WO2011102695A9 - 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 유효성분으로 포함하는 엘엑스알-알파 과다 발현으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 유효성분으로 포함하는 엘엑스알-알파 과다 발현으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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김상건
김상찬
김영우
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Definitions

  • the present invention relates to the pharmaceutical or food use of liquiritigenin, Isoliquiritigenin or licorice extract extracts comprising them. More specifically, due to overexpression or overactivity of LXR ⁇ (Liver X receptor-alpha) or SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1) using liquirithigenin, isoriquiritigenin or licorice extract extract extract It relates to the prevention, amelioration and treatment of disease or obesity.
  • LXR ⁇ Liver X receptor-alpha
  • SREBP-1 Sterol Response Element Binding Protein-1
  • Liver X receptor is a type of nuclear hormone receptor, a gene involved in cholesterol metabolism and homeostasis, such as apolipoprotein E (apoE), ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, cholesterol 7 ⁇ -hydrate Plays an important role in the transcriptional regulation of cholesterol 7 ⁇ -hydroxylase and scavenger receptor class B type I genes [Schwarz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 274: 794-802. LXR also acts directly on the SREBP-1c gene to regulate lipid metabolism [Yoshikawa et al., Mol. Cell. Biol., 2001, 21: 2991-3000.
  • LXR isomers include LXR ⁇ and LXR ⁇ .
  • LXR ⁇ is mainly present in the liver and LXR ⁇ is expressed mostly in organs.
  • LXR ⁇ is activated by natural ligands, oxysterols, high concentrations of sugars and artificial ligands, T0901317, GW3965 and the like, and regulates the expression of genes responsible for lipid formation and cholesterol homeostasis in the body.
  • LXR ⁇ acts as a lipid sensor in the production of liver lipids, which strongly increases the expression and activity of SREBP-1c, a key transcription factor that regulates the expression of lipid-forming genes, thereby promoting fatty acid synthesis in liver tissues and increasing blood triglyceride levels. .
  • SREBP-1c dependent pathways There are largely SREBP-1c dependent pathways and SREBP-1c independent pathways in which LXR ⁇ activation causes nonalcoholic fatty liver disease.
  • SREBP-1c-dependent fatty liver the expression of lipogenetic genes is upregulated through transcriptional activation of LXR ⁇ -mediated SREBP-1c, and in SREBP-1c-independent fatty liver, LXR ⁇ activation increases the expression of CD36 protein, a transporter of free fatty acids. By stimulating the transport of fatty acids to the liver.
  • LXR ⁇ plays an important role in the secretion of renin in the kidney.
  • LXR ⁇ and LXR ⁇ are both expressed in abundance in juxtaglomerular cells that produce renin.
  • an agonist of LXR ⁇ increases the expression of renin mRNA in the kidney and increases blood renin activity [Morelo et al., J. Clin. Invest., 2005, 115: 1913-1922.
  • Excessive increase in blood renin leads to hyperreninemia, which leads to hypertension and aldosteroneism.
  • LXR also regulates the expression of the ABCD2 gene associated with adrenoleukodystrophy (ALD), a rare disease in which the body's ⁇ very long chain fatty acid '' (VLCFA) does not break down and enters the brain and destroys nerve cells. It has been reported to be useful for the treatment of ALD [Winehopper et al., J. Biol. Chem., 2005, 280: 41243-41251.
  • SREBP Sterol Response Element Binding Protein
  • SREBP-1a and SREBP-1c are transcribed from the same gene and SREBP-2 is expressed from other genes.
  • SREBP-1c is a gene mainly involved in fatty acid synthesis, and SREBP-2 is a transcription factor that regulates transcription of genes involved in cholesterol synthesis.
  • SREBP-1 and SREBP-2 increase in the expression of the kidneys with age, thereby increasing the lipid synthesis and accumulation of triglycerides and cholesterol in the kidneys, such as glomerulosclerosis, proteinuria, kidney It has been reported to play an important role in the nephropathy (Jiang et al., Kidney Int., 2005, 68 (6): 2608-2620).
  • SREBP is usually present as a endoplasmic reticulum membrane protein and is 125 kilodaltons (kDa) in size. Before being activated by stimulation such as sterol depletion, it is bound to the membrane in an inactivated form, and upon activation, it is transferred to the Golgi apparatus and cleaved into an active protein of 65 kilodalton size. When activated, SREBP moves into the nucleus and binds to the SRE of the target gene, thereby increasing the expression of the lipid synthesis gene.
  • Target genes of SREBP-1c include fatty acid synthase (FAS), acetyl CoA carboxylase (ACC), and stearoyl CoA desaturase (SCD).
  • SREBP-1c which induces and regulates proteins such as FAS, ACC, and SCD, which are responsible for fat production in the liver, is an important factor of alcoholic or non-alcoholic steatosis [Kohjima et al., Int. J. Mol. Med., 2008, 21 (4): 507-511, Donohue, World J. Gastroenterol. 2007, 13 (37): 4974-4978.
  • Fatty liver is a medical condition in which fat exceeds more than 5% of the total liver weight.
  • Liver disease including this, is known to be the second most serious disease after cancer in developed countries in the 40-50 adult population. About 30% of the population in major countries, including developed countries, already has fatty liver symptoms, and 20% of them progress to cirrhosis through liver fibrosis. Half of these cirrhosis patients die of liver disease within 10 years of diagnosis.
  • Non-alcoholic fatty liver is currently increasing incidence due to increased dietary intake and Western insufficiency and lack of exercise, and it is recommended to improve lifestyles such as eating habits as a treatment.
  • liqueurinine and isoriquirigenin is a component contained in Glycyrrhizae Radix, a perennial herbaceous plant belonging to the legume (Leguminosae). National Road ), Micho, Citrus, Wheat, Yeongtong ⁇ ), cubicle ( Liquorice, also called rocho, has a peculiar smell, tastes sweet and special, and is known to have detoxification, hepatitis, urticaria, dermatitis, eczema, cough, expectoration, muscle relaxation, diuresis, and anti-inflammatory action.
  • licorice root and rhizome contains glycyrrhizic acid (Glycyrrhizin) of triterpenoid saponins, which is 2-glu of glycyrrhetic acid.
  • 2-Glucuronic acid glycoside (2-Glucuronic acid glycoside) component to give a sweet taste of licorice the glycoside (Glycoside) has no hemolysis ( ⁇ ⁇ ), but glycyrrhetic acid (Glycyrrhetic acid) has a hemolytic action.
  • Hydrolysis of licorice root extracts uralenic acid, which is 18 ⁇ -glycyrrhetic acid.
  • Flavonoids among the various components of licorice are Liquiritigenin (4 ', 7-Dihydroxyflavanone), Isoliquiritigenin (Chalcone corresponding to Liquiritigenin, ie 2, 4, 4'-). Trihydroxychalcone, Liquiritin; Liquiritigenin-4'- ⁇ -glucoside, Neoliquiritin; Liquiritigenin-7- ⁇ -glucoside, Neoisoliquiritin; Isoliquiritigenin-4- ⁇ -glucoside , Isoriquiritigenin-4- ⁇ -gluco- ⁇ -apioside (Isoliquiritigenin-4- ⁇ -gluco- ⁇ -apioside; Licurazid), etc. (Information and Shin Min-kyo) , Yeonglimsa, pp. 684-686, 1998; Park, Jong-Hee, Encyclopedia of Herbal Medicine (Sang), Shin Il Sang, pp. 14-18, 2002).
  • the inventors of the present invention have a treatment effect of liquirigenin has the effects of heavy metal poisoning (registered patent No. 697056) and acute and chronic liver disease (registered patent No. 697056) induced by hepatotoxic substances. (Kim et al., Toxicology, Vol. 197, pp. 239-251, 2004; Kim et al., Chem. Biol. Interact, Vol. 161, pp. 125-138, 2006). However, it has not been reported that liqueurinin or isoriquirigenin can be used as a composition for the prevention and treatment of diseases or obesity due to the overexpression or overactivity of LXR ⁇ or SREBP-1.
  • the present invention to provide a novel inhibitor of LXR ⁇ or SREBP-1 and the inhibition method using the same to solve the problem.
  • the present invention also relates to diseases caused by overexpression or overactivity of LXR ⁇ or SREBP-1, such as fatty liver, hypertriglyceridemia, hyperreninemia, renin-induced hypertension, aldosteroneism, adrenal protein dystrophy, renal glomerulosclerosis, proteinuria
  • diseases caused by overexpression or overactivity of LXR ⁇ or SREBP-1 such as fatty liver, hypertriglyceridemia, hyperreninemia, renin-induced hypertension, aldosteroneism, adrenal protein dystrophy, renal glomerulosclerosis, proteinuria
  • the present invention provides a pharmaceutical composition or a food composition comprising liquirithiinine, lisoriquiriginine or licorice processed extract fractions containing the same as an active ingredient to solve the above problems, and a method of using the same.
  • composition comprising the liquirithigenin, isoriquiritigenin of the present invention or licorice processed extract fraction comprising them as an active ingredient inhibits the expression or activity of LXR ⁇ or SREBP-1, and therefore, due to their overexpression or overactivity It can be effectively used for the prevention, amelioration and treatment of diseases.
  • the composition includes fatty liver, hypertriglyceridemia, hyperreninemia, high blood pressure caused by lenin, aldosteroneism, adrenoleukodystrophy, glomerulosclerosis, proteinuria, nephropathy, etc. It can be effectively used for the prevention, improvement and treatment of the.
  • the composition of the present invention can be used to prevent and treat obesity.
  • composition of the present invention can be used for the manufacture of medicines or nutraceuticals that can be used for the prevention, improvement or treatment of the disease.
  • FIG. 1 is a result of treating T0901317, an LXR ⁇ activator, with HepG2, a hepatocyte cell line, and observing the effect of Liquirithigenin (LQ) or Isoriquitigenin (IsoLQ) on the expression level of LXR ⁇ .
