WO2018008838A1 - 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 벼 추출물 및 그 용도 - Google Patents

조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 벼 추출물 및 그 용도 Download PDF

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김현석
박기문
양희진
윤형식
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주식회사 성균바이오텍
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Definitions

  • the present invention relates to a rice extract that promotes osteoblast differentiation and inhibits adipocyte differentiation
  • the rice extract of the present invention can be used in the manufacture of health food or medicines associated with bone metabolism disease or obesity.
  • Bones not only structurally support muscles or organs, but also support the soft tissues and weight of the human body, surround internal organs, protect internal organs from external shocks, and store substances such as calcium and other essential minerals in the body, such as phosphorus or magnesium.
  • substances such as calcium and other essential minerals in the body, such as phosphorus or magnesium.
  • Bone is composed of osteoblasts (osteoblast), osteocytes (osteocyte), osteoclasts (osteoclast).
  • osteoblasts are derived from mesenchymal stem cells capable of differentiating into chondrocytes, myocytes, and adipocytes, and form bone tissues through proliferation, bone matrix formation, and calcification. It plays a role.
  • the osteoclasts also play a role in absorbing bone.
  • osteoblasts regulate homeostasis of bone metabolism in the body by regulating the differentiation of osteoclasts responsible for bone resorption through the secretion of substances such as receptor activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG). Keep it.
  • RNKL nuclear factor- ⁇ B ligand
  • OPG osteoprotegerin
  • a bone metabolic disease such as osteoporosis, bone formation disorder or fracture occurs.
  • Osteoporosis a typical bone metabolic disease, is characterized by a decrease in bone mass and bone quality, with bone mineral density of 2.5 or less, or T-score (standard deviation from the average adult's average bone mass) of -2.5 or less.
  • T-score standard deviation from the average adult's average bone mass
  • Osteoporosis occurs frequently in postmenopausal women, and with age, the bone matrix decreases and fat cells form in the voids, and the formed fat cells decrease the function and differentiation of osteoblasts, which form bone, and release inflammatory cytokines. It is known to promote the function and differentiation of osteoclasts, which are responsible for the absorption of bone by secretion. If the bone density is excessively reduced, a small impact will easily cause fractures. Osteoporosis is not a symptom itself but rather various fractures caused by bone weakness, especially femoral fractures or vertebral fractures, which limit long-term activity and lead to a healthy life, resulting in 15% of elderly deaths.
  • Osteodystrophy is also called osteotrophy and is a disease of bone caused by chronic kidney failure. It is caused by congenital abnormal kidney function and dies when dialysis is not performed when the kidney is weak. This bone disease is called renal osteodystrophy. Bone diseases related to osteotrophy include osteomalacia and osteotease fibrosa.
  • Calcium adjuvant is recommended for the treatment or prevention of the bone metabolism disease, vitamin D, or hormones such as estrogen or calcitonin are recommended for postmenopausal women.
  • a bisphosphonate family such as Fosamax (component name: alendronate) and Actonel (component name: risedronate) is mainly used for bone resorption inhibitors that inhibit osteoclasts and induce death.
  • calcium adjuvant inhibits parathyroid hormone secretion and prevents bone loss due to bone resorption, but individual differences in bone mass maintenance are known to be severe. Hormone increases bone density, but side effects such as breast cancer, myocardial infarction and venous thrombosis (Nelson, HD et al., JAMA, 288: 872-881, 2002; Lemay, A., J. Obstet. Bynaecol. Can., 24: 711-7152-3). In the case of bisphosphonate preparations, cases of necrosis of the jawbone, severe atrial fibrillation, incapacitation of bones or joints or pain of the musculoskeletal are reported (Coleman RE., Br J Cancer, 98: 1736-1740 (2008).
  • the conventional agents for the treatment or prevention of bone metabolic diseases have a pharmacological action to prevent bone loss anymore, but to date, there was no effect to restore the reduced bone mass to its original state.
  • the present inventors have confirmed that the rice extract is capable of treating and preventing bone metabolic diseases or obesity by controlling the differentiation of osteoblasts and adipocytes and completed the invention.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating bone metabolism of the present invention is an active ingredient of the rice ( Oryza sativa ) extract.
  • the 'Rice' used in the present invention includes seed (outpost) of the seedling cultivation step in which the roots from the rice seed.
  • the rice extract is an outpost, stem or root extract of rice, preferably the root extract.
  • the outpost means the whole plant including roots and stems except grains.
  • the root means a portion of the rice except the ground portion.
  • Rice root extract of the present invention has the highest osteoblast differentiation activity and adipocyte differentiation inhibitory activity in the harvester root extract.
  • the term 'harvest' used in the present invention means 50 days before the harvesting date for harvesting rice, preferably 30 days before the harvesting date, to a point after a certain period of time after harvesting. A certain time after harvesting does not need to be particularly limited, but may be used within one year after harvesting.
  • osteoblast differentiation activity and adipocyte differentiation inhibitory activity of rice root extract tended to increase as the growth period increased, but commercially, the rice root remaining in the paddy field was used as a raw material for the production of rice root extract.
  • the use of roots that can be obtained within a few weeks or one to two months after growing the hair from the bedside may be somewhat less active, but is advantageous for reducing production costs.
  • the extract may be an extract of water, an organic solvent or a mixed solvent thereof, including purified water.
  • the organic solvent may be one or more solvents selected from the group consisting of alcohols of 1 to 4 carbon atoms, hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, chloroform, diethyl ether, more preferably methanol, ethanol or methanol And an aqueous solution of ethanol.
  • polar solvents such as acetic acid, dimethyl-formamide (DMFO) and dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, fluoroalkane, pentane, 2,2,4-trimethylpentane, decane, Cyclohexane, cyclopentane, diisobutylene, 1-pentene, 1-chlorobutane, 1-chloropentane, o-xylene, diisopropyl ether, 2-chloropropane, toluene, 1-chloropropane, chlorobenzene,
  • Nonpolar solvents such as benzene, diethyl ether, diethyl sulfide, 1,2-dichloroethane, anneal, diethylamine, ether, carbon tetrachloride and THF (Tetrahydrofuran) can be used.
  • the rice extract of the present invention is an extract of water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof, or a fraction obtained by distilling it with dichloromethane or ethyl acetate.
  • the rice extract of the present invention contains any one or more compounds selected from the compounds of the following Chemical Formulas 1, 2 and 3 as active ingredients or indicators that promote osteoblast differentiation and inhibit adipocyte differentiation.
  • the method for preparing the extract of the present invention may be, for example, dry and ground rice plants, stems or roots of rice, and then, about 1 to 50 times the weight of the dried sample, preferably about 10 to 40 times the amount of water, With a solvent selected from an organic solvent or a mixed solvent thereof, stirring extraction, boiling water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction, ultrasonic extraction for about 24 hours, or 2 to 4 hours at 20 to 100 °C, preferably 40 to 60 °C Alternatively, using an extraction method such as supercritical extraction, the extract obtained after hot water extraction is preferably filtered, concentrated under reduced pressure or dried to obtain the extract of the present invention.
