CN103848843A - 魁蒿有效成分提取方法及该成分在抗植物病害中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对植物病毒和植物细菌具有抑制作用的活性物质的制备方法及其用途。制备方法是以贵州魁蒿为原料，晒干后粉碎，用乙醇提取；将乙醇提取物用氯仿萃取；将氯仿萃取层也减压浓缩得到粗提物；将氯仿粗提物经硅胶柱层析，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯混合洗脱剂进行梯度洗脱，再经若干次硅胶柱层析法等纯化手段，得到两个单体化合物，分别是8α-羟基蒿萜和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮。经生物活性测试表明，单体化合物I对黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒等植物病毒有较好的防治作用。5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮对番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病等细菌性病害病原菌具有良好的抑制作用。

Description

魁蒿有效成分提取方法及该成分在抗植物病害中的应用
技术领域
本发明属于植物源农药技术领域，涉及能抑制植物病害活性物质的制备方法及其应用，具体的说，是以产于贵州的一种植物-魁蒿为原料，采用各种化学手段和方法提取其中的活性物质，活性物质对植物病毒和细菌病菌具有较高抑制作用。
背景技术
植物病毒是一类危害大且难防治的植物病害，有“植物癌症”之称，一旦发病，很难防治。黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒是粮经作物生产中的主要病毒病，农作物受其危害而不同程度的减产、影响品质，甚至绝收。据统计，全世界每年由黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒的危害就造成约数十亿多美元的经济损失，目前我国农作物受其危害而损失严重，且尚无特效的防治药剂。目前，市场上销售的大多数抗作物病毒制剂防治效果差，缺乏有效防控技术。因此，寻找具有高效、低毒、及环境友好型抗病毒活性药物已成为当前亟待解决的问题。
植物细菌病害与病毒病害一样，呈现出发生频度高、成灾重、发生范围广、防控难度大、危害程度重等特点，给农业生产造成了巨大的经济损失，严重影响我国粮食与经济作物生产安全。目前市场上用于防治植物细菌的农药主要是铜制剂，如噻菌铜、可杀得等，但铜制剂易被雨水冲刷而失去药效，持效期太短，防治效果差等。因此，研究和开发高效、低毒、低残留、环境友好型抑制植物细菌病害的农药迫在眉睫。
研究发现，很多天然植物中的化学成分，具有高效、低毒，低残留以及环境友好的特点，因此，提取天然产物中的有效化学成分，寻找到具有较高活性的先导化合物，已成为当前研究绿色农药的热点之一。
魁蒿属于菊科蒿属多年生草本植物，学名Artemisia princepsPamp. 又名野艾蒿，王侯蒿（云南），五月艾（广东），野艾（湖南），艾叶、黄花艾、端午艾（广西）。多产于我国辽宁（南部）、内蒙古（东南部）、河北（南部）、山西（南部）、陕西（南部）、甘肃（南部）、山东、江苏、安徽、江西、福建、台湾、河南、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南；多生于低海拔或中海拔地区的路旁、山坡、灌丛、林缘及沟边。此外，该植物在日本、朝鲜也有分布。魁蒿作为一味中药具有祛风除湿、调经安胎等功效。民间入药，作“艾”的代用品，有逐寒湿、理气血、调经、安胎、止血、消炎等的功效。据文献报道，魁蒿含有的主要化学成分可分为挥发油、倍半萜、黄酮以及甾体等。
据《中华本草》中记载，魁蒿叶中含有挥发油0.45%-1.00%，有2-甲基丁醇、2-己烯醛等60种成分，还有黄酮类、桉叶烷类、三萜类等成分；魁蒿叶具有平喘、镇咳、祛痰、消炎等作用。临床上用于治疗慢性支气管炎、肺气肿、支气管哮喘等。(《中华本草》编委会. 《中华本草》[M]. 上海，上海科学技术出版社，1999. 第十九卷(7). 668. )
2011年，Ryu等报道了魁蒿的挥发油及其成分能够抑制皮肤的瘙痒症状，作者以成年大鼠为试验品做止痒试验，结果表明，魁蒿的挥发油及其化学成分-叶绿醇能够明显抑制过敏性细胞因子(NF-κB, AP-1)的激活和表达，从而达到抑制皮肤瘙痒的作用(Ryu, K. R.; Choi J. Y.; Chung S.; et al. Anti-scratching Behavioral Effectof the Essential Oil and Phytol Isolatedfrom Artemisia princepsPamp. in Mice[J]. Planta Med, 2011, 77: 22-26. )
