WO2013191342A1 - 독성물질을 제거한 삼백초 정제물 및 분획물의 제조방법 및 상기 정제물을 유효성분으로 함유하는 천식 및 알러지성 질환의 치료 및 예방을 위한 조성물 - Google Patents

독성물질을 제거한 삼백초 정제물 및 분획물의 제조방법 및 상기 정제물을 유효성분으로 함유하는 천식 및 알러지성 질환의 치료 및 예방을 위한 조성물 Download PDF

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asthma
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allergic
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장현욱
손종근
이선
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영남대학교 산학협력단
한국보건산업진흥원
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    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing trichophytes and fractions from which toxic substances have been removed, and a composition for the prevention or treatment of asthma or allergic diseases, containing the trichophytes and fractions prepared by the preparation as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for producing trichophyte leaf tablets and fractions from which toxic substances have been removed, and to a composition for the prevention or treatment of asthma or allergic diseases, containing the trichophyte leaf tablets and fractions prepared by the method as an active ingredient.
  • Allergic diseases are most often caused by mast cells in tissues activated by an antigen-antibody response and by basophil cells in blood and eosinophils (primarily histamine, leukotriene, prostaglandin, TNF ⁇ , cytokines, etc.). Since the use of allergy therapeutic drugs currently used remains symptomatic, there is an urgent need for the development of more fundamental therapeutic drugs.
  • Phospholipase A2 and cyclooxygenase And lipoxygenase to generate from arachidonic acid as a precursor.
  • drugs that have recently attracted attention as an allergic agent for asthma are drugs having both histamine free inhibition, leukotriene C 4 production inhibition, and platelet activator inhibitory activity.
  • the three hundred (S aururus chinensis ) is a perennial herb belonging to the tree of more than three hundred , and it lives in low wetlands, and is distributed in Southeast Japan and Southeast Asia. There are two species of genus 300 , of which S. cernuus is distributed in eastern North America.
  • Korean Patent Registration No. 10-0675618 in the prior art has developed a drug for treating asthma or allergic diseases of the three hundred seconds (Saururus chinensis) purified by the inventor of the present invention, the three hundred seconds ethanol purified disclosed in the prior art is a toxic substance The high levels of manassatin A and manassatin B have been impeded for product development.
  • the present inventors researched and developed the extraction and fractionation method to remove the toxic substances in the trichophytium leaf, and completed the manufacturing method for preparing the trichophytic foliar purified product to remove the toxic substances, and developed as the preparation method.
  • PSA passive systemic anaphylaxis
  • TNF- ⁇ Factor- ⁇
  • IL-6 antigen-antibody induced systemic allergy model
  • the present invention provides a method of preparing the purified leaf and fractions 300 seconds removed toxic substances.
  • the present invention comprises about 0.5 to 200 times the weight (w / v), preferably 1 to 100 times the weight (w / v),
  • a nonpolar solvent selected from 5 to 20 times the weight (w / v) of hexane, heptane, methylenetloride, dichloromethane, chloroform or ethyl acetate or a mixed solvent thereof, preferably hexane, heptane, or a mixture thereof
  • the solution is 30 minutes to 1 week, preferably 1 hour to 72 hours, more preferably 3 hours to 12 hours, about 10 ° C to 150 ° C, preferably 20 ° C to 100 ° C, more preferably 40
  • Extraction method such as cold sediment extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, etc., preferably, by reflux extraction at a temperature of 80 ° C.
  • the present invention is about 1 to 200 times (w / w), preferably 10 times to 100 times (w / w) of the sample weight on the dried three hundred seconds leaf Water, alcohol, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof, preferably water or a water and ethanol mixed solvent, more preferably water or a 50-99% water and ethanol mixed solvent, 12 hours to 1 week, preferably 48 hours to 72 hours, 10 °C to 150 °C, preferably 20 °C to 100 °C, extraction methods such as cold extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, preferably Preferably, a second step of obtaining a crude extract by extraction by reflux extraction; A third step of preparing the suspension by adding the crude extract to about 0.05 to 50 times the volume of the crude extract, preferably 0.5 to 5 times the volume (v / w%) of water; In the suspension about 0.5-20 times the volume of the suspension, preferably 1-5 times the volume (v
  • the present inventors inhibit the degranulation reaction released after the fractions developed by the above-described method to the antigen-antibody to the mouse bone marrow mast cells, inhibit the production of COX-2 dependent PGD2, 5-lipoxygenase-dependent LTC4 Passive systemic anaphylaxis (PSA), an in vivo animal test model that suppresses production and inhibits the production of inflammatory cytokine Tumor Necrosis Factor- ⁇ (TNF- ⁇ ) and IL-6, as well as antigen-antibody-induced systemic allergy models It was confirmed that the production of PGD2 and LTC4 produced in the blood strongly inhibited dose dependently.
  • PGD2 and LTC4 produced in the blood strongly inhibited dose dependently.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of asthma or allergic diseases, containing as an active ingredient three hundred seconds leaf tablets or fractions prepared by the preparation method.
  • the present invention also provides a treatment method for treating a patient with asthma or allergic disease, comprising administering to the patient a patient with asthma or allergic disease three hundred seconds leaf tablet or fraction prepared by the above method.
  • the present invention provides the use of three hundred seconds leaf tablets or fractions prepared by the above method for the preparation of a medicament for the treatment of asthma or allergic diseases.
  • Asthma or allergic diseases as defined herein include bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic asthma or allergic dermatitis, and the like.
  • composition of the present invention preferably contains 0.01 to 99.9% of the triticale leaf purified product, and more preferably contains 0.1 to 90%.
  • composition as described above is not necessarily limited thereto, and may vary according to the condition of the patient and the type and extent of the disease.
  • composition comprising the triticale leaf tablets of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • compositions comprising tablets according to the invention, respectively, in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • Carriers, excipients, and diluents that can be used in formulation and may be included in the composition comprising the tablets include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate , Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose ( It is prepared by mixing sucrose or lactose and gelatin.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose ( It is prepared by mixing sucrose or lactose and gelatin.
  • lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Preferred dosages of the tablets of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the tablet of the present invention is preferably administered at 0.01 mg / kg to 10 g / kg, preferably 1 mg / kg to 1 g / kg per day. Administration may be administered once a day or may be divided several times. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the pharmaceutical dosage forms of the tablets of the present invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable collection.