  • LQ Liquirithigenin
  • IsoLQ Isoriquitigenin
  • FIG. 2 is a result of treating LXR ⁇ activator T0901317 to hepatocyte line HepG2 and observing the effect of Liquirithigenin (LQ) or Isoriquirigenin (IsoLQ) treatment on LXRE.
  • LQ Liquirithigenin
  • IsoLQ Isoriquirigenin
  • Figure 3 is a result of treating the TX01 ⁇ activator T0901317 to the hepatocyte line HepG2, and observed the effect of liquirithiinin (LQ) or isoriquirigenin (IsoLQ) on the expression level of SREBP-1 protein.
  • LQ liquirithiinin
  • IsoLQ isoriquirigenin
  • Figure 4 shows the results of observing the effect of liquirithigenin (LQ) or Isoriquiritigenin (IsoLQ) treatment on the hepatic expression of the lipid-generating gene LXR induced by a high lipid diet.
  • RXR ⁇ mRNA levels in the normal diet were expressed as relative values.
  • ND normal diet
  • HFD high-fat diet
  • IsoLQ isoriquirigenin **: p ⁇ 0.01 compared to ND group, #: p ⁇ 0.05 compared to HFD alone group, ##: HFD P ⁇ 0.01 compared to single group
  • Figure 6 is a result of observing the effect of the administration of liquirithiinin (LQ) or isoriquirigenin (IsoLQ) on the content of triglycerides in liver tissue in a high-fat diet-induced fatty liver animal model.
  • LQ Liquirithygenin
  • IsoLQ Isoquirithygenin **: p ⁇ 0.01 compared with ND group, #: p ⁇ 0.05 compared with HFD alone group, ##: HFD alone P ⁇ 0.01 compared to the group
  • Figure 7 is a fat liver animal model induced by a high-lipid diet and liver tissue when stained with liquirithiinin (LQ) or Isoriquiritigenin (IsoLQ) to the animal model was stained by fat staining method (Oil Red O) It is the result compared with the obtained color photograph.
  • LQ liquirithiinin
  • IsoLQ Isoriquiritigenin
  • FIG. 8 shows the results of confirming the effects of liquirithiogenin or isoriquirigenin treatment on body weight change in a fatty liver animal model induced with liquirithigenin (LQ) and isoriquirigenin (IsoLQ) and a high-lipid diet.
  • LQ normal diet
  • IsoLQ isoriquirigenin
  • FIG. 11 shows the results of the administration of licorice extract fraction DW700 on Alanine aminotransferase (ALT) levels in plasma in a fatty liver animal model induced by a high lipid diet.
  • Control normal diet HFD: high-fat diet **: p ⁇ 0.01 compared to normal diet group, ##: p ⁇ 0.01 compared to HFD alone group
  • the present invention provides a pharmaceutical or food use of liquiritigenin represented by the following formula (1), Isoliquiritigenin represented by the following formula (2) or licorice extract extract comprising the same It is related.
  • the inventors of the present invention have repeatedly studied the substances affecting the expression and activity of LXR ⁇ and SREBP-1, surprisingly, licorice extract extract containing 10% liquirithigenin, isoriquiritigenin or liquiritigenin (DW700) revealed that T0901317, known as an activator of LXR ⁇ , inhibits the expression and activity of LXR ⁇ and SREBP-1 that are increased when treated with hepatocytes (FIGS. 1-3 and 9).
  • the expression of LXR ⁇ and SREBP-1 increased in the liver of the mouse with a high-lipid diet was inhibited by liquirithigenin or isoriquiritigenin (Figs.
  • the present invention provides a method for preventing, ameliorating, and treating diseases caused by overexpression or activity of LXR ⁇ or SREBP-1 including liquirithigenin, isoriquirigenin or licorice extract as an active ingredient.
  • composition of the present invention prevents hypertriglyceridemia, hyperreninemia, renin-induced hypertension, aldosteroneism, adrenal protein dystrophy, renal glomerulosclerosis, proteinuria, renal injury, etc., due to overexpression and activity of LXR ⁇ or SREBP-1. It may be used for improvement, or treatment, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention inhibits the expression and activity of SREBP-1, a key transcription factor that regulates the expression of lipid generating enzyme genes through the regulation of LXR ⁇ activation, and furthermore, fatty liver disease caused by metabolic disorders through inhibition of the expression of lipid producing genes. Since it inhibits the accumulation of triglycerides in liver tissue due to, the composition of the present invention containing it as an active ingredient can be usefully used to prevent and treat fatty liver (liver steatosis).
  • the present invention also provides a composition for preventing, ameliorating, and treating obesity containing liquirithigenin, isoriquirigenin or licorice processing extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a method of inhibiting the expression or activity of LXR ⁇ or SREBP-1 in vivo or in vitro by administering liquirithigenin, isoriquirigenin or licorice extract extract.
  • the present invention provides a method for preventing, ameliorating, and treating diseases and obesity due to overexpression or overactivity of LXR ⁇ or SREBP-1 by administering liquirithigenin, isoriquirigenin or licorice extract extract.
  • Liquirithiinine and isoriquirigenin of the present invention can be obtained by hydrolyzing the liquirithin separated from the licorice extract fraction through a manufacturing process such as the following process.
  • a low polar solvent such as chloroform, dichloromethane, or ethyl acetate, preferably dichloromethane, is added to the shaded licorice for 1 to 7 days, preferably 48 to 72 hours, for 10 to 50 ° C.
  • the remaining polar extract was added water or a lower alcohol solvent such as methanol, ethanol and a mixed solvent thereof, preferably methanol or ethanol or a mixture of these and water to 1 day to 7 days, preferably 48 hours to 72 hours at 10 to 80 °C, extraction method such as cold extraction method, cold extraction method, ultrasonic extraction method, hot needle extraction method, supercritical extraction method, such as room temperature or reflux extraction, preferably using ultrasonic extraction method
  • the licorice extract is about 5 to 40 times the volume of the extract, preferably about 15 to about 20 times (v / v) of about 1 to 3 concentrations of hydrochloric acid and sulfuric acid, such as sulfuric acid.
  • Acid number hydrolyzate which is subjected to an acid hydrolysis process by adding hydrochloric acid (HCl) at 1-normal concentration and heating at 50 to 200 ° C., preferably at 80 to 100 ° C. for 2 hours to 10 hours, preferably 4 to 8 hours. Performing a decomposition treatment process to obtain an isoriquitingenin and a liquiditinine component;
  • a third step of neutralizing the acid hydrolyzed extract with a strong base such as sodium hydroxide and potassium hydroxide;
  • step 4 silica gel column chromatography was performed on the hydrolyzate including the non-saccharide residual liquirithiinine and isoriquirigenin to perform the fifth step of separating and purifying liquiritigenin and isoriquirigeninin.
  • Liquiritigenin and isoliquiritigenin of the invention can be prepared in large quantities. Therefore, the present invention also includes the step of adding a strong acid to the licorice extract to hydrolyze the hydrolysine and neutralizing it by adding a strong base thereto, and then washing the obtained hydrolyzate several times with water to remove sugar components and salts.
  • It provides a manufacturing method comprising the above-mentioned manufacturing process for producing a licorice processed extract fraction with an increase in the content of liqueuritinin and isoriquirigenin.
  • Each component is subjected to qualitative analysis on the LC / Mass / Mass compared to the standard material.
  • Liquirithiinin or isoriquirigenin of the present invention can be obtained by separating the licorice processed extract fraction of the present invention by chromatography, and further recrystallized to obtain a more purified liquiritigenin or isoriquiriginine. Law and the like.
  • Licorice processed extract fractions of the present invention comprises the first step of extracting licorice with a non-polar solvent to remove the non-polar components, extract with water, lower alcohol or a mixture thereof to obtain a licorice extract; A second step of acid treating the licorice extract obtained in the first step to hydrolyze the liqueurin to obtain a liqueuritinin component; It comprises a licorice processed extract fraction with an increased content of liquirigenin obtained through a manufacturing method comprising a third step of neutralizing the acid-treated extract and removing the hydrolyzed sugar component.
  • the licorice processing extract fraction of the present invention is the first step of extracting licorice with a low polar solvent to remove the low polar components and to obtain a licorit-rich licorice extract;
  • the licorice extract fraction of the present invention, liqueurigenin or isoriquirigenin can be prepared with pharmaceutically acceptable salts and solvates according to conventional methods in the art.
  • pharmaceutically acceptable salt of the present invention acid addition salts formed by free acid are useful.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • acid or alcohol eg, glycol monomethyl ether
  • organic acids and inorganic acids may be used as the free acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, Citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid ( gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid, and the like.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained by, for example, dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (for example, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of the licorice extract extract, liqueurinin or isoriquirigenin include salts of acidic or basic groups which may be present in the compound, unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen Phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts. It can be prepared through.
  • composition comprising licorice extract extract of the present invention, liqueurigenin or isoriquirigenin may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • composition of the present invention is licorice processing extract, liquirithiinine or isoriquirigenin 0.01 to 99.9% by weight, preferably 0.1 to 90% by weight, more preferably 0.1 to 50% by weight relative to the total weight of the composition Include.
  • the composition as described above is not necessarily limited thereto, and may vary according to the condition of the patient and the type and extent of the disease.
  • Carriers, excipients and diluents which may be used in the form of suppositories and sterile injectable solutions, may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, Acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Can be mentioned.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like in the extract or compound. (sucrose), lactose (lactose), gelatin, etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like may be used, but are not limited thereto.
  • compositions of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition comprising the licorice extract extract of the present invention, Isoriquirigenin or Liquiriginine as an active ingredient is 0.01 mg / kg to 10 g / kg per day, preferably 1 mg / It is recommended to administer from kg to 1 g / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, but not limited to oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition or a composition for nutraceuticals. Accordingly, the present invention provides a medicament, a nutraceutical and a beverage comprising the composition of the present invention.
  • the food to which the liquirithiinin or isoriquirigenin of the present invention can be added include various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, health supplements, and the like, and include powders, granules, tablets, It may be used in the form of capsules, pills or beverages, but is not limited thereto.