  • the term 'as an active ingredient' means containing an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the rice extract.
  • the bone metabolic disease includes osteoporosis, bone dysplasia or fractures.
  • the 'osteoporosis' includes all types of clinical classification according to bone mineral density (BMD) measurement, that is, osteopenia, osteoporosis, and severe osteoporosis.
  • BMD bone mineral density
  • primary osteoporosis includes type 1 postmenopausal osteoporosis, type 2 senile osteoporosis, and secondary osteoporosis.
  • the ⁇ osteodystrophy '' includes osteomalacia, osteote fibrosa, and the like.
  • the term 'fracture' refers to a state in which continuity of bone or cartilage is completely or incompletely lost or linear deformation occurs.
  • the fractures are repeatedly loaded with pathological fractures caused by anatomical location, degree of fracture, direction of fracture surface, presence of open window, number of fractures, stability, presence of fracture fragments, osteoporosis and tumor osteomyelitis, which are special fractures. It can be classified as fatigue fracture caused by the addition.
  • Health functional foods for improving or preventing bone metabolism disease of the present invention promotes osteoblast differentiation and has the activity of inhibiting adipocyte differentiation. Therefore, obesity and bone metabolic diseases can be simultaneously improved or prevented.
  • Health functional foods for improving or preventing bone metabolism disease of the present invention may include vitamins, natural products, or extracts thereof having the improvement or preventive activity of bone metabolism disease with rice extract.
  • vitamins, natural products, or extracts thereof having the improvement or preventive activity of bone metabolism disease with rice extract For example, calcium supplements, vitamin D, etc. may be included in combination with one or more of the rice extracts.
  • Health functional foods for improving or preventing bone metabolism disease of the present invention may include food supplements additives in addition to foods acceptable in addition to the active ingredient described above.
  • the health functional food of the present invention includes various foods, gums, teas, vitamin complexes, health supplements, and the like, and may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, or beverages.
  • the amount of rice extract in the food can generally be added at 0.001 to 5% by weight of the total food weight, the amount of the compound in the beverage It can be added at a ratio of 0.002 to 5 g, preferably 0.03 to 1 g, based on 100 ml.
  • the beverage is not particularly limited in the liquid component and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional components, as in general beverages.
  • natural carbohydrates are conventional monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose, such as maltose, sucrose and the like, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like.
  • Sugars and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of natural carbohydrates is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of beverage.
  • the health functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid And salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the health functional foods of the present invention may contain fruit flesh for the production of natural fruit juice and fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is generally selected in the range of 0.1 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the health functional food of the present invention.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating bone metabolic disease of the present invention promotes osteoblast differentiation and has an activity of inhibiting adipocyte differentiation. Therefore, obesity and bone metabolic diseases can be prevented or treated simultaneously.
  • composition for preventing or treating bone metabolic disease of the present invention may include a drug, vitamins, natural products, or extracts thereof having the prophylactic or therapeutic activity of the bone metabolic disease together with the rice extract.
  • the rice extract calcium adjuvant, vitamin D, hormones such as estrogen or calcitonin, bisphosphonate-based bone resorption inhibitors such as Fosamax (component name: alendronate) and actonel (component name: risedronate)
  • Fosamax component name: alendronate
  • actonel component name: risedronate
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating bone metabolic disease of the present invention may be prepared by further including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, including antioxidants, buffers, Other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating bone metabolic diseases of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, intraperitoneally, subcutaneously or topically) according to the purpose, and the dosage may be weight, age, The range varies depending on sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of disease.
  • the dosage of the rice extract is 0.1mg / kg to 10g / kg per day, preferably 1mg / kg to 1g / kg. Administration can be administered once a day or divided into several times depending on the purpose.
  • the present invention relates to a rice extract having activity for promoting osteoblast differentiation and inhibiting adipocyte differentiation
  • the rice extract of the present invention increases the expression of ALP, Osterix and Runx2, genes involved in osteoblast differentiation, Drugs or health useful for reducing bone marrow disease or obesity by reducing the expression of PPAR ⁇ , aP2 and CD36, genes involved in cell differentiation, increasing BMD in ovarian osteoporosis animal models, and reducing fat cells in bone marrow It can be used as an active ingredient of nutraceuticals.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a process of preparing a solvent fraction of the rice extract in Preparation Example 3.
  • Figure 2 is a graph measuring the change in ALP production amount by -b value after ALP staining to determine the change in ALP (alkaline phosphatase) production according to the treatment of each part of rice during osteoblast differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 1 to be.
  • FIG 3 is a graph showing the result of staining oil red o absorbance after oil red o staining in order to show the change in fat production according to the extraction of each part of rice during adipocyte differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 1 .
  • Figure 4 shows the change in ALP production amount after the ALP staining to determine the ALP (alkaline phosphatase) production change according to the root extract treatment of rice during the osteoblast differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 2 with -b value One graph.
  • FIG. 5 shows the staining results of oil red o absorbance after oil red o staining in order to show a change in fat production according to the root extract treatment of rice during the adipocyte differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 2.
  • FIG. It is a graph.
  • FIG. 6 shows the change in ALP production amount by -b value after ALP staining to confirm the change in ALP (alkaline phosphatase) production according to the treatment of each solvent fraction of rice root extract during osteoblast differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 3.
  • ALP alkaline phosphatase
  • FIG. 7 shows the staining results of oil red o absorbance after oil red o staining to show a change in fat production according to treatment of each solvent fraction of rice root extract during adipocyte differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 3. It is a graph.
  • Figure 8 shows the change in ALP production after ALP staining to confirm the change in ALP (alkaline phosphatase) production according to the treatment of six compounds isolated in Preparation Example 4 when osteoblast differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 4 -b value It is a graph measured by.
  • Figure 9 shows the results of the oil red o absorbance after staining oil red o stains to show the change in fat production according to the treatment of six compounds isolated in Preparation Example 4 when adipocyte differentiation of C3H10T1 / 2 cell line in Experimental Example 4 It is a graph.
  • FIG. 10 is a graph showing changes in expression levels of mRNAs ALP, Osterix and Runx2 in the C3H10T1 / 2 cell line according to the treatment of six compounds isolated in Preparation Example 4 in Experimental Example 4.
  • FIG. 10 is a graph showing changes in expression levels of mRNAs ALP, Osterix and Runx2 in the C3H10T1 / 2 cell line according to the treatment of six compounds isolated in Preparation Example 4 in Experimental Example 4.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in expression levels of CD36, aP2, and PPAR ⁇ mRNAs in the C3H10T1 / 2 cell line according to the treatment of six single peaks isolated from Preparation Example 3 in Experimental Example 4.
  • FIG. 12 is a graph comparing the weight of ovarian resection rats administered orally with rice root extract in Experimental Example 5 for 12 weeks.
  • Figure 13 is a graph measuring bone mineral density (Bone Mineral Density) of the ovarian resected rat femur administered rice root extract in Experimental Example 5.
