KR20200073491A - 감마-테르피넨을 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감마-테르피넨을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료제 및 보조제 조성물에 관한 것으로서, 감마-테르피넨은 PERK와 eIF2α의 인산화를 유도하여 자궁경부암세포의 생장률을 낮추고 세포사멸을 유도하는 바, 자궁경부암의 치료제 또는 치료보조제로 이용될 수 있다.

Description

감마-테르피넨을 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CERVICAL CANCER COMPRISING GAMMA-TERPINENE}

본 발명은 자궁경부암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

자궁경부암은 여성에게서 발생되는 악성 종양 가운데 두 번째로 발병 빈도가 높은 것으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁경부암으로 사망하고 있으며, 그 수가 계속 증가하고 있다(Pisani P, 등. Int J Cancer 2002;97(1):72-81.). 현대 과학기술의 발달과 더불어 의학기술, 생명공학 및 유전공학이 발전함에 따라 암을 치료하기 위한 다양한 연구 및 방법들이 개발되고 있음에도 불구하고, 암은 아직 완치될 수 없는 중대한 질환으로 인식되고 있다. 이러한 암을 치료하기 위한 방법으로 절개술, 화학요법, 방사선요법, 절개술 등의 많은 방법이 개발되었지만 방사선 요법이나 절개술 등은 주로 암의 초기진단이 이루어졌을 때에만 효과가 있을 뿐 말기암으로 진행된 상태에서는 소용이 없으며 화학요법을 주로 사용하여 치료할 수 밖에 없다. 화학요법은 암의 시기와 관계없이 비교적 쉽게 적용할 수 있다는 장점이 있어서 현재 많은 관심이 집중되고 있으며, 여러가지 항암 화학요법제가 개발되고 있다.

그러나, 화학요법에 사용되는 항암제들은 반복적으로 장기간 투여되거나 암이 재발된 경우에는 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 단점이 있다. 또한, 대부분의 항암제는 세포 내 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시켜 효과를 나타내는데, 이들 항암제는 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직 세포에도 손상을 입히기 때문에 골수 기능 저하, 위장관 점막 손상, 탈모 등 여러 부작용이 나타나는 단점이 있다. 상기와 같은 암세포의 항암제에 대한 내성을 억제하고자, 단일 제제의 항암제를 사용하기보다는 교체 내성(cross-resistance)이 없고, 작용 기전이 서로 다른 약제를 사용하는 병용 요법(combined chemotherapy)이 사용되고 있다. 또한, 항암제의 부작용을 억제하기 위한 방법으로는, 부작용이 없는 새로운 항암제를 개발하거나 종래의 항암제를 최소 유효 농도로 사용하는 방법 등이 제시되고 있다.

최근 이러한 화학요법을 위한 항암제의 표적으로 아폽토시스(apoptosis)에 관여하는 여러 유전자 및 단백질의 차단에 대한 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구들은 지난 수 년 동안 화학요법에 이용되었던 항암제들이 암세포의 유전자를 손상시켜 아폽토시스, 즉 계획된 세포 사멸(programmed cell death)을 유발시킨다는 것에 대한 발견에서부터 시작하여 사멸되지 않은 세포를 분화시키기 위한 세포분화 신호전달 조절 분자들을 발견하기에 이르렀다. 아폽토시스(programed cell death, apoptosis)는 세포의 다양한 생명활동에 매우 중요한 역할을 하는 메커니즘으로, 아폽토시스의 과잉 또는 불충분은 허혈(ischemia), 신경퇴행(neurodegeneration), 자가면역(autoimmunity), 바이러스 감염(viral infection), 종양(tumor) 등 여러 질병과 깊은 관련을 가진다.

소포체(endoplasmic reticulum, ER)는 분비단백질, 세포막, 골지체와 lysosome이 유기적으로 연관된 지정된 단백질의 합성과 폴딩(folding)에 중요한 부위이다. 소포체는 핵막으로부터 뻗어 나와 가지를 친 것 같은 막성분의 구조로서 세포 내 단백질의 약 1/3이 조면소포체에서 전령 RNA (messenger RNA, mRNA)에서 단백질로 번역 후 폴딩과 조립(assembly), 당화(glycolation) 및 이황화결합(disulfide bond) 등의 수정 과정을 통해 활성형 단백질 구조가 된다. 그러나 생리적 혹은 병리적 환경에 의해 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 미성숙 단백질이 소포체 내로 유입이 되거나 소포체 내 칼슘이 고갈되면 소포체기능에 장애가 발생하는데 이러한 상태를 소포체 스트레스(ER stress)라고 한다. 소포체 스트레스 경로는 소포체 기능을 보존하기 위한 세포의 중요한 보상기전으로 다양한 세포내외 스트레스에서 세포를 보호하기 위하여 활성화되고, 스트레스가 심하면 손상된 세포를 제거하기 위해 세포사멸을 유도한다. 소포체 스트레스 반응은 소포체 막에 존재하는 세 가지의 신호전달체계인 pancreatic ER kinase (PERK), inositol-requiring 1α(IRE-1α)/X-box binding protein 1 (XBP-1) 및 activating transcription factor 6 (ATF6)에 의해 매개된다. 스트레스가 없는 상태에서는 소포체 샤페론 BiP는 3개의 감지기의 소포체 내강의 도메인에 결합되어 있다. 폴딩되지 않았거나 잘못 폴딩된 단백질이 소포체 내에 축적되면, 소포체 스트레스 감지기에서부터 BiP가 분리되어 비정상적인 단백질에 결합하면서 소포체 스트레스 감지기의 활성화를 유도한다. 이러한 소포체 스트레스 감지기의 활성화는 새로운 단백질의 합성을 감소시키거나 폴딩되지 않거나 잘못 폴딩된 단백질을 분해하는 과정을 거치며 이러한 과정으로도 극복하지 못하는 소포체 스트레스는 세포사멸 경로를 활성화하여 손상된 세포를 제거한다.