2011年，Trinh等报道了魁蒿挥发油的主要化学成分对加德纳菌和白色念珠菌具有较好的抑制作用，作者以成年大鼠为试验品做止痒试验，发现了魁蒿的挥发油及其化学成分能够抑制大鼠体内微生物的生长，其中α-松油醇能够很好的抑制大鼠体内加德纳菌和白色念珠菌的生长，其MIC值可达到0.06和0.125%(V/V)。(Trinh, H. T.; Lee, I. A.; Hyun, Y. J.; et al. Artemisia princepsPamp.Essential Oil and Its ConsitituentsEucalyptol and α-terpineol AmeliorateBacterial Vaginosis and Vulvovaginal Candidiasisin Mice by Inhibiting Bacterial Growth and NF-κBActivation[J]. Planta Med, 2011, 77: 1996-2002. )
总之，魁蒿对部分植物真菌病菌具有一定的抑制作用，然而，该植物在农用活性的研究较少，因此，本发明的发明人对魁蒿的化学成分进行提取和分离，研究其在农用活性方面的作用，发现了其中的化学成分8α-羟基蒿萜对烟草花叶病毒有良好的抑制作用，5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮对抗植物病毒和细菌病害具有较好的抑制作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:针对缺乏黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒和番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病的防治药物或药剂，提供对抗植物病毒和细菌病害具有较高抑制作用的植物源活性化合物的提取方法。发明人在研究中发现黔产魁蒿中的化学成分8α-羟基蒿萜即化合物I在钝化作用方面对黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒有良好的抑制作用，5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮即化合物II对番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病具有较好抑制作用。
为达到上述目的，本发明提供贵州魁蒿中单体化合物8α-羟基蒿萜和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮的提取方法及其分别在抗植物病毒和细菌病害中的应用：
本发明魁蒿有效成分的提取方法，所指魁蒿的有效成分为8α-羟基蒿萜,简称化合物I和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮,简称化合物II,其结构式分别为:
Figure 2014101002964100002DEST_PATH_IMAGE001
               
化合物I和化合物II的提取方法按下列步骤进行:
（1）以产于贵州的魁蒿为原料，晒干后粉碎，并在85%工业乙醇中加热回流提取2次，每次2.5小时，过滤后将滤渣用70%的工业乙醇加热回流提取2小时，过滤，将三次滤液合并，然后再减压浓缩除醇，得到乙醇提取物。
（2）向乙醇粗提物加少量蒸馏水，并将其在超声仪中分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩脱除溶剂后，得到石油醚层提取物、氯仿层提取物、乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物和水层提取物。
（3）将上述氯仿层提取物用无水乙醇溶解，经硅胶柱层析，然后依次用石油醚：乙酸乙酯=20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测后合并相同组分，共得到8个部分粗分段：Fr.1～Fr.8。
（4）将上述Fr.4 部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到5个部分：Fr.4-1～Fr.4-5。其中所得Fr.4-3部分，再以硅胶柱层析法分离纯化，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=3:1洗脱，所得流分减压脱溶后，得到白色粉末状固体，经丙酮重结晶后，得到白色粉末状固体32 mg，经1H NMR、13C NMR及LC-MS鉴定结合文献对照，确定其为8α-羟基蒿萜(I)。
（5）将上述Fr.5部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到8个部分:Fr.5-1～Fr.5-8。