  • Figure 14 is a graph showing the expression levels of ALP, Osterix and Runx2 mRNA in bone cells in the femur of ovarian resection rats administered with rice root extract in Experimental Example 5.
  • Rice ethanol extracts were prepared by dividing the harvested rice into stems, roots, grains (except chaff), and outposts (including whole stems and roots, except grains).
  • Root seed seedling cultivation roots, seedling cultivation roots after 90 days of growth, roots after seedling cultivation 110 days, roots after 130 days of cultivation (after harvesting). Rice root extract was prepared.
  • Rice root ethanol extract of Preparation Example 1 was fractionated stepwise as shown in Figure 1 to prepare each fraction.
  • the ethanol extract of the rice root of Preparation Example 1 was fractionated by hexane, dichloromethane, ethyl acetate, butyl alcohol and water stepwise, hexane fraction (Hexane), dichloromethane fraction (DCM), ethyl acetate fraction (EtOAc), Butanol fraction (BuOH) and water fraction (DW) were obtained and these were each concentrated and lyophilized.
  • ALP alkaline phosphatase
  • C3H10T1 / 2 cell lines derived from mouse embryonic fibroblasts are generally pluripotent stem cell lines capable of differentiating into various cell lineages including osteoblasts.
  • One of the characteristics of osteoblasts is that it shows ALP (Alkaline phosphatase) activity, and thus the osteoblast differentiation effect was measured through ALP activity of C3H10T1 / 2 cell lines.
  • ALP Alkaline phosphatase
  • C3H10T1 / 2 cell line was incubated in DMEM medium containing 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin at 37 ° C and 5% CO2.
  • the C3H10T1 / 2 cells were incubated with a medium containing 10 mM ⁇ -glycerophosphate and 50 ⁇ g / ml ascorbic acid for osteoblast differentiation at a concentration of 2.5 ⁇ 10 ⁇ s / ml in 6 well plates, and the NK11 compound was cultured. 0.1, 0.5, 1 and 5 ⁇ M, respectively, were added and differentiated for 9 days with changing medium every 3 days.
  • C3H10T1 / 2 pluripotent stem cell lines were cultured in DMEM medium containing 10% FBS, 1% penicillin and streptomycine at 37 ° C and 5% CO2.
  • the cells were incubated with a medium containing 10 mM ⁇ -glycerophosphate and 50 ⁇ g / ml ascorbic acid for osteoblast differentiation at a concentration of 2.5 ⁇ 10 ⁇ cells / ml in 6 well plates, and the medium was changed every 3 days.
  • stem and root extracts showed a strong osteoblast differentiation activity, in particular the root extract was the highest activity, the grain extract was low (see Fig. 2).
  • Adipocyte differentiation inhibitory activity was similar to the starch extract and grain extract, and the stem extract and root extract in order to inhibit the fat production of adipocytes (see Figure 3).
  • ALP alkaline phosphatase
  • osteoblast differentiation activity tended to increase with increasing growth period from rice seed, and after 110 days of seedling cultivation, there was no significant difference in osteoblast differentiation activity.
  • ALP alkaline phosphatase
  • osteoblast differentiation activity was significantly increased only in dichloromethane fraction (DCM) and ethyl acetate fraction (EtOAc), and osteoblast differentiation activity was not observed in the remaining fractions.
  • the active ingredient of the rice root extract having the activity of differentiating osteoblasts and the differentiation of adipocytes was expected to be present in the dichloromethane fraction, and the effective compound was separated from the fraction.
  • the active fraction layer was selected by preparing a fraction according to the molecular size. Each fraction was obtained by Sephadex LH-20 column size-exclusion chromatography using a methanol single solvent. After confirming the physiological activity with the obtained fractions, two active fractions of the fractions obtained by reprocessing the active fractions were identified.
  • the two fractionated layers were separated using TLC (Thin layer Chromatography) to establish separation conditions, separated by prep-HPLC, and then reconfirmed by TLC.
  • TLC Thin layer Chromatography
  • the structure of the material identified as a single peak was characterized by electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS), hydrogen-nuclear magnetic resonance (1H-NMR) and carbon-nuclear magnetic resonance spectroscopy. Analysis by (13C-NMR).
  • 2D NMR was measured to obtain the IR, CD, alpha values to identify the material.
  • Peak 1 is 2E, 2'E)-(-2,5-bis (4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) tetrahydrofuran-3,4-diyl) bis (methylene) bis (3- (4) -hydroxyphenyl) acrylate).
  • Peak 2 is (2E, 2'E)-(-2,5-bis (4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) tetrahydrofuran-3,4-diyl) bis (methylene) bis (3- ( 4-hydroxyphenyl) acrylate) (isomer).
  • Peak 3 is 2 (2E, 2'E)-(-2,5-bis (4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) tetrahydrofuran-3,4-diyl) bis (methylene) bis (3- (4-hydroxyphenyl) acrylate) (isomer).
  • Peak 4 was 2-O-feruloyl-glyceride of Chemical Formula 4 below.
  • Peak 5 was 2-O-feruloyl-glyceride (isomer) of Chemical Formula 5 below.
  • Peak 6 was Takakin of Formula 6 below.
  • Osteoblast differentiation activity and adipocyte differentiation inhibitory activity of the compounds of Formulas 1 to 6 of the peaks 1 to 6 isolated in Preparation Example 4 were carried out in the same manner as in Experimental Example 1, and the results are shown in FIGS. 8 and 9. It was. However, the addition concentration of each sample was changed to 5 ⁇ g / ml and added only 1/8.
  • ALP alkaline phosphatase
  • adipocyte differentiation inhibitory activity was significantly increased in the compounds of formulas (1) and (2) of peaks 1 and 2, and then the adipocyte differentiation inhibitory activity was shown in the compound of formula (3) of the peak 3, the remaining peaks 4 to 6 In the compounds of Formulas 4 to 6, adipocyte differentiation inhibitory activity was hardly observed.
  • the active ingredient of the rice root extract having the activity of differentiating osteoblasts and the differentiation of adipocytes was predicted to the compounds of the formula (1).
  • osteoblast differentiation factors ALP, Ostreix and Runx2 were confirmed by differentiating C3H10T1 / 2 cell lines into osteoblasts as in Experimental Example 1.
  • the expression level of the adipocyte differentiation factors CD36, aP2 and PPAR ⁇ was confirmed by differentiating the C3H10T1 / 2 cell line into adipocytes as in Experimental Example 1.
  • RNA extraction was done using TRIzol (Invitrogen). 1 ⁇ g of the isolated RNA was synthesized by cDNA by adding random primer, dNTP, and PrimeScript TM Reverse Transcriptase (TaKaRa). The synthesized cDNA was subjected to realtime PCR with SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) using a primer.
  • the experimental group was group that was open without ovarian resection (Sham), ovarian resection after distilled water (OVX), and ovarian resection after administration of rice root extract of Preparation Example 1 at a concentration of 50 mg / kg each (OVX + REOS) and the non-glycoside soy isoflavone (OVX + ISF) 50 mg / kg administered as a positive control group was tested.