한편, 감마-테르피넨(γ-terpinene)이라고 하는, 화합물 1-메틸-4-프로판-2-일사이클로헥사-1,4-디엔은 이소프렌을 함유하는 유기 화합물로, 산림에서 방출되며 백리향의 정유, Lippia gracilis Schauer, 멜라루카 앨터니폴리아(Melaleuca alternifolia) 및 실론(Ceylon)에서 발견된다. 감마-테르피넨은 IL-1β와 TNF-α 다형 핵 백혈구와 같은 전 염증성 사이토카인 생산을 감소시키고(Ramalho et al., 2015), Satureja thymbra, satureja parnassica 및 Lippia gracilis Schauer의 에센셜 오일(다양한 테르펜 성분 함유)은 항암 활성을 갖는다고 보고되었다(Ferraz et al., 2013; Fitsiou et al., 2016). 지난 연구에서 테르피넨 성분들을 함유하는 에센셜 오일이 항암 효과와 항염증 효과를 가지고 있음이 입증되었지만 (Cho et al., 2017; Ferraz et al., 2013; Fitsiou et al., 2016; Hua et al., 2014; Ramalho et al., 2015), 상기 문헌 어디에도 정유로부터 분리된 감마-테르피넨 단독 화합물이 자궁경부암에 대한 치료 효과를 가진다는 것에 대해서는 교시되거나 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 정유로부터 분리된 감마-테르피넨 화합물이 자궁경부암을 억제할 뿐만 아니라 자궁경부암 세포주에 대한 강력한 항암활성이 있으며, 감마-테르피넨이 소포체 스트레스 반응과 관련된 PERK-eIF2α 신호경로를 활성화시켜 자궁경부암 세포의 성장억제 및 세포사멸을 유도하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물, 자궁경부암 치료에 대한 보조용 조성물, 또는 상기 보조용 조성물을 이용한 항암제의 암세포에 대한 세포 사멸 증진 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에서는, 감마-테르피넨이 자궁경부암에서 유래한 HeLa 세포에 미치는 영향에 관하여 조사한 결과, HeLa 세포에 감마-테르피넨을 처리한 시간과 농도가 증가함에 따라 세포의 생존율이 감소하였고 caspase-7 및 PARP의 cleavage가 유도되며 또한 감마-테르피넨은 소포체 스트레스를 유발하여 PERK-eIF2α 신호전달 경로를 활성화시키고, 이를 통해 단백질의 번역을 저하시키는 것을 확인하였다. 또한, GADD34의 과발현을 유도하여 eIF2α를 탈 인산화 시켰을 때 감마-테르피넨에 의한 세포사멸은 감소하였지만, 대조적으로 구아나벤즈(guanabenz)를 이용하여 eIF2α의 탈 인산화를 억제하면 HeLa 세포의 감마-테르피넨 민감성이 증가함을 확인하였다. eIF2α의 상위 조절단백질인 PERK의 인산화를 억제 시키거나 낙아웃(knock out) 시켰을 때 감마테르피넨에 의한 eIF2α 인산화가 감소하고 HeLa 세포의 감마-테르피넨 민감성이 감소함을 확인하였다. 결론적으로 감마-테르피넨을 매개로 하는 세포사멸은 PERK-eIF2α 신호전달기전에 의해 일어나고 이는 항암치료제 또는 보조제로서 감마-테르피넨의 적용 가능성을 제안한다.

따라서, 본 발명은 감마-테르피넨(γ-Terpinene) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암(Cervical cancer) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감마-테르피넨 및 GADD34 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 항암제와 함께 개체 내에 투여하는 단계를 포함하는, 항암제의 암세포에 대한 세포사멸 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 감마-테르피넨은 자궁경부암세포의 생장률을 낮추고 세포사멸을 유도하는바, 자궁경부암을 예방하거나 치료하는 용도로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 감마-테르피넨은 소포체 스트레스와 관련된 PERK와 eIF2α의 인산화를 유도하여 암 세포의 사멸이 더욱 민감하게 일어나게 하여 항암제를 단독 사용하는 경우에 비하여 아폽토시스 유발로 인한 항암치료에 현저한 상승효과를 가져오므로, 감마-테르피넨을 항암 보조용 조성물로 하여 항암제와 병용 투여함으로써 항암 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 뿐 아니라, 항암제의 투여량을 줄여 항암제 과다 투여로 인한 부작용을 최소화할 수 있다.

