KR101064937B1 - 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염을 포함하는 혈관재협착 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관재협착 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 약물로서 포함하는, 혈관재협착 예방 또는 치료용 약물 용출성 스텐트를 제공한다.
타우로우루소데옥시콜릭산, 혈관재협착

Description

타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염을 포함하는 혈관재협착 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating restenosis comprising tauroursodeoxycholic acid or its salt}
본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관재협착 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
1977년 Gruntzig가 관상동맥 풍선확장술(coronary artery balloon angioplasty)을 사람에게 최초로 시술한 이후, 경피적 관상동맥 중재술(percutaneous coronary intervention, PCI)은 관상동맥 재관류술(coronary revascularization)을 위한 보편적인 치료방법으로 알려져 있다. PCI는 관상동맥우회술(coronary artery bypass grafting, CABG)과 비교하여 비용이 적게 들고, 환자의 회복이 빠른 장점이 있다. PCI 초창기에는 풍선확장술(Balloon Angioplasty)을 이용하여 단일 혈관 질환에 한정되어 시술이 진행 되었다. 그러나 풍선확장술의 제한점을 상당히 줄여주는 관상동맥 스텐트의 도입으로 다혈관 질환, 급성 심근 경색, 불안정 협심증, 좁거나 복잡한 형태의 내강 협착에도 PCI가 쓰이고 있다. 최근 에는 관상 동맥 재협착률을 줄이는 약물 용출성 스텐트(drug eluting stent, DES)가 도입되어 현재 모든 PCI의 90%이상에서 스텐트 삽입술이 시행되고 있으며, 이때 사용되는 스텐트의 90% 이상을 DES가 차지하고 있다. PCI는 처음에는 경피적 관상동맥 성형술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)에만 국한된 표현이었으나, 새로운 기술이 많이 도입되어 현재는 여러 종류의 죽종제거술(atherectomy), 레이저 혈관성형술(coronary laser angioplasty), 관상동맥내 스텐트 설치(intracoronary stenting), 등을 포함한다. 기타, 관상동맥 재관류술로서 동맥내막절제술(Endarterectomy) 등이 시행되고 있다.
그러나, 경피적 관상동맥 중재술, 관상동맥우회술, 동맥내막절제술 등의 시행 후에 발생하는 혈관재협착(restenosis)은 혈관 손상에 대한 동맥의 치유과정으로 일어나는 현상으로 관상동맥 재관류술의 중요한 제한점이 되고 있다. 더욱이, 약물용출 스텐트의 성공에도 불구하고, PCI를 비롯한 관상동맥 재관류술이 다양한 증례로 확대되고 있기 때문에, 혈관재협착을 예방 및 치료하여야 하는 필요성이 지속적으로 존재한다.
혈관재협착은 탄성반도(elastic recoil)와 혈관벽 재형성(vessel wall remodeling)에 의한 급성 또는 만성 혈관 크기의 변화와 신내막 비대(neointimal hyperplasia) 등의 기전에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다 (Kimura T, et al., Remodeling of human coronary arteries undergoing coronary angioplasty or atherectomy. Circulation 1997;96:475-83; 및 Post MJ, et al., Arterial remodeling after balloon angioplasty or stenting in an atherosclerotic epxerimental model. Circulation 1997;96: 996-1003). 신내막은 중막에 있는 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells)가 증식하고 내막으로 이동하여 비대해지며(Owens Gk. Regulation and differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev 1995;75:487-517; 및 Sartore S, et. al., Molecular and cellular phenotypes and their regulation in smooth muscle. Rev Physiol Biochem Pharmacol 1999;134:235-320), 외막의 섬유모세포가 혈관평활근세포와 비슷한 근섬유모세포로 형질전환된 후 증식하고 이동하여 신내막 형성에 참여한다(Zalewski A, et al., Vascular myofibroblasts: lessons from coronary repair and remodeling. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:417-22).