  • the amount of the compound in the food or beverage is generally added to the health food composition of the present invention to 0.01 to 15% by weight of the total food weight, the health beverage composition is 0.02 to 10 g, preferably based on 100 ml Can be added in a ratio of 0.3 to 1 g.
  • the health beverage composition of the present invention is not particularly limited in the liquid component, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates are conventional monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose, such as maltose, sucrose and the like, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like. Sugars and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tacumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the compositions of the present invention may also contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is generally selected from the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • Licorice processing extract or liquirithiinin or isoriquirigenin itself derived from the fraction of the present invention is a drug that can be used safely for long-term administration for the purpose of prevention and improvement because there is little toxicity and side effects.
  • Liquirithigenin was prepared with reference to the method described in Chemico-Biological Interactions, vol. 161, pp125-138, 2006, and isoriquitingenin was described in the European Journal of Pharmacology, Vol. 587, pp124-128, 2008 It was prepared with reference to.
  • hydrochloric acid was added to hydrochloric acid at a temperature of 100 ° C. for 6 hours, followed by hydrolysis of liquiritin, followed by 2 L of sodium hydroxide solution of 1 normal concentration. It was neutralized to obtain about 90 g of hydrolyzate of licorice extract (hereinafter, referred to as GE-2).
  • GEF-1 a licorice processed extract
  • GEF-2 a licorice processed extract
  • mice Male C57BL / 6 mice (average weight 25-30 g) used as experimental animals were purchased from Charles River Orient (Seoul. Korea). Before the experiment, animals were adapted from the Seoul National University College of Pharmacy Animal Experimental Research Building with controlled humidity of 55 ⁇ 5%, temperature of 22 ⁇ 2 °C and ventilation for more than 1 week. Changed the contrast in time periods. No significant changes were observed in the amount of food and water for the duration of the experiment. The weight and condition of the animals were checked once weekly, and were bred for 11 weeks on a high-fat diet (Dyets Inc., Bethlehem) and a normal diet, and 10 or 30 mg / kg / of liquiditinine or isoriquitingenin during the last 5 weeks. day, 5 times / week).
  • a high-fat diet Dyets Inc., Bethlehem
  • mice were fed for 8 weeks with high-fat diet and normal diet, and DW700 was administered 25, 50 or 100 mg / kg / day (5 times / week) for the last 4 weeks. Each group consisted of a total of 10 mice each.
  • a high-fat diet for fatty liver induction was purchased from Diet Co., USA.
  • RNA (2 ⁇ g), d (T) 16 primer and AMV reverse transcriptase were extracted from mouse liver to obtain cDNA. Relative amounts of genes were quantified by Realtime RT-PCR method using CyBr green dye. Realtime RT-PCR used Light-cycler 2.0 from Roche (Mannheim, Germany). PCR was performed according to the manufacturer's method and the relative amount of each gene was analyzed using the Light-cycler software 4.0 program.
  • Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis was performed using a Mighty Small II SE 250 apparatus according to the Laemmli UK method (1970). Dissolve the fraction of liver sample in sample dilution buffer [63mM Tris (pH.6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 0.0013% bromophenol blue, 5% ⁇ -mercaptoethanol] and use 7.5%, 9% gel Electrophoresis was performed in buffer (including Tris 15g, glycine 72g, SDS 5g in 1L solution).
  • the electrophoresis gel was transferred to nitrocellulose paper for 1 hour at 190 mAmps in transition buffer [25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% v / v methanol (pH.8.3)] using a transfer electrophoresis device.
  • transition buffer [25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% v / v methanol (pH.8.3)
  • a transfer electrophoresis device After reacting Anti-SREBP-1 as a primary antibody, Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG was reacted with secondary antibody for 1 hour and developed using ECL chemiluminecence system (Amersham, Gaithesberg, MA). The homogeneity of the protein content in the samples was confirmed using anti- ⁇ -actin antibodies (Sigma, St. Louis, MO).
  • HepG2 As a cell line, HepG2, a representative human liver cell line, was used. HepG2 was pretreated with liquirithigenin (LQ, 100 ⁇ M) or isosuriquitingenin (IsoLQ, 20 ⁇ M) for 1 hour, and treated with LXR ⁇ activator T0901317 (10 ⁇ M) for 12 hours, after which mRNA was isolated from liver cell lines and RT- After cDNA was synthesized by PCR, it was analyzed by real-time PCR using specific primers (Human LXR, 5'-GATCGAGGTGATGCTTCTGGAG-3 '(sense) and 5'-CCCTGCTTTGGCAAAGTCTTC-3' (antisense)).
  • LQ liquirithigenin
  • IsoLQ isosuriquitingenin
  • LXR ⁇ activator T0901317 was treated with HepG2, a hepatocyte cell line, mRNA expression of LXR ⁇ was significantly increased (p ⁇ 0.01) and statistically significant increase was inhibited by pretreatment with liquirithiinin or isosuriquitingenin (p ⁇ 0.01). 0.01) could be observed (FIG. 1).
  • LXR ⁇ regulates gene expression by binding to a specific region (LXRE) present in the target gene promoter.
  • a reporter gene assay was performed to determine whether LXRE binding capacity was changed by treatment of liquirithigenin, isoriquirigenin or licorice extract extract.
  • a vector containing LXRE was transfected to a HepG2 cell line using lipofectamine (Invitrogen, USA). After 12 hours, HepG2 was pretreated with liquirithiinine (LQ, 100 ⁇ M), Isoriquirigenin (IsoLQ, 20 ⁇ M) or DW700 3 ⁇ g / ml or 10 ⁇ g / ml for 1 hour, and the LXR ⁇ activator T0901317 (10 ⁇ M). was treated for 12 hours. Then, using a passive lysis buffer (Promega, USA) to obtain a fraction of the cells, Luciferase activity was measured using a Luminometer.
  • Luciferase activity was significantly increased by T0901317 treatment (p ⁇ 0.01). This increased luciferase activity was statistically significantly (p ⁇ 0.01) inhibited by liquirithigenin, isoriquiritigenin or DW700 pretreatment (FIGS. 2 and 9). This suggests that liqueurinine, isoriquirigenin and licorice extract extract have the effect of inhibiting the activity of LXR ⁇ .
  • cDNA was synthesized through RT-PCR, and then a specific primer ( Human SREBP-1, 5'-CGACATCGAAGACATGCTTCAG-3 '(sense) and 5'-GGAAGGCTTCAAGAGAGGAGC-3' (antisense) were analyzed by real-time PCR (Figure 3, bottom).
  • the effect of liqueurinin or isoriquirigenin on the increased expression of the lipid-generating gene LXR ⁇ induced by a high-lipid diet was observed.
  • the expression level of the intracellular lipid sensor LXR ⁇ was analyzed by real-time PCR using a specific primer after synthesizing cDNA through mRNA isolation and RT-PCR in liver tissue. Mice fed a high-lipid diet and a normal diet for 11 weeks, and mice fed a high-lipid diet in the last 5 weeks were treated with liquirithiinin or isoriquiritigenin (10 or 30 mg / kg, 5 times / week) The expression level of LXR ⁇ in liver tissues was measured.
  • the expression of the intracellular lipid sensor LXR ⁇ was significantly increased by high lipid diet (p ⁇ 0.01), and the increase in LXR ⁇ expression was inhibited by the administration of liquirithiinin or isoriquirigeninin (p ⁇ 0.01 in both cases). It turned out.
  • SREBP-1 a transcription factor that regulates lipogenesis enzyme gene expression
  • SREBP-1 expression level of SREBP-1 was measured in liver tissue of mice bred in the same manner as in Experimental Example 4. After separating mRNA from liver tissue and synthesizing cDNA through RT-PCR, using specific primers (mouse SREBP-1, 5'-AACGTCACTTCCAGCTAGAC-3 '(sense) and 5'-CCACTAAGGTGCCTACAGAGC-3' (antisense)) was analyzed by real-time PCR.
  • ND normal diet group
  • SREBP-1 mRNA was significantly increased by high lipid diet (p ⁇ 0.01), and it was found that this increase in expression was inhibited by administration of Liquirithiinin or Isoriquiritigenin (p ⁇ 0.01 in both cases). ).
  • the content of triglycerides in liver tissue is an indicator of fatty liver.
  • Normal and high-lipid diets were administered to mice for 11 weeks and the last 5 weeks were administered Liquirithigenin or Isoriquirigenin 5 times per week, 10-30 mg / kg / day, respectively.
  • Liver tissue accumulated in a high-lipid diet after 8 weeks of normal and high-lipid diets in mice and 5, 25, 50, or 100 mg / kg / day of licorice extract extract extract DW700 per week for the last 4 weeks.
  • the effect on triglyceride content was observed.
  • triglyceride content in liver tissue was significantly increased (p ⁇ 0.01) compared to the normal diet group (p ⁇ 0.01).
  • the content was significantly reduced (p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, respectively) (FIG. 6).
  • liver induced by high lipid diet by administration of liquirithigenin or isoriquirigenin was analyzed using oil red O staining method, which is a fat-specific staining agent.
  • Oil red O staining method which is a fat-specific staining agent.
  • Liver tissue obtained in Experiment 6 was fixed with 10% neutral formalin solution, and the tissue was embedded with paraffin after the usual fixation and dehydration procedures.
  • the embedded tissues were tissue sections with a thickness of 4 ⁇ m, stained with oil red o, and observed with an optical microscope.
  • the red stained area was remarkably stained with oil red o (HFD + vehicle), the liquirithigenin-treated group (HFD + LQ) or the Isoriquirithigenin-treated group (HFD + IsoLQ). Marked fractions were markedly reduced, which is the same effect on triglyceride content (see color picture in FIG. 7).
  • mice bred for 11 weeks on a high-fat diet (Dyets Inc., Bethlehem) and a normal diet and received liquirithigenin or isoriquiritigenin (10 or 30 mg / kg / day, 5 times / week) for the last 5 weeks. Body weights were measured during the breeding period. Each group consisted of a total of 10 mice. As shown in FIG. 8, administration of Liquirithigenin 30 mg / kg, Isoriquirigenin 10 or 30 mg / kg significantly reduced weight gain due to a high-fat diet (p ⁇ 0.05).