도 1은 자궁경부암 세포에서 감마-테르피넨의 세포사멸 효과를 나타낸 도면이다: 구체적으로, 도 1A는 감마-테르피넨의 화학식을 나타내고, 도 1B는 HeLa 세포를 90분 동안 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 처리한 후 세포 생존력을 MTT 분석을 사용하여 측정한 결과이다. MTT 분석 데이터는 3 회 수행된 3 번의 독립적인 실험의 평균의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 또한, 도 1C는 HeLa 세포를 90분 동안 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 처리한 후 세포 용해액을 PARP, Caspase-7 및 GAPDH에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 1D는 다양한 기간 동안 250 μM의 감마-테르피넨을 처리한 후 세포 용해액을 면역블롯 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 감마-테르피넨이 HeLa 세포에서 PERK-eIF2α 신호 전달 경로를 활성화시키는 것을 확인한 도면이다: 도 2A는 HeLa 세포를 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 90 분간 처리하고, 도 2B는 HeLa 세포를 250μM 감마-테르피넨으로 30, 60, 90, 120분 동안 처리한 후 면역블롯을 통해 UPR 관련 단백질의 변화를 분석한 것이며, 도 2C는 HeLa 세포를 90분 동안 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 처리하고 RT-PCR을 이용하여 ER 스트레스 마커의 전사가 증가하는 것을 확인한 결과이고, 도 2D는 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 40분간 처리한 HeLa 세포를 10 μM 퓨로마이신 10분간 처리한 후 세포 용해액을 퓨로마이신 및 GAPDH에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석한 결과이다.
도 3은 eIF2α 인산화의 하향 조절이 HeLa 세포에서 감마-테르피넨 매개 세포사멸(apoptosis)을 감소시키는 것을 확인한 도면이다: HeLa 세포를 FLAG-GADD34 플라스미드 또는 대조군인 pcDNA3.1 (+) 플라스미드를 사용하여 일시적으로 형질 감염시키고 24 시간 후, 배지를 교환하고 지시된 바와 같이 90 분 동안 다양한 농도의 감마-테르피넨을 세포에 처리하였다. 세포 생존력은 MTT 분석 (A) 및 면역블롯 분석 (B)을 사용하여 측정되었다. MTT 분석 데이터는 3 회 수행된 3 번의 독립적인 실험의 평균의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 통계적 유의성은 * p≤ 0.05 인 Student's의 t- 검정을 사용하여 계산되었다. 면역블롯 분석은 FLAG, ATF4, PARP, Caspase-7, GAPDH, PERK, p-eIF2α 및 eIF2α에 특이적인 항체를 사용하여 수행되었다. (c) HeLa 세포를 FLAG-GADD34 플라스미드 또는 pcDNA3.1 (+)를 대조군으로하여 일시적으로 형질 감염시켰다. 형질 감염 24 시간 후, 배지를 교환하고 지시 된 바와 같이 40 분 동안 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 세포를 처리하였다. 그런 다음 HeLa 세포를 10 μM puromycin으로 10 분간 처리하였다. 세포 용해액을 퓨로마이신 (puromycin), FLAG 및 GAPDH에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석하였다. 화살촉은 FLAG 태그 GADD34 밴드를 나타낸다.
도 4는 GADD34 억제제{구아나벤즈 (Guanabenz)}가 HeLa 세포에서 γ- 테르피넨 매개 세포사멸을 증가시키는 것을 확인한 도면이다: 37.5 μM의 구아나벤즈를 2시간 동안 전처리 하거나 그렇지 않은 HeLa 세포를 150 또는 200 μM의 감마-테르피넨으로 90 분 동안 처리하였다. 세포 생존력은 MTT 분석 (A) 및 면역블롯 분석 (B)을 사용하여 측정하였다. MTT 분석 데이터는 3 회 수행 된 3 번의 독립적 인 실험의 평균의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 통계적 유의성은 * p≤ 0.05 인 Student's의 t- 검정을 사용하여 계산되었다. 면역블롯 분석은 ATF4, PARP, Caspase-7, GAPDH, PERK, p- eIF2α 및 eIF2α에 특이적인 항체를 사용하여 수행되었다. (C) 37.5 μM 구아나벤즈를 2 시간 동안 전처리 하거나 그렇지 않은 HeLa 세포를 지시된대로 40 분 동안 150 또는 200 μM 감마- 테르피넨으로 처리하였다. 그런 다음 HeLa 세포를 10 μM 퓨로마이신으로 10 분간 처리하였다. 세포 용해액을 퓨로마이신 및 GAPDH에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석하였다.
