トリスＨＣｌ　０．
３ｇ＋ＥＤＴＡ　０．１ｇ　＋　ＮａＣｌ　０．１４ｇ
　、ｐＨ８．０　に調整）　　　　微量元素ミックスＡ
組成 　　　　　　Ｆｅ（ＳＯ４）３・７Ｈ２Ｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２５０ｍｇ　　　　　　ＭｎＣｌ２　・４Ｈ２Ｏ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５００ｍｇ　　　　　　ＣｕＣｌ２　・
２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２５ｍｇ　　　　　　
ＣａＣｌ２　・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｇ　
　　　　　Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　５０ｍｇ　　　　　　（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４
・４Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２０ｍｇ　　　　　　ＺｎＳＯ４
　・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ　　　　　
　Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
ｍｇ　　　　　　０．１Ｎ　ＨＣｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０００ｍｌ
【００１４】 　　培地４ 　　　　デキストロース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ　　
　　大豆ミール　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ　
　　　酵母エキス（デイフコ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ　　　　Ｎａ
Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
　　　　ＭＥＳ緩衝剤　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．８ｇ　　
　　蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ　
　　　ｐＨ７．０
【００１５】 　　培地５ 　　　　デキストロース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５ｇ　　
　　ペプトン化ミルク（シェフフィールド）　　　　　
　　　　　　　２４ｇ　　　　アルダミンｐＨ（イース
トプロダクツ社）　　　　　　　　　　２．５ｇ　　　
　ポリグリコール２０００（ダウ）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２．５ｍｌ　　　　蒸留水　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ　　　　　　　　
　　　　　　　　ｐＨ７．０
【００１６】 　　培地６ 　　　　デキストロース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０％　　　
　酵母エキス（ディフコ）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２．０　　　　　　カザミノ酸
（ディフコ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２．０　　　　　　ＫＮＯ３　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．２　　　　　　ＭｇＳＯ４　
・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０．０５　　　　ＮａＣ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５　　　
　ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００
２５　　　　ＣａＣｌ２　・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．００２　　　　ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２Ｏ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．００１　　　　ＭｎＳＯ４　・Ｈ２Ｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．０００５　　　　蒸留水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１０００ｍｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　ＮａＯＨでｐＨ７．０
【００１６】 　　培地７ 　　　　デキストロース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１％　　　