  • the effect on (Alanine aminotransferase: ALT) was observed.
  • Alanine aminotransferase (ALT) in plasma was analyzed using Spectrum [(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), an automated blood analyzer.
  • Plasma ALT was significantly increased (p ⁇ 0.01) in mice fed a high lipid diet (p ⁇ 0.01), but significantly (p ⁇ 0.01 at all concentrations) when DW700 was administered (FIG. 11). This means that licorice extract extract recovers liver damage from high-fat diet.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • each component is added to the purified water to dissolve, the lemon flavor is appropriately added, the above components are mixed, purified water is added, the whole is purified to 100 ml, and then filled in a brown bottle.
  • the solution is prepared by sterilization.
  • Vitamin B6 0.5 mg
  • composition ratio of the vitamin and mineral mixture is a composition suitable for a relatively healthy food in a preferred embodiment
  • the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method.
  • the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.
  • composition ratio is mixed with a component suitable for a favorite beverage in a preferred embodiment, the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and usage.
  • composition comprising the liquirithigenin, isoriquiritigenin of the present invention or licorice processed extract fraction comprising them as an active ingredient can be used to inhibit the expression or activity of LXR ⁇ or SREBP-1.
  • composition comprising the liquirithiene, lisoriquiriginine, or licorice processed extract fraction comprising the same as an active ingredient of the present invention, the prevention, improvement and treatment of diseases due to overexpression or overactivity of LXR ⁇ or SREBP-1 Can be used effectively.
  • the composition includes fatty liver, hypertriglyceridemia, hyperreninemia, high blood pressure caused by lenin, aldosteroneism, adrenoleukodystrophy, glomerulosclerosis, proteinuria, nephropathy, etc. It can be effectively used for the prevention, improvement and treatment of the.
  • the composition of the present invention can be used to prevent and treat obesity.
  • composition of the present invention can be used for the manufacture of medicines or nutraceuticals that can be used for the prevention, improvement or treatment of the disease.

Abstract

본 발명은 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌, 이들을 포함하는 감초가공추출분획물을 유효성분으로 포함하는 LXRα(Liver X recptorα) 또는 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1)의 발현 또는 과다 활성으로 기인하는 질병의 예방, 개선 및 치료에 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 지방간, 고중성지방혈증, 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증, 신사구체경화, 단백뇨, 신장해 등의 예방, 개선 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 비만의 예방 및 치료를 위하여 사용될 수 있다.

Description

리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 유효성분으로 포함하는 엘엑스알-알파 과다 발현으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 리퀴리티게닌(Liquiritigenin), 이소리퀴리티게닌 (Isoliquiritigenin) 또는 이들을 포함하는 감초가공추출분획물의 의약학적 또는 식품학적 용도와 관련된 것이다. 보다 구체적으로, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물을 이용한 LXRα(Liver X receptor-alpha) 또는 SREBP-1(Sterol Response Element Binding Protein-1)의 과다 발현 또는 과다활성으로 기인하는 질병 또는 비만의 예방, 개선 및 치료와 관련된 것이다.
본 발명을 위한 연구는 우수연구센터 (ERC) [과제고유번호: R11-2007-107-01001-0 과제명: 대사 및 염증 질환 신약 개발 센터] 에 의하여 일부 지원되었다.
LXR(Liver X receptor)는 핵호르몬수용체 (nuclear hormone receptor)의 일종으로서, 콜레스테롤 대사 및 항상성과 관련이 있는 유전자 즉, 아포리포프로테인E(apoE), ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, 콜레스테롤 7α-히드록실라제(cholesterol 7α-hydroxylase) 및 스캐빈저 수용체 클라스 B타입 I(scavenger receptor class B type I) 유전자의 전사조절에 중요한 역할을 한다 [슈바르츠 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 274: 794-802]. 또한 LXR은 SREBP-1c 유전자에 직접적으로 작용하여 지질대사를 조절한다 [요시카와 등, Mol. Cell. Biol., 2001, 21: 2991-3000].
LXR은 이성체로 LXRα 와 LXRβ가 존재한다. LXRα는 주로 간에 존재하며, LXRβ는 대부분 장기에 발현한다. LXRα는 천연리간드인 옥시스테롤류, 고농도의 당 및 인공리간드인 T0901317, GW3965 등에 의해 활성화되며, 지질생성을 관장하는 유전자의 발현 및 체내 콜레스테롤 항상성을 조절한다. 간지질 생성에 있어 LXRα는 지질센서로 작용하여 지질 생성 유전자의 발현을 조절하는 핵심전사인자인 SREBP-1c의 발현 및 활성을 강력히 증가시킴으로 간조직 내 지방산합성을 촉진하고 혈중 중성지방 수치를 증가시킨다.
LXRα의 활성화가 비알코올성 지방간증을 유발하는 경로는 크게 SREBP-1c 의존적 경로와 SREBP-1c 비의존적 경로가 있다. SREBP-1c 의존적 지방간은 LXRα매개성 SREBP-1c의 전사활성화를 통하여 지질생성유전자의 발현이 상향 조절되어 나타나고, SREBP-1c 비의존적 지방간은 LXRα의 활성화가 유리지방산의 수송체인 CD36단백질의 발현을 증가시킴으로써 간으로의 지방산 이동을 자극하여 나타난다.
또한, LXRα는 신장에서 레닌의 분비에 있어서 중요한 역할을 한다고 보고된바 있다. LXRα와 LXRβ는 모두 레닌을 생성하는 juxtaglomerular 세포에 풍부하게 발현된다. 모렐로 등에 의하면, LXRα의 아고니스트인 T0901317 또는 GW3965가 신장에서의 레닌의 mRNA의 발현을 증가시키며, 혈중 레닌활성을 증가시킨다 [모렐로 등, J. Clin. Invest., 2005, 115: 1913-1922]. 지나친 혈중 레닌의 증가는 고레닌혈증을 초래하며, 이로 인해 고혈압 및 알도스테론증이 나타난다.
LXR은 또한 몸안의 '매우 긴사슬 지방산'(VLCFA)이 분해되지 않고 뇌에 들어가 신경세포를 파괴하는 희귀질환인 부신백질이영양증(ALD, adrenoleukodystrophy) 과 관련된 ABCD2 유전자의 발현을 조절하므로 LXR의 저해제는 ALD의 치료에 유용한 것으로 보고된 바 있다 [와인호퍼 등, J. Biol. Chem., 2005, 280: 41243-41251].
SREBP(Sterol Response Element Binding Protein)는 스테롤에 의해 조절되는 유전자의 전사조절부위인 sterol response element(SRE)에 결합하는 단백질이며 세 가지 이성질체 구조(isoform)로 존재한다. SREBP-1a 와 SREBP-1c는 동일 유전자로부터 전사되며, SREBP-2는 이와 다른 유전자로부터 발현된다. SREBP-1c는 주로 지방산 합성에 관련된 유전자, SREBP-2는 콜레스테롤 합성에 관련된 유전자 전사를 조절하는 전사인자이다.
SREBP-1 및 SREBP-2은 나이에 따라 신장에서의 발현이 증가하며 이에 따라 신장에서의 지질합성 및 트리글리세리드와 콜레스테롤의 축적이 증가하게 되는데, 이는 신사구체경화(glomerulosclerosis) 및 단백뇨(proteinuria), 신장해(nephropathy)에서 중요한 역할을 한다는 것이 보고되었다 [지앙 등, Kidney Int., 2005, 68(6): 2608-2620].
SREBP는 보통의 경우 소포체 막단백질로 존재하며 크기는 125 킬로달톤(kDa) 이다. 스테롤 고갈 등의 자극으로 활성화 되기 전에는 비활성화 형태(inactivated form)로 막에 결합되어 있다가, 활성화시 골지체로 이동, 절단되어 65킬로달톤 크기의 활성형 단백질로 된다. SREBP는 활성화될 때 핵내로 이동하여 표적유전자의 SRE에 결합하여 지질합성 유전자의 발현을 증가시킨다. SREBP-1c의 표적 유전자로는 지방산 합성경로를 촉매하는 효소인 FAS(fatty acid synthase), ACC(acetyl CoA carboxylase), SCD(stearoyl CoA desaturase) 등이 있다. 혈중에서 간으로 유입되는 유리지방산과 간에서 직접 생성하는 지방산의 양이 초저밀도지단백(VLDL)형태로 배출되거나 베타 산화되는 지방산의 양보다 많을 경우 간에서의 지질대사 균형이 깨어져 지방간증으로 이행되기 때문에, 간에서 지방생성을 담당하는 FAS, ACC, SCD등의 단백질을 유도조절하는 SREBP-1c는 알코올성 또는 비알코올성 지방간증(liver steatosis)의 중요 요인이다[코히지마 등, Int. J. Mol. Med., 2008, 21(4): 507-511, 도노휴, World J. Gastroenterol. 2007, 13(37): 4974-4978].
지방간은 의학적으로 지방이 전체 간 무게의 5% 이상을 초과하는 병적 상태를 의미하는데, 이를 포함하는 간질환은 선진국 40-50대 성인 인구의 사망원인에서 암 다음으로 심각한 질환으로 알려져 있다. 선진국을 포함한 주요 국가의 인구 중 약 30%는 이미 지방간 증상을 보이고 있으며, 이들 중 20%는 간섬유화를 거처 간경변증으로 진행한다. 이 같은 간경변 환자의 절반은 진단 후 10년 내에 간질환으로 사망한다. 비알코올성 지방간은 현재 서구형 고지질 식이 섭취증가와 운동부족으로 발병률이 증가하고 있으며, 치료법으로 식습관 등 생활습관 개선을 추천하는 것이 전부이다.