도 5은 PERK가 결여된 MEF가 감마-테르피넨 매개 세포사멸에 저항력이 있음을 확인한 도면이다: 구체적으로, PERK +/+ 및 PERK -/- MEF에 150 또는 200 μM의 감마-테르피넨을 90 분 동안 처리하고 세포 생존력을 MTT 분석 (A) 및 면역블롯 분석 (B)를 사용하여 측정되었다. MTT 분석 데이터는 3 회 수행된 3 번의 독립적인 실험의 평균의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 통계적 유의성은 ** p ≤ 0.01 인 Student's t-검정을 사용하여 계산하였다. 세포 용해액을 PERK, p-eIF2α, eIF2α, PARP 및 β-actin에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석하였다. (C, D) 1 μM PERK 억제제(GSK2606414)를 2 시간 동안 전처리 하거나 그렇지 않은 HeLa 세포를 200 또는 250 μM 감마-테르피넨으로 90 분간 처리하였다. 세포 생존력은 MTT 분석 (C) 및 면역블롯 분석 (D)을 사용하여 측정하였다. MTT 분석 데이터는 3 회 수행 된 3 번의 독립적 인 실험의 평균의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 통계적 유의성은 * p≤ 0.05 이하의 Student's t-검정을 사용하여 계산하였다. 세포 용해액을 PERK, p-eIF2α, eIF2α, PARP, Caspase-7 및 β-actin에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석하였다.
도 6은 NAC(활성산소 제거제)의 처리는 세포 생존력을 회복시키지만 감마-테르피넨 처리된 HeLa 세포에서 ROS와는 독립적임을 확인한 도면이다: 5 mM NAC을 2시간 동안 전처리 하거나 그렇지 않은 HeLa 세포에 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 90 분 동안 처리하였다. 세포 생존력은 MTT 분석 (A) 및 면역블롯 분석 (B)을 사용하여 측정하였다. MTT 분석 데이터는 3 회 수행된 3 번의 독립적인 실험의 평균의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 세포 용해액을 PARP, ATF4, Caspase-7 및 GAPDH에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석하였다. (C) 5 mM NAC을 2 시간 동안 전 처리하거나 그렇지 않은 세포를 250 μM의 감마-테르피넨으로 60 분간 처리한 후 20 μM DCFH-DA 처리하였다. 형광 강도는 현미경에 의해 검출되었다. (D) 250 μm의 감마-테르피넨을 50 분 처리 세포는 10 μm의 DCFH-DA로 처리하고 유동 세포 분석법으로 분석했다.
도 7는 shCHOP가 γ- 테르피넨 처리 HeLa 세포의 생존력에 영향을 미치지 않음을 확인한 결과이다: HeLa 세포를 EGFP (shEGFP) 또는 CHOP (shCHOP) shRNAs를 발현하는 렌티 바이러스 입자로 감염시켰다. 감염 후 48 시간에 세포를 500 μM Thapsigargin (Tg)으로 처리하고 세포 용 해물을 CHOP 및 GAPDH (A)에 특이적인 항체를 사용하여 면역블롯 분석하였다. (B) MTT 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정 하였다. MTT 분석 데이터는 3 회 수행 된 3 번의 독립적 인 실험의 평균의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다.
도 8은 감마-테르피넨에 의해 유도된 세포사멸 모델을 개략적으로 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 감마-테르피넨(γ-Terpinene) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암(Cervical cancer) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 실시예에서는 상기 조성물을 자궁경부암세포(HeLa)에 처리하여 감마-테르피넨이 자궁경부암세포 성장억제 및 세포사멸에 미치는 영향을 평가하였다. 이를 통해 감마-테르피넨 화합물의 자궁경부암 예방 또는 개선 내지 치료 가능성을 확인하고자 하였다. 그 결과, 본 발명에 의한 감마-테르피넨 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물이 자궁경부암세포 성장억제 및 세포사멸 효과가 있는 것으로 나타났다. 보다 구체적으로 본 발명에 의한 감마-테르피넨을 200μM, 250μM, 300μM의 농도로 처리하였을 때 모두 유의적으로 HeLa 세포의 세포사멸을 유도하였고, 화합물의 농도를 300μM로 첨가하였을 때 70% 이상의 높은 세포사멸 효과를 나타내었다(도 1B).