본 발명자들은 혈관재협착을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 혈관재협착 기전을 근거로 다양한 물질에 대하여 연구를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도, 답즙산의 일종으로 알려져 있는 타우로우루소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid)이 신내막 형성을 효과적으로 억제함으로써, 혈관재협착의 예방 및 치료 활성을 가진다는 것을 발견하였다. 특히, 타우로우루소데옥시콜릭산은 신내막 형성을 억제함과 동시에, 혈관신생을 유의성 있게 증가시킴으로써 손상된 내피세포를 회복시켜, 혈관재협착의 예방 및 치료에 특히 유용함을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관재협착 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 타우로우루소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관재협착 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 혈관재협착은 관상동맥 재관류술 시행 후에 발생하는 혈관재협착일 수 있다.
본 발명은 또한, 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 약학적으로 허용가능 한 염을 약물로서 포함하는, 혈관재협착 예방 또는 치료용 약물 용출성 스텐트(drug eluting stent)를 제공한다.
본 발명에 의해, 답즙산의 일종인 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염이 평활근 세포의 증식 억제 및 사멸 유도를 통하여, 이미 형성된 신내막의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염은 손상된 혈관내피세포의 이동(migration) 및 혈관 형성(tube formation)을 촉진함으로써, 혈관재협착을 예방할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 약학조성물은 혈관재협착 환자, 특히 관상동맥 중재술, 관상동맥우회술, 동맥내막절제술 등의 관상동맥 재관류술 시행을 받은 환자의 혈관재협착을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 혈관재협착을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관재협착 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
신내막(neointima)은 혈관내피세포가 손상을 입게 될 경우 혈관내피세포 바로 밑에 존재하는 평활근 세포의 과증식에 의해 형성되며, 신내막이 과증식될 경우 혈관이 막히게 되는 위험한 상황이 발생하게 된다. 특히, 관상동맥 재관류술 시행 후에 높은 빈도로 발생하는 신내막 비대(neointimal hyperplasia)는 혈관재협착으로 이어지게 된다. 본 발명자들은 답즙산의 일종인 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염이 평활근 세포의 증식 억제 및 사멸 유도를 통하여, 이미 형성된 신내막의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다는 것을 밝혀냈다. 또한, 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염이 손상된 혈관내피세포의 이동(migration) 및 혈관 형성(tube formation)을 촉진함으로써, 혈관재협착을 예방할 수 있으므로, 만성 혈관재협착 환자에도 유용하게 적용될 수 있음을 밝혀냈다.
타우로우루소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid)은 담즙산의 일종으로 콜레스테롤을 전구체로 하여 간으로부터 생성된다. 타우로우루소데옥시콜릭산은 당뇨 쥐의 췌도 세포를 재생시키는 것으로 보고된 바 있으며, 심근경색에 의해 유발되는 심근세포의 사멸을 억제함으로써 심근세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 타우로우루소데옥시콜릭산이 혈관신생을 촉진한다거나 혹은 신내막 형성과 관련된다는 보고는 아직까지 보고된 바 없다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 타우로우루소데옥시콜릭산은 다양한 염 형태, 약학적으로 허용가능한 염 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어, 소듐, 칼륨 등의 알칼리 금속염 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는 소듐염 형태의 타우로우루소데옥시콜릭산이 본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 상기 "혈관재협착(restenosis)"라 함은 관상동맥 재관류술 등의 처치에 의해 치료되었던 평활근세포의 재증식으로 인해 다시 혈관이 막히는 질환을 의미하며, 특히 경피적 관상동맥 중재술, 관상동맥우회술, 동맥내막절제술 등의 관상동맥 재관류술(coronary revascularization) 시행 후에 발생하는 혈관재협착을 포함한다. 