  • the present invention provides a health functional food for the prevention and improvement of asthma or allergic diseases containing three hundred seconds leaf tablets or fractions prepared by the above production method as an active ingredient.
  • Foods to which it may be added include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, beverages, gums, tea vitamin complexes, and health functional foods.
  • the tablets or fractions of the present invention are drugs that can be used with confidence even when taken for a long period of time for prevention purposes because they have little toxicity and side effects.
  • the present invention provides a dietary supplement comprising the triticale leaf tablets or fractions prepared by the above-described manufacturing method showing the effect of the prevention of asthma or allergic diseases, and a food supplement acceptable food supplement.
  • composition containing the purified product of the present invention can be used in a variety of drugs, food and beverages for the prevention of asthma or allergic diseases.
  • foods to which the triticale leaf tablets can be added include, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, dietary supplements, and the like, which are used in the form of powders, granules, tablets, capsules, or beverages. Can be.
  • the triticale leaf tablet itself of the present invention has little toxicity and side effects, and thus is a drug that can be used safely even when taken for long periods of time.
  • the purified product of the present invention may be added to food or beverage for the purpose of preventing allergic diseases or inflammatory diseases.
  • the amount of the purified product in the food or beverage may generally be added to 0.01 to 15% by weight of the total food weight of the health food composition of the present invention, the health beverage composition is 0.02 to 30 g, preferably based on 100 ml Can be added in a ratio of 0.3 to 10 g.
  • the health beverage composition of the present invention in addition to containing the purified product as an essential component in the indicated ratio, there is no particular limitation on the liquid component, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates are conventional monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose, such as maltose, sucrose and the like, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like.
  • Sugars and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia tablets (e.g., Rebaudioside A, glycyrzin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the compositions of the present invention may also contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is generally selected from the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the three hundred seconds tablets of the present invention exhibits an anti-asthma and anti-allergic effect, as a composition for the prevention or treatment of asthma or allergic diseases, can be used as a medicinal and health supplement consisting of non-toxic natural medicine have.
  • 1 is a diagram showing a calibration curve of standard materials
  • Figure 2 is a diagram showing the HPLC chromatogram of the standard
  • 3 to 7 are HPLC chromatograms of three hundred seconds ethanol purified (A), nucleic acid fraction (B), ethyl acetate (EtoAc) fraction (C), butanol fraction (D) and water fraction (E) of the standard. Is;
  • 11 is a diagram showing the effect of inhibiting PGD2 production of nucleic acid fractions
  • FIG. 12 is a diagram showing the inhibitory action of 5-lipoxygenase (5-LO) dependent LTC4 production generated after stimulation with antigen-antibody to the mouse bone marrow mast cells of the nucleic acid fraction,
  • 5-LO 5-lipoxygenase
  • FIGS. 13 and 14 are diagrams showing the effects on the production of TNF- ⁇ and IL-6 generated after stimulation with an antigen-antibody to a mouse bone marrow mast cell of a nucleic acid fraction
  • FIG 15 and 16 is a diagram showing the effect of the nucleic acid fraction on the passive systemic anaphylaxis (PSA), an antigen-induced systemic allergic model-the effect on the production of serum PGD2 and LTC4,
  • PSA passive systemic anaphylaxis
  • 17 is a diagram showing the degranulation inhibitory effect of the nucleic acid purified product
  • 18 is a diagram showing the effect of inhibiting PGD2 production of nucleic acid purified products.
  • FIG. 19 is a diagram showing a 5-lipoxygenase (5-LO) dependent LTC4 production inhibitory effect generated after stimulation with an antigen-antibody to a mouse bone marrow mast cell of a nucleic acid purified product,
  • 5-LO 5-lipoxygenase
  • FIG. 22 and 23 are diagrams showing the effect of nucleic acid purification on the passive systemic anaphylaxis (PSA), an antigen-induced systemic allergic model, on the production of PGD2 and LTC4 in serum.
  • PSA passive systemic anaphylaxis
  • the above ingredients are mixed and made into 2 ml by a conventional method, and then filled into 2 ml ampoules and sterilized to prepare an injection.
  • the above components are mixed and tableted according to a conventional method for producing tablets to produce tablets.
  • Capsules are prepared by mixing the above ingredients and filling into gelatin capsules according to a conventional method for preparing capsules.
  • Purified water was added to make a total of 1000 ml. According to the conventional method for preparing a liquid, the above components are mixed, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.
  • composition ratio is a composition suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment
  • the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, use purpose.
  • Nicotinic Acid Amide ... 1.7 mg
  • composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixtures is mixed with a component suitable for a health food in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method.
  • the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.
  • Purified water is added to the whole ... 900 ml
  • composition ratio is mixed with a component suitable for a favorite beverage in a preferred embodiment
  • the compounding ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and use purpose.
  • Example 1 Preparation method of three hundred leaf leaf tablets for removing toxic substances
  • Saururus chinensis used in this experiment were purchased from Baekdu Pharmaceutical Co., Ltd. located in Yangnyeong Market, Daegu, Korea. 20 g of ground-dried powder of three hundred seconds of natural drying was added, and 150 ml of hexane was added thereto. In the case of hexane solvent, the mixture was extracted under reflux for 5 hours at 40 ° C., and the above procedure was repeated three times. Was evaporated to dryness to give 212.86 mg of hexane purified product (hereinafter referred to as SCEHX).
  • SCEHX hexane purified product
  • the leaves of Saururus chinensis used in this experiment were purchased from Baekdu Pharmaceutical Co., Ltd. located in Yangnyeong Market, Daegu, Korea. 20 g of naturally-dried three hundred sec ground powder was added, and 150 ml of heptane was added thereto, and in the case of heptane solvent, the mixture was extracted under reflux for 5 hours at 70 ° C., and the procedure was repeated three times. Evaporation to dryness yielded 222.20 mg of heptane purified product (hereinafter referred to as SCEHP).
  • SCEHP heptane purified product
  • the leaves of Saururus chinensis used in this experiment were purchased from Baekdu Pharmaceutical Co., Ltd. located in Yangnyeong Market, Daegu, Korea.