（6）将上述Fr.5-3部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=2:1洗脱剂进行洗脱，并减压浓缩时，有大量黄色絮状物析出，用石油醚：丙酮=1:2的混合溶剂重结晶该黄色絮状物，最后得到黄色粉末状固体143mg，经1H NMR、13C NMR及LC-MS鉴定结合文献对照，确定其为5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮。
本发明所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用,是根据8α-羟基蒿萜即化合物I对植物病毒病具有良好抑制作用的性质,用于制备抑制植物病毒的药物或药剂;根据5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮即化合物II对植物细菌具有较好抑制作用的性质,用于制备抑制植物细菌病菌的药物或药剂。 
本发明所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用, 是指化合物I用于制备抑制黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒等病毒抑制的药物或药剂。
本发明所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用, 是指化合物II用于制备抑制番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病等细菌病菌抑制的药物或药剂。
上述所指的剂型包括农药的各种剂型。
附图说明
图1,8α-羟基蒿萜即化合物I制备工艺流程图；
图2, 5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮即化合物II制备工艺流程图。
具体实施方式
实施例1,魁蒿有效成分的提取方法依次按下列步骤进行:
（1）将经过干燥并粉碎的魁蒿20kg在85%工业乙醇中加热回流提取2次，每次2.5小时，过滤后将滤渣用70%的工业乙醇加热回流提取2小时并过滤，将三次滤液合并，然后再减压浓缩除醇，得到乙醇提取物。
（2）向乙醇粗提物加少量蒸馏水，并将其在超声仪中分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩脱除溶剂后，得到石油醚层提取物、氯仿层提取物、乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物和水层提取物。
（3）将上述氯仿层提取物用无水乙醇溶解，经硅胶柱层析，然后依次用石油醚：乙酸乙酯=20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测后合并相同组分，共得到8个部分:Fr.1～Fr.8。
（4）将上述Fr.4 部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到5个部分：Fr.4-1～Fr.4-5。其中所得Fr.4-3部分，再以硅胶柱层析法分离纯化，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=3:1洗脱，所得流分经减压脱溶后，得到白色粉末状固体，经丙酮重结晶后，得到白色粉末状固体32 mg，经1H NMR、13C NMR及LC-MS鉴定结合文献对照，确定其为8α-羟基蒿萜(I)。
（5）将上述Fr.5部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到8个部分：Fr.5-1～Fr.5-8。
（6）将上述Fr.5-3部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=2:1混合洗脱剂进行洗脱，并减压浓缩时，有大量黄色絮状物析出，用石油醚：丙酮=1:2的混合溶剂重结晶该黄色絮状物，最后得到黄色粉末状固体143mg，经1H NMR、13C NMR及LC-MS鉴定结合文献对照，确定其为5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮。
化合物结构如下所示：
Figure 427002DEST_PATH_IMAGE001
               
Figure 35838DEST_PATH_IMAGE002
化合物理化数据及波谱数据：