　可溶性デンプン（フィッシャ）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１．０　　　　牛肉エキス　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．３　　　　酵母自己分解物（アルダミ
ンｐＨ，　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　
　　　　　　　　　　イーストプロダクツ）　　　　Ｎ
ＺアミンタイプＥ（シェフフィールド）　　　　　　　
　０．５　　　　　　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２Ｏ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．００５　　　　ＫＨ２ＰＯ４　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．０１８２　　　　Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．０１９０　　　
　ＣａＣＯ３　＊　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
５　　　　蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００
ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　　　ＮａＯＨでｐＨ
７．０〜７．２　　　　＊ｐＨ調整後添加
【００１７】枯草菌ＭＢ−４９７４を使用する発酵は約
２０〜４０℃の温度で行なうことができる。最適結果と
しては約２４〜３０℃の温度でこれらの発酵を行なうこ
とが最も都合がよい。約２７〜２８℃の温度が最適であ
る。本化合物を生産するのに適当な栄養培地のｐＨは約
５．０〜８．５に変化させることができ約６．０〜７．
５が好適である。
【００１８】小規模な発酵は栄養培地の適当量を既知の
滅菌技術を使用するフラスコ中に装填し、枯草菌ＭＢ−
４９７４の胞子あるいは栄養細胞増殖をフラスコに接種
し、フラスコをコットンでかるく栓をし、発酵を約２８
℃の恒温室中９５〜３００ｒｐｍ　の回転振盪機で約２
〜１０日間進行させることによって実施するのが都合が
よい。大規模な作業に対しては攪拌機と発酵培地に通気
する手段を備えた適当なタンクで発酵を行なうのが好適
である。栄養培地はタンク中で調製され、滅菌後枯草菌
ＭＡ−４９７４の栄養細胞増殖源を接種する。発酵は栄
養培地を約２４〜３７℃の温度で攪拌及び／又は通気し
ながら１〜８日間続けておく。通気の程度は発酵槽の大
きさ、攪拌速度等のいくつかの因子に依存する。一般に
大規模な発酵は約９５〜５００ｒｐｍ　及び１分当たり
約２〜２０立方フィート（ＣＦＭ）の空気で攪拌する。
【００１９】全発酵ブイヨンからの新規な化合物の分離
及び該化合物の回収は溶媒抽出及び種々のクロマトグラ
フィー技術と溶媒系でクロマトグラフィー分別の適用に
よって実施される。
【００２０】本化合物は水に難溶であるが、有機溶媒に
可溶である。この性質は発酵ブイヨンから化合物を回収
するために使用するのに都合がよい。従ってある回収方
法では、全発酵ブイヨンを有機溶媒のほぼ同量と混合す
る。任意の有機溶媒を使用することができるが酢酸エチ
ル、塩化メチレン、クロロホルム等の水不混和性溶媒を
使用することが好ましい。一般に最大回収を得るために
数回の抽出が望ましい。溶媒は本化合物並びに本化合物
の免疫抑制作用のない他の物質を除去する。溶媒が水不
混和性の場合、層を分離し、減圧下で有機溶媒を蒸発さ
せる。溶媒が水混和性の場合には水不混和性溶媒で抽出
して移送した水を分離することができる。次にこの溶媒
を減圧下で濃縮することができる。残留物を好ましくは
シリカゲルを含有するクロマトグラフィーカラムに装填
する。カラムが所望の生成物といくらかの不純物を保持
するが、不純物の多く、特に無極性不純物を通過させる
。カラムを塩化メチレン又はクロロホルムのような適度
の極性有機溶媒で洗浄して更に不純物を除去し、次に塩
化メチレン又はクロロホルム及びアセトン、酢酸エチル
、メタノール及びエタノール等が好適である有機溶媒の
混合物で洗浄する。溶媒を蒸発させ、残留物を更にクロ
マトグラフィー媒質としてシリカゲル、酸化アルミニウ
ム、デキストランゲル等を用い、溶離剤として種々の溶
媒及び溶媒を併用して、カラムクロマトグラフィー、薄
層クロマトグラフィー、分取用層クロマトグラフィー、
好ましくは逆相の高圧液体クロマトグラフィーを使用し
てクロマトグラフィー処理する。薄層、高圧、液体及び
分取用層クロマトグラフィーは本化合物の存在の検出及
び分離するために使用することができる。上述の技術並
びに当業者に既知の他の技術の使用は本化合物を含有す
る精製組成物を与える。所望の化合物の存在は、選択さ
れた寄生虫に対する生物学的作用又は物理化学特性に対
して種々のクロマトグラフィー画分を分析することによ
って決定される。本化合物の構造は化合物の様々なスペ
クトル特性、特に核磁気共鳴、質量スペクトル、紫外線
スペクトル及び赤外線スペクトルの詳細な分析によって
決定されている。
【００２１】適当な物質の製剤はまた酢酸塩のような分
子上のヒドロキシ基により生成した本発明の化合物の通