  • the naturally dried three hundred seconds above ground portion (10 Kg) was extracted under reflux at 80 ° C. for 12 hours at 25 L, 25 L and 25 L, respectively, at 70%, 90% and 100% ethanol, respectively, and the extracts were concentrated under a vacuum rotary evaporator.
  • Evaporation of the solvent with Nihon Seiko, Japan (VR-205c) yielded 1.2 kg, 1.1 kg and 1.3 kg of 70% ethanol, 90% ethanol and 100% ethanol soluble purification, respectively.
  • the components were analyzed by HPLC analysis as follows.
  • HPLC systems for content analysis include LC-20AD pump (Shimadzu, Japan), SPD-M20A (Shimadzu) diode array detector, SIL-20A (Shimadzu) auto-sampler injector, DGU-20A 5 (Shimadzu) solvent degasser and CTO- It consists of 20A (Shimadzu) column oven.
  • HPLC system for content analysis was purchased from LC-20AD pump (Shimadzu, Japan), SPD-M20A (Burdick & Jackson (USA)).
  • FIGS. Chromatograms of fractions of three hundred leaf extracts are shown in FIGS. The contents of Sauchinone, manassantin A and manassantin B, which are the main components in 300 seconds, are shown in Table 1.
  • nucleic acid component contained almost no manassantin A (MA) and manassantin B (MB).
  • the known ethanol tablets contained 1.09 mg, 0.53 mg, and 0.98 mg per gram of crude drug sample, respectively, and the sauchinone was used as a crude drug sample in the nucleic acid purified fractions from the ethanol tablet. It contained 0.21 mg per gram, it was confirmed that no toxic substances manassatin A and manassatin B contained in the existing ethanol purified (Fig. 3 to 7 and Table 1).
  • Cell culture reagents such as RPMI-1640, Modified Eagle Medium (MEM), non-essential amino acids solution, fetal bovine serum (FBS), streptomycin, penicillin, etc. It was purchased from Grand Island, USA. IgE and DNP-HSA (antigen) among the reagents used in the experiment were purchased from Sigma (St. Louis, USA). EIA kits of prostaglandin D2 and leukotriene C4 were purchased from Cayman (Ann Arbor, USA).
  • BMMC Mouse bone marrow-derived mast cells
  • the supernatant was mixed with ⁇ -hex substrate [100 mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, pH 4.5), 1.3 mg / ml p-nitrophenyl-N-acetyl-bD-glucosaminide] in a ratio of 1: 2.
  • ⁇ -hex substrate 100 mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, pH 4.5)
  • the reaction was stopped with 0.2 M glycine (pH 10.7) to measure absorbance at 405 nm using ELISA (BIO-TECK INSTRUMENTS, INC, ELx800), and the measured value Calculation was made according to equation 1.
  • the purified matter and fractions (final concentration 125 ⁇ g / ml) obtained in the above example were subjected to IgE-sensitized mast cell concentration 2 ⁇ 10 5 cells / well.
  • 25 ng / ml of DNP-HSA was treated, and then, after 8 hours of cell stimulation, the superstitial prostaglandin D2 was subjected to an Enzyme linked immunoassay (EIA) using a prostaglandin D2 assay kit (Cayman). Measured.
  • EIA Enzyme linked immunoassay
  • the sample-nucleic acid tablets extracted directly from the hexane fraction of the triticale leaf and the triticale leaf were nucleic acid-produced after 5-lipoxygenase-dependent stimulation of antigen-antibodies to rat bone marrow mast cells. It was confirmed that phosphorus LTC4 production was dose dependently inhibited.
  • the purified and fractions obtained in the above Example to IgE-sensitized mast cells (2 ⁇ 10 5 cells / well) After pretreatment at a constant concentration (5, 10 ⁇ g / ml) for 1 hour, DNP-HSA (Sigma, S9915) 25 ng / ml was treated for 15 minutes. TNF- ⁇ and IL-6 quantification of supernatants after cell stimulation was measured using the TNF- ⁇ and IL-6 EIA kit (Enzyme linked immunoassay, from R & D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA).
  • the hexane fraction of the triticale leaf and the sample-nucleic acid purified products extracted directly from the triticale leaf were produced after stimulation with the antigen-antibody to the rat bone marrow mast cells. It was confirmed that dose-dependent inhibition of inflammatory cytokine Tumor Necrosis Factor- ⁇ (TNF- ⁇ ) and IL-6 production.
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor- ⁇
  • ICR mice are injected intravenously with 2 ⁇ g IgE dissolved in 100 ⁇ l of saline. After 24 hours, a certain amount (50, 100 mg / kg, dissolved in CMC) of the purified products and fractions obtained in the Examples was orally administered 1 hour before administration.
  • Antigen is injected intravenously with 4 mg DNP-HSA dissolved in 200 ⁇ l of saline. As a control, 200 ⁇ l of CMC (Carboxymethylcellulose) was orally administered. At this time, fexofenadin, an H1 receptor antagonist, was used as a positive control.
  • CMC Carboxymethylcellulose
  • the present inventors researched and developed the extraction and fractionation method to remove the above toxic substances on the leaves of the three hundred seconds, to complete the manufacturing method of manufacturing the three hundred seconds leaf purified from the toxic substances, fractions developed by the production method Stimulates mouse bone marrow mast cells with antigen-antibody and inhibits free degranulation, inhibits COX-2 dependent PGD2 production, inhibits 5-lipoxygenase dependent LTC4 production, and Tumor Necrosis Factor, an inflammatory cytokine
  • PGD2 and LTC4 production were generated in the blood using passive systemic anaphylaxis (PSA), an in vivo animal model, a systemic allergy model induced by antigen-antibody. It has been found that this dose-dependently strong inhibition has been completed and the present invention can be used in the field of allergy treatment.