化合物I：白色粉末状固体; m.p. 188-190°C;分子式：C15H20O4; ESI-MS m/z: 287 [M+Na]+;1H NMR(DMSO-d 6 , 500MHz) δ: 5.54(1H, s, 3-H), 4.79(1H, d,J=5.2Hz,H-8β), 3.93(1H, t, J=10.5Hz, H-6), 3.51(1H, br s, 8-OH), 2.92(1H, d, J=10.5Hz, H-5), 2.70(1H, d, J=17.75Hz,H-2α)，2.56(1H, m, H-9β), 2.10(2H, m, H-2β and H-9α), 1.98(1H, d, J=17.2Hz, H-2β), 1.61(1H, m, H-7), 1.82(3H, s, H-15), 1.24(3H, s, H-14), 1.18(3H, d, J=6.85Hz, H-13); 13C NMR(DMSO-d 6 , 125MHz) δ: 178.4(C-12), 140.8(C-4), 124.8(C-3), 79.0(C-6), 72.2(C-1), 68.2(C-8), 60.6(C-10), 59.8(C-7), 51.5(C-5), 44.1(C-9), 40.4(C-11), 39.1(C-2), 22.1(C-14), 17.8(C-15), 15.7(C-13).与文献(Wong H. F.; Geoffrey D. B. Dimeric Guaianolides and a Fulvenoguaianolide from Artemisia myriantha [J] . J. Nat. Prod. 2002, 65: 481-486.)所报道化合物波谱数据一致。由以上数据及文献资料可以确定化合物(I)的结构。
化合物II：黄色粉末状固体; m.p. 209～211°C;分子式：C18H16O7; ESI-MS: m/z:367[M+Na]+; 1H NMR(DMSO-d 6, 500MHz) δ: 7.60-7.63(2H, m, H-2’ and H-6’ ), 3.94(3H, s, 7-OCH3), 3.91(3H, s, 6-OCH3), 3.74(3H, s, 3’-OCH3); 13C NMR(DMSO-d 6, 125MHz) δ:182.2(C-4), 163.8(C-2), 158.4(C-9), 152.5 (C-7), 151.9(C-5), 150.7(C-4’), 147.9(C-3’), 131.7(C-6), 121.3(C-1’), 120.3(C-6’), 115.6(C-5’), 110.0(C-2’), 104.9(C-10), 102.9(C-3), 91.5(C-8), 59.9(7- OCH3), 56.3(6- OCH3), 55.8(3’- OCH3). 与文献(Chris O.; Roger A.; Eddy L.; et al. Three Methylated Flavones from Thymus Vulgaris[J] . Phytochemistry,1982, 21(10): 2581-2583.)所报道化合物波谱数据一致。由以上数据及文献资料可确定化合物II的结构。
实施例2：
化合物8α-羟基蒿萜 抗黄瓜花叶病毒活性测试（半叶枯斑法）。
抗黄瓜花叶病毒活性测试试验按下列步骤顺序进行：
(1)病毒提纯
采用Gooding方法(Gooding G V jr, Hebert T T.A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities[J]. Phytopathology, 1967, 57, 1285.)，选取接种3周以上，CMV系统侵染寄主Nicotianatabacum. L植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，再加10%氯仿:正丁醇(1:1) 匀浆，双层纱布过滤，1000g离心即得到CMV的粗提液体。整个实验在4°C下进行(深见顺一，上杉康彦〔日〕，李树正，王笃枯，焦书梅译. 农药实验法―杀菌剂篇[M] 北京：农业出版社，1991, 93-94.)。用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。
病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1%1cm260nm
其中 E表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液，在光程为1cm时的光吸收(光密度)值。CMV的E0.1%1cm260nm是5。
(2)药剂对CMV的活体钝化作用
将供试药剂8α-羟基蒿萜(I)与等体积的病毒汁液混合钝化30 min，摩擦接种苋色藜左半叶，灭菌水与病毒汁液混合接种右半叶。3～4天后记录枯斑数。
(3)药剂对CMV侵染的活体治疗作用
选长势一致的苋色藜，先用毛笔蘸取病毒汁液，全叶接种病毒，接种后用水冲洗。待叶片干后，在左半叶涂施供试药剂8α-羟基蒿萜，右半叶涂施灭菌水作对照。3～4天后记录枯斑数，计算抑制率。其中，未涂施药剂半叶的平均枯斑数和涂施供试药剂8α-羟基蒿萜半叶的平均枯斑数都采用各组三次重复的平均数。