따라서 본 발명에 의한 감마-테르피넨을 유효성분으로 함유하는 조성물은 자궁경부암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 이용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 자궁경부암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분인 감마-테르피넨(Gamma-terpinene)은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물로서, 분자식은 C₁₀H₁₆이고 분자량은 136.24g/mol이다. 감마-테르피넨의 IUPAC 명칭은 1-methyl-4-propan-2-ylcyclohexa-1,4-diene이다. 상기 감마-테르피넨의 자궁경부암에 대한 치료 효과는 지금까지 전혀 알려진 바 없으며, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.

[화학식 1]

본 발명의 감마-테르피넨은 상기 감마-테르피넨과 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 감마-테르피넨 유도체 등을 포함할 수 있고, 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.

상기 감마-테르피넨의 수득방법은 특별히 한정되지 않으며, 공지된 제법을 사용하여 화학적으로 합성하거나 시판되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염" 또는 "이의 염"은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예를 들어, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

상기 유리산으로는 무기산 또는 유기산을 사용할 수 있다 상기 무기산의 비제한적인 예로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 염" 또는 "이의 염"은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예를 들어, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

상기 감마-테르피넨의 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 감마-테르피넨의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 감마-테르피넨의 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 화장품학적으로 허용 가능한 염으로는 하드로브로마이드, 황산, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트 (메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트 (토실레이트)염 등을 들 수 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명에서, "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서, "개선" 또는 "치료"는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 발명의 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "개체"란 자궁경부암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명의 자궁경부암의 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 인간을 제외한 개체에 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자궁경부암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효한 양의 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여방법, 투여시간, 투여경로, 치료기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 조성물은 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 감마-테르피넨 및 GADD34 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

소포체(ER)는 단백질 접힘, 지질 합성 및 칼슘 저장을 담당하는 중요한 세포 소기관이다. 하지만, 산화 스트레스, 대사성 스트레스 및 염증 반응에 의해 유발되는 ER 및 ER 스트레스에서의 폴딩된 또는 폴딩되지 않은 단백질의 축적은 unfolded protein response (UPR)로 이어지고, 중증 또는 만성 스트레스 조건 하에서 세포는 생존을 위하여 세포사멸을 시작한다. 암세포의 세포증식을 억제하고 세포주기 진행을 지연하며 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것은 암을 억제하는 효과적인 방법이다.

본 발명의 실시예에서, 선행된 세포독성 실험에서 효과가 있는 감마-테르피넨의 HeLa 세포사멸 효과가 소포체 스트레스 반응과 관련이 있는지 확인하기 위하여 감마-테르피넨을 HeLa 세포에 농도별, 시간별로 처리하고 웨스턴 블롯, RT-PCR 및 퓨로마이신을 이용한 단백질 합성을 통해 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현 변화를 조사하였다. 그 결과, 소포체 스트레스 관련 단백질 중 PERK 및 eIF2α의 인산화가 증가하고(도 2A, B), CHOP과 GRP78 유전자의 전사가 증가하며(도 2C), HeLa 세포의 단백질 합성을 저해시키는 것을 확인하였다(도 2D). 이는 감마-테르피넨의 처리가 eIF2α의 인산화를 증가시킴으로써 번역을 억제한다는 것을 보여준다.

또한, HeLa 세포에서 감마-테르피넨의 세포사멸 효과가 eIF2α 인산화에 의해 일어나는 것인지 더 확실히 알아보기 위하여, HeLa 세포에 eIF2α의 탈인산화를 유도하는 GADD34를 과발현시키고 감마-테르피넨을 처리하였다. 그 결과, eIF2α 인산화가 감소하고, PARP 및 Caspase 7의 클리비지가 복구되었으며(도 3B, C) 세포사멸 효과가 저해됨을 확인하였다(도 3A). 이는 감마-테르피넨에 의한 세포사멸 효과가 소포체 스트레스 반응 및 eIF2α의 인산화에 의해 일어나는 것으로 해석할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, eIF2α의 탈인산화를 유도하는 GADD34 억제제를 감마-테르피넨과 병용 처리하였을 때 세포사멸 효과가 상승적으로 일어나는지 확인하기 위하여, GADD34 억제제로서 구아나벤즈(Guanabenze)를 HeLa 세포에 전처리한 후 감마-테르피넨을 함께 처리하였다. 그 결과, HeLa 세포의 생존률이 더 감소하는 것(도 4A), 감마-테르피넨 단독 치료와 비교하여 구아나벤즈와 감마-테르피넨을 병용하였을 때 eIF2α의 인산화가 현저히 증가하는 것(도 4B) 및 구아나벤즈를 처리하여 eIF2α의 탈인산화를 막으면 감마-테르피넨에 의한 세포사멸 효과는 증가하고 단백질의 합성은 감소하는 것을 확인하였다(도 4C).

따라서, 본 발명에서, 상기 감마-테르피넨은 PERK 및 eIF2α의 인산화를 유도하여 자궁경부암 세포의 성장억제 및 세포사멸의 유도 활성을 가지고, 상기 GADD34 억제제는 GADD34에 의한 eIF2α의 탈인산화를 방지하여 eIF2α의 인산화를 연장시키는 것을 통하여 자궁경부암 세포의 세포사멸을 상승적으로 유도함으로써 자궁경부암 치료 효과를 가진다.

이에, 본 발명의 감마-테르피넨 및 GADD34 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 GADD34 억제제는 구아나벤즈일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 조성물을 제공한다.