현재 지방간을 약물학적으로 치료하는데 유용한 약제는 거의 없는 상태이므로 운동과 식이요법만이 권장되고 있으나, 실제로 이러한 방법에 의한 지방간의 치료효율은 매우 낮아서 유효한 치료제 개발에 대한 요구가 절실한 상황이다. 약물보조요법으로서 베타인(betaine), 글루큐로네이트(glucuronate), 메티오닌(methionine), 콜린(choline), 친지방(lipotrophic) 제제가 보조적으로 이용되기도 하지만, 이들에 대한 의약학적 근거가 완전히 증명된 것은 아니다. 따라서, 효과가 탁월하면서도 부작용을 유발하지 않는 안전한 지방간 치료제의 개발이 절실한 실정이다.
한편, 리퀴리티게닌 및 이소리퀴리티게닌은 콩과(Leguminosae)에 속하는 다년생 초본식물인 감초(甘草, Glycyrrhizae Radix)에 포함되어 있는 성분이다. 국로(國
Figure f934
), 미초(美草), 밀감(蜜甘), 밀초(蜜草), 영통(
Figure f9b3
通), 첨초(
Figure 751b
草), 로초라고도 불리는 감초는 특이한 냄새가 약간 있고 맛은 달며 특수하며, 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진, 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염작용 등이 있다고 알려져 있다. 좀 더 구체적으로, 감초의 뿌리와 뿌리줄기는 트리테르페노이드 사포닌(Triterpenoid saponins)의 글리시리직 산(Glycyrrhizic acid; Glycyrrhizin)이 함유되어 있고, 이것은 글리시렉틱 산(Glycyrrhetic acid)의 2-글루커로닉 산 글리코사이드(2-Glucuronic acid glycoside)성분으로 감초의 단맛을 내며, 이 글리코사이드(Glycoside)에는 용혈작용(溶血作用)이 없지만 글리시렉틱 산(Glycyrrhetic acid)은 용혈작용을 가진다. 감초 뿌리를 가수분해하면 우라렌익 산(Uralenic acid)이 추출되는데, 이것은 18α-글리시렉틱 산(18α-Glycyrrhetic acid)이다.
감초에 포함되어 있는 여러 가지 성분 중 후라보노이드(Flavonoid)는 리퀴리티게닌(Liquiritigenin; 4', 7-Dihydroxyflavanone), 이소리퀴리티게닌 (Isoliquiritigenin; Liquiritigenin에 상응하는 Chalcone, 즉 2, 4, 4'-Trihydroxychalcone), 리퀴리틴(Liquiritin; Liquiritigenin-4'-β-glucoside), 네오리퀴리틴 (Neoliquiritin; Liquiritigenin-7-β-glucoside), 네오이소리퀴리틴 (Neoisoliquiritin; Isoliquiritigenin-4-β-glucoside), 이소리퀴리티게닌-4-β-글루코-β-아피오사이드(Isoliquiritigenin-4-β-gluco-β-apioside; Licurazid) 등으로 분리할 수 있다(정보섭 및 신민교 저, 도해향약(생약)대사전, 영림사, pp. 684-686, 1998; 박종희 저, 한약백과도감(상), 신일상사, pp. 14-18, 2002 ).
리퀴리티게닌은 중금속 중독으로 인한 질환(등록특허공보 제697056호) 및 간독성물질로 유도된 급·만성 간질환(등록특허공보 제697056호)의 치료·예방효과를 가진다는 것이 본 발명의 발명자들에 의하여 밝혀진 바 있다(Kim et al., Toxicology, Vol.197, pp. 239~251, 2004; Kim et al., Chem. Biol. Interact, Vol.161, pp. 125~138, 2006). 그러나, 리퀴리티게닌이나 이소리퀴리티게닌이 LXRα 또는 SREBP-1의 과다발현 또는 과다활성으로 인한 질병 또는 비만의 예방 및 치료용 조성물로 사용될 수 있다는 것은 아직 보고된 바 없다.
본 발명에서는 LXRα 또는 SREBP-1 의 신규한 저해제 및 이를 이용한 저해방법을 제공하는 것을 해결하고자 하는 과제로 한다. 또한 본 발명은 LXRα 또는 SREBP-1의 과다발현 또는 과다활성으로 인한 질병, 예를 들어 지방간, 고중성지방혈증, 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증, 신사구체경화, 단백뇨, 신장해 등의 예방, 개선 및 치료를 위한 약학 또는 식품조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다. 또한, 비만의 예방 또는 치료제용 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것 또한 본 발명에서 해결하고자 하는 과제이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 이들을 포함하는 감초가공추출분획물을 유효성분으로 포함하는 의약조성물 또는 식품조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 이들을 포함하는 감초 가공추출분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 LXRα또는 SREBP-1의 발현 또는 활성을 억제하므로, 이들의 과다발현 또는 과다활성으로 인한 질병의 예방, 개선 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 조성물은 지방간, 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증 (adrenoleukodystrophy), 신사구체경화 (glomerulosclerosis), 단백뇨 (proteinuria), 신장해(nephropathy) 등의 예방, 개선 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 비만을 예방, 치료하기 위하여 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 질병의 예방, 개선 또는 치료목적으로 사용될 수 있는 의약품 또는 건강기능식품의 제조를 위하여 이용될 수 있다.
도 1은 LXRα활성화제인 T0901317을 간세포주인 HepG2에 처치하고, LXRα의 발현정도에 대한 리퀴리티게닌(LQ) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ)의 효과를 관찰한 결과이다. (Control: 무처리군, T090: T0901317 처리군, **: Control군과 비교하여 p<0.01, ##: T0901317만 처리한 군과 비교하여 p<0.01)
도 2는 LXRα활성화제인 T0901317을 간세포주인 HepG2에 처치하고 LXRE에 대한 리퀴리티게닌(LQ) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ) 처치의 효과를 관찰한 결과이다.(Control: 무처리군, T090: T0901317 처리군, **: Control군과 비교하여 p<0.01, ##: T0901317만 처리한 군과 비교하여 p<0.01 )
도3은 LXRα활성화제인 T0901317을 간세포주인 HepG2에 처치하고, SREBP-1 단백질의 발현정도에 대한 리퀴리티게닌(LQ) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ)의 효과를 관찰한 결과이다. (Control 또는 Con: 무처리군, T090: T0901317 처리군, **: Control군과 비교하여 p<0.01, #: T0901317만 처리한 군과 비교하여 p<0.05, ##: T0901317만 처리한 군과 비교하여 p<0.01)
도 4는 고지질식이로 유도된 지질생성 유전자 LXR의 간조직내 발현량에 대한 리퀴리티게닌(LQ) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ) 처치의 효과를 관찰한 결과이다. 정상식이군의 LXRα mRNA 수준에 대한 상대적인 값으로 나타내었다. (ND:정상식이 HFD:고지질식이 LQ:리퀴리티게닌 IsoLQ:이소리퀴리티게닌 **: ND군과 비교하여 p<0.01, #: HFD 단독군과 비교하여 p<0.05, ##: HFD 단독군과 비교하여 p<0.01 )
도 5는 고지질식이로 유도된 지질생성 유전자 SREBP의 간조직내 발현량에 대한 리퀴리티게닌(LQ) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ) 처치의 효과를 관찰한 결과이다. 정상식이군의 SREBP-1 mRNA 수준에 대한 상대적인 값으로 나타내었다. (ND:정상식이 HFD:고지질식이 LQ:리퀴리티게닌 IsoLQ:이소리퀴리티게닌 **: ND군과 비교하여 p<0.01 ##: HFD 단독군과 비교하여 p<0.01 )
도 6은 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 간 조직 내 중성지방의 함량에 대한 리퀴리티게닌(LQ) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ)의 투여시의 효과를 관찰한 결과이다.(ND:정상식이 HFD:고지질식이 LQ:리퀴리티게닌, IsoLQ:이소리퀴리티게닌 **: ND군과 비교하여 p<0.01, #: HFD 단독군과 비교하여 p<0.05, ##: HFD 단독군과 비교하여 p<0.01 )
도 7은 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델 및 상기 동물모델에 리퀴리티게닌(LQ) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ)을 투여하였을 경우의 간조직을 지방 염색법(Oil Red O)으로 염색하여 얻은 컬러사진으로 비교한 결과이다.
도 8은 리퀴리티게닌(LQ) 및 이소리퀴리티게닌(IsoLQ) 투여 스케쥴 및 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 체중 변화에 대한 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치의 효과를 확인한 결과이다.(ND:정상식이 HFD:고지질식이 LQ:리퀴리티게닌 IsoLQ:이소리퀴리티게닌, **: ND군과 비교하여 p<0.01 #: HFD 단독군과 비교하여 p<0.05 )
도 9 는 LXRα활성화제인 T0901317을 간세포주인 HepG2에 처치하고 LXRE에 대한 감초가공추출분획물 DW700 처치의 효과를 관찰한 결과이다.(Control: 무처리군, T090: T0901317 처리군, **: Control군과 비교하여 p<0.01, ##: T0901317만 처리한 군과 비교하여 p<0.01 )
도 10은 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 간 조직 내 중성지방의 함량에 대한 감초가공추출분획물 DW700의 투여시의 효과를 관찰한 결과이다(Control:정상식이 HFD:고지질식이 **: 정상식이군과 비교하여 p<0.01, ##: HFD 단독군과 비교하여 p<0.01 ).
도 11은 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 혈장중의 Alanine aminotransferase (ALT) 수치에 대한 감초가공추출분획물 DW700의 투여시의 효과를 관찰한 결과이다. (Control:정상식이 HFD:고지질식이 **: 정상식이군과 비교하여 p<0.01, ##: HFD 단독군과 비교하여 p<0.01 )
본 발명은 하기 화학식 (1)로 표시되는 리퀴리티게닌(Liquiritigenin), 하기 화학식 (2)로 표시되는 이소리퀴리티게닌(Isoliquiritigenin) 또는 이들을 포함하는 감초가공추출분획물의 의약학적 또는 식품학적 용도와 관련된 것이다.