本发明实施例辅以说明本发明的技术方案，但实施例的内容并不局限于此，实验结果如表1所示。
 表1化合物8α-羟基蒿萜(I)对黄瓜花叶病毒的保护和治疗活性 
化合物 浓度(μg/mL) 治疗活性(%) 钝化活性 (%)
 I 500 57.5 82.6
宁南霉素 500 55.1 87.2
 实验结果表明：在500 μg/mL浓度下，化合物8α-羟基蒿萜对黄瓜花叶病毒的钝化活性、钝化活性分别为82.6%和57.5%。
实施例3：
化合物8α-羟基蒿萜 抗烟草花叶病毒活性测试（半叶枯斑法）。
抗烟草花叶病毒活性测试试验按下列步骤顺序进行：
(1)病毒提纯：
采用Gooding等方法(Gooding G. V. jr ;Hebert T T. , A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities [J] . Phytopathology, 1967, 57(11): 1285-1290.)，选取接种3周以上，TMV系统侵染寄主Nicotiana tabacum. L植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，1000g离心，经2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到TMV的粗提掖。整个实验在4°C下进行（深见顺一，上杉康彦〔日〕，.李树正，王笃枯，焦书梅译. 农药实验法――杀菌剂篇[M]. 北京：农业出版社，1991, 93-94.）。用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。
病毒浓度（mg/mL）＝（A260×稀释倍数）/E0.1% 1cm 260nm
其中 E表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％（1mg/mL）的悬浮液，在光程为1cm时的光吸收（光密度）值。TMV的E0.1% 1cm 260nm是3.1。
(2)药剂对烟草花叶病毒侵染的活体钝化作用：
选健康且长势一致的心叶烟，暗室中放置一夜。每株心叶烟挑选水平位置相同的3片烟叶，将已配制好的浓度为500μg/mL供试药剂8α-羟基蒿萜 与等体积的病毒汁液混合钝化30 min，摩擦接种心叶烟的左半叶片，灭菌水与病毒汁液混合摩擦接种右半叶片。3-4天后记录枯斑数。防效的计算公式如下：
防效=（右半叶枯斑数-左半叶枯斑数）/右半叶枯斑数??100%
按照以上方法测定，化合物8α-羟基蒿萜 抗烟草花叶病毒钝化作用活性见表2。
表2化合物8α-羟基蒿萜(I)抗烟草花叶病毒钝化作用活性
供试药剂 浓度(μg/mL) 抑制率(%)
8α-羟基蒿萜 500 80.2
宁南霉素 500 91.1
实验结果表明：化合物8α-羟基蒿萜 在钝化作用方面对烟草花叶病毒具有一定的抑制活性，在500 μg/mL浓度下，其抑制率为80.2%。
实施例3：
化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 体外抑制番茄青枯病菌活性测定（浑浊度法）。
采用浊度法测试了目标化合物的番茄青枯病抗菌活性。将供试化合物7.5mg溶解在150??L的二甲基亚砜（DMSO）中，并用含吐温-20（0.1%）的水溶液配制成200和100μg/mL，DMSO的无菌蒸馏水作为空白对照，可杀得作为阳性对照，1mL供试药剂5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 样品液加入到4mL无毒的营养肉汤（TM, 蛋白胨10克，糖5克，酪蛋白酸水解物1克，1000毫升蒸馏水，pH值7～7.2）的试管中，然后加入大约40??L含TM番茄青枯菌到5mL供试化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 和商品对照药剂可杀得。接种后的试管置于30±1°C、180转不断振摇48 h，将各个浓度的菌液在分光光度计上测定OD值（600nm）。并且另外测定浓度为200μg/mL、100μg/mL药剂和对照药剂的培养基OD值，对药剂本身造成的OD值进行校正。校正OD值和防效的计算公式如下：
校正OD值＝含菌培养基OD值－无菌培养基OD值
防效＝（校正后对照培养基菌液OD值－校正含毒培养基OD值）/校正后对照培养基菌液OD值×100%
按照以上方法测定，化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 的抑制番茄青枯病菌活性见表3。
 
Figure 209331DEST_PATH_IMAGE003
实验结果表明：5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮对番茄青枯病具有较好的抑制作用，在200μg/mL的浓度下，抑制番茄青枯病菌作用均高于商品化药剂可杀得；在100μg/mL的浓度下，抑制番茄青枯病菌作用高于商品化药剂可杀得。