  • PSA passive systemic anaphylaxis

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Abstract

본 발명은 독성물질을 제거한 삼백초 잎 정제물 및 분획물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎 정제물 및 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

독성물질을 제거한 삼백초 정제물 및 분획물의 제조방법 및 상기 정제물을 유효성분으로 함유하는 천식 및 알러지성 질환의 치료 및 예방을 위한 조성물
본 발명은 독성물질을 제거한 삼백초 정제물 및 분획물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 정제물 및 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[문헌 1] 한국특허등록 제 10-0675618호
[문헌 2] Chang HW et al.. Planta. Medica., 70(5), pp.474-476, 2004
[문헌 3] Lionel A. Samayawardhena and Catherine J. Pallen J. Immunol 185, 5993-6002, 2010
본 발명은 독성물질을 제거한 삼백초 잎 정제물 및 분획물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎 정제물 및 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알러지성 질환은 대부분이 항원-항체 반응에 의해 활성화된 조직의 비만세포 및 혈액의 호염기성 세포 및 호산구에서 유리되는 매개체들 (주로 히스타민, 류코트리엔, 프로스타글란딘, TNFα, 시토카인 등)에 의해서 야기된다. 현재 사용되는 알러지 치료 약물들의 용도는 증상완화에 머무르고 있기 때문에 보다 근본적인 치료 약물의 개발이 절실히 요구된다.
알러지성 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandindes), 류코티리엔류(leukotriens), 혈소판활성화인자(PAF) 등은 포스포리파제 A2(phospholipase A2) 및 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)로 부터 생성된다.
한편, 최근에는 알러지성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C4 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다.
한편, 삼백초(Saururus chinensis)는 후추목 삼백초과에 속하는 여러해살이풀로, 저습지에 군생하며, 한국일본동남아시아에 분포한다. 삼백초속은 2종이 있으며, 그 중 S. cernuus는 북아메리카 동부에 분포한다.
한편, 종래기술로서 한국특허등록 제 10-0675618호에는 본원 발명자가 발명한 삼백초(Saururus chinensis) 정제물의 천식 또는 알러지 성 질환 치료제를 개발한 바가 있으나, 상기 종래 기술에 개시된 삼백초 에탄올 정제물은 독성물질들인 manassatin A 및 manassatin B이 다량 함유되어 제품으로서의 개발에 장애가 되어 왔다.
따라서, 본 발명자들은 상기 삼백초 잎을 대상으로 상기한 독성물질을 제거하고자 추출 및 분획방법을 연구개발한 결과, 독성물질을 제거한 삼백초 잎 정제물을 제조하는 제조방법을 완성하고, 상기 제조방법으로 개발된 분획물들이 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 유리되는 탈과립 반응을 억제하고, COX-2 의존적인 PGD2의 생성을 억제하고, 5-lipoxygenase 의존적인 LTC4 생성을 억제하고 염증성 cytokine인 Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α) 및 IL-6생성을 억제하였을 뿐만 아니라, 항원-항체로 유도한 전신성 알러지 모델인 생체내 동물실험 모델인 passive systemic anaphylaxis (PSA)을 사용하여 혈액내에 생성된 PGD2 및 LTC4생성이 용량 의존적으로 강하게 억제함을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 독성물질을 제거한 삼백초 잎 정제물 및 분획물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명은 건조된 삼백초 잎에 상기 시료 부피의 약 0.5배 내지 200배 중량(w/v), 바람직하게는 1배 내지 100배 중량(w/v), 보다 바람직하게는 5배 내지 20배 중량(w/v)의 헥산, 헵탄, 메틸렌틀로리드, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매 또는 이의 혼합용매, 바람직하게는 헥산, 헵탄, 또는 이의 혼합용매, 보다 바람직하게는 헥산, 또는 헵탄용매를 첨가하는 제 1단계; 상기 용액을 30분 내지 1주일, 바람직하게는 1시간 내지 72시간 동안, 보다 바람직하게는 3시간 내지 12시간 동안, 약 10℃ 내지 150℃, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃, 보다 바람직하게 40℃ 내지 80℃에서 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는, 환류추출법으로 추출하는 제 2단계; 상기 추출과정을 1회 내지 제 10회, 바람직하게는 제 2회 내지 5회 반복수행하는 제 3단계; 상기 추출물을 추출용매를 제거하고 건조하는 제 4단계 공정을 포함하는 독성물질을 제거한 삼백초 잎 정제물을 제조하는 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명은 건조된 삼백초 잎에 상기 시료 중량의 약 1배 내지 200배(w/w), 바람직하게는 10배 내지 100배(w/w)의 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 50-99% 물 및 에탄올 혼합용매를 가하여 12시간 내지 1주일, 바람직하게는 48시간 내지 72시간 동안, 10℃ 내지 150℃, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃에서, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는, 환류추출법으로 추출하여 조추출물을 수득하는 제 2단계; 상기 조추출물을 상기 조추출물 중량의 약 0.05 내지 50배, 바람직하게는 0.5 내지 5배 부피 (v/w%)의 물을 가하여 현탁물을 제조하는 제 3단계; 상기 현탁물에 상기 현탁물 부피의 약 0.5 내지 20배 부피, 바람직하게는 1 내지 5배 부피 (v/w%)의 n-헥산, 헵탄, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매, 바람직하게는 헥산 또는 에틸아세테이트 용매로 분획하여 비극성 용매 가용분획물을 수득하는 제 4단계; 상기 비극성용매 가용 분획물을 회수하여 증발건조하는 제 5단계 공정을 포함하는 독성물질을 제거한 삼백초 잎 분획물을 제조하는 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎의 정제물 및 분획물은 종래에 공지된 에탄올 정제물에 다량 함유된 독성물질들인 manassatin A 및 manassatin B을 거의 함유하지 않음을 확인하였다.
또한 본 발명자는 상기 제조방법으로 개발된 분획물들이 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 유리되는 탈과립 반응을 억제하고, COX-2 의존적인 PGD2의 생성을 억제하고, 5-lipoxygenase 의존적인 LTC4 생성을 억제하고 염증성 cytokine인 Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α) 및 IL-6생성을 억제하였을 뿐만 아니라, 항원-항체로 유도한 전신성 알러지 모델인 생체내 동물실험 모델인 passive systemic anaphylaxis (PSA)을 사용하여 혈액내에 생성된 PGD2 및 LTC4생성이 용량 의존적으로 강하게 억제함을 확인하였다.
따라서 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎 정제물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎 정제물 또는 분획물을 천식 또는 알러지성 질환 환자에게 투여함을 포함하는, 천식 또는 알러지성 질환 환자를 치료하기 위한 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 천식 또는 알러지성 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎 정제물 또는 분획물의 용도를 제공한다.