  • Body weights were measured weekly for 12 weeks, and femoral bones of ovarian resected rats were sacrificed at the end of the experiment and bone mineral density (BMD) was measured using a dual energy X-ray bone density analyzer (Norland pDEXA).
  • RNA extraction was done using TRIzol (Invitrogen). 1 ug of isolated RNA was synthesized by cDNA by adding random primer, dNTP, PrimeScript TM Reverse Transcriptase (TaKaRa). Synthesized cDNA was performed by realtime PCR with SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) using primers to confirm mRNA expression levels of ALP, Osterix and Runx2, which are differentiation factors related to osteoblast formation.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
  • Vitamin B6 0.5 mg
  • composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixtures is mixed with a component suitable for a health food in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method.
  • the granules may be prepared and used in the manufacture of health functional food according to a conventional method.
  • the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed sterilized and then refrigerated It is used in the manufacture of the nutraceutical beverage composition of the present invention.

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Abstract

본 발명은 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 활성을 갖는 벼 추출물에 관한 것으로, 본 발명의 벼 추출물은 조골세포의 분화에 관련된 유전자인 ALP, Osterix 및 Runx2의 발현을 증가시키고, 지방세포의 분화를 관여하는 유전자인 PPARγ, aP2 및 CD36의 발현을 감소하며, 난소절제 골다공증 동물모델에서 골밀도(BMD)를 증가시키며, 골수 속의 지방세포를 감소시켜, 골대사 질환 또는 비만에 유용한 의약품 또는 건강기능식품의 유효성분으로 이용될 수 있다.

Description

조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 벼 추출물 및 그 용도
본 발명은 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 벼 추출물에 관한 것으로, 본 발명의 벼 추출물은 골대사 질환 또는 비만과 관련된 건강기능식품 또는 의약품의 제조에 이용될 수 있다.
뼈는 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호해주며 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.
뼈는 조골세포(osteoblast), 골세포(osteocyte), 파골세포(osteoclast)로 이루어져 있다. 그 중 조골세포는 연골세포(contract), 미오사이트(myocyte), 지방세포(adipocyte)로 분화가 가능한 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)로 부터 유래하며 증식기, 골 기질 형성기, 석회화기를 거쳐 골조직을 형성하는 역할을 수행한다. 또한 파골세포는 골을 흡수하는 역할을 수행한다.
성장이 끝난 성인의 뼈는 파골세포에 의해 오래된 뼈는 제거하고 조골세포에 의해 새로운 뼈로 대체하는 골 흡수와 생성을 지속적으로 반복 재생하면서 골재형성 과정이 일어난다. 예를 들어 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand) 및 그의 유도 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 분비를 통해 골흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골대사의 항상성을 유지한다.
상기 골대사의 항상성이 특정 원인에 의해 무너지면 골다공증, 골형성 장애 또는 골절 등과 같은 골대사 질환이 발생한다.
대표적인 골 대사 질환인 골다공증은 골량과 골질이 감소하여 골밀도(Bone mineral density)가 2.5 이하이거나 T-score(일반적인 성인의 평균 골질량과의 표준편차)가 -2.5이하인 경우로 뼈가 약해져 골절이 일어나기 쉬운 상태를 말한다. 골다공증은 폐경기 이후 여성에서 빈번하게 발생하며 나이가 들수록 골 기질이 감소하고 그 빈 공간에 지방세포의 형성이 이루어지며 형성된 지방세포는 뼈를 형성하는 조골세포의 기능과 분화는 저하시키고 염증성 사이토카인을 분비하여 골의 흡수를 담당하는 파골세포의 기능과 분화를 촉진한다고 알려져 있다. 골밀도가 과다하게 감소하게 되면 작은 충격에도 쉽게 골절이 생기게 된다. 골다공증은 그 증세 자체보다는 뼈의 약화에 따라 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등으로 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
또한 골형성 장애(osteodystrophy)라 함은, 골이영양증이라고도 하며 만성 신부전 등에 의해 발생되는 뼈의 질환이다. 선천적으로 비정상적인 신장기능에 의해 발생하며, 신장이 약해질 때 투석을 하지 않으면 사망한다. 이와 같은 뼈 질환을 신성 골이영양증(renal osteodystrophy)이라고 불리운다. 골이영양증과 관계있는 뼈 질환으로는 골연화증(osteomalacia) 섬유성 골염(osteitis fibrosa) 등이 있다.
상기 골대사 질환의 치료 또는 예방을 위하여 칼슘보강제가 추천되며, 폐경기의 여성들에게는 비타민 D, 또는 에스트로겐이나 칼시토닌과 같은 호르몬제가 추천되고 있다. 또한 포사맥스(Fosamax, 성분명: alendronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열이 파골세포를 저해하고 사멸을 유도하는 골흡수 저해제가 주로 사용되고 있다.
그러나 칼슘보강제는 부갑상선 호르몬의 분비를 저해하며 골흡수에 의한 골량 감소를 방지하나 골량 유지의 개인 차이가 심한 것으로 알려져 있고, 호르몬제는 골밀도를 증가시키나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된바 있다(Nelson, H.D et al., JAMA, 288:872-881, 2002; Lemay, A., J.Obstet. Bynaecol. Can., 24:711-7152-3). 또한 비스포스포네이트 제제의 경우, 턱뼈의 괴사, 중증 심방세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 보고되고 있다(Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008).
또한 상기 종래 골대사 질환의 치료 또는 예방용 제제들은 더 이상 골 손실을 막는 약리 작용은 가지지만 현재까지 감소된 골량을 원상태로 회복시킬 만한 효과는 없었다.
이에 따라 본 발명자들은 벼 추출물이 조골세포와 지방세포의 분화 조절을 통해 골대사 질환 또는 비만을 치료하고 예방 가능함을 확인하고 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 벼 추출물을 유효성분으로 하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 벼 추출물을 유효성분으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품은 벼(Oryza sativa) 추출물을 유효성분으로 한다.
또한 본 발명의 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 벼(Oryza sativa) 추출물을 유효성분으로 한다.
본 발명에서 사용하는 '벼'는 볍씨에서 뿌리가 발생한 모판 재배 단계의 모(전초)를 포함한다. 상기 벼 추출물은 벼의 전초, 줄기 또는 뿌리 추출물이고, 바람직하게는 뿌리 추출물이다. 상기 전초는 알곡을 제외한 뿌리 및 줄기를 포함하는 전체 식물을 의미한다. 상기 뿌리는 벼에서 지상부를 제외한 부분을 의미한다.
본 발명의 벼 뿌리 추출물은 수확기 뿌리 추출물에서 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성이 가장 높다. 본 발명에서 사용하는 용어 '수확기'는 벼를 수확하는 수확일 전 50일, 바람직하게는 수확일 전 30일부터 수확 후 일정기간이 지난 시점까지를 의미한다. 수확 후 일정시간은 특별히 한정할 필요는 없으나 수확 후 1년 이내의 것을 사용할 수 있다.