实施例4：
化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 体外抑制烟草青枯病菌活性测定（浑浊度法）。
室内测试抑制烟草青枯病菌活性试验按下列步骤顺序进行：
将烟草青枯病病原菌（由贵州省烟科所提供）在NA固体培养基（蛋白胨5g，酵母粉1g，葡萄糖10g，琼脂18g，蒸馏水1L，PH=7.0-7.2）上面进行划线，在28°C下培养直到长出单菌落。取NA固体培养基上烟草青枯病病原菌单菌落至液体NA培养基中，在30°C、180rpm恒温摇床震荡培养到对数生长期备用。
将供试药剂5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 和对照药剂分别配制成浓度为200mg/L、100mg/L的含毒NB液体培养基（牛肉膏3g，蛋白胨5g，酵母粉1g，葡萄糖10g，蒸馏水1L。Ph=7.0-7.2），取5mL至试管中，加入40μL含有青枯病病菌的NA液体培养基，在30°C、180rpm恒温摇床振荡培养2天，将各个浓度的菌液在分光光度计上测定OD值（600nm）。并且另外测定浓度为200μg/mL、100μg/mL药剂和对照药剂的NB液体培养基OD值，对药剂本身造成的OD值进行校正。校正OD值和防效的计算公式如下：
校正OD值＝含菌培养基OD值－无菌培养基OD值
防效＝（校正后对照培养基菌液OD值－校正含毒培养基OD值）/校正后对照培养基菌液OD值×100%
按照以上方法测定，化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 的抑制烟草青枯病菌活性见表4。
 
Figure 2014101002964100002DEST_PATH_IMAGE004
实验结果表明：5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮对烟草青枯病具有较好的抑制作用，在200μg/mL和100μg/mL的浓度下，抑制烟草青枯病菌作用均高于商品化药剂噻菌铜；在100μg/mL的浓度下，抑制烟草青枯病菌作用高于商品化药剂可杀得。
本发明是从黔产魁蒿提取出化合物8α-羟基蒿萜 和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 ，其中，发现化合物I对在钝化作用方面对烟草花叶病毒具有良好的抑制作用，在500 μg/mL浓度下，其抑制率为80.2%。发现化合物II对烟草青枯病菌具有较好的抑制作用，在药剂浓度为200μg/mL和100μg/mL时，抑制烟草青枯病菌作用均高于商品药剂噻菌铜，在药剂浓度100 μg/mL时，抑制烟草青枯病菌作用略高于商品药剂可杀得。化合物8α-羟基蒿萜 和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 是源自于天然植物魁蒿的化学成分，化合物I对烟草花叶病毒有良好的抑制活性，化合物II对烟草青枯病菌具有较好的抑制活性，化合物8α-羟基蒿萜 是可用于防治烟草花叶病毒的药物，化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 是可用于防治烟草青枯病菌的药物。
实施例5：
化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 室内抑制水稻白叶枯和水稻细菌性条斑病病原菌活性测定
实验方法
将水稻白叶枯或者水稻细菌性条斑病病原菌在M210（酶水解酪素：8 g，蔗糖：5 g，酵母提取物：4 g，K2HPO4：3 g，MgSO4??7H2O：0.3 g，琼脂：15 g，二次水：1 L，pH=7.0）固体培养基上面进行划线，在28℃下培养直到长出单菌落。挑取M210固体培养基上水稻白叶枯或者水稻细菌性条斑病病原菌单菌落至M210液体培养基（酶水解酪素：8 g，蔗糖：5 g，酵母提取物：4 g，K2HPO4：3 g，MgSO4·7HO：0.3 g，二次水：1 L，pH=7.0）中，在28 ℃、180 rpm恒温摇床振荡培养到生长对数期备用。
将化合物5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮 和商品对照药剂分别配置成浓度为200、100 ??g/mL的含毒M210液体培养基，加入40 μL上述制备的含有水稻白叶枯或者水稻细菌性条斑病病原菌的M210液体培养基，在28 ℃、180 rpm恒温摇床振荡培养24～48 h，将各个浓度的菌液在酶标仪上测定OD值(OD595)。并且另外测定浓度为200、100 ??g/mL药剂和对照药剂的M210液体培养基OD值，对药剂本身造成的OD值进行校正。校正OD值和抑制率的计算公式如下：
校正OD值＝含菌培养基OD值－无菌培养基OD值；