본원에서 정의되는 천식 또는 알러지성 질환은 기관지천식, 알러지성 비염, 알러지성 천식 또는 알러지성 피부염 등을 포함한다.
본 발명의 조성물은 삼백초 잎 정제물을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 삼백초 잎 정제물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 정제물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 정제물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 정제물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 정제물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 정제물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 정제물 의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎 정제물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 또는 알러지성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 이를 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
본 발명의 상기 정제물 또는 분획물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명은 천식 또는 알러지성 질환의 예방의 효과를 나타내는 상기 제조방법으로 제조된 삼백초 잎 정제물 또는 분획물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다.
본 발명의 정제물을 포함하는 조성물은 천식 또는 알러지성 질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 삼백초 잎 정제물 을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 삼백초 잎 정제물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 정제물은 알러지성 질환 또는 염증 질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 정제물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 정제물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 정제물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 삼백초 정제물은 항천식, 항알러지 효과를 나타내어, 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로, 독성이 없는 천연약제로 구성된 의약 및 건강보조식품으로 사용할 수 있다.
도 1은 표준물질들의 calibration curve를 나타낸 도이고,
도 2는 표준물질의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이며,
도 3 내지 7는 표준물질의 삼백초 에탄올 정제물(A), 핵산분획 (B), 에틸아세테이트(EtoAc)분획 (C), 부탄올 분획 (D) 및 물 분획 (E)들의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이며;
도 8, 9는 핵산 (hexane) 정제물 및 헵탄(haptane)정제물의 HPLC 형태를 나타낸 도이고,
도 10는 핵산 분획의 탈과립 억제 효과를 나타낸 도이며,
도 11는 핵산 분획의 PGD2 생성 억제 효과를 나타낸 도이며,
도 12은 핵산 분획의 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 생성되는 5-lipoxygenase (5-LO) 의존적인 LTC4 생성 억제 작용를 나타낸 도이고,
도 13, 14는 핵산 분획의 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 생성되는 TNF-α 및 IL-6생성에 미치는 영향를 나타낸 도이며,
도 15, 16는 항원-항체로 유도한 전신성 알러지 모델인 passive systemic anaphylaxis(PSA)에 미치는 핵산 분획의 영향-혈청내 PGD2 및 LTC4 생성에 미치는 영향를 나타낸 도이며,
도 17은 핵산 정제물의 탈과립 억제 효과를 나타낸 도이며,
도 18은 핵산 정제물의 PGD2 생성 억제 효과를 나타낸 도이며,
도 19는 핵산 정제물의 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 생성되는 5-lipoxygenase(5-LO) 의존적인 LTC4 생성 억제 작용를 나타낸 도이고,
도 20, 21은 핵산 정제물의 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 생성되는 TNF-α 및 IL-6생성에 미치는 영향를 나타낸 도이며,
도 22, 23은 항원-항체로 유도한 전신성 알러지 모델인 passive systemic anaphylaxis(PSA)에 미치는 핵산 정제물의 영향-혈청내 PGD2 및 LTC4 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
하기에 본 발명의 정제물 및 분획물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 주사제제의 제조
SCEHX 분획물........................................10㎎
소디움 메타비설파이트..............................3.0㎎
메틸파라벤.........................................0.8㎎
프로필파라벤.......................................0.1mg
주사용 멸균증류수...................................적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
SCEHP 분획물........................................200㎎
유당................................................100㎎
전분................................................100㎎
스테아린산 마그네슘..................................적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캡슐제의 제조
SCHE 분획물.........................................10㎎
유당................................................50㎎
전분................................................50㎎
탈크.................................................2㎎
스테아린산 마그네슘.................................적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 액제의 제조
SCEA 분획물........................................1000㎎
설탕..................................................20g
이성화당..............................................20g
레몬향...............................................적량
정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제제예 5. 건강 식품의 제조
SCEHX 분획물.........................................1000 ㎎
비타민 혼합물...........................................적량
비타민 A 아세테이트....................................70 ㎍
비타민 E..............................................1.0 ㎎
비타민 B1............................................0.13 ㎎
비타민 B2............................................0.15 ㎎
비타민 B6.............................................0.5 ㎎
비타민 B12............................................0.2 ㎍
비타민 C...............................................10 ㎎
비오틴.................................................10 ㎍
니코틴산아미드........................................1.7 ㎎
엽산...................................................50 ㎍
판토텐산 칼슘.........................................0.5 ㎎
무기질 혼합물...........................................적량
황산제1철............................................1.75 ㎎
산화아연.............................................0.82 ㎎
탄산마그네슘.........................................25.3 ㎎
제1인산칼륨............................................15 ㎎
제2인산칼슘............................................55 ㎎
구연산칼륨.............................................90 ㎎
탄산칼슘..............................................100 ㎎
염화마그네슘.........................................24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 6. 건강 음료의 제조
SCHE 분획물.........................................1000 ㎎
구연산..............................................1000 ㎎
올리고당..............................................100 g
매실농축액..............................................2 g
타우린..................................................1 g
정제수를 가하여 전체.................................900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 독성물질제거를 위한 삼백초잎 정제물의 제조법
1-1. 삼백초잎 Hexane 추출법
본 실험에 사용된 삼백초(Saururus chinensis)의 잎은 대한민국 대구시 약령시장에 위치한 백두약업사에서 구입하였다. 자연건조시킨 삼백초의 지상부 분말을 20 g씩 취하여 헥산(hexane) 150 ml을 가하여 헥산 용매인 경우는 40℃에서 각각 5시간동안 환류 추출하였고 상기 과정을 3회 반복하였고, 상기에서 얻은 용액의 헥산용액을 증발건고하여 헥산 정제물 212.86 mg 수득하였다(이하, SCEHX이라 함)
1-2. 삼백초잎 Heptane 추출법
본 실험에 사용된 삼백초(Saururus chinensis)의 잎은 대한민국 대구시 약령시장에 위치한 백두약업사에서 구입하였다. 자연건조시킨 삼백초의 지상부 분말을 20 g씩 취하여 각각 헵탄(heptane) 150ml을 가하여 헵탄 용매인 경우는 70℃하에서 5시간동안 환류 추출하였고 상기 과정을 3회 반복하였고, 상기에서 얻은 용액들의 헵탄 용액을 증발건고하여 헵탄 정제물 222.20mg을 각각 수득하였다(이하, SCEHP이라 함).
