CN111072616A - 一种抗烟草黑胫病的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物化学技术领域，特别涉及一种抗烟草黑胫病的化合物及其制备方法和用途。所述化合物分子式为C18H22O4，且具有下述结构式：
Figure DDA0002313713040000011
本发明首次以基因改良抗黑胫病的烟草茎皮为原料，提取出一种新的苯并吡喃内酯类化合物，该化合物抑制烟草疫霉菌效果显著优于农用氯霉素，具有突出的抑制黑茎病活性，对烟草黑胫病防治效果为73.5％±3.5％，具有显著的烟草黑胫病防治效果。

Description

一种抗烟草黑胫病的化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，特别涉及一种抗烟草黑胫病的化合物及其制备方法和用途。
背景技术
烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病，烟农称为“黑杆疯”、“黑根”、“乌头病”。中国各主要产烟区均有不同程度发生，其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍。目前黑茎病的防治主要通过轮作栽培、品种基因改良、生物农药等方法实现防治。其中用生物农药防治是最常用且最容易实现的方法。目前从药用植物资源中发现具有植物病害防治功效的新活性防治是天然产物研究热点。期待研发一种具有抗烟草黑胫病的生物农药。
发明内容
为了解决上述问题，提出本发明。
本发明第一方面提供一种苯并吡喃内酯类化合物，所述化合物分子式为C18H22O4，且具有下述结构式：
Figure BDA0002313713020000011
该化合物的命名为：7-甲氧基-6-(3-羟丙基)-3-异戊烯基-2H-色烯-2-酮，英文名为：7-methoxy-6-(3-hydroxypropyl)-3-prenyl-2H-chromen-2-one。
本发明第二方面提供一种第一方面所述的苯并吡喃内酯类化合物的制备方法，其特征在于，以基因改良抗黑胫病的烟草茎皮为原料，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：
(1)浸膏提取：将所述烟草茎皮用有机溶剂水溶液回流提取35～60min，提取次数为1～3次，合并提取液，萃取，浓缩，得到浸膏；
(2)硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏用重量比1.5～3倍量的甲醇、或乙醇、或丙酮溶解后，然后用重量比0.8～2.5倍量的80-100目粗硅胶拌样，烘干，用重量比1～5倍量的150-200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；
以三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同极性部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述三氯甲烷-丙酮溶液的体积配比为20:1、9:1、6:4、7:3、6:4、和5:5；
(3)高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)洗脱液的9:1洗脱部分使用高压液相色谱进一步分离；其中，所述高压液相色谱分离纯化是采用Zorbax PrepHT GF 21.2mm×25cm反相柱，以40％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为292nm，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述苯并吡喃内酯类化合物。
流动相为40％的甲醇水溶液即，流动相为甲醇/水，V/V＝40/60。
优选地，所述有机溶剂为乙醇、甲醇或丙酮。
优选地，步骤(1)中，将所述烟草茎皮用95wt％的乙醇水溶液回流提取2次，合并两次提取液，浓缩，用乙酸乙酯萃取2次，萃取后的乙酸乙酯减压浓缩得浸膏。
优选地，步骤(3)中，所述高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化，得到所述苯并吡喃内酯类化合物。
上述技术方案在不矛盾的前提下，可自由组合。
本发明第三方面提供第一方面所述的苯并吡喃内酯类化合物在制备生物农药中的应用。
本发明第四方面提供第一方面所述的苯并吡喃内酯类化合物在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。
以上述方法制备的苯并吡喃内酯类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：
本发明化合物为黄色胶状物，有微弱的香草香味。
HRESI-MS显示其准分子离子峰为325.1410[M+Na]+，结合1H和13C NMR将分子式定为C18H22O4，化合物的不饱和度为8。其红外光谱显示化合物中有羟基(3385cm-1)、羰基(1706cm-1)和芳环(1620、1558和1472cm-1)信号，紫外光谱在220、273和336nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的1H和13C NMR谱(表1、图1、图2)显示其含有18个碳和22个氢(表-1)，包括一个1,2,4,5-四取代的苯环(C-5～C-10；H-5和H-8)，一组α,β-不饱和酯羰基(-CH＝C-C(O)O-，C-2～C-4，H-4)，一个异戊烯基(-CH2-CH＝C(CH3)2；C-1'～C-5'；H2-1',H-2',H3-4'和H3-5')，一个3-羟基丙基(C-1”～C-3”，H2-1”～H2-3”)，以及一个甲氧基(δC 55.8，δH 3.85s)。为了支持化合物中的8个不饱和度，以及苯环上有两个氧化的季碳,苯环和α,β-不饱和酯羰基之间还应形成一个六元吡喃环；化合物应为苯并吡喃内酯类结构。该推断可进一步由H-4与C-2、C-3、C-5、C-9、C-10，H-5和C-4、C-9、C-10，以及H-8和C-9和C-10的HMBC相关得到证实，图3。