상기 경피적 관상동맥 중재술은 관상동맥 풍선확장술, (coronary artery balloon angioplasty), 관상동맥 죽종제거술(coronary atherectomy), 레이저 혈관성형술(coronary laser angioplasty), 관상동맥내 스텐트 설치(intracoronary stenting), 약물 용출성 스텐트(drug eluting stent, DES) 삽입술 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 다양한 투여 형태, 예를 들어 정제, 캡슐제 등의 경구용 투여 형태 및 주사용 액제, 현탁액제, 에멀젼, 동결건조 제제 등의 비경구용 투여 형태로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 정제 형태로 제제화될 수 있다. 정제, 캡슐제 등의 경구용 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 실리카(예를 들어, SIPERNAT® 22), 스테아릭산(stearic acid), 마그네슘 스테아레이트 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 또한 필요할 경우, 필름 코팅 등의 코팅층을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 담체로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁화제, 유화제 등을 포함할 수 있으며, 예를 들어 현탁화제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은, 약물 용출성 스텐트(예를 들어 클로피도그렐 등의 혈소판 응집 억제제 등을 포함하는 약물 용출성 스텐트)에 해당 약물 대신 혹은 해당 약물과 함께 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염을 함유시켜 얻어진 약물 용출성 스텐트 형태일 수 있다. 상기 약물 용출성 스텐트는 통상의 방법, 예를 들어, 미국특허 제4,916,193호, 제4,994,071호, 제5,304,121호 제5,464,650호, 제5,163.952호, 제5,092,877호 등에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 약학조성물에 함유되는 상기 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염의 투여량은 혈관재협착 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로(예를 들어, 정제, 주사제, 혹은 스텐트 형태) 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 정제 등의 경구용 제제의 형태로 투여되는 경우, 상기 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염은 1일 50∼500 mg/kg, 바람직하게는 100∼300 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 약물 용출성 스텐트 형태로 적용되는 경우, 상기 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 염은 1일 0.5∼20 mg/kg, 바람직하게는 1∼10 mg/kg의 용량으로 약물 용출성 스텐트에 함유될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염(sodium tauroursodeoxycholate, TUDCA)이 혈관형성에 어떠한 영향을 미치는지 인간 혈관내피세포(human endothelial cell)를 이용하여 세포 이동(cell migration) 및 혈관 형성(tube formation) 분석을 수행하 였다. 또한, TUDCA가 평활근 세포에 미치는 영향 및 풍선 삽입술 모델(balloon injury carotid artery model)에서 신내막 형성에 미치는 영향을 평가하였다.
TUDCA는 Calbiochem 사(cat#580549)로부터 구입하여 사용하였다. 인간 혈관내피세포는 인간 말초 혈액 단핵구 세포(human peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로부터 공지의 방법(rterioscler Thromb Vasc Biol. 2004 Feb;24(2):288-93)에 따라 분리하였다. 상기 인간 혈관내피세포는 Egm-2 media Bulltkit (CC-3162, Clonetics사) 중에서 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
실시예 1. 혈관신생에 미치는 TUDCA의 영향 평가
혈관신생(Angiogenesis)은 혈관내피세포의 증식(proliferation), 이동(migration) 및 혈관 형성(tube formation)에 의해 이루어진다. 혈관신생에 미치는 TUDCA의 영향을 다음과 같이 평가하였다.
(1) 세포 이동 분석(cell migration assay)
세포 이동 분석을 위하여, 24 웰로 구성된 트랜스웰 챔버(Transwell chamber)(Coastar, 8umm pore size)를 사용하였다. EGM2 media로 재현탁시킨 3 x 104의 인간 혈관내피세포를 트랜스웰 챔버의 상부-챔버에 넣고, 아래의 챔버에는 TUDCA를 포함한 EGM2 media 를 첨가하거나 혹은 VEGF(2ng/ml)와 EGM2 media를 섞어 첨가하여 7 시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양한 후, 이동한 인간 혈관내피세포의 수를 측정하였으며, 그 결과는 도 1a와 같다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, TUDCA는 VEGF(vascular endothelial growth factor)와 상승적으로(synergystically) 인간 혈관내피세포의 이동을 촉진시키는 것으로 나타났다.