대부분의 항암제는 안전성 및 효과 이유를 위해서 상당히 좁은 용량 범위를 갖는 강한 약제이다. 너무 적은 작용제의 복용은 암을 잘 치료하지 않을 것이고, 너무 많은 복용은 생명-위협적인 부작용을 유발할 수 있다. 화학요법이 이와 연관된 부작용에 대해서 공지되어 있다. 일반적인 부작용은 특히 피로, 통증, 구강 및 인후 상처, 설사, 구역 및 구토이다. 따라서 투여되는 화학치료제의 용량을 제한 또는 감소시키는 방식이 바람직하다.

하기에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포에 대한 감마-테르피넨의 이로운 치료 효과 및 ER 스트레스와의 독특한 연관성은 본 발명의 추가 양상에 대한 근거로서 제공되었고, 이에 따라서 감마-테르피넨이 또 다른 항암 치료제와 조합되어 항암 보조제로 사용될 수 있다. ER 스트레스에 대한 감마-테르피넨의 효과의 결과로서, 감마-테르피넨은 추가적인 항암제의 투여량을 상당히 감소시킬 수 있고, 따라서 약물의 항-종양 효과를 유지시키면서, 연관된 부작용을 간접적으로 감소시킬 수 있다.

상기 항암 치료제는 자궁경부암 항암제로 알려진 것이면 제한 없이 사용될 수 있고, 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 토포테칸(topotecan)이 상기 항암 치료제에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 항암 보조용 조성물은 항암제와 감마-테르피넨이 단일 조성물의 형태로 제제화되거나 또는 개별적인 조성물의 형태로 제제화될 수 있고, 바람직하게는, 개별적인 조성물의 형태로 제제화될 수 있다. 본 발명에 따른 감마-테르피넨을 포함하는 항암 보조용 조성물에 있어서, 항암제와 본 발명의 감마-테르피넨은 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함된 성분이 단일 조성물(single composition)로 되어 있는 경우에는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 조성물로 되어 있지 않을 경우에는 한 성분을, 다른 성분이 투여되기 전, 후 및/또는 다른 성분과 함께 동시에 투여될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 조성물의 투여 순서 즉, 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것 인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 단일 투여 단위로 제제화되지 않은 본 발명의 조성물의 경우, 본 발명의 조성물인 감마-테르피넨을 먼저 투여하고 항암제를 시간적 간격을 두고 투여한다. 보다 바람직하게는, 감마-테르피넨은 투여 개시일부터 매일 투여하고, 항암제는 투여 개시일에 투여한 후 투여 개시일로부터 2일 내지 3일 간격으로 투여한다. 예를 들면, 감마-테르피넨은 투여 개시부터 매일 1회 투여하고, 항암제를 투여 개시일, 투여 후 2일, 5일, 8일 및 11일에 5회 투여한다.

또한, 본 발명은 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 항암제와 함께 개체 내에 투여하는 단계를 포함하는, 항암제의 암세포에 대한 세포사멸 증진 방법을 제공한다.

상기 항암제는 자궁경부암의 치료를 위해 사용되는 화학요법제인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 일반적으로 세포 사멸로 인한 항암 효과를 지니는 항암제라면 어느 것이든 사용 가능하다.

상기 암세포는 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종과 같은 고형암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 더 바람직하게는 위암, 폐암, 자궁암, 피부암, 간암, 유방암, 난소암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 가장 바람직하게는 자궁경부암 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 감마-테르피넨이 소포체 스트레스와 관련하여 PERK-eIF2α 인산화를 통해 세포사멸을 유도하는 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라, GADD34가 과발현된 암 세포에서 eIF2α 탈인산화 방지에 의한 암 세포의 사멸이 더욱 민감하게 일어나 GADD34 억제제 및 감마-테르피넨 단독 사용에 비하여 세포사멸로 인한 항암치료에 현저한 상승효과를 가져옴을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 항암제와 함께 개체 내에 투여하여 항암제의 암세포에 대한 세포 사멸을 증진할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[재료 및 실험방법]

1. 시약

본 발명에서 사용된 감마-테르피넨과 guanabenz는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입했다. PARP, ATF4, GAPDH, FLAG 및 β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. Caspase-7, IRE1α, CHOP, p-eIF2α(Ser51), eIF2α 및 PERK에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)로부터 구입하였다. PERK 억제제(GSK26060414) 와 퓨로마이신에 대한 항체는 Merck Millipore (Burlington, MA)로부터 구입하였다.

2. 세포 배양

본 발명에 사용한 자궁 경부암 세포인 HeLa 세포는 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)에서 구입했다. 야생형 MEFs와 PERK 결여된 MEFs 세포는 백승훈 교수 (Ulsan University)가 제공했다. HeLa 세포를 10% 열 불활성화 소태아혈청 (Biowes), 1% 페니실린 및 스트렙토 마이신(GIBCO)이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. MEFs 배지는 37℃에서 5% CO₂로 가습한 상태에서 2% MEM 아미노산 (50X)과 1% MEM 비필수아미노산 (100X) (GIBCO)을 추가로 함유한다. 세포를 트립신 처리하여 100 및 60 mm 배양 접시, 6, 24, 48 및 96 웰 플레이트에 뿌리고 75-85 %의 밀도로 실험에 사용하였다.