화학식 1
Figure PCTKR2011001150-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2011001150-appb-C000002
본 발명의 발명자들은 LXRα 및 SREBP-1의 발현 및 활성에 영향을 주는 물질에 대한 연구를 거듭하여, 놀랍게도 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 리퀴리티게닌 10%를 함유하는 감초가공추출분획물(DW700)이 LXRα의 활성화제로 알려져 있는 T0901317를 간세포주에 처치시 증가하는 LXRα 및 SREBP-1의 발현 및 활성을 억제한다는 것을 밝혔다(도1-3 및 도9). 또한 본 발명의 발명자들은 고지질식이로 마우스의 간에서 발현이 증가된 LXRα 및 SREBP-1이 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌에 의하여 발현이 억제되었으며(도4 및 도 5), 고지질 식이를 투여하여 간조직 내에 중성지방의 함량이 증가된 마우스에 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물을 투여할 경우 상기 중성지방의 함량이 유의하게 감소하고(도 6), 간조직을 지방염색법으로 관찰하여 지방의 양이 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌의 투여에 의하여 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 7). 또한, 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌의 투여는 고지질식이로 인한 체중증가를 유의하게 감소시켰다(도 8). 고지질식이 마우스의 혈장 중의 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (Alanine aminotransferase; ALT)도 감초가공추출분획물에 의하여 억제되었다(도 11).
이와 같은 실험결과를 기초로 본 발명은 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물을 유효성분으로 포함하는 LXRα 또는 SREBP-1의 과다 발현 또는 활성으로 기인하는 질병의 예방, 개선 및 치료용 의약조성물 또는 식품조성물을 제공한다.
발명의 조성물은 LXRα 또는 SREBP-1의 과다 발현 및 활성으로 인한 질병인 고중성지방혈증, 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증, 신사구체경화, 단백뇨, 신장해 등의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물의 투여는 LXRα활성화 조절을 통하여 지질생성 효소 유전자 발현을 조절하는 핵심 전사인자인 SREBP-1의 발현 및 활성을 억제하며, 나아가 지질생성 유전자의 발현 억제를 통해 대사장애에 의한 지방간증으로 인한 간조직 내 중성지방의 축적을 억제하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 지방간증(liver steatosis)을 예방하고 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물을 유효성분으로 함유하는 비만을 예방, 개선, 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물을 투여하여 LXRα 또는 SREBP-1의 발현 또는 활성을 인비보 또는 인비트로에서 억제하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물을 투여하여 LXRα 또는 SREBP-1의 과다 발현 또는 과다 활성으로 인한 질병, 비만을 예방, 개선, 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 리퀴리티게닌 및 이소리퀴리티게닌은 하기 공정과 같은 제조공정을 통하여 감초 추출 분획물로부터 분리된 리퀴리틴을 가수 분해하여 수득할 수 있다.
구체적으로, 음건 세절한 감초에 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트와 같은 저극성용매, 바람직하게는 디클로메탄을 가하여 1일 내지 7일, 바람직하게는 48시간 내지 72시간 동안, 10 내지 50℃ 로 추출하여 비극성 가용성분이 함유된 추출물을 제거한 후에, 잔존한 극성 추출물에 물 또는 메탄올, 에탄올과 같은 저급 알콜 용매 및 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올 또는 이들과 물의 혼합물을 가하여 1일 내지 7일, 바람직하게는 48시간 내지 72시간 동안, 10 내지 80℃ 로, 상온 또는 환류 냉각추출법, 냉침추출법, 초음파 추출법, 온침 추출법, 초임계 추출법 등의 추출법, 바람직하게는, 초음파 추출법을 이용하여 감초를 추출하고 저극성 성분을 제거한 감초 추출물을 수득하는 제 1단계;
상기 감초 추출물을 상기 추출물 부피의 약 5 내지 40배, 바람직하게는, 약 15 내지 약 20배(v/v)의 약 1 내지 3 노르말(N) 농도의 염산, 황산 등의 강산, 바람직하게는 1-노르말 농도의 염산(HCl)을 가하여 50 내지 200℃, 바람직하게는 80 내지 100℃에서 2시간 내지 10시간, 바람직하게는 4 내지 8 시간 동안 중탕 가열하여 산가수분해 공정을 수행하는 산가수분해 처리공정을 수행하여 이소리퀴리티게닌 및 리퀴리티게닌 성분을 수득하는 제 2단계;
상기 산가수분해 처리된 추출물을 수산화나트륨, 수산화 칼륨 등의 강염기로 중화시키는 제 3단계;
상기에서 얻어지는 당성분이 용해된 수용성 성분을 물로 추출 분리하여 제거하여 리퀴리티게닌 및 이소리퀴리티게닌을 다량 함유한 분획물을 수득하는 제 4단계;
상기 4단계에서 비당체인 잔존하는 리퀴리티게닌 및 이소리퀴리티게닌을 포함한 가수분해물을 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 실시하여 리퀴리티게닌 및 이소리퀴리티게닌을 분리 정제하는 제 5단계 공정을 수행하여 본 발명의 리퀴리티게닌(liquiritigenin) 및 이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)을 다량 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 감초 추출물에 강산을 넣어 리퀴리틴을 산가수 분해시키고, 여기에 강염기를 첨가하여 중화시킨 후, 얻어진 가수분해물을 물로 수회 세척하여 당성분 및 염을 제거하는 단계를 포함하는 리퀴리티게닌 및 이소리퀴리티게닌 함량이 증대된 감초 가공 추출 분획물을 제조하는 상기 제조공정을 포함한 제조방법을 제공한다. 각각의 성분은 LC/Mass/Mass상에서 Standard 물질과 비교하여, 정성분석을 실시한다.
본 발명의 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌은 본 발명의 감초 가공 추출 분획물을 크로마토그래피법에 의하여 분리하여 얻을 수 있으며, 보다 정제된 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 얻기 위하여 추가로 재결정법 등을 실시할 수 있다.
본 발명의 감초 가공 추출 분획물은 감초를 비극성용매로 추출하여 비극성성분을 제거하고, 물, 저급알콜 또는 이들의 혼합물로 추출하여 감초 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 제 1 단계에서 수득한 감초 추출물을 산처리하여 리퀴리틴을 가수분해시켜 리퀴리티게닌 성분을 수득하는 제 2단계; 상기 산처리 추출물을 중화시키고 가수분해된 당성분을 제거시키는 제 3단계 공정을 포함하는 제조방법을 통하여 수득되는 리퀴리티게닌 함량이 증대된 감초 가공 추출 분획물을 포함한다.
또한 본 발명의 감초가공추출분획물은 감초를 저극성용매로 추출하여 저극성성분을 제거하고 리퀴리틴이 풍부한 감초 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 제 1 단계에서 수득한 감초 추출물을 산처리하여 리퀴리틴을 가수분해시켜 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 성분을 수득하는 제 2단계; 상기 산처리 추출물을 중화시키고 가수분해된 당성분을 제거시키는 제3단계 공정을 포함하는 제조방법을 통하여 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 함량이 증대된 감초가공추출분획물을 포함한다.
본 발명의 감초가공추출분획물, 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들 면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수 혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산 , 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기의 감초가공추출분획물, 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함 되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 감초가공추출분획물, 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 감초가공추출분획물, 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 조성물 총 중량에 대하여0.01 ~ 99.9중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 90 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 50중량%을 포함한다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명에 따른 분획물 또는 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 감초가공추출분획물, 이소리퀴리티게닌 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 포함하는 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여 하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 의약조성물 또는 건강기능식품용 조성물로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 의약, 건강기능식품 및 음료를 제공한다. 본 발명의 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 환제 또는 음료인 형태로 사용할 수 있으며 이로 제한되지 않는다.
이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유 하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조 성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 감초 가공 추출 분획물 또는 이 분획물로부터 유래된 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 및 개선 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용 할 수 있는 약제이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 감초 추출물의 제조
리퀴리티게닌은 Chemico-Biological Interactions, vol.161, pp125-138, 2006에 기재된 방법을 참조하여 제조하였으며, 이소리퀴리티게닌은 European Journal of Pharmacology, Vol.587, pp124-128, 2008에 기재된 방법을 참조하여 제조하였다.
음건 세절한 감초 3㎏(대원약업사, 대구)에 15ℓ의 100 % 디클로로메탄을 가여여 48시간 추출하여 추출물을 버리고, 다시 15ℓ의 100 % 메탄올을 가하고 상온에서 72시간 동안 추출하고 여과지로 여과한 후, 여과한 여액을 감압농축기(N-21NS, ELYA)로 가온 감압 농축하여 갈색 젤 형태의 감초 추출물 120 g(이하, GE-1 이라 함)을 얻었다.
실시예 2．감초추출물의 가수분해물의 제조
상기 실시예　1의 감초 추출물 (GE-1) 120g에 2ℓ의 1노르말 농도의 염산을 가하여 6시간동안 100 ℃에서 중탕가열하여 리퀴리틴을 가수분해 하고, 2ℓ의 1노르말 농도의 수산화 나트륨 용액으로 중화 시켜 약 90g의 감초추출물의 가수분해물(이하, GE-2 이라 함)을 획득하였다.
실시예 3. 리퀴리티게닌 및 이소리퀴리티게닌의 제조
상기 실시예 2에서 수득한 감초추출물의 가수분해물(GE-2)을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(60 ㎝, 230-400 mesh, 1.2 kg)에 로딩(loading)한 후, 6 L의 클로로포름을 흘린 후, 클로로포름-메탄올(CHCl3-MeOH[50:1 (6L), 30:1 (6L), 15:1 (6L)]) 경사로 분리 하였다. 클로로포름-메탄올 30:1 (6L) 분획을 감압농축하여 옅은 황색의 소분획물 21 g을 얻었다. 이 분획물은 다시 클로로포름-아세톤(CHCl3-acetone[20:1 (6L), 10:1 (5 L), 4:1 (5 L), 1: 1 (5 L)]) 경사의 용매조합을 이용하여, 2차 실리카 겔 칼럼크로마토그래피(50 cm, 230-400 매쉬, 250 g)를 실시하여 다시 소분획물로 나누었다. 2차 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로부터 분리된 소분획물들 중 22-45 번 분획물들은 이소리퀴리티게닌 및 리퀴리티게닌이 [Rf=0.7, CHCl3-메탄올(4:1)] 풍부한 분획물들로 확인 되어 이들을 농축하여 17g의 이소리퀴리티게닌 및 리퀴리티게닌(liquiritigenin)이 풍부한 옅은 황색 분획물을 얻었다. 더욱 더 고순도의 이소리퀴리티게닌 및 리퀴리티게닌을 정제하기 위해 상기 분획을 메탄올-물 용매조합과 GPC 칼럼(JAI, 20 X 40㎝)을 사용하여, 리사이클링 HPLC(JAI)를 실시 하여, 노란색 분말의 이소리퀴리티게닌(4g) 과 흰색분말의 리퀴리티게닌(6g)을(Liquiritigenin, 이하 LQ 라고도 함) 얻었다. 제조된 이소리퀴리티게닌 및 리퀴리티게닌의 순도 및 정성분석은 각각 Sigma Chemical Co. 및 Chromadex Chemical로부터 구입한 표준품 사용하여, LC/Mass/ Mass(Waters)의 RT와 분자이온 피크를 비교하여 확인하였다.