실시예 2. 삼백초 분획물의 제조
2-1. 삼백초잎 EtOH 정제물 제조
본 실험에 사용된 삼백초(Saururus chinensis)의 잎은 대한민국 대구시 약령시장에 위치한 백두약업사에서 구입하였다. 자연 건조시킨 삼백초의 지상부(10 Kg)을 각각 70%, 90% 그리고 100% 에탄올 각각 25 L, 25 L 및 25 L로 12시간동안 80 ℃ 에서 환류 추출하고, 추출액들을 감압 회전농축기(Vaccum rotary evaporator; 일본의 Nihon Seiko사, VR-205c)로 용매를 증발시켜 70% 에탄올, 90% 에탄올 및 100% 에탄올 가용 정제물을 1.2 kg, 1.1 kg 및 1.3 kg을 각각 수득하였다.
2-2. 삼백초잎 용매분획물 제조
상기 삼백초잎 에탄올 용액들을 증발 건고하여 3.0 L 물에 현탁시킨 후에 상기 현탁물의 2-3 배 부피의 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올용매로 각각 분획하고 증발 건고하여, 헥산분획 51.3 g, 에틸아세테이트분획 248.4 g, 부탄올분획 189.4 g 및 물분획 346.7 g을 각각 수득하였다 (이하, 각각, SCHE, SCEA, SCBU 및 SCWA이라 함).
실시예 3. 성분 분석
상기 실시예에서 얻은 시료들의 성분분석을 위하여 하기와 같이 HPLC 분석법을 통하여 함유 성분을 분석하였다.
3-1. 기기 및 시약
함량분석을 위한 HPLC시스템은 LC-20AD pump (Shimadzu, Japan), SPD-M20A (Shimadzu) diode array detector, SIL-20A (Shimadzu) auto-sampler injector, DGU-20A5 (Shimadzu) solvent degasser 및 CTO-20A (Shimadzu) column oven로 구성되어 있다.
표준물질인 manassantin B는 삼백초로부터 분리하였으며, 각 표준물질의 순도는 95% 이상이었다. HPLC 분석을 위한 메탄올 및 아세토니트릴은 함량분석을 위한 HPLC시스템은 LC-20AD pump (Shimadzu, Japan), SPD-M20A (Burdick & Jackson (USA)에서 구입하여 사용하였다.
3-2. 표준액의 조제
Sauchinone, manassantin A 및 manassantin B의 표준용액은 무게를 정확하게 측정한후 메탄올로 녹여 모두 1 mg/ml의 농도로 조제한 후에 4℃에 보관하면서 사용 전에 단계 희석하여 사용하였다.
3-3. HPLC 분석조건
삼백초 내 주요성분인 Sauchinone (S), manassantin A (MA) 및 manassantin B(MB)의 함량을 분석하기 위하여 Shimadzu사의 LC-20A 시스템을 사용하여 측정하였다. 분석에 사용된 칼럼(column)은 Agilent Eclipse XDB-C18 (5 μm, 4.6×150 mm) 칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40℃로 유지하였다. 유속은 1.0 mL/min으로 흘려주었으며 주입량은 10 μL였다. 이동상은 50 % 아세토니트릴 (v/v)로 흘려주었으며, 검출파장은 241nm에서 검출하였다.
3-4. HPLC 분석 결과 (분획물)
Sauchinone, manassantin A 및 manassantin B의 peak 면적에 대한 검량선은 25200.00 μg/mL의 농도 범위에서 각각 y = 26132x + 51114 (R2=0.9998),y = 13439x + 32736 (R2=0.9998)및 y = 13769x + 30421 (R2=0.9998)의 직선성을 나타내었다 (도 1).
세 성분은 13.517 (sauchinone), 26.025 (manassantin A) 및 39.612min (manassantin B)에 검출되었다 (도 2).
삼백초잎 정제물 분획별 크로마토그램은 도 3 내지 7에 나타내었다. 삼백초 내 주요성분인 Sauchinone, manassantin A 및 manassantin B의 함량은 표 1에 나타내었다.
표 1 각 분획중의 sauchinone (S), manassantin A (MA) 및 manassantin B (MB) 함량비교
S(mg/g) MA(mg/g) MB(mg/g)
EtOH 추출 1.09 0.53 0.98
Hexane 분획 0.21 0.00 0.00
EtOAc 분획 0.92 0.35 0.69
BuOH 분획 0.00 0.00 0.00
H2O 분획 0.00 0.00 0.00
상기 표 1과 같이 핵산성분 중에는 독성을 나타내는 manassantin A (MA) 및 manassantin B (MB)를 거의 함유하고 있지 않음을 확인할 수 있었다.
1. 삼백초의 에탄올 정제물을 얻고, 이 에탄올 정제물을 용매분획하여 헥산분획, 에틸아세테이트분획, 부탄올분획 그리고 물분획을 얻었으며 이들 각분획에 함유된 sauchinone의 함량을 상기 설정된 HPLC 분석법으로 정량하였다.
이 실험결과, 기존에 공지된 에탄올 정제물에는 상기 세가지 화합물들이 생약시료 1 그램 당 1.09 mg, 0.53 mg, 0.98 mg을 각각 함유하고 있었으며, 이 에탄올 정제물로부터 분획한 핵산 정제물에는 sauchinone이 생약시료 1그램당 0.21 mg 함유하며, 기존의 에탄올 정제물에 함유된 독성물질들인 manassatin A 및 manassatin B는 함유되어 있지 않음을 확인하였다(도 3 내지 7 및 표 1).
3-5. HPLC 분석 결과 (독성물질 제거 정제물)
Sauchinone, manassantin A 및 manassantin B의 peak 면적에 대한 검량선은 25200.00 μg/mL의 농도 범위에서 각각 y = 26132x + 51114 (R2=0.9998),y = 13439x + 32736 (R2=0.9998)및 y = 13769x + 30421 (R2=0.9998)의 직선성을 나타내었다 (도 1).