化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基(异戊烯基、3-羟基丙基和甲氧基)的位置可通过进一步分析其HMBC相关确定。根据H2-1”与C-5、C-6、C-7，H2-2”和C-5，以及H-5和C-1”的HMBC相关，可确定3-羟基丙基取代在C-6位；根据H2-1′与C-2、C-3、C-4，H-2′和C-3，以及H-4和C-1′的HMBC相关，可确定异戊烯基取代在C-3位。根据甲氧基氢(δH 3.85)与C-7的HMBC相关，可确定酚羟基取代在C-7位。至此，本发明化合物的结构鉴定为：7-甲氧基羟基-6-(3-羟丙基)-3-异戊烯基-2H-色烯-2-酮。
表-1.化合物的1H NMR和13C NMR数据(溶剂为CDCl3)
Figure BDA0002313713020000031
化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(CH3OH)λmax(logε)220(4.16)、273(3.72)、336(3.90)nm；IR(KBr)νmax 3385、2964、2258、1706、1620、1558、1472、1261、1163、1042、854、785cm-1；13C-NMR和1H-NMR数据(CDCl3，125和500MHz)，见表-1；ESIMS m/z 325[M+Na]+；HRESIMS m/z 325.1410[M+Na]+(计算值C18H22NaO4，325.1416)。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次以基因改良抗黑胫病的烟草茎皮为原料，提取出一种新的苯并吡喃内酯类化合物，该化合物抑制烟草疫霉菌效果显著优于农用氯霉素，具有突出的抑制黑茎病活性，对烟草黑胫病防治效果为73.5％±3.5％，具有显著的烟草黑胫病防治效果。
(2)本发明采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，提取方法简单，容易分离得到，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产容易实现。
(3)本发明的化合物以烟草茎皮为原料，烟草茎皮为茎皮生产过程中的废弃物，原料易得，原料成本非常低。
附图说明
图1为本发明苯并吡喃内酯类化合物的核磁共振碳谱。
图2为本发明苯并吡喃内酯类化合物的核磁共振氢谱。
图3为本发明苯并吡喃内酯类化合物的主要HMBC相关。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步说明本发明的内容。
实施例1
一种苯并吡喃内酯类化合物C18H22O4的制备方法，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离，具体采用以下步骤：
(1)浸膏提取：取基因改良高抗黑胫病的烟草茎皮晒干，粉碎到约35目。称取35kg粉碎后的样品，置于200L的玻璃反应釜中，加入95wt％的乙醇水溶液80L，回流提取60min，滤出提取液；再次往残渣中加入95wt％的乙醇水溶液80L，回流提取60min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，浓缩液用60L的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相浓缩得到浸膏856g。
(2)硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏用重量比1.5倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，然后用1.2kg(80-100目)粗硅胶拌样，烘干，用2.2kg(150-200目)硅胶进行干法装柱进行硅胶柱层析；以三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同极性部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
其中，所述三氯甲烷-丙酮溶液的体积配比为20:1、9:1、6:4、7:3、6:4、和5:5。
(3)高压液相色谱分离纯化：选取步骤(2)洗脱液配比9:1洗脱部分进行高压液相色谱分离：
其中，所述高压液相色谱分离纯化是采用Agilent公司的Zorbax PrepHTGF21.2mm×25cm反相柱，以40％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为292nm，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。
本实施例1所用烟草茎皮原料不受地区限制，均可以实现本发明，下面以基因改良高抗黑胫病的烟草品种(云烟-300)为例，对本发明做进一步说明：
实施例2
烟草茎皮样品来源于云南大理，品种为云烟-300。
取烟草茎皮晒干，粉碎到约45目。称取38kg粉碎后的样品，置于200L的玻璃反应釜中，加入95％的乙醇80L，回流提取38min，滤出提取液；再次往残渣中加入95％的乙醇80L，回流提取40min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，再次用40L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏864g。