실시예 4. 리퀴리티게닌 성분 함량이 증대된 감초 가공 추출물의 제조
실시예 1에서 수득한 감초 추출물 (GE-1) 1kg에 1N HCl 2000 ml을 넣어 100℃로 6시간 중탕 가열하여 리퀴리틴을 산가수분해시킨 후 1N NaOH 2000 ml을 추가하여 중화시킨 후에, 가수분해물을 물로 수회 세척하여 당성분 및 염을 제거하여 리퀴리티게닌의 함량이 증대된 감초 가공 추출물(이하, GEF-1 이라 함)을 제조하였다.
또 다른 방법으로서, 감초에 80% 에탄올을 가하고 85oC 이상에서 1차 추출을 하는 단계, 80% 에탄올 85oC이상에서 2차 추출하는 단계, 60oC 이하에서 감압농축하는 단계, 3M 황산으로 90oC 이상에서 가수분해하는 단계, 에틸아세테이트로 침전물을 용해하는 단계, 정제수로 세척하여 중화하는 단계, 60oC 이하에서 감압농축하는 단계, 주정(에탄올)으로 용해하고 감압농축하는 단계를 포함하여 리퀴리티게닌이 10% 함유된 감초가공추출분획물 (DW700)을 얻었다.
실시예 5. 이소리퀴리티게닌 성분 함량이 증대된 감초 가공 추출물의 제조
실시예 1에서 수득한 감초 추출물 (GE-1) 1kg에 1N HCl 2000 ml을 넣어 100℃로 6시간 중탕 가열하여 리퀴리틴을 산가수분해시킨 후 1N NaOH 2000 ml을 추가하여 중화시킨 후에, 가수분해물을 물로 수회 세척하여 당성분 및 염을 제거하여 이소리퀴리티게닌의 함량이 증대된 감초 가공 추출물(이하, GEF-2 이라 함)을 제조하였다.
참고예 1: 실험 동물 및 식이
실험동물로 사용된 수컷 C57BL/6 마우스 (평균 체중 25 내지 30g)는 Charles River Orient (Seoul. Korea)에서 구입하였다. 실험에 사용하기 전 1주 이상 55± 5%의 습도, 22± 2℃의 온도 및 환기가 조절된 서울대 약대 동물실험 연구동에서 동물을 적응시켰으며, 오전 7시와 오후 7시를 기준으로 하여 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었다. 실험이 진행되는 기간 동안 식이량 및 식수량에는 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 동물의 무게와 상태를 매주 1회 검사하였고 고지질 식이 (Dyets Inc., Bethlehem) 및 정상식이로 11주간 사육하였고 마지막 5주 동안 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 10 또는 30 mg/kg/day, 5 times/week) 투여하였다.
감초가공추출물분획 DW700투여실험은 고지질식이 및 정상식이로 8주간 마우스를 사육하였고 마지막 4주 동안 DW700을 25, 50 또는 100mg/kg/day(5 times/week) 투여하였다. 각 그룹은 각각 총 10마리의 마우스로 구성되었다.
참고예 2: 시료 준비
지방간 유발을 위한 고지질 식이는 미국 다이엣사(Dyet Co.)에서 구입하였다. 원하는 농도의 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌, DW700은 실시예2에서 제조된 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌, 실시예4에서 제조된 DW700을 40% PEG #400으로 희석[PEG #400:물=4:6]하여 제조하였다.
참고예 3: Real time-RT PCR
마우스 간에서 추출한 total RNA (2 μg)와 d(T)16 primer 및 AMV 역전사효소 (reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 얻었다. 유전자들의 상대적인 양은 CyBr green dye를 사용한 Realtime RT-PCR법에 의해 정량하였다. Realtime RT-PCR은 Roche (Mannheim, Germany)의 Light-cycler 2.0 을 이용하였다. 제조사의 방법에 따라 PCR을 수행하고 Light-cycler software 4.0 프로그램을 사용하여 각 유전자의 상대적인 양을 분석하였다.
참고예 4: 웨스턴 브롯
Laemmli UK 방법 (1970)에 따라 Mighty Small II SE 250장치를 사용하여 sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 하였다. 간 시료의 용해분획을 샘플희석완충액 [63mM Tris (pH.6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 0.0013% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol]에 희석하여 7.5%, 9% 젤을 사용하여 전극 완충액 (1L 용액 중 Tris 15g, glycine 72g, SDS 5g 포함)내에서 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤은 전이용 전기영동장치를 이용하여 전이완충액 [25mM Tris, 192mM glycine, 20% v/v methanol (pH.8.3)]내에서 190mAmps로 1시간 동안 니트로셀룰로오즈지에 단백질을 전이시켰다. Anti-SREBP-1를 1차 항체로서 반응시킨 후 2차 항체로 Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG를 1시간 반응시키고 ECL chemiluminecence system (Amersham, Gaithesberg, MA)을 사용하여 발색하였다. 시료 중 단백질 함량의 동질성은 anti-β-actin 항체(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 확인하였다.
참고예 5: 분석 방법
실험예에서 제시한 자료는 약물학적 계산 프로그램을 이용하여 분석한 것으로, 다양한 실험군 간의 유의성을 일방향 평방편차 분석법 (Fisher, R.A., Statistical Methods for Research Workers, Edinburgh: Oliver & Boyd, 1925) 으로 검정한 후 뉴먼-켈스 검사(Norman GR 등, Biostatistics: The Bare Essentials, 2000) 로 판정하였다 (*, #p<0.05, **, ##p<0.01).
실험예 1: 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치에 의한 LXRα의 발현억제 효과
세포주로는 대표적인 Human 간세포주인 HepG2를 사용하였다. HepG2에 리퀴리티게닌(LQ, 100μM) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ, 20μM)을 1시간 전처리하고, LXRα활성화제 T0901317(10μM)을 12시간 처리한 후, 간세포주에서 mRNA를 분리하고 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머(Human LXR, 5'-GATCGAGGTGATGCTTCTGGAG-3' (sense) and 5'-CCCTGCTTTGGCAAAGTCTTC-3' (antisense))를 활용하여 real-time PCR 로 분석하였다.
LXRα활성화제 T0901317를 간세포주인 HepG2에 처치시 LXRα의 mRNA 발현이 현저히 증가하였으며(p<0.01), 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌의 전처치에 의하여 통계적으로 유의하게 증가가 억제됨을(p<0.01) 관찰할 수 있었다 (도1).
실험예 2: 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출물분획 처치에 의한 LXRα활성억제 (LXRE 결합능 억제) 효과
LXRα은 표적유전자 프로모터에 존재하는 특정영역(LXRE)에 결합함으로서 유전자의 발현을 조절한다. 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출물분획의 처치에 의해 LXRE 결합능이 변화되는지를 관찰하고자 리포터진 어세이(Luciferase reporter gene assay)를 분석법을 실시하였다.
먼저, LXRE를 함유한 벡터(Vector)를 HepG2 세포주에 lipofectamine (Invitrogen, USA)을 이용하여 트렌스펙션(Transfection, 형질변환)을 실시하였다. 12시간이 경과한 후, HepG2에 리퀴리티게닌(LQ, 100μM), 이소리퀴리티게닌(IsoLQ, 20μM) 또는 DW700 3μg/ml 또는 10μg/ml을 1시간 전처리하고, LXRα활성화제 T0901317(10μM)을 12시간 처리하였다. 그런 후, Passive lysis buffer (Promega, USA)를 이용하여, 세포의 분획물을 획득한 후, Luminometer를 이용하여 Luciferase activity를 측정하였다. T0901317 처리에 의하여 루시퍼라제 활성은 현저하게 증가되었다(p<0.01). 이렇게 증가된 루시퍼라제 활성은 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 DW700전처치에 의하여 통계적으로 유의하게(p<0.01) 억제되었다(도2 및 도 9). 이는 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 및 감초가공추출분획물이 LXRα의 활성을 억제하는 효과가 있음을 말해주는 것이다.
실험예 3: 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치에 의한 SREBP-1의 발현 및 활성억제 효과
LXRα활성화제인 T0901317을 간세포주인 HepG2 에 처치한 경우와, 이때 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 전처치한 경우에 있어서, SREBP-1의 mRNA 및 단백질 발현정도를 비교 관찰하였다(도3). HepG2에 리퀴리티게닌(LQ, 20 μM 또는 100μM) 또는 이소리퀴리티게닌(IsoLQ, 10 μM 또는 20μM)을 1시간 전처리하고, LXRα활성화제 T0901317(10μM)을 12시간 처리하였다. 그런 후, 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯을 실시하여 SREBP-1의 단백질변화를 관찰하였다 (도3, 상단). 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치에 의하여 농도 의존적으로 SREBP-1의 단백질 발현의 증가가 억제되었다.
리퀴리티게닌 100 μM, 이소리퀴리티게닌 20 μM 을 1시간 전처리하고 LXRα활성화제 T0901317(10μM)을 12시간 처리한 시료의 mRNA를 분리하여 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머(human SREBP-1, 5'-CGACATCGAAGACATGCTTCAG-3' (sense) and 5'-GGAAGGCTTCAAGAGAGGAGC-3' (antisense)) 를 활용하여 real-time PCR 로 분석하였다 (도3, 하단).