3. 세포 생존능 분석

HeLa 세포, 야생형 MEF 및 PERK가 결여된 MEF를 24-웰 세포배양 플레이트 상에 접종하고 16시간 동안 배양하였다. 세포를 다양한 농도의 감마-테르피넨으로 90 분 동안 처리하였다. 필요한 경우 guanabenz, GSK2606414 또는 N-acetl-L-cysteine (NAC)으로 2 시간 동안 세포를 전처리하거나 감마-테르피넨 처리 전 18 시간 동안 플라스미드로 형질 감염시켰다. 세포를 인산완충식염수(PBS, Biowest)로 세척한 후, 배지 중 0.5 mg/ml MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드]로 처리하였다. MTT 처리된 세포를 37℃에서 5% CO₂에서 가습하에 2시간 동안 배양하였다. 각 웰에 함유된 배지를 흡인하고, 300㎕의 DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 흡광도는 UVM 340 (ASYS Hitech, Salzburg, Austria) 판 판독기를 사용하여 파장 570/690 nm에서 측정하였다.

4. 면역 블롯 분석

세포를 NET 용해 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 1 mM EDTA 및 1 % 프로테아제 및 포스파타아제 억제제]를 사용하여 수확하였다. 단백질은 Bradford 분석법 (Bio-Rad)을 사용하여 단백질 농도의 정량화 후에 사용되었다. 단백질을 1X 단백질 로딩 완충액[250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 50 % 글리세롤, 500 mM β- 머캅토에탄올, 10% SDS 및 0.02% 브로모페놀블루]을 넣고 끓인 후 SDS-폴리아크릴아미드겔을 사용하여 분리하였다. 단백질을 Immobilon-P 막 (Merck Millipore)으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유로 실온에서 2 시간 동안 항온 배양하고 항체를 0.08% Tween 20 (TBST)과 1% 탈지유가 함유된 용액에 4 ℃에서 밤새 흡착시켰다. 막을 2시간 동안 실온에서 퍼옥시다아제 결합 제2 항체와 함께 배양하고, 밴드 신호를 LAS-3000 발광 이미지 분석기 (Fujifilm)로 시각화하였다. 항체들을 씻어내기위해 50℃에서 20분 동안 스트리핑 완충액 [100 mM β-메르캅토 에탄올, 2% SDS, 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)]을 넣어주고 스트리핑 한 다음 TBST 완충액으로 10 회 각각 β-actin 또는 GAPDH에 특이적인 항체로 다시 다음단계를 진행했다.

5. 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 PCR 프라이머

세포를 60 mm 세포 배양 접시에서 배양하였다. 총 RNA 추출은 RNAiso plus (TAKARA, Japan)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행했다. Implrome Ⅱ (Promega, Medison, WI)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 2000 ng의 total RNA로 cDNA 합성을 수행하였다. 제조업체의 절차에 따라 FIREPol® DNA 중합 효소 (Solis BioDyne, Estonia)를 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행했다. 프라이머 서열은 하기 [표 1]과 같이 특정 유전자를 증폭하기 위해 준비되었다. PCR 산물을 1% 아가로즈겔에서 25분간 전기영동 하였다.

유전자	종류	염기서열(5'->3')	서열번호
인간 CHOP	Forward	5'-TGGAAGCCTGGTATGAGGAC-3'	1
	Reverse	5'-GTTCTTTCTCCTTCATGCGC-3'	2
인간 GRP78	Forward	5'-TAACGTATGGTGCTGCTGTC-3'	3
	Reverse	5'-GTCAGGCGATTCTGGTCATT-3'	4
인간 GAPDH	Forward	5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3'	5
	Reverse	5'-GCTTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'	6

6. 일시적인 형질 감염

GADD34-FLAG 유전자 발현 벡터는 백승훈 교수(울산 대학교)가 제공하였다. GADD34-FLAG 플라스미드의 일시적인 형질 감염은 제조사의 지시에 따라 iN-fect ^TM invitro Transfection Reagent (iNtRON Biotechnology, Inc., Korea)를 사용하여 수행되었다.