抑制率＝（校正后对照培养基菌液OD值－校正含毒培养基OD值）/校正后对照培养基菌液OD值×100%；
按照以上方法测定，部分目标化合物的抑制活性见表5和表6。
Figure 157695DEST_PATH_IMAGE005
Figure 2014101002964100002DEST_PATH_IMAGE006
由表5和表6可以看出：在测试浓度下，化合物II对水稻白叶枯和水稻细菌性条斑病病原菌均具有一定的抑制活性。在200和100μg/mL浓度下，所测试的化合物对水稻白叶枯和水稻细菌性条斑病病原菌的抑制率均在70%以上，均优于对照药剂叶枯唑和噻菌铜。

Claims (5)

1.魁蒿有效成分的提取方法，其特征在于：所指魁蒿的有效成分为8α-羟基蒿萜,简称化合物I和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮,简称化合物II,其结构式分别为:
               
Figure 2014101002964100001DEST_PATH_IMAGE003
化合物I和化合物II的提取方法按下列步骤进行:
（1）以产于贵州的魁蒿为原料，晒干后粉碎，并在85%工业乙醇中加热回流提取2次，每次2.5小时，过滤后将滤渣用70%的工业乙醇加热回流提取2小时，过滤，将三次滤液合并，然后再减压浓缩除醇，得到乙醇提取物;
（2）向乙醇粗提物加少量蒸馏水，并将其在超声仪中分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩脱除溶剂后，得到石油醚层提取物、氯仿层提取物、乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物和水层提取物;
（3）将上述氯仿层提取物用无水乙醇溶解，经硅胶柱层析，然后依次用石油醚：乙酸乙酯=20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测后合并相同组分，共得到8个部分粗分段：Fr.1～Fr.8;
（4）将上述Fr.4 部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到5个部分：Fr.4-1～Fr.4-5；
其中所得Fr.4-3部分，再以硅胶柱层析法分离纯化，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=3:1洗脱，所得流分减压脱溶后，得到白色粉末状固体，经丙酮重结晶后，得到白色粉末状固体32 mg，经1H NMR、13C NMR及LC-MS鉴定结合文献对照，确定其为8α-羟基蒿萜;
（5）将上述Fr.5部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到8个部分:Fr.5-1～Fr.5-8;
（6）将上述Fr.5-3部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=2:1洗脱剂进行洗脱，并减压浓缩时，有大量黄色絮状物析出，用石油醚：丙酮=1:2的混合溶剂重结晶该黄色絮状物，最后得到黄色粉末状固体143mg，经1H NMR、13C NMR及LC-MS鉴定结合文献对照，确定其为5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮。
2.按照权利1所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用,其特征在于:根据8α-羟基蒿萜即化合物I对植物病毒病具有良好抑制作用的性质,用于制备抑制植物病毒的药物或药剂;根据5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮即化合物II对植物细菌具有较好抑制作用的性质,用于制备抑制植物细菌病菌的药物或药剂。
3.根据权利2所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用, 其特征在于: 化合物I用于制备抑制植物病毒的药物或药剂是指黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒等病毒抑制的药物或药剂。
4.根据权利2所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用, 其特征在于:化合物II用于制备抑制植物细菌病菌的药物或药剂是指对番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病等细菌病菌抑制的药物或药剂。
5.根据权利2所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用, 其特征在于:所指的剂型包括农药的各种剂型。
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