상기 3가지 성분은 13.517 (sauchinone), 26.025 (manassantin A) 및 39.612min (manassantin B)에 검출되었다 (도 2). 상기 실시예에서 얻은 삼백초잎의 헥산 및 헵탄 추출용매를 이용한 정제물들의 정제물별 크로마토그램은 도 8, 9에 나타내었다. 삼백초 내 주요성분인 Sauchinone, manassantin A 및 manassantin B의 함량은 표 2에 나타내었다.
표 2 핵산 및 헵탄 정제물중의 sauchinone (S), manassantin A (MA) 및 manassantin B (MB) 함량비교
S(mg/g) MA(mg/g) MB(mg/g)
Hexane추출 0.33 0.00 0.08
Heptane추출 0.30 0.00 0.13
2. 삼백초로부터 sauchinone을 선택적으로 추출하기 위하여 삼백초 생약시료를 핵산 및 헵탄으로 직접 추출하였을 때 핵산 정제물에는 sauchinone 및 manassatin B가 생약시료 1 그람 당 0.33 mg 및 0.08 mg를 함유하며 독성을 나타내는 manassatin A는 함유하지 않으며, 헵탄 정제물에는 sauchinone 및 manassatin B가 생약시료 1그람 당 0.30mg 및 0.13mg을 함유하며 독성을 나타내는 manassatin A는 함유하지 않았다(도 8, 9 및 표 2).
참고예 1. 실험재료의 준비
세포 배양액인 RPMI-1640, Modified Eagle Medium(MEM), non-essential amino acids solution, 우태혈청(fetal bovine serum; FBS), 스트렙토마이신 (streptomycin), 페니실린(penicillin)등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 IgE 및 DNP-HSA (항원)은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 프로스타글란딘 D2 및 류코트리엔 C4의 EIA 키트는 Cayman사 (Ann Arbor, USA)에서 구입하였다.
참고예 2. 실험용 세포 배양
쥐 골수 유래 비만세포(BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 BALB/C 마우스로부터 골수에서 분리하여, 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640 배지와 IL-3(쥐의 비장세포에 포크위드 마이토겐(pokeweed mitogen)으로 자극하여 얻은 상층액을 최종 20% 되도록 넣은 배양액)로 약 3주 정도 배양하여 95%이상의 균질한 BMMC를 얻었다.
실험예 1. 비만세포에서 탈과립 억제반응 측정
상기 참고예 2의 쥐 골수 유래 비만세포 배양 3주 후, 세포농도 2Ｘ105 cells를 100 ng/ml의 IgE로 2시간이상 처리한 후 (IgE-감작 비만세포) 삼백초 분획을 1시간 전리한다. 그 다음 25ng/ml DNP-HSA(항원)를 15분간 자극시키고, 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 β-hex기질 [100mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/ml p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide]와 1:2 비율로 혼합 시키고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.2 M 글리신 (pH 10.7)으로 반응을 정지시켜 ELISA(BIO-TECK INSTRUMENTS, INC, ELx800)를 사용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
수학식 1
Figure PCTKR2012011036-appb-M000001
그 결과, 도 10 및 도 17에 나타난 바와 같이 삼백초 잎의 헥산 분획물 및 삼백초잎을 핵산으로 바로 추출한 검체-핵산정제물들이 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 유리되는 탈과립 반응이 용량의존적으로 억제되었다.
실험예 2. 사이클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘D2 생성 억제 측정
상기 실시예에서 수득한 정제물 및 분획물의 각종 염증성질환에 대한 저해정도를 확인하기 위해 프로스타글란딘D2 EIA 키트 (Cayman, PGD2-MOX EIA kit, product no. 512011)를 사용하여 프로스타글란딘 D2 (PGD2)의 생성량을 측정하였다.
상기 참고예 2의 쥐 골수 유래 비만세포(BMMC) 배양 3주 후, IgE-감작 비만세포농도 2×105 cells/well에 상기 실시예에서 수득한 정제물 및 분획물(최종농도 125μg/ml)을 1시간 전 처리한 후, 25 ng/ml의 DNP-HSA를 처리한 다음, 세포 자극 8시간 후 상층액의 프로스타글란딘 D2를 프로스타글란딘 D2 분석 키트 (Cayman사)를 이용하여 EIA (Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 이때 사이클로옥시게나제-1에 의해서 생성되는 프로스타글란딘 D2의 생성을 억제시키기 위하여 쥐 골수 유래 비만세포에 아스피린 10㎍/㎖을 1시간 전에 미리 전 처리한 후 사용하였다. 세정 완충용액 (washing buffer)으로 4회 세정하고, 기질용액 (substrate solution)을 200㎕씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50㎕의 반응정지 용액 (stop solution)을 처리한 후에 450nm에서 흡광도를 ELx800 (BIO-TEK, Instrument, Inc, USA)으로 측정하였다. 이때 양성대조군으로는 COX-2-2/5-LO dual inhibitor인 licofelon(Toronto Research Chemicals Inc., North York, ON, Canada)을 사용하였다.
실험결과, 도 11 및 도 18에 나타난 바와 같이, 삼백초 잎의 헥산 분획물 및 삼백초잎을 핵산으로 바로 추출한 검체-핵산정제물들이 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 생성되는 COX-2의존적인 PGD2의 생성을 용량의존적으로 억제하였으며, 이 억제는 COX-2 단백질 발현억제로 일어남을 확인하였다.
실험예 3. 류코트리엔 생성에 대한 영향 분석 실험
상기 실시예에서 수득한 정제물 및 분획물이 류코트리엔 C4 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다 (Chang HW et al.. Planta. Medica., 70(5), pp.474-476, 2004).
상기 참고예 2의 쥐 골수 유래 비만세포 배양 3주 후 IgE-감작 비만세포(2× 105 cells/well)에 상기 실시예에서 수득한 정제물 및 분획물을 일정농도(1, 5, 10 μg/ml)로 미리 1시간 전처리 한 후 DNP-HSA (Sigma 사, S9915) 25 ng/ml를 15분 처리하였다. 세포 자극 후 상층액의 류코트리엔 C4 정량은 류코트리엔 C4 EIA 키트 (Enzyme linked immuno assay, Cayman 사, product no. 520211)를 이용하여 측정하였다.
