CN113214213B

CN113214213B - 一种重排愈创木烷型倍半萜及其制备与应用

Info

Publication number: CN113214213B
Application number: CN202110413214.1A
Authority: CN
Inventors: 应优敏; 姚君毅; 田婷; 于航飞; 占扎君; 单伟光
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-04-16
Filing date: 2021-04-16
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-04-16
Also published as: CN113214213A

Abstract

本发明涉及植物化学与生物医药领域，具体涉及一种从瑞香狼毒Stellera chamaejasme根中提取分离得到一个新的重排愈创木烷型倍半萜及其制备方法与应用。本发明提供的重排愈创木烷型倍半萜结构如式(1)所示。经体外活性试验评价，本发明的化合物在体外能显著抑制大肠杆菌来源的β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性，可用于制备治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的创新药物。

Description

一种重排愈创木烷型倍半萜及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种从瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.根中分离得到的新结构重排愈创木烷型倍半萜及其制备方法和其在抑制大肠杆菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶活性方面的应用。

背景技术

瑞香狼毒S.chamaejasme L.为瑞香科狼毒属多年生草本植物，始载于《神农本草经》，一般以根部入药，味苦、性平、有毒、具有散结、逐水祛痰、破积杀虫之功效，主治水肿腹胀、痰食虫积、心腹疼痛、症瘕积聚、结核、疥癣等，民间主要用于治疗淋巴结核、神经性皮炎等病症。瑞香狼毒主要含有黄酮、木脂素、香豆素、二萜和挥发油等化学成分。现代药理学研究表明，来源于瑞香狼毒化学的成分在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗惊厥、抗癫痫等方面均表现出较好的活性。

肠道菌群是近年来生物医学领域的研究热点。研究表明，肠道菌可参与多种内、外源性物质的代谢，进而影响疾病的发生发展进程以及药物的吸收和代谢过程。肠道菌群可产生一类重要的水解酶——β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，GUS)，其可催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的苷元。肠道菌GUS可催化众多药物的葡萄糖醛酸苷产物发生水解，释放出毒性更强的苷元，后者在肠道内的过量累积会引起严重的迟发型腹泻。例如，GUS可催化7-乙基-10-羟基喜树碱-O-葡萄糖醛酸(SN-38G)的水解并生成具有强细胞毒作用的产物SN-38，而后者在肠道中累积可引发肠黏膜脱落并导致严重的迟发型腹泻等不良反应。因此，从中草药中筛选和发现肠道菌中GUS抑制剂，进而用于减缓伊立替康等药物引起的不良反应已成为肿瘤辅助治疗研究领域的一大热点。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种从瑞香狼毒S.chamaejasme L.中提取分离的具有药理活性的新的重排愈创木烷型倍半萜及其制备方法与应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的目的之一是，提供一种重排愈创木烷型倍半萜，分子式为C₁₅H₂₀O₃，结构如式(1)所示：

本发明的再一个目的是，提供一种所述重排愈创木烷型倍半萜的制备方法，包括以下步骤：

1)取瑞香狼毒根，自然风干后粉碎，用有机溶剂提取，提取液去除溶剂，得粗提物浸膏；

2)将粗提物浸膏用水悬浮后，用有机溶剂进行萃取，收集有机溶剂相，去除溶剂，得萃取物浸膏；

3)将步骤2)处理后的萃取物浸膏依次进行硅胶柱层析、MCI CHP20P柱层析、ODSC-18柱层析后，分段收集洗脱液，将洗脱液用薄层色谱法检测，合并含目标化合物的洗脱液，去除溶剂，得到式(1)所示化合物重排愈创木烷型倍半萜。

优选的，所述步骤1)中有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮。

优选的，所述步骤1)中有机溶剂的用量以瑞香狼毒质量计为2-5mL/g。

优选的，所述步骤1)中提取为室温浸泡提取，所述浸泡提取至少进行3次，每次提取时间为3-5天；所述室温为15-40℃。

优选的，所述步骤2)中水的用量以粗体物浸膏的质量计为2-5mL/g。

优选的，所述步骤2)中有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷。

优选的，所述步骤2)中有机溶剂与水的体积比例为1:(0.5-2)；萃取3-5次。

优选的，所述步骤3)中，将步骤2)处理后的萃取物浸膏以体积比为40:1～1:1的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂进行硅胶开放柱层析梯度洗脱，收集体积比为15:1的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂洗脱部位，减压浓缩除去溶剂得浓缩物I；将浓缩物I以体积比为30:70～100:0的甲醇/水为洗脱剂进行MCI CHP20P柱层析梯度洗脱，收集体积比为80:20的甲醇/水洗脱部位，减压浓缩除去溶剂得浓缩物II；再将浓缩物II以体积比为40:60～100:0的甲醇/水为洗脱剂进行ODS C-18柱层析梯度洗脱，以体积比为2:1的石油醚/丙酮为展开剂进行薄层层析检测，收集Rf值为0.5的组分，去除溶剂获得式(1)所示化合物；