浸膏用1200g 80-100目粗硅胶拌样，烘干，用2500g硅胶(150-200目)柱色谱，以三氯甲烷-丙酮溶液(体积配比为20:1、9:1、6:4、7:3、6:4、5:5)进行梯度洗脱，分成6个部分。
选取9:1洗脱部分进行HPLC进一步分离：其中，所述高压液相色谱分离纯化是采用Zorbax PrepHT GF 21.2mm×25cm反相柱，以40％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为292nm，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。
实施例3
烟草茎皮样品来源于云南楚雄，品种为云烟-300。
取烟草茎皮晒干，粉碎到约55目。称取46kg粉碎后的样品，置于200L的玻璃反应釜中，加入95wt％的乙醇水溶液120L，回流提取25min，滤出提取液；再次往残渣中加入95wt％的乙醇水溶液120L，回流提取30min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用50L的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相浓缩得到浸膏1168g。浸膏用2.0kg(80-100目)粗硅胶拌样，烘干，用3.2kg硅胶(150-200目)柱色谱，三氯甲烷：丙酮溶液(体积配比为20:1、9:1、6:4、7:3、6:4、5:5)进行梯度洗脱，分成6个部分。
选取9:1洗脱部分进行HPLC进一步分离：所述高压液相色谱分离纯化是采用Zorbax PrepHT GF 21.2mm×25cm反相柱，以40％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为292nm，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。
实施例4
烟草茎皮样品来源于云南红河，品种为云烟-300。
取烟草茎皮晒干，粉碎到约38目。称取50kg粉碎后的样品，置于200L的玻璃反应釜中，加入95％的乙醇120L，回流提取30min，滤出提取液；再次往残渣中加入95％的乙醇100L，回流提取50min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，浓缩液用55L的乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯相浓缩得到浸膏1247g。浸膏用2.0kg(80-100目)粗硅胶拌样，烘干，用3.8kg硅胶(150-200目)柱色谱；三氯甲烷-丙酮溶液(体积配比为20:1、9:1、6:4、7:3、6:4、5:5)进行梯度洗脱，分成6个部分。
选取9:1洗脱部分进行HPLC进一步分离：所述高压液相色谱分离纯化是采用Zorbax PrepHT GF 21.2mm×25cm反相柱，以40％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为292nm，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。
实施例5
化合物结构的鉴定
取实施例1-4制备的化合物，以上述方法制备得到的苯并吡喃内酯类化合物的结构通过以下方法进行测定。
外观观测发现：化合物为黄色胶状物，有微弱的香草香味。
HRESI-MS显示其准分子离子峰为325.1410[M+Na]+，结合1H和13C NMR将分子式定为C18H22O4，化合物的不饱和度为8。
其红外光谱显示化合物中有羟基(3385cm-1)、羰基(1706cm-1)和芳环(1620、1558和1472cm-1)信号，紫外光谱在220、273和336nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的1H和13C NMR谱(表1、图1、图2)显示其含有18个碳和22个氢(表1、图1、图2)，包括一个1,2,4,5-四取代的苯环(C-5～C-10；H-5和H-8)，一组α,β-不饱和酯羰基(-CH＝C-C(O)O-，C-2～C-4，H-4)，一个异戊烯基(-CH2-CH＝C(CH3)2；C-1'～C-5'；H2-1',H-2',H3-4'和H3-5')，一个3-羟基丙基(C-1”～C-3”，H2-1”～H2-3”)，以及一个甲氧基(δC 55.8，δH 3.85s)。为了支持化合物中的8个不饱和度，以及苯环上有两个氧化的季碳,苯环和α,β-不饱和酯羰基之间还应形成一个六元吡喃环；化合物应为苯并吡喃内酯类结构。该推断可进一步由H-4与C-2、C-3、C-5、C-9、C-10，H-5和C-4、C-9、C-10，以及H-8和C-9和C-10的HMBC相关(图3)得到证实。
化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基(异戊烯基、3-羟基丙基和甲氧基)的位置可通过进一步分析其HMBC相关确定。根据H2-1”与C-5、C-6、C-7，H2-2”和C-5，以及H-5和C-1”的HMBC相关，可确定3-羟基丙基取代在C-6位；根据H2-1′与C-2、C-3、C-4，H-2′和C-3，以及H-4和C-1′的HMBC相关，可确定异戊烯基取代在C-3位。根据甲氧基氢(δH 3.85)与C-7的HMBC相关，可确定酚羟基取代在C-7位。至此，本发明化合物的结构鉴定为：
Figure BDA0002313713020000081
该化合物的命名为：7-甲氧基-6-(3-羟丙基)-3-异戊烯基-2H-色烯-2-酮，英文名为：7-methoxy-6-(3-hydroxypropyl)-3-prenyl-2H-chromen-2-one。
实施例6
烟草黑茎病是由烟草疫霉菌浸染而导致的，本发明中先测定化合物的抑制疫霉菌活性。
取实施例1-4制备的任一苯并吡喃内酯类化合物进行抗烟草黑胫病活性试验，试验情况如下：