7. 렌티 바이러스 형질 도입

pLKO.1-TRC 벡터는 Addgene 형태로 구입하였다. CHOP (shCHOP)에 대한 짧은 헤어핀 RNA를 발현하는 pLKO.1-TRC 벡터는 Addgene의 프로토콜에 따라 디자인되었다. shCHOP의 센스가닥 서열은 5'-ccggGAGGAAGAAGAGGAAGATCAActcgagTTGATCTTCCTCTTCTTCCTCtttttg-3 '이고(서열번호 7) shCHOP의 안티센스 가닥 서열은 5'-aattcaaaaAAGAACTAGGAAACGGAAACActcgagTGTTTCCGTTTCCTAGTTCTT-3 '(서열번호 8)이다. pRSV-Rev, pMD2-VSVG 및 pMDL-g/pRRe와 같은 렌티 바이러스 패킹 벡터 및 shCHOP 발현 벡터를 HEK293T 세포에 형질 감염시켰다. 렌티 바이러스를 함유하는 1 ml의 형질전환 된 세포배양 배지는 9 ml 완전배지(complete media) 및 폴리브렌(polybrene)과 혼합되었다. HeLa 세포를 24 시간 동안 형질도입 배지와 함께 배양하였다. shCHOP를 발현하는 안정한 세포주는 신선한 완전배지로 대체하고 1 μg/ml 퓨로마이신(puromycin)으로 24시간 처리하여 얻었다.

8. 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)의 유세포 분석 검출

ROS 생성의 검출을 위해 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)를 사용하였다. 감마-테르피넨으로 처리된 HeLa 세포를 수확하고 20 μM DCFH-DA로 처리 하였다. DCFH-DA의 분석은 CytoFLEX (Beckman Coulter)를 525/40 (FITC) 밴드 패스 필터로 사용하여 수행되었다.

9. 통계 분석

수치의 값은 평균 ± S.D로 표현된다. 본 연구의 수치는 세 가지 이상의 실험을 대표한다. 대조군과 치료군 간의 통계 분석은 Student's t-test 또는 Mann-whiteney U-test에 의해 수행되었다. P <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

[실험결과]

감마-테르피넨 치료는 세포 생존을 감소시키고 HeLa 세포에서 세포 사멸을 유도한다(도 1)

HeLa 세포에서 테르펜의 항암 효과를 측정하기 위해 16 가지 유형의 테르펜 (terpenes)으로 스크리닝을 실시했다. HeLa 세포에서 오차가 큰 테르펜은 배제하였다. 여러 유형의 테르펜 중에서 감마-테르피넨이 HeLa 세포의 생존력을 크게 감소시키는 것을 확인하였으며, 웨스턴블랏 결과에서도 PARP와 Caspase cleavage가 가장 강하게 보이는 것을 확인하였다. 감마-테르피넨 (isoprene containing-organic compound)은 C₁₀H₁₆ (도 1A)으로 구성된 세 가지 이성체 탄화수소 중 하나이다. HeLa 세포에서 감마-테르피넨의 항암 효과를 확인한 결과, 감마-테르피넨 처리가 HeLa 세포의 생존력을 용량 의존적으로 감소시킨다는 것을 확인했다(도 1B).

감마-테르피넨으로 처리한 HeLa 세포에서 pro-apoptotic marker의 변화를 시험했을 때, 감마-테르피넨은 시간 및 용량 의존적으로 Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)와 Caspase-7의 절단을 유도했다. PARP와 Caspase-7의 절단은 90 분에서 250 μM 감마-테르피넨으로 명확하게 관찰되었다 (도 1C 및 3D). 이러한 결과로부터, 감마-테르피넨은 조기에 HeLa 세포에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 보인다.

감마-테르피넨은 HeLa 세포에서 PERK-eIF2α 경로를 유도하고 번역을 억제한다(도 2)

γ-Terpinene을 세포에 처리 시 세포에서 일어나는 ER 스트레스 반응(UPR)의 변화를 조사하기 위해 γ-terpinene을 HeLa 세포에 농도별, 시간별로 처리하고 western blot을 통해 UPR 관련 단백질인 IRE1α, PERK, eIF2α 및 ATF4의 변화를 조사한 결과, PERK 및 eIF2α는 투여량과 시간에 따라 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2A, B). 마찬가지로 γ-terpinene을 처리하고 RT-PCR을 이용하여 ER 스트레스 반응(UPR) 관련 유전자인 CHOP 및 GRP78의 전사(transcription)가 증가하는 것을 확인하였다(도 2C). eIF2α의 인산화는 단백질의 번역(translation)을 억제한다. γ-Terpinene을 처리하고 퓨로마이신을 이용하여 단백질의 합성을 조사한 결과 γ-terpinene은 HeLa 세포의 단백질 합성을 저해시키는 것을 확인하였다(도 2의 D). 위의 결과는, 감마-테르피넨의 처리가 eIF2α의 인산화를 증가시킴으로써 번역을 억제한다는 것을 보여준다.

GADD34의 과발현은 HeLa 세포에서 eIF2α의 탈인산화를 통해 감마-테르피넨 매개 세포사멸을 감소시킨다(도 3)

γ-Terpinene에 의한 세포사멸(apoptosis) 효과가 eIF2α의 인산화에 의해 일어나는 것인지 확인하기 위해 eIF2α의 탈인산화를 유도하는 GADD34(growth arrest and DNA damage-inducible 34)를