更优选的，所述步骤3)中具体条件为，硅胶柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为40:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚(沸程60-90℃)/乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱4个柱体积；所述MCI CHP20P柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2个柱体积；所述ODS C-18柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2个柱体积；所述薄层色谱法检测的条件如下：用收集的洗脱液点样，采用硅胶GF₂₅₄薄层板，以石油醚(沸程60-90℃)/丙酮体积比为2:1的混合溶液为展开剂，展开结束后经10％硫酸-乙醇显色，合并Rf值约为0.5的洗脱液，去除溶剂获得式(1)所示化合物。

本发明的再一个目的是，提供一种所述重排愈创木烷型倍半萜在抑制β-葡萄糖醛酸苷酶中的应用。

优选的，所述β-葡萄糖醛酸苷酶为大肠杆菌来源。

本发明的再一个目的是，提供一种所述重排愈创木烷型倍半萜在治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻中的应用。

本发明经过简单提取分离，从瑞香狼毒S.chamaejasme L.根中获得重排愈创木烷型倍半萜，其具有较好的β-葡萄糖醛酸苷酶抑制活性，与阳性药物D-葡萄糖二酸1,4-内酯相当。

本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：

(1)通过有机溶剂浸提和色谱柱分离等系列流程得到化合物，制备方法具有简单、快速、获得的化合物纯度高等优点；

(2)化合物具有较好的β-葡萄糖醛酸苷酶抑制活性，与阳性药物D-葡萄糖二酸1,4-内酯相当，可以在治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻中获得应用。以此类化合物为先导物，开展结构优化，对于新型药源性腹泻治疗药物研发具有重要意义。

附图说明

图1是化合物1的¹H-NMR谱。

图2是化合物1的¹³C-NMR谱。

图3是化合物1的DEPT谱

图4是化合物1的HSQC谱。

图5是化合物1的¹H-¹H COSY谱。

图6是化合物1的HMBC谱。

图7是化合物1的NOESY谱。

图8是化合物1的高分辨质谱。

图9是化合物1的红外光谱。

图10是化合物1的圆二色(CD)谱。

图11是化合物1对EcGUS的浓度依赖抑制曲线。

图12为D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(DSL)对EcGUS的浓度依赖抑制曲线。

图13为用于判断化合物1抑制作用类型的Lineweaver Burk双倒数作图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的具体说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。。

实施例1化合物1的制备

1)粗提物的制备

瑞香狼毒10kg，自然风干后粉碎，用95％乙醇30L浸提4次(每次4天)，合并提取液，减压浓缩去除溶剂，得到粗提物浸膏(1300g)。

2)萃取

将上述粗提物浸膏悬浮于3L水中，以氯仿萃取，每次3L，共萃取3次；合并氯仿相，减压回收溶剂，得氯仿萃取物浸膏(122g)。

3)分离纯化

氯仿萃取物浸膏(122g)用200mL乙酸乙酯溶解，先经开放硅胶柱层析(硅胶200-300目，硅胶柱直径d＝8cm，高h＝50cm)初步分离，以体积比为40:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚(沸程60-90℃)/乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱4个柱体积(约10L)，流速自然，收集体积比为15:1的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂洗脱部位，减压浓缩除去溶剂得浓缩物I(13.6g)；浓缩物I(13.6g)用30mL甲醇溶解，经MCI CHP20P柱层析(柱直径d＝4cm，高h＝30cm)分离，以体积比为30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度洗脱2个柱体积(约800mL)，流速约10mL/min，收集体积比为80:20的甲醇/水洗脱部位，减压浓缩除去溶剂得浓缩物II(956.8mg)；浓缩物II(956.8mg)用3mL甲醇溶解，经ODS C-18柱层析(柱直径d＝4cm，高h＝30cm)分离，以体积比为40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度洗脱2个柱体积(约800mL)，流速约10mL/min，以薄层层析(展开剂为石油醚/丙酮＝2:1)为指导，合并Rf值约为0.5的斑点，得到重排愈创木烷型倍半萜化合物1(5.0mg)，化合物1如下所示：

实施例2化合物1的理化性质及波谱数据

化合物1：无色油状物；分子式为C₁₅H₂₀O₃，结构式为式(1)，不饱和度为六；旋光

红外光谱V_max：3362,1636,1093,1009,925,621cm^-1；氢谱及碳谱见表1；高分辨电喷雾质谱：m/z249.1494[M+H]⁺。

表1化合物1的核磁数据(CDCl₃；氢谱、碳谱分别在600和150MHz测定)

实施例3化合物1的体外β葡萄糖醛酸苷酶抑制活性评价

1)EcGUS抑制剂的初步筛选(抑制剂终浓度100μM)

抑制剂：将化合物1用二甲基亚砜(DMSO)配成10mM的溶液，待用。

底物：4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，购于Sigma-Aldrich)，用PBS缓冲液溶解配成2.5mM的溶液，待用。

酶：β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)冻干粉，用PBS缓冲液溶解后，稀释至1μg/mL，作为反应酶液。

阳性对照(DSL)：D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone，DSL，购于Sigma-Aldrich)，用DMSO溶解配成10mM的溶液，作为阳性对照。