(1)、燕麦片加水1000mL,在沸水浴上加热1小时，纱布过滤后加水补足1000mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉)过滤于三角瓶中，121℃、15磅灭菌20min(分钟),取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5mg/100mL),混匀后倾倒于平皿中,28℃培养48小时，经检查无菌后待用。
(2)取直径5mm的圆形滤纸,放入培养皿中,置于15磅高压灭菌30min，烘干后分别浸入20μM的任一苯并吡喃内酯类化合物水溶液、75wt％乙醇水溶液及灭菌蒸馏水中，得到三个待测滤纸片。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2mL烟草疫霉菌的新鲜菌液于三个燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀,将上述三个待测滤纸片用镊子分别轻贴于三个燕麦片琼脂培养基平板上,置28℃培养观察实验结果，测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。
(3)测试结果表明：本发明的苯并吡喃内酯类化合物抑菌圈直径为15.2±1.4mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.3±1.2mm。说明本发明化合物的抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑胫病活性。
(4)烟苗移栽到直径10cm，高10cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(质量比2:2:1)，每盆1株。移栽缓苗后于根部加入烟草疫霉菌菌谷10g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30℃，黑夜28℃，光照∶黑暗(12h:12h)，相对湿度95％，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20μM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10mL，共浇2次。每个处理10株，重复3次，14天后调查发病情况，计算病情指数。
其中，所述菌谷制作方法：将谷子煮至约一半谷粒开花，捞出并装入三角瓶，高压121℃灭菌1h。将已培养好的黑胫病菌菌种接种到灭菌后冷却的谷子上，28℃下恒温培养15-20d即成。
其中，病情指数和防治效果的计算方法按照行业内可查到的《烟草抗黑胫病评价技术规范》计算。
病情指数(D)
D＝∑(Mi×Si)×100/(N×9)
式中：D——病情指数
Si——病情为i的级值
i——病级数
Mi——病情为i的株数
N——调查总株数
防治效果计算方法如下：
烟草黑胫病抑制率＝(对照黑胫病发病数-处理黑胫病发病数)/对照黑胫病发病数×100％
结果表明：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为73.5％±3.5％，具有显著的烟草黑胫病防治效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种苯并吡喃内酯类化合物，其特征在于，所述化合物分子式为C18H22O4，且具有下述结构式：
Figure FDA0002313713010000011
2.一种权利要求1所述的苯并吡喃内酯类化合物的制备方法，其特征在于，以基因改良抗黑胫病的烟草茎皮为原料，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：
(1)浸膏提取：将所述烟草茎皮用有机溶剂水溶液回流提取35～60min，提取1～3次，合并提取液，萃取，浓缩，得到浸膏；
(2)硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏用重量比1.5～3倍量的甲醇、或乙醇、或丙酮溶解后，然后用重量比0.8～2.5倍量的80-100目粗硅胶拌样，烘干，用重量比1～5倍量的150-200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同极性部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
其中，所述三氯甲烷-丙酮溶液的体积配比为20:1、9:1、6:4、7:3、6:4、和5:5；
(3)高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)洗脱液的9:1洗脱部分使用高压液相色谱进一步分离；其中，所述高压液相色谱分离纯化采用Zorbax PrepHT GF21.2mm×25cm反相柱，以40％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为292nm，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述苯并吡喃内酯类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，将所述烟草茎皮用95wt％的乙醇水溶液回流提取2次，合并提取液，浓缩，用乙酸乙酯萃取2次，萃取后的乙酸乙酯减压浓缩得浸膏。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化，得到所述苯并吡喃内酯类化合物。
5.根据权利要求1所述的苯并吡喃内酯类化合物在制备生物农药中的应用。
6.根据权利要求1所述的苯并吡喃内酯类化合物在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。
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