(2) MMP의 분비에 대한 영향 분석
또한 인간 혈관내피세포의 이동은 MMP(matrix metalloprotease)에 의해 매개되는 것으로 알려져 있으므로, TUDCA가 인간 혈관내피세포로부터 MMP의 분비에 영향을 미치는지 zymogram을 이용하여 조사하였다. Zymogram의 분석은 12 well plate에 5 X 104의 혈관내피세포를 시딩한 후 12시간 동안 배양하고 VEGF(2ng/ml)를 1시간 동안 전처리한 후, TUDCA를 농도별로 24시간 처리하였다. 이후 배양 배지를 수확하고, 3,000 rpm에서 원심분리하여 얻어진 상층액을 20ul씩 젤라틴이 포함된 SDS-PAGE에 로딩하여 MMP-활성을 측정하였다. 상기 겔의 준비 및 분석방법은J.biol.Chem. 2002.Nov.45243-45248에 개시된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과는 도 1b와 같다. 도 1b로부터, TUDCA는 인간 혈관내피세포에서 MMP-9의 분비에는 영향을 미치지 않는 반면, MMP-2의 분비를 증가시킴을 알 수 있다.
(3) 혈관 형성(Tube formation) 평가
혈관 형성 평가는 마트리겔(matriegel)(BD biosciences)를 이용하였다. 200ul의 마트리겔(BD Biosciences)을 24 웰 플레이트에 부어 골고루 편 후 상온에서 겔로 굳힌 다음, 인간 혈관내피세포(2 X 104)만을 시딩하거나 혹은 농도별로 TUDCA를 혈관내피세포와 섞어 시딩한 후, 37℃ CO2 배양기에서 배양하면서, 혈관 형성을 관찰하였다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, TUDCA는 농도 의존적으로 인간 혈관내피세포의 혈관 형성을 촉진하는 것으로 나타났다.
(4) 웨스턴 블럿팅
어떤 신호전달체계의 활성화가 TUDCA에 의한 인간 혈관내피세포의 이동에 영향을 미치는지 분석하였다. TUDCA를 인간 혈관내피세포에 시간의존적으로 처리한 후 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였을 때, MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 일종인 ERK(extracellular signal-regulated kinases)의 인산화를 유도하는 것으로 나타났으며, 혈관신생 유도에 필수적인 Akt의 인산화 또한 증가하는 것으로 나타났다 (도 2a). 다음으로, Akt 와 ERK의 활성화가 인간 혈관내피세포의 이동과 어떤 상관관계가 있는지를 조사하기 위하여, Akt의 upstream molelcule인 PI3K에 대한 저해제인 LY294002 (Calbiochem 사)와 p38MAPK 저해제인 SB203580 (Calbiochem 사)를 전처리한 후, TUDCA 100 μM을 7시간 동안 처리하여 세포 이동을 분석한 결과, TUDCA에 의한 세포 이동이 Akt-의존적인 것을 확인하였다 (도 2b).
따라서, 상기 시험결과로부터, TUDCA는 혈관내피세포의 이동(migration) 및 혈관 형성(tube formation)을 촉진함으로써, 우수한 혈관신생 유도 활성을 가짐을 알 수 있다.
실시예 2. 평활근 세포 증식 분석
Eur. J. Cell Biol. 1982. 27:34-46에 개시된 방법에 따라, 랫트 대동맥 평활근 세포를 얻었다. 즉, 랫트 대동맥에 콜라게나아제(0.125 mg/ml)와 엘라스타아 제(0.125 mg/ml)을 첨가하여 90분 동안 37℃에서 배양(shaking incubation) 후, 400g에서 5분간 원심분리하여, 35π 플레이트에 시딩하여, 랫트 대동맥 평활근 세포를 분리하였다. 랫트 대동맥 평활근 세포는 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 중에서 배양하였다. 세포 증식 분석을 위하여, 랫트 대동맥 평활근 세포 1 X 104 cell을 96웰 플레이트에 시딩하여, 12 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, TUDCA를 농도별로 20시간 동안 처리한 다음, well당 20 ㎕의 MTS 용액(Promega, Cat#G3580)을 4시간 동안 처리한 후 490nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, TUDCA는 농도의존적으로 평활근 세포의 증식을 억제하였다.