또한 벼 뿌리 추출물의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성은 생육기간이 증가함에 따라 증가하는 경향을 나타내지만, 상업적으로 벼 뿌리 추출물 제조를 위한 원료로는 수확 후 논에 남아 있는 벼 뿌리를 활용하거나, 모판에서 모를 생육시킨 후 수주 또는 1 내지 2 개월 이내에 얻을 수 있는 뿌리를 활용하는 것이 다소 활성은 낮을 수 있지만, 생산 비용 절감에 유리하다.
상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매의 추출물일 수 있다. 바람직하게 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매일 수 있고, 더욱 바람직하게는 메탄올, 에탄올 또는 메탄올과 에탄올의 수용액이다. 유기용매에는 이외에도 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 등의 극성 용매, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran) 등의 비극성 용매가 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어인 '추출물'은 상기 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 비극성용매 또는 이들의 혼합용매의 추출물뿐만 아니라, 상기 용매들로 재분획한 분획물, 또는 다양한 크로마토그래피나 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 통해 얻은 분획물을 포함한다.
바람직하게 본 발명의 벼 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물, 또는 이를 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트로 분획한 분획물이다.
본 발명의 벼 추출물은 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 유효성분 또는 지표성분으로 함유한다.
Figure PCTKR2017004973-appb-C000001
Figure PCTKR2017004973-appb-C000002
Figure PCTKR2017004973-appb-C000003
본 발명의 추출물의 제조방법은 예를 들어, 벼의 전초, 줄기 또는 뿌리를 음건하여 마쇄한 후, 건조된 시료의 중량의 약 1 내지 50배, 바람직하게는 약 10 내지 40배 분량의 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로, 20 ~ 100 ℃, 바람직하게는 40 ~ 60 ℃에서 약 24시간, 또는 2 내지 4시간 동안 교반추출, 열탕 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열탕 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 '유효성분으로 하는'이란 상기 벼 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
상기 골대사 질환은 골다공증, 골형성 장애 또는 골절 등을 포함한다.
상기 '골다공증(osteoporosis)'은 골밀도(bone mineral density, BMD) 측정에 따른 임상적 분류 형태 즉, 골감소증(osteopenia), 골다공증(osteoporosis), 심각한 골다공증(severe osteoporosis)을 모두 포함한다. 또한 원발성 골다공증인 제1형 골다공증(type 1. postmenopausal osteoporosis), 제2형 골다공증(type 2. senile osteoporosis), 속발성 골다공증을 모두 포함한다.
상기 '골형성 장애(osteodystrophy)'는 골연화증(osteomalacia), 섬유성 골염(osteitis fibrosa) 등을 포함한다.
상기 '골절(fracture)'은 뼈나 연골의 연속성이 완전 또는 불완전하게 소실되거나 선상의 변형을 일으킨 상태를 말한다. 상기 골절은 해부학적인 위치, 골절의 정도, 골절면의 방향, 개방창 동반여부, 골절편의 수, 안정성, 골절편의 전위 여부, 특수 골절인 골다공증과 종양 골수염 등으로 인하여 발생되는 병적 골절과 반복해서 부하가 가해져서 발생되는 피로골절 등으로 분류될 수 있다.
본 발명의 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품은 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 활성을 갖는다. 따라서 비만 및 골대사 질환을 동시에 개선 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품은 벼 추출물과 함께 골대사 질환의 개선 또는 예방 활성을 갖는 비타민, 천연물, 또는 그 추출물을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 벼 추출물과 함께 칼슘보강제, 비타민 D 등이 하나 이상 복합적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품은 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 각종 식품류, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
상기 벼 추출물이 골대사 질환 개선 또는 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 때, 식품 중의 상기 벼 추출물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.001 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 음료 중의 상기 화합물의 양은 음료 100 ㎖를 기준으로 0.002 내지 5 g, 바람직하게는 0.03 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
상기 음료는 유효성분으로 상기 벼 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 음료 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 건강기능식품들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 활성을 갖는다. 따라서 비만 및 골대사 질환을 동시에 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 벼 추출물과 함께 골대사 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 약물, 비타민, 천연물, 또는 그 추출물을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 벼 추출물과 함께 칼슘보강제, 비타민 D, 에스트로겐이나 칼시토닌과 같은 호르몬제, 포사맥스(Fosamax, 성분명: alendronate), 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 골흡수 저해제가 하나 이상 복합적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 목적에 따라 경구 투여 혹은 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 복강 내, 피하 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에서 벼 추출물의 투여량은 1일 0.1mg/kg내지 10g/kg이며, 바람직하게는 1mg/kg 내지 1g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 1일 1회 혹은 목적에 따라 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 활성을 갖는 벼 추출물에 관한 것으로, 본 발명의 벼 추출물은 조골세포의 분화에 관련된 유전자인 ALP, Osterix 및 Runx2의 발현을 증가시키고, 지방세포의 분화를 관여하는 유전자인 PPARγ, aP2 및 CD36의 발현을 감소하며, 난소절제 골다공증 동물모델에서 골밀도(BMD)를 증가시키며, 골수 속의 지방세포를 감소시켜, 골대사 질환 또는 비만에 유용한 의약품 또는 건강기능식품의 유효성분으로 이용될 수 있다.
도 1은 제조예 3에서 벼 추출물의 용매 분획물을 제조하는 과정을 도시한 개략도이다.
도 2는 실험예 1에서 C3H10T1/2세포주의 조골세포 분화 시 벼의 각 부위 추출물 처리에 따른 ALP(alkaline phosphatase)생성량 변화를 확인하기 위한 ALP염색한 후 ALP 생성량 변화를 -b value로 측정한 그래프이다.
도 3은 실험예 1에서 C3H10T1/2세포주의 지방세포 분화 시 벼의 각 부위 추출물 처리에 따른 지방 생성량 변화를 나타내기 위해 오일 레드 오 염색을 한 후 상기 염색 결과를 오일 레드 오 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 2에서 C3H10T1/2세포주의 조골세포 분화 시 벼의 생육 시기별 뿌리 추출물 처리에 따른 ALP(alkaline phosphatase)생성량 변화를 확인하기 위한 ALP염색한 후 ALP 생성량 변화를 -b value로 측정한 그래프이다.
도 5는 실험예 2에서 C3H10T1/2세포주의 지방세포 분화 시 벼의 생육 시기별 뿌리 추출물 처리에 따른 지방 생성량 변화를 나타내기 위해 오일 레드 오 염색을 한 후 상기 염색 결과를 오일 레드 오 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 3에서 C3H10T1/2세포주의 조골세포 분화 시 벼 뿌리 추출물의 각 용매 분획물 처리에 따른 ALP(alkaline phosphatase)생성량 변화를 확인하기 위한 ALP염색한 후 ALP 생성량 변화를 -b value로 측정한 그래프이다.
도 7은 실험예 3에서 C3H10T1/2세포주의 지방세포 분화 시 벼 뿌리 추출물의 각 용매 분획물 처리에 따른 지방 생성량 변화를 나타내기 위해 오일 레드 오 염색을 한 후 상기 염색 결과를 오일 레드 오 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 4에서 C3H10T1/2세포주의 조골세포 분화 시 제조예 4에서 분리된 6개의 화합물 처리에 따른 ALP(alkaline phosphatase)생성량 변화를 확인하기 위한 ALP염색한 후 ALP 생성량 변화를 -b value로 측정한 그래프이다.