실험 결과, 도 12 및 도 19에 나타난 바와 같이, 삼백초 잎의 헥산 분획물 및 삼백초잎을 핵산으로 바로 추출한 검체-핵산정제물들이 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 생성되는 5-lipoxygenase 의존적인 LTC4 생성이 용량 의존적으로 억제되었음을 확인하였다.
실험예 4. 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 생성에 미치는 영향
상기 실시예에서 수득한 정제물들의 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, IgE-감작 비만세포(2×105 cells/well)에 상기 실시예에서 수득한 정제물 및 분획물을 일정농도(5, 10 μg/ml)로 미리 1시간 전처리 한 후 DNP-HSA (Sigma 사, S9915) 25 ng/ml를 15분 처리하였다. 세포 자극 후 상층액의 TNF-α 및 IL-6 정량은 TNF-α 및 IL-6 EIA 키트 (Enzyme linked immuno assay, from R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA) 이용하여 측정하였다.
본 실험 결과, 도 13 내지 14 및 도 20 내지 21에 나타난 바와 같이 삼백초 잎의 헥산 분획물 및 삼백초잎을 핵산으로 바로 추출한 검체-핵산 정제물들이 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 생성되는 염증성 cytokine인 Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) 및 IL-6생성을 용량 의존적으로 억제함을 확인하였다.
실험예 5. 동물모델에서의 알러지 억제 효과
상기 실시예에서 수득한 정제물들의 생체 내(in vivo)에서의 항알러지 효과를 확인하기 위해, 문헌에 개시된 수동성 전신적 아나필락시스 (passive systemic anaphylaxis)법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다(Lionel A. Samayawardhena and Catherine J. Pallen J. Immunol 185, 5993-6002, 2010).
ICR 마우스에 생리식염수 100 μl 에 녹인 2 μg IgE를 정맥으로 주사한다. 24시간 후에 실시예에서 수득한 정제물 및 분획물을 일정량(50, 100 mg/kg, CMC에 녹임)을 미리 항원투여 1시간전 경구투여한다. 항원은 생리식염수 200 μl 에 녹인4 mg DNP-HSA를 정맥주사한다. 대조군으로 CMC(Carboxymethylcellulose)만 200㎕를 경구 투여하였다. 이때 양성 대조군으로는 H1 수용체 길항제인 fexofenadin을 사용하였다.
실험 결과, 도 15 내지 16 및 도 22 내지 23에 나타난 바와 같이, 삼백초 잎의 헥산 분획물 및 삼백초잎을 핵산으로 바로 추출한 검체-핵산정제물들이 항원-항체로 유도한 전신성 알러지 모델인 passive systemic anaphylaxis (PSA)을 사용하여 혈액내에 생성된 PGD2 및 LTC4생성이 용량 의존적으로 강하게 억제되었다.
본 발명자들은 상기 삼백초 잎을 대상으로 상기한 독성물질을 제거하고자 추출 및 분획방법을 연구개발한 결과, 독성물질을 제거한 삼백초 잎 정제물을 제조하는 제조방법을 완성하고, 상기 제조방법으로 개발된 분획물들이 쥐골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 유리되는 탈과립 반응을 억제하고, COX-2 의존적인 PGD2의 생성을 억제하고, 5-lipoxygenase 의존적인 LTC4 생성을 억제하고 염증성 cytokine인 Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α) 및 IL-6생성을 억제하였을 뿐만 아니라, 항원-항체로 유도한 전신성 알러지 모델인 생체내 동물실험 모델인 passive systemic anaphylaxis (PSA)을 사용하여 혈액내에 생성된 PGD2 및 LTC4생성이 용량 의존적으로 강하게 억제함을 알아내어 본 발명을 완성하여 알러지 치료 분야에 이용가능하다.

Claims (11)

  1. 건조된 삼백초 잎에 시료 부피의 0.5배 내지 200배 중량(w/v)의 헥산, 헵탄, 메틸렌클로리드, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매 또는 이의 혼합용매를 첨가하는 제 1단계; 상기 용액을 30분 내지 1주일 동안, 10℃ 내지 150℃에서 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류냉각 추출방법으로 추출하는 제 2단계; 상기 추출과정을 1회 내지 제 10회 반복수행하는 제 3단계; 상기 추출물을 추출용매를 제거하고 건조하는 제 4단계 공정을 포함하는 독성물질을 제거한 삼백초 잎 정제물을 제조하는 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1단계의 용매는 헥산, 헵탄, 또는 이의 혼합용매임을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 건조된 삼백초 잎에 시료 중량의 1배 내지 200배(w/w)의 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매를 가하여 12시간 내지 1주일 동안, 10℃ 내지 150℃에서, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류냉각 추출 등의 추출방법으로 추출하여 조추출물을 수득하는 제 2단계; 상기 조추출물을 상기 조추출물 중량의 0.05 내지 50배 부피 (v/w%)의 물을 가하여 현탁물을 제조하는 제 3단계; 상기 현탁물에 상기 현탁물 부피의 0.5 내지 20배 (v/w%)의 n-헥산, 헵탄, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매로 분획하여 비극성 용매 가용분획물을 수득하는 제 4단계; 상기 비극성용매 가용 분획물을 회수하여 증발건조하는 제 5단계 공정을 포함하는 독성물질을 제거한 삼백초 잎 분획물을 제조하는 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 제 4단계의 용매는 헥산, 에틸아세테이트 또는 이의 혼합용매임을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제 1항 또는 제 3항의 삼백초잎 정제물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 천식 또는 알러지성 질환은 기관지천식, 알러지성 비염, 알러지성 천식 또는 알러지성 피부염인 약학조성물.
  7. 제 1항 또는 제 3항의 삼백초잎 정제물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 건강기능식품 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태인 건강기능식품.
  9. 천식 또는 알러지성 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타내는 제 1항 또는 제 3항의 삼백초잎 정제물 또는 분획물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품.
  10. 제 1항 또는 제 3항의 제조방법으로 수득된 삼백초 잎 정제물 또는 분획물을 천식 또는 알러지성 질환 환자에게 투여함을 포함하는, 천식 또는 알러지성 질환 환자를 치료하기 위한 치료방법.
  11. 천식 또는 알러지성 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 제 1항 또는 제 3항의 제조방법으로 수득된 삼백초 잎 정제물 또는 분획물의 용도.
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