常医薬的に使用し得る生物活性エステルを包含する。
【００２２】本発明の化合物は免疫抑制活性、抗菌活性
等の薬理学的活性をもち、従って心臓、腎臓、肝臓、骨
髄、皮膚等の臓器又は組織の移植拒否反応、骨髄移植に
よる対宿主移植片疾患、リウマチ様関節炎、紅斑性狼瘡
、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖
尿病、葡萄膜炎等の自己免疫疾患の治療及び予防に有用
である。
【００２３】本発明の医薬組成物は有効成分として本発
明の化合物を外用内用又は非経口用に適した有機又は無
機担体又は賦形剤と混和して例えば固体、半固体又は液
体の医薬調製物として使用することができる。有効成分
は例えば錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐薬液剤、乳
剤、懸濁液剤及び使用に適した任意の他の形態の通常無
毒性の医薬的に使用し得る担体と配合することができる
。使用することができる担体は水、グルコース、ラクト
ース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプ
ンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンス
ターチ、ゲラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプ
ン、尿素及び固体、半固体又は液体形態の製造調製物の
使用に適した他の担体であり更に補助剤、安定化剤、濃
厚化剤、着色剤及び香料を使用することができる。目的
の有効化合物は病気の過程又は症状に対して所望の効果
を十分生じる量で医薬組成物に含まれる。
【００２４】この組成物をヒトに適用する場合、非経口
又は経腸投与によって適用することが好ましい。本発明
の化合物の治療的に有効な量の投薬量は治療される個々
の患者の年令及び症状で異なりまたこれらに依存するが
、有効成分約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．
１〜５００ｍｇ、更に好ましくは０．５〜１００ｍｇの
日用量（７０ｋｇの人に対して計算）が一般に病気を治
療するのに投与され一回の平均投与量約０．５ｍｇ、１
ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５
０ｍｇ及び５００ｍｇが一般に投与される。本発明は更
に次の実施例によって明確にされるが、これは具体的に
説明するものであり、限定するものではない。
【００２５】実施例 　　転換方法 　　転換法Ｉ：静止細胞生物転換 　　培地：種子培地Ａ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ｇ／ｌ　　　　デキストロース　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０
ｇ　　　　大豆ミール　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ
　　　　酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ　
　　　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
．０ｇ　　　　ＭＥＳ緩衝液　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．８
ｇ　　　　蒸留水１０００ｍｌ、ｐＨ７．０　　転換培
地Ｂ 　　　　滅菌グルコース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｇ　　　　
ＤＭＳＯ０．２ｍｌ中イムノマイシン　　　　　　　　
　　２００．０ｍｇ　　　　０．１ＭＥＳ緩衝液１００
０ｍｌ、ｐＨ６．０凍結乾燥管を無菌的に開け、２９．
５℃に於て回転振盪機（２２０ｒｐｍ）で４８時間種子
培地（２５０ｍｌのバッフル付きでない三角フラスコ中
５０ｍｌ）中で増殖させた。 次にこの種子（５ｍｌ）を使用して第２段階フラスコ（
培地Ａ、誘発物質としてイムノマイシン２０μｇ／ｍｌ
を含有する２５０ｍｌのバッフル付きでない三角フラス
コ中５０ｍｌ）に２９．５℃に於て回転振盪機（２２０
ｒｐｍ）で２４時間接種した。第２段階フラスコからの
細胞を遠心分離を用いて沈降させ、滅菌食塩水で１回洗
浄し、この細胞を培地Ｂに再浮遊させて静止細胞を調製
した。次のこの培養液を回転振盪機で２９．５℃に於て
１８時間温置した。
【００２６】転換法ＩＩ：アルギン酸塩固定化細胞生物
転換 培地：種子培地Ａ：方法１と同様 転換培地Ｃ 滅菌グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１０．０ｇＤＭＳＯ０．２ｍｌ中イム
ノマイシン　　　　　　　　　　２．０ｍｇＨ２Ｏ　中
０．１ＭＥＳ緩衝液／０．１Ｍ　ＣａＣｌ２　１０ｍｌ
、ｐＨ６．０上の方法Ｉで記載した第２段階フラスコか
らの沈降物を食塩水で２回洗浄し、細胞９．４ｇ（湿重
量）を食塩水１０ｍｌに再浮遊させた。この細胞混合液
に食塩水４０ｍｌ中ケルコＬＶアルギン酸０．７５ｍｇ
の溶液を加え、次にこの混合液を氷冷却０．１Ｍ　Ｃａ
Ｃｌ２にゆっくりと滴下した。この混合液を１５分間硬
化し、次にビーズをチーズクロスで濾過して集めた。ビ
ーズ２ｇを培地Ｃ１０ｍｌ中で２９．５℃に於て１８時
間温置した。