도 9는 실험예 4에서 C3H10T1/2세포주의 지방세포 분화 시 제조예 4에서 분리된 6개의 화합물 처리에 따른 지방 생성량 변화를 나타내기 위해 오일 레드 오 염색을 한 후 상기 염색 결과를 오일 레드 오 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 10은 실험예 4에서 제조예 4에서 분리된 6개의 화합물 처리에 따른 C3H10T1/2세포주 내 mRNA인 ALP, Osterix 및 Runx2의 발현량 변화를 표시한 그래프이다.
도 11은 실험예 4에서 제조예 3에서 분리된 6개의 단일 피크의 화합물 처리에 따른 C3H10T1/2세포주 내 mRNA인 CD36, aP2 및 PPARγ의 발현량 변화를 표시한 그래프이다.
도 12는 실험예 5에서 벼 뿌리 추출물을 12주간 경구 투여한 난소절제 흰쥐의 체중 비교 그래프이다.
도 13은 실험예 5에서 벼 뿌리 추출물을 투여한 난소절제 흰쥐 대퇴골의 골밀도(Bone Mineral Density)를 측정한 그래프이다.
도 14는 실험예 5에서 벼 뿌리 추출물을 투여한 난소절제 흰쥐의 대퇴골 내 골세포 내 mRNA인 ALP, Osterix 및 Runx2 발현양을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 이용하여 상세히 설명한다. 단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 벼(Oryza sativa) 추출물 제조
수확한 벼를 줄기, 뿌리, 알곡(왕겨 제외), 전초(줄기 및 뿌리 전체 포함하고 알곡만 제외)로 나누어 벼 에탄올 추출물을 제조하였다.
상기 각각의 시료를 상온에서 2일간 완전히 건조시킨 다음, 곱게 분쇄하여 분말 시료를 얻은 후, 분말 시료 10 g당 70(v/v)% 에탄올 수용액 200 ml을 넣은 후, 진탕배양기에서 120 rpm, 40 ℃에서 24 시간 추출하였으며, 상등액을 와트만 No.1 필터 페이퍼로 여과하였으며, 남은 시료에 다시 70(v/v)% 에탄올 수용액을 시료 10 g당 200 ml을 넣은 후 다시 24 시간 추출하여 상기와 같은 방법으로 여과하였다. 상기 여과액을 회전식 진공 증발기로 45℃에서 감압 농축하여 용매를 완전히 제거하여 벼 전초 에탄올 추출물, 벼 줄기 에탄올 추출물, 벼 뿌리 에탄올 추출물 및 벼 알곡 에탄올 추출물을 각각 제조하였다.
제조예 2: 생육시기에 따른 벼(Oryza sativa) 뿌리 추출물의 제조
볍씨, 모판재배 뿌리, 모판재배 90일 생육 후 뿌리, 모판재배 110일 후 뿌리, 모판재배 130일 후(수확 후) 뿌리로 각각 구분하여 뿌리를 얻은 후 제조예 1과 동일한 방법으로 각각 생육 시기별 벼 뿌리 추출물을 제조하였다.
제조예 3: 벼(Oryza sativa) 뿌리 추출물의 용매 분획물 제조
제조예 1의 벼 뿌리 에탄올 추출물을 도 1에 나타낸 것과 같이 단계적으로 분획하여 각각의 분획물을 제조하였다.
상기 제조예 1의 벼 뿌리 에탄올 추출물은 가용성 부분은 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부틸알코올 및 물로 단계적으로 분획하여, 헥산 분획물(Hexane), 디클로로메탄 분획물(DCM), 에틸아세테이트 분획물(EtOAc), 부탄올 분획물(BuOH), 물 분획물(D.W.)을 얻은 후 이들을 각각 농축하고, 동결건조 하여 사용하였다.
실험예 1: 벼 부위별 추출물의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성
(1) 벼 부위별 추출물의 ALP(alkaline phosphatase)생성 촉진 활성
생쥐의 배아 섬유 모세포에서 기원한 C3H10T1/2 세포주는 일반적으로 골모세포를 포함한 다양한 세포혈통으로 분화할 수 있는 다능성 줄기세포주이다. 조골세포의 특징 중 하나는 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 나타낸다는 것이므로, C3H10T1/2 세포주들의 ALP 활성을 통해 조골세포 분화 효과를 측정하였다.
C3H10T1/2 세포주는 10% FBS, 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO₂환경에서 배양되었다. 상기 C3H10T1/2 세포는 6 웰 플레이트에 2.5 × 10⁴/ml의 농도로 골세포 분화를 위한 10 mM β-글리세로포스페이트와 50 ㎍/ml 아스코르빈산을 함유한 배지와 함께 배양하였고, NK11 화합물을 0.1, 0.5, 1 및 5 μM로 각각 첨가하여, 3 일 마다 배지를 교환하며 9일간 분화시켰다.
다능성 줄기세포주인 C3H10T1/2 세포를 10% FBS, 1% penicillin과 streptomycine이 첨가된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO₂환경에서 배양하였다. 세포는 6 well plate에 2.5 × 10⁴cells/ml의 농도로 골세포 분화를 위한 10mM β-glycerophosphate와 50μg/ml ascorbic acid를 함유한 배지와 함께 배양하였고 3일 마다 배지를 교환하며 제조예 1의 벼 부위별 추출물 40 μg/ml를 각각 첨가하여 총 9일간 분화 시킨 뒤 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium (BCIP/NBT)를 이용하여 ALP 염색을 실시하고, 이후 ALP 염색을 수행한 웰 플레이트의 이미지파일을 이용하여 Lab 색 공간을 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
전초, 줄기 및 뿌리 추출물에서 강한 조골세포 분화 활성을 나타내었으며, 특히 뿌리 추출물에서 그 활성이 가장 높게 나타났고, 알곡 추출물에서는 낮게 나타났다(도 2 참조).
(2) 벼 부위별 추출물의 지방세포 분화 저해 활성
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 6 웰 플레이트에 세포를 분주 후 지방세포 분화를 위해 1μM 덱사메타손, 5μg/mL 인슐린과 1μM 트로글리타존을 함유한 배지와 제조예 1의 벼 부위별 추출물 40 μg/ml을 각각 첨가하여 총 9일간 배양하였다. 분화 종료 후 배지를 제거하고 10% neutral buffered formalin으로 세포를 고정시켜 0.5% 오일 레드 오 용액으로 염색을 실시하고, 이후 웰 플레이트의 이미지파일을 이용하여 Lab 색 공간을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.
지방세포 분화 저해 활성은 전초 추출물과 알곡 추출물이 유사하게 나타났고, 줄기 추출물 및 뿌리 추출물 순으로 지방세포의 지방생성을 저해하는 효과를 나타내었다(도 3 참조).