反应：在96孔板中进行，反应体系如下。空白组：酶10μL+PBS缓冲液79μL+体积浓度10％DMSO水溶液1μL+2.5mM底物10μL；实验组：酶10μL+PBS缓冲液79μL+10mM抑制剂/阳性对照药1μL+2.5mM底物10μL；实验设置3个平行组。按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的OD值(期间于37℃下孵育)，通过计算得到化合物1在终浓度100μM下对EcGUS的相对活性值和抑制率。化合物1对EcGUS的抑制率为87.76％，高于阳性对照化合物DSL(抑制率66.76％)。

上述的具体计算过程如下：

Δ_OD＝OD_30min-OD_0min；

ΔC_PNP＝Δ_OD/0.003262(0.003262为文献报道的吸光度与PNP溶度的相关性系数)；

相对活性(％)＝实验组ΔC_PNP/空白组ΔC_PNP；

抑制率(％)＝1-相对活性(％)；

2)半数有效抑制浓度IC₅₀的测定：

根据初步筛选的结果，在终浓度0.1-1000μM区间内设置一系列浓度点(如0.1、1、20、40、50、100、250、400、500、1000μM)。反应在96孔板中进行，反应体系如下：空白组：酶10μL+PBS缓冲液70μL+体积分数1％DMSO水溶液10μL+2.5mM底物10μL；实验组：酶10μL+PBS缓冲液70μL+不同浓度抑制剂(化合物1)10μL+2.5mM底物10μL；每组设3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，然后在酶标仪405nm波长下分别测量0min和30min的OD值(期间于37℃下孵育)，通过计算得到抑制剂在不同浓度条件下对EcGUS的相对活性值，最后将抑制剂浓度(μM)取10为底的导数得到lg值，并以lg值为横坐标，相对活性为纵坐标，利用Graphad Prism 6.0软件拟合作图(图11和12)，并经软件分析分别得出抑制剂与阳性对照药的IC₅₀值。结果表明，化合物1对EcGUS的IC₅₀值为51.79±3.21μM，与阳性对照化合物DSL相当(表2)。

表2化合物1体外β葡萄糖醛酸苷酶抑制活性

3)化合物1对EcGUS的抑制类型研究：

抑制剂用PBS缓冲液配制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8mM的溶液(即终浓度为20、40、60、80μM)，底物用PBS缓冲液配制成浓度为2、3、5、10mM的溶液(即终浓度为200、300、500、1000μM)。底物与化合物1不同浓度的排列组合表见表3.

表3底物与化合物1不同浓度的排列组合表

注释：C_PNPG表示底物终浓度，C_IN表示抑制剂(化合物1)终浓度，О表示96孔板的一个样品孔，每个浓度组合做三组平行。

反应在96孔板中进行，反应体系如下：酶10μL+PBS 70μL+不同浓度抑制剂(化合物1)10μL+不同浓度底物10μL，每个组合设3个平行，按酶、PBS、抑制剂、底物的顺序加样，使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的吸光度(期间于37℃下孵育)，按步骤(3)计算不同浓度组合对应的PNP浓度差值(ΔC_PNP)，最后计算出1/V(μmol/min/mg)和1/PNPG值，V(μmol/min/mg)即酶的催化速度，表示在温度、pH值、底物浓度一定的条件下，每毫克酶每分钟催化产生产物的摩尔量；

计算过程如下：

1/V(μmol/min/mg)＝1/(ΔC_PNP*100/10/30/1)；1/PNPG＝1/ΔC_PNP；

其中，ΔC_PNP表示0min和30min体系中PNP的浓度差，100表示反应体系100μL，10表示酶的加入量10μL，30表示反应时间30min，1表示酶的浓度为1μg/mL。

最后利用Graphad Prism 6.0软件绘制抑制双倒数曲线图(图13)，根据曲线交点判断抑制剂类型，从图13可以发现图像在第二象限存在交点，表明化合物1对EcGUS的抑制属于混合型抑制，与酶的活性位点和变构位点均能产生结合。

实施例4

步骤1)有机溶剂为甲醇，用量为5mL/g，25℃下浸泡5次，每次3天，其他操作方法同实施例1，得到化合物1。

实施例5

步骤1)有机溶剂的用量为2mL/g，30℃下浸泡3次，每次4天，其他操作方法同实施例1，得到化合物1。

实施例6

步骤2)中水的用量以粗体物浸膏的质量计为5mL/g，步骤2)有机溶剂为二氯甲烷，步骤2)有机溶剂与水的体积比为1:2，萃取3次，其他操作方法同实施例1，得到化合物1。

以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种重排愈创木烷型倍半萜在制备抑制β-葡萄糖醛酸苷酶的药物中的应用，所述重排愈创木烷型倍半萜的分子式为C₁₅H₂₀O₃，结构如下所示：

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2.一种重排愈创木烷型倍半萜在制备治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物中的应用，所述重排愈创木烷型倍半萜的分子式为C₁₅H₂₀O₃，结构如下所示：

。