【００２７】温置後全ブイヨンを次の通り抽出した。 抽出方法 ａ．全ブイヨン１５０ｍｌを塩化メチレン７５ｍｌずつ
で３回抽出した。 ｂ．プールした塩化メチレン抽出液を無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、次に濾過真空下で濃縮して褐色油状物を得
た。 ｃ．この油状物を冷石油エーテルで２回洗浄し、再び真
空乾燥した。 ｄ．この油状物を０．１％　Ｈ３ＰＯ４を含むアセトニ
トリル：水混合液（４５％アセトニトリル）に溶解し、
５７℃に於て高性能液体クロマトグラフィー（ホワット
マンパーチシル１０　　ＯＤＳ−３、流速４．９ｍｌ／
分、アセトニトリル：水＋０．１％　Ｈ３ＰＯ４勾配、
２０分にわたって４５〜８０％アセトニトリルにする）
で精製した。 ｅ．保持時間１５．６分の画分をプールし、ｐＨ７．０
に調整した。次にこの混合液を真空下で濃縮して水性残
留物を得、次に塩メチレンで２回抽出した。 ｆ．有機抽出液をプールし、次に水で２回洗浄した。こ
の有機溶液を真空下４０℃で濃縮して本発明の化合物を
得、ラベルＬ−６８６．９７７とした。
【００２８】実施例１で得た化合物を無水トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）中で３７℃に於て１５分間加熱した。次
にこの反応混合液を真空下で濃縮乾固し、残留物をクロ
ロホルムに溶解した。この有機溶液を水で２回抽出し、
水性抽出液を合わせ、次に真空下５０℃で濃縮した。残
留物を水に溶解し中圧液体クロマトグラフィー（Ｃ−１
８セプパック）で精製した。次に水溶液を濃縮し、高性
能液体クロマトグラフィー（ブラウンリ−アミノ結合相
ＨＰＬＣカラム、９０％水性アセトニトリル）で精製し
て本発明の化合物の糖残基を得た。
【００２９】次の分析用データに基づき、本実施例の化
合物は次の構造式を有すると思われる。 Ｍ．Ｓ．　（ＦＡＢ）　ｍ／ｅ＝９５３　（Ｍ＋　）
【
００３０】この化合物の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクト
ルは添付の図１に示され、バリアンＸＬ−４００ＮＭＲ
分光計でＣＤＣｌ３　中室温に於て記録した。また比較
のために添付した図２はイムノマイシンのＮＭＲスペク
トルである。化学シフトは０ｐｐｍの内部標準としてテ
トラメチルシランに相対するｐｐｍ　で示す。
【００３１】上述した通り分離した開裂糖残基（以下の
構造のＲ）のＮＭＲスペクトルは添付の図３に示され、
これは基準グルコースのｎ．ｍ．ｒ．も含む。２つのス
ペクトルの比較は構造中のＲが以下に示される構造を有
するグルコースであることを示す。
【００３２】構造は次の通りである。
【化４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は４００ＭＨｚ　に於て測定した実施例と
して上述した本発明の化合物Ｌ−６８６．９７７の１Ｈ
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルである。
【図２】図２は４００ＭＨｚ　に於て測定したＬ−６８
３．５９０と数表示されているイムノマイシンのＮＭＲ
である。
【図３】図１は４００ＭＨｚ　に於て測定したＬ−６８
６．９７７の化学分解残基のＮＭＲスペクトル及び比較
として含むグルコースのＮＭＲスペクトルである。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　式 【化１】 （式中Ｒは糖残基である。）を有する化合物。
  2. 【請求項２】　　Ｒが ａ）グルコピラノシル、 ｂ）ガラクトピラノシル、 ｃ）グルカノピラノシル、 ｄ）リボフラノシル、 ｅ）アラビノフラノシル、 ｆ）マンノピラノシル又は ｇ）キシロフラノシル である請求項１記載の化合物。
  3. 【請求項３】　　Ｒが 【化２】 である請求項１記載の化合物。
  4. 【請求項４】　　請求項１記載の化合物の治療的に有効
    な量及び医薬的に使用し得る実質的に無毒性の担体又は
    賦形剤を包含している医薬組成物。
  5. 【請求項５】　　請求項２記載の化合物の治療的に有効
    な量及び医薬的に使用し得る実質的に無毒性の担体又は
    賦形剤を包含している医薬組成物。
  6. 【請求項６】　　請求項３記載の化合物の治療的に有効
    な量及び医薬的に使用し得る実質的に無毒性の担体又は
    賦形剤を包含している医薬組成物。
  7. 【請求項７】　　請求項１記載の化合物の治療的に有効
    な量をヒト宿主に投与することを特徴とするヒト宿主に
    於ける移植拒否反応の予防又は自己免疫疾患又は感染症
    の治療方法。
  8. 【請求項８】　　請求項２記載の化合物の治療的に有効
    な量をヒト宿主に投与することを特徴とするヒト宿主に
    於ける移植拒否反応の予防又は自己免疫疾患又は感染症
    の治療方法。
  9. 【請求項９】　　請求項３記載の化合物の治療的に有効
    な量をヒト宿主に投与することを特徴とするヒト宿主に
    於ける移植拒否反応の予防又は自己免疫疾患又は感染症
    の治療方法。
JP3162866A 1990-07-03 1991-07-03 微生物の新規な免疫抑制発酵産物 Pending JPH04230399A (ja)

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