상기 도 2 및 도 3의 결과로부터 벼 뿌리 추출물에 조골세포를 분화시키는 활성 및 지방세포의 분화를 저해하는 활성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 생육기간에 따른 벼 뿌리의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성
제조예 2의 볍씨, 모판재배 뿌리, 모판재배 90일 생육 후 뿌리, 모판재배 110일 후 뿌리, 모판재배 130일 후(수확 후) 뿌리 추출물의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성을 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 실시하여 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
(1) 생육기간에 따른 벼 뿌리의 ALP(alkaline phosphatase)생성 촉진 활성
도 4에 따르면 볍씨에서부터 생육기간의 증가에 따라 조골세포 분화 활성은 증가하는 경향을 나타내었고, 모판재배 110일 이후에는 더 이상 조골세포 분화 활성에 큰 차이를 나타내지 않았다.
(2) 생육기간에 따른 벼 뿌리의 지방세포 분화 저해 활성
도 5에 따르면 볍씨에서부터 모판재배 130일 후(수확 후) 까지 재배기간이 증가될수록 음성 대조군보다는 지방세포 분화 저해 활성이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 모판재배 110일 후 및 130일 후(수확 후)에서는 생육기간이 증가함에 따라 지방세포 분화 저해 활성이 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
상기 도 4 및 도 5의 결과로부터 조골세포를 분화시키는 활성 및 지방세포의 분화를 저해하는 활성이 가장 높은 벼 뿌리 추출물을 상용화하기 위해서는 수확 후 남은 벼 뿌리를 이용하는 것이 유리할 것으로 판단되었다.
실험예 3: 벼 뿌리 용매 분획물의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성
제조예 3의 헥산 분획물(Hexane), 디클로로메탄 분획물(DCM), 에틸아세테이트 분획물(EtOAc), 부탄올 분획물(BuOH), 물 분획물(D.W.)의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성을 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 실시하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 다만 각각 시료의 첨가 농도는 20 μg/ml로 변경하여 1/2만 첨가하였다.
(1) 벼 뿌리 용매 분획물의 ALP(alkaline phosphatase)생성 촉진 활성
도 6에 따르면 디클로로메탄 분획물(DCM) 및 에틸아세테이트 분획물(EtOAc)에서만 조골세포 분화 활성이 현저히 증가하였고, 나머지 분획물에서는 조골세포 분화 활성을 관찰할 수 없었다.
(2) 벼 뿌리 용매 분획물의 지방세포 분화 저해 활성
도 7에 따르면 디클로로메탄 분획물(DCM) 및 에틸아세테이트 분획물(EtOAc), 특히 디클로로메탄 분획물(DCM)에서 지방세포 분화 억제 활성이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서 조골세포를 분화시키는 활성 및 지방세포의 분화를 저해하는 활성을 갖는 벼 뿌리 추출물의 유효성분은 디클로로메탄 분획물에 존재할 것으로 예상하여 상기 분획물에서 유효 화합물의 분리를 실시하였다.
제조예 4: 벼 뿌리 추출물의 디클로로메탄 분획물(DCM)에서 유효 화합물의 분리
제조예 3의 디클로로메탄 분획물(DCM)로부터 조골세포를 분화시키는 활성 및 지방세포의 분화를 저해하는 활성을 동시에 가지는 유효 화합물을 분리하기 위해서, 추출용매 혼합 비율에 따른 분획을 제조하여 선별하였다. 클로로포름과 메탄올의 혼합 비율을 100:1, 50:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1로 혼합하여 1ℓ의 용출용매를 제조하였고, C18 실리카 겔 컬럼 흡착 크로마토그래피(C-18 silica gel column adsorption chromatography)에서 상기 용출 용매를 각각 두 번씩 이용하여 각 분획을 수득하였다.
상기 분획의 생리활성을 확인 후, 활성 분획층을 분자 크기에 따른 분획을 제조하여 선별하였다. 메탄올 단일 용매를 이용하여, Sephadex LH-20 컬럼 크기 배제 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column size-exclusion chromatography)로 각 분획을 수득하였다. 얻어진 분획으로 생리활성을 확인 후, 활성 분획층을 재처리하여 수득한 분획 중 2개의 활성 분획층을 확인하였다.
얻어진 2개의 분획층을 TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여, 분리 조건을 확립하고 prep-HPLC로 분리 후 TLC로 물질 재확인 하였다. 단일 peak로 확인된 물질의 구조를 전기분무이온화 질량분석기(Electrospray ionization-mass spectrometry; ESI-MS), 수소-핵자기공명 분광법(1H-nuclear magnetic resonance;1H-NMR) 및 탄소-핵자기공명 분광법(13C-NMR)로 분석하였다. 또한, 신규 화합물의 경우 2D NMR을 측정하여 IR, CD, alpha 값을 얻어 물질을 확인하였다.
상기의 방법으로 총 6개 피크에서 각각 화학식 1 내지 6의 화합물을 확인하였다.
피크 1은 아래 화학식 1의 2E,2'E)-(-2,5-bis(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)tetrahydrofuran-3,4-diyl)bis(methylene) bis(3-(4-hydroxyphenyl)acrylate) 이었다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017004973-appb-I000001
피크 2는 아래 화학식 2의 (2E,2'E)-(-2,5-bis(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)tetrahydrofuran-3,4-diyl)bis(methylene) bis(3-(4-hydroxyphenyl)acrylate) (isomer)이었다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2017004973-appb-I000002
피크 3은 아래 화학식 3의 2(2E,2'E)-(-2,5-bis(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)tetrahydrofuran-3,4-diyl)bis(methylene) bis(3-(4-hydroxyphenyl)acrylate) (isomer)이었다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2017004973-appb-I000003
피크 4는 아래 화학식 4의 2-O-feruloyl-glyceride이었다.
Figure PCTKR2017004973-appb-C000004
피크 5는 아래 화학식 5의 2-O-feruloyl-glyceride (isomer)이었다.
Figure PCTKR2017004973-appb-C000005
피크 6은 아래 화학식 6의 Takakin이었다.
Figure PCTKR2017004973-appb-C000006
실험예 4: 벼 뿌리 추출물 유래 화합물의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성
제조예 4에서 분리된 피크 1 내지 6의 화학식 1 내지 6의 화합물의 조골세포 분화 활성 및 지방세포 분화 저해 활성을 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 실시하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 다만 각각 시료의 첨가 농도는 5 μg/ml로 변경하여 1/8만 첨가하였다.
(1) 벼 뿌리 추출물 유래 화합물의 ALP(alkaline phosphatase)생성 촉진 활성
도 8에 따르면 피크 1 내지 3의 화학식 1 내지 3의 화합물, 특히 피크 1의 화학식 1의 화합물에서 조골세포 분화 활성이 현저히 증가하였고, 나머지 피크 4 내지 6의 화학식 4 내지 6의 화합물에서는 조골세포 분화 활성이 미약하였다.
(2) 벼 뿌리 추출물 유래 화합물의 지방세포 분화 저해 활성
도 9에 따르면 피크 1 및 2의 화학식 1 및 2의 화합물에서 지방세포 분화 저해 활성이 현저히 증가하였고, 다음으로 피크 3의 화학식 3의 화합물에서 지방세포 분화 저해 활성을 나타내었으며, 나머지 피크 4 내지 6의 화학식 4 내지 6의 화합물에서는 지방세포 분화 저해 활성이 거의 나타나지 않았다.