TUDCA에 의한 평활근 세포의 증식 억제와 관련된 신호전달체계를 분석하기 위하여, 60π 접시(dish)에 랫트 대동맥 평활근 세포 5 X 105 cell을 시딩한 후, 12시간 동안 배양하였다. TUDCA를 농도별로 30분간 처리한 후, 차가운(ice cold) 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세포를 세척한 다음 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿팅을 실시한 결과, ERK는 TUDCA가 낮은 농도에서부터 인산화를 촉진하였고 100 μM이상에서는 JNK를 활성화 시켰다 (도 4a 참조). ERK와 JNK에 대한 특이적 저해제인 U0126 (50μM)과 SP600125(10 μM)를 처리한 후, TUDCA(200μM)를 20시간 동안 처리하여 세포 증식을 분석한 결과, JNK 활성화가 TUDCA에 의한 평활근 세포의 증식 억제에 필수적임을 확인하였다 (도 4b).
실시예 3. 풍선 삽입술 모델(balloon injury carotid artery model)에서 TUDCA 활성 분석
TUDCA가 농도의존적으로 평활근 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났기 때문에, 신내막(neointima) 모델에서 TUDCA가 신내막의 증식을 억제하는지를 조사하였다. 12 주령 수컷 SD 랫트(오리엔트사)로부터 구입하여 1주일간 안정화시킨 후, 경동맥을 절개하여 2F Fogarty embolectomy catheter(Edwards Lifesciences, USA)을 삽입한 후, 생리식염수 0.2ml 주입을 통해 풍선을 팽창시켜 삽입한 다음, 10 회 왕복하여 경동맥에 신내막 비대(neointimal hyperplasia)를 유발시켰다. 수술부위를 봉합실로 봉합한 후, 대조군(PBS, N=6), TUDCA 처리 군 1(50mg/kg, n=6),TUDCA 처리군 2(100mg/kg, n=6), TUDCA 처리군 3(200mg/kg, n=6)으로 나누어, 수술 다음날부터 하루에 1회씩 비이클(vehicle) 및 약물을 2주 동안 경구투여하였다. 2주 후 랫트를 마취하여 수술을 통해 경동맥을 절단하여 10% 포르말린 용액에 24시간 동안 고정하였다. 조직을 다시 물로 세척하여 파라핀 블록(paraffin block)을 제작한 후, 8 ㎛로 잘라 H&E 염색을 하였다. 그 결과, TUDCA는 농도의존적으로 약 40% 정도 신내막의 형성을 억제하였다 (도 5a, 5b, 및 5c). 또한, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, media에 대한 내막의 비율을 측정한 결과, TUDCA가 농도 의존적으로 신내막을 억제하였다.
상기 파라핀 블록을 8 ㎛로 잘라 파라핀을 제거한 후 1% 스킴 밀크(skim milk)와 0.1% 트윈 20을 포함한 PBS로 상온에서 1시간 블록킹(blocking)하였다. 동일 용액에 1/100으로 희석된 PCNA 항체(Santacruz사)를 이용하여 4 ℃에서 12시간 동안 결합시킨 후, 0.1% 트윈 20을 포함한 PBS로 3회 세척하였다. HRP-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG(horse radish peroxidase(HRP)-conjugate anti-mouse IgG)를 1% 스킴 밀크와 0.1% 트윈 20을 포함한 PBS에 1/200으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 다시 0.1% 트윈 20을 포함한 PBS로 3회 세척한 후 DAB(diaminobenzidine)를 7분간 처리하여 발색시키고, 슬라이드를 물에 흘려줌으로써 반응을 종료시켰다. 핵은 Mayer's 헤마톡시린으로 염색하였다. 그 결과, TUDCA는 농도의존적으로 약 80% 정도까지 신내막의 평활근 세포의 증식을 억제하였다(도 6).