LXRα활성화제 (T0901317)를 간세포주인 HepG2에 처치시 지질생성 유전자 발현을 조절하는 세포단백질인 SREBP-1의 mRNA가 12 시간 만에 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 현저한 증가를 보였으며 (p<0.01), 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치에 의하여 통계적으로 유의하게 증가가 억제되었다 (리퀴리티게닌 처치의 경우 p<0.01, 이소리퀴리티게닌 처치의 경우 p<0.05).
실험예 4: 고지질식이로 발현이 증가된 LXRα에 대한 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치의 효과
고지질식이로 유도된 지질생성 유전자 LXRα의 발현증가에 대한 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌의 효과를 관찰하였다. 세포내 지질 센서인 LXRα의 발현량을 간조직에서 mRNA 분리 및 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성후 특정 프라이머를 활용하여 real-time PCR 기계로 분석하였다. 고지질 식이 및 정상식이로 11주간 사육하였고, 고지질 식이로 사육한 군에 마지막 5주동안 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 (10 또는 30 mg/kg, 5 times/week)를 투여한 마우스의 간조직에서 LXRα의 발현정도를 측정하였다. 간조직에서 mRNA를 분리하고 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머(mouse LXR, 5'-TGCCATCAGCATCTTCTCTG-3' (sense) and 5'-GGCTCACCAGCTTCATTAGC-3' (antisense))를 활용하여 real-time PCR 로 분석하였다. 정상식이군(ND)의 LXRα mRNA의 수준을 1로 하였을 때, 고지질식이군 또는 고지질식이+리퀴리티게닌 투여군, 고지질식이+이소리퀴리티게닌 투여군의 상대적인 LXRα mRNA의 수준을 나타내었다(도 4). 세포내 지질 센서인 LXRα의 발현이 고지질 식이에 의해 유의하게 증가되었으며(p<0.01), LXRα 발현의 증가는 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 투여로 억제된다(두 경우 모두 p<0.01)는 것이 밝혀졌다.
실험예 5: 고지질식이로 발현이 증가된 SREBP-1에 대한 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치의 효과
지질생성 효소 유전자 발현을 조절하는 전사인자인 SREBP-1의 발현 역시 고지질 식이에 의해 증가되었으며 이에 대한 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 투여의 효과를 관찰하였다.
실험예4에서와 같은 방법으로 사육한 마우스의 간조직에서 SREBP-1의 발현정도를 측정하였다. 간조직에서 mRNA를 분리하고 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머(mouse SREBP-1, 5'-AACGTCACTTCCAGCTAGAC-3' (sense) and 5'-CCACTAAGGTGCCTACAGAGC-3' (antisense))를 활용하여 real-time PCR 로 분석하였다. 정상식이군(ND)의 SREBP-1 mRNA의 수준을 1로 하였을 때, 고지질식이군, 고지질식이+리퀴리티게닌 투여군, 고지질식이+이소리퀴리티게닌 투여군의 상대적인 SREBP-1 mRNA의 수준을 도5에 나타내었다. SREBP-1 mRNA의 발현이 고지질 식이에 의해 유의하게 증가되었으며(p<0.01), 이러한 발현의 증가는 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 투여로 억제된다는 것이 밝혀졌다(두 경우 모두 p<0.01).
실험예 6: 고지질식이로 축적된 간조직 내 중성지방의 함량에 대한 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물 처치의 효과
간조직 내 중성지방의 함량은 지방간을 나타내는 지표이다. 정상 식이 및 고지질 식이를 마우스에 11주간 실시하고 마지막 5주간 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 주당 5회, 각각 10-30 mg/kg/day 투여하였다. 또한 정상 식이 및 고지질 식이를 마우스에 8주간 실시하고 마지막 4주간, 감초가공추출분획물 DW700을 주당 5회, 25, 50, 또는 100mg/kg/day를 투여한 후 고지질 식이로 축적된 간조직 내 중성지방 함량에 대한 효과를 관찰하였다. 고지질 식이를 실시한 마우스에서는 간조직 내 중성지방의 함량이 정상식이군에 비하여 현저히 증가된 반면(p<0.01), 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 DW700이 투여된 경우에는 조직내 중성지방의 함량이 유의하게 (각각, p<0.01, p<0.05, p<0.01) 감소하였다 (도 6).
실험예 7: 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델의 간조직에 대한 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 투여의 효과
리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌의 투여에 의한 고지질식이로 유도된 지방간의 치료효과를 간 조직을 지방 특이 염색제인 오일 레드 오 (Oil Red O) 염색법을 이용하여 분석하였다. 실험6에서 채취한 간 조직을 10% 중성포르말린 용액으로 고정하고 통상적인 고정절차 및 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 조직을 포매하였다. 포매한 조직을 4 ㎛의 두께로 조직 절편을 하여 오일 레드 오로 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 고지질식이군에서는 오일레드오로 붉게 염색된 부분이 현저하게 나타났으며 (HFD+vehicle), 리퀴리티게닌 투여군(HFD+LQ)또는 이소리퀴리티게닌 투여군 (HFD+IsoLQ)에서는 붉게 염색된 부분이 현저하게 감소하였으며, 이는 중성지방 함량에 대한 효과와 동일한 효과이다 (도 7의 컬러사진 참조).
실험예 8: 고지질식이로 인한 체중증가에 대한 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌 처치의 효과
고지질 식이 (Dyets Inc., Bethlehem) 및 정상식이로 11주간 사육하였고 마지막 5주 동안 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌(10 또는 30 mg/kg/day, 5 times/week)를 투여한 마우스의 사육기간 동안의 체중을 측정하였다. 각 그룹은 총 10마리의 마우스로 구성되었다. 도 8에서 보는 바와 같이, 리퀴리티게닌 30mg/kg, 이소리퀴리티게닌 10 또는 30mg/kg 의 투여는 고지질식이로 인한 체중증가를 유의하게 감소시켰다(p<0.05).
실험예 9: 고지질식이로 인한 ALT증가에 대한 감초가공추출분획물 처치의 효과
정상 식이 및 고지질 식이를 마우스에 8주간 실시하고 마지막 4주간 동안 감초가공추출분획물 DW700을 주당 5회, 25, 50, 또는 100mg/kg/day를 투여한 후 고지질 식이 마우스의 혈장 아미노트랜스퍼라제 (Alanine aminotransferase:ALT)에 대한 효과를 관찰하였다. 혈장의 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (Alanine aminotransferase:ALT)는 자동 혈액 분석기인 Spectrum [(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)]를 사용하여 분석하였다.
고지질 식이를 실시한 마우스에서는 혈장 ALT가 정상식이군(Control)에 비하여 현저히 증가된 반면(p<0.01), DW700이 투여된 경우에는 유의하게 (모든 농도에서 p<0.01) 감소하였다 (도 11). 이는 고지질식이로 인한 간손상을 감초가공추출분획물이 회복시킨다는 것을 의미한다.
이하는 본 발명의 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 감초가공추출분획물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
리퀴리티게닌 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
GEF-1 또는 DW700 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
리퀴리티게닌 5 mg
이소리퀴리티게닌 5mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
이소리퀴리티게닌 5 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
GEF-1 또는 DW700 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 기능 식품의 제조
GEF-1 또는 DW700 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
GEF-1 또는 DW700 100 ㎎
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 적량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
본 발명의 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 이들을 포함하는 감초 가공추출분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 LXRα또는 SREBP-1의 발현 또는 활성을 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌 또는 이들을 포함하는 감초 가공추출분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 LXRα또는 SREBP-1의 과다발현 또는 과다활성으로 인한 질병의 예방, 개선 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 조성물은 지방간, 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증 (adrenoleukodystrophy), 신사구체경화 (glomerulosclerosis), 단백뇨 (proteinuria), 신장해(nephropathy) 등의 예방, 개선 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 비만을 예방, 치료하기 위하여 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 질병의 예방, 개선 또는 치료목적으로 사용될 수 있는 의약품 또는 건강기능식품의 제조를 위하여 이용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌, 이들을 포함하는 감초가공추출분획물, 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들의 용매화물 및 이들의 수화물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 LXRα(Liver X receptor) 또는 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1)의 과다발현 또는 과다 활성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LXRα(Liver X receptor) 또는 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1)의 과다발현 또는 과다 활성으로 인한 질병이 지방간, 고중성지방혈증, 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증, 신사구체경화, 단백뇨 및 신장해로 이루어 진 군으로부터 선택되는 것인 의약조성물.
  3. 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌, 이들을 포함하는 감초가공추출분획물, 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들의 용매화물 및 이들의 수화물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 의약조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 지방간이 대사장애성 지방간인 의약 조성물.
  5. 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌, 이들을 포함하는 감초가공추출분획물, 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들의 용매화물 및 이들의 수화물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 의약조성물.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감초가공추출 분획물은 감초를 비극성용매로 추출하여 비극성성분을 제거하고, 물, 저급알콜 또는 이들의 혼합물로 추출하여 감초 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 제 1 단계에서 수득한 감초 추출물을 산처리하여 리퀴리틴을 가수분해시키는 제2단계; 상기 가수분해물을 중화시키는 제 3단계 공정을 포함하는 제조방법을 통하여 수득되는 리퀴리티게닌 함량이 증대된 감초 가공 추출 분획물임을 특징으로 하는 의약조성물.
  7. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 리퀴리티게닌 또는 이소리퀴리티게닌을 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량 %로 포함하는 의약조성물.
  8. 리퀴리티게닌, 이소리퀴리티게닌, 이들을 포함하는 감초가공추출분획물, 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들의 용매화물 및 이들의 수화물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 LXRα(Liver X receptor) 또는 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1)의 과다발현 또는 과다 활성으로 인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  9. 제8항에 있어서 상기 질병이 지방간, 고중성지방혈증, 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증, 신사구체경화, 단백뇨 및 신장해로 이루어 진 군으로부터 선택되는 것인 건강기능식품.
  10. 제 8항 또는 제9항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료의 형태인 건강기능식품.
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