따라서 조골세포를 분화시키는 활성 및 지방세포의 분화를 저해하는 활성을 갖는 벼 뿌리 추출물의 유효성분은 화학식 1 내지 3의 화합물로 예측되었다.
실험예 5: 벼 뿌리 추출물 유래 화합물의 조골세포( osteoblast ) 분화인자 및 지방세포 분화인자 발현량
제조예 4에서 분리된 피크 1 내지 6의 화학식 1 내지 6의 화합물을 처리 하였을 때 세포내의 조골세포 분화인자 및 지방세포 분화인자의 mRNA발현량을 확인하여 도 10 및 도 11에 각각 나타내었다.
먼저 실험예 1과 동일하게 C3H10T1/2 세포주를 조골세포로 분화시키면서 조골세포 분화인자인 ALP, Ostreix 및 Runx2의 발현량을 확인하였다. 또한 실험예 1과 동일하게 C3H10T1/2 세포주를 지방세포로 분화시키면서 지방세포 분화인자인 CD36, aP2 및 PPARγ의 발현양을 확인하였다.
총 RNA 추출은 TRIzol (Invitrogen)을 이용하였다. 분리한 RNA 1 μg은 random primer, dNTP, PrimeScript™ Reverse Transcriptase (TaKaRa)를 첨가하여 cDNA로 합성하였다. 합성한 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)과 함께 realtime PCR을 수행하였다.
피크 1 내지 3의 화학식 1 내지 3의 화합물은 조골세포 분화인자인 ALP, Osterix 및 Runx2의 발현양을 모두 증가시켰으며, 특히 화학식 1 및 2의 화합물에서 발현양을 현저히 증가시켰다(도 10 참조).
또한 피크 1 내지 3의 화학식 1 내지 3의 화합물은 지방세포 분화 관련 유전자인 CD36과 aP2, PPARγ의 발현양을 현저히 감소시켰으며, 특히 화학식 1 및 2의 화합물에서 발현양을 현저히 증가시켰다(도 11 참조).
실험예 6: 난소절제(ovariectomy) 골대사 질환 동물모델을 이용한 동물시험
벼 추출물이 골대사 질환의 치료 및 예방에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 제조예 1의 벼 뿌리 추출물을 난소절제 흰쥐에 추출물을 투여한 후, 골밀도를 측정하고 조직학적 분석을 실시하였다.
(1) 동물사육 및 난소절제술(ovariectomy)
8주령의 암컷 SD(Sprague-Dawley) 래트를 구입하여 1주간의 순화기간을 가졌다. 9주령이 되었을 때 난소절제술을 시행하였고 1주간의 회복기를 가졌다. 12 주 동안 시료를 매일 1회 경구 투여하였고, 실험기간 중의 실험동물은 한 마리씩 한 케이지에서 사육하였고, 환경조건은 실내온도 25 ± 5℃, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간으로 조절하였다. 사료(AIN-93g)와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
실험군은 난소를 절제하지 않고 개복한 군(Sham), 난소절제 시행 후 증류수를 투여한 군(OVX), 난소절제 시행 후 각 50 mg/kg의 농도로 제조예 1의 벼 뿌리 추출물을 투여한 군(OVX+REOS)과 양성 대조군으로 비배당체 대두이소플라본(OVX+ISF) 50 mg/kg을 투여한 군으로 나누어 시험하였다.
12주간의 매주 체중을 측정하고, 실험 종료 후 희생시킨 난소절제 흰쥐의 대퇴골을 적출하여 이중에너지 X선 골밀도측정기(Norland pDEXA)를 사용해 골밀도(BMD)를 측정하였다.
난소절제 흰쥐에서 적출한 대퇴골을 액체질소로 급속 냉동 후 분쇄하여 시험에 사용하였다. 총 RNA 추출은 TRIzol (Invitrogen)을 이용하였다. 분리한 RNA 1 ug은 random primer, dNTP, PrimeScript™ Reverse Transcriptase (TaKaRa)를 첨가하여 cDNA로 합성하였다. 합성한 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)과 함께 realtime PCR을 수행하여 조골세포(osteoblast)형성과 관련된 분화인자인 ALP, Osterix 및 Runx2의 mRNA 발현량을 확인하였다.
(2) 체중 측정
난소를 절제하지 않고 개복한 군(Sham)에 비해서 난소 절제한 모든 실험군에서 체중이 증가하는 경향은 보였으나 유의차는 나타나지 않았다(도 12 참조).
(3) 골밀도(BMD) 측정
난소절제를 한 실험군(OVX)의 골밀도(BMD)가 난소절제를 하지 않은 실험군(Sham)에 비해 유의차 있게 감소하는 것을 보였고, 양성 대조군인 비배당체 대두이소플라본(ISOFLAVONE)에 비해 제조예 1의 벼 뿌리 추출물은 유의차있게 골밀도를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(도 13 참조).
(5) 조골세포 분화인자 발현량 측정
대퇴골에서 추출한 조골세포(osteoblast)형성과 관련된 분화인자인 ALP, Osterix 및 Runx2는 난소절제를 한 실험군(OVX)에서 난소절제를 하지 않은 실험군(Sham)에 비해 유의차 있게 감소하였고, 제조예 1의 벼 뿌리 추출물의 투여는 이를 다시 유의적으로 상승시켰다. 제조예 1의 벼 뿌리 추출물은 특히 Runx2에 대해서 양성 대조군보다 현저히 높은 발현양을 나타내었다(도 14 참조).
하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
제조예 1의 벼 뿌리 추출물 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
제조예 1의 벼 뿌리 추출물 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
제조예 1의 벼 뿌리 추출물 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
제조예 1의 벼 뿌리 추출물 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
제조예 1의 벼 뿌리 추출물 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강기능식품의 제조
제조예 1의 벼 뿌리 추출물 1,000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강기능식품 음료의 제조
제조예 1의 벼 뿌리 추출물 1,000 ㎎
구연산 1,000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강기능식품 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강기능식품 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (15)

  1. 벼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  2. 제 1 항에 있어서, 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  3. 제 2 항에 있어서, 비만 및 골대사 질환을 동시에 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 벼의 전초, 줄기 또는 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 벼 수확기의 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 분획한 분획물인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 개선 또는 예방용 건강기능식품:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017004973-appb-I000004
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2017004973-appb-I000005
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2017004973-appb-I000006
    .
  8. 벼 추출물을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 비만 및 골대사 질환을 동시에 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 벼의 전초, 줄기 또는 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 벼 수확기의 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 분획한 분획물인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제 8 항에 있어서, 상기 벼 추출물은 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017004973-appb-I000007
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2017004973-appb-I000008
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2017004973-appb-I000009
    .
PCT/KR2017/004973 2016-07-06 2017-05-12 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 벼 추출물 및 그 용도 WO2018008838A1 (ko)

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