실시예 4. 신내막의 세포사멸(apoptosis) 측정
파라핀 블록을 8 ㎛로 잘라 파라핀을 제거한 후 ApopTag® Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon, cat# S7100)를 이용하여 세포사멸(apoptosis)을 측정한 결과, TUDCA는 농도의존적으로 약 4배정도 신내막의 평활근 세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다 (도 7).
도 1a는 타우로우루소데옥시콜릭산이 인간 혈관내피세포의 이동에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 도 1a에서 Tudca는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미하며, VEGF는 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor)를 나타낸다.
도 1b는 타우로우루소데옥시콜릭산이 MMP(matrix metalloprotease)의 분비에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 도 1b에서 TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미하며, VEGF는 혈관 내피 세포 성장 인자를 나타낸다.
도 1c는 타우로우루소데옥시콜릭산이 혈관 형성(Tube formation)에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 도 1c에서 TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미하며, VEGF는 혈관 내피 세포 성장 인자를 나타내고, Vehicle은 인산완충식염수를 나타낸다.
도 2a는 타우로우루소데옥시콜릭산을 인간 혈관내피세포에 시간의존적으로 처리한 후 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과를 나타낸다. 도 2a에서 TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미한다.
도 2b는 PI3K에 대한 저해제인 LY294002 (LY)와 p38MAPK 저해제인 SB203580 (SB)를 전처리한 후, 타우로우루소데옥시콜릭산을 처리하여 세포 이동을 분석한 결과를 나타낸다. 도 2b에서 TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미한다.
도 3은 타우로우루소데옥시콜릭산이 평활근 세포 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 도 3에서 TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미한다.
도 4는 ERK와 JNK의 활성화가 타우로우루소데옥시콜릭산에 의한 평활근 세포의 세포사멸에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 4a는 타우로우루소데옥시콜릭산을 농도별로 처리한 후, 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿팅을 실시한 결과를 나타내고, 도 4b는 ERK와 JNK에 대한 특이적 저해제인 U0126과 SP600125를 처리한 후, 타우로우루소데옥시콜릭산을 처리하여 세포 증식을 분석한 결과를 나타낸다. 도 4에서 TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미한다.
도 5는 풍선 삽입술 모델(balloon injury carotid artery model)에서 타우로우루소데옥시콜릭산의 활성을 분석한 결과로서, 도 5a는 시험 종료 후, 랫트의 경동맥을 적출하여 파라핀 블록을 제작한 후 H&E 염색을 한 결과를 나타내고, 도 5b는 병리조직학적으로 좀더 자세히 관찰하기 위하여 도 5a를 확대한 것이며, 도 5c는 신내막의 두께를 media의 두께로 나누어 상대적인 비율로 나타내어 정량적으로 표시한 결과이다. 도 5에서 Vehicle은 인산완충식염수를 의미한다.
도 6은 면역화학염색을 통한 세포 증식 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 도 6에서 control은 인산완충식염수를 처리한 것을 나타내며, TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미한다.
도 7은 면역화학염색을 통한 세포사멸 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 도 7에서 control은 인산완충식염수를 처리한 것을 나타내며, TUDCA는 타우로우루소데옥시콜릭산 소듐염을 의미한다.

Claims (3)

  1. 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신내막 평활근 세포의 증식 억제를 통한, 관상동맥 재관류술 시행 후에 발생하는 혈관재협착의 예방용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 약물로서 포함하는, 신내막 평활근 세포의 증식 억제를 통한, 관상동맥 재관류술 시행 후에 발생하는 혈관재협착의 예방용 약물 용출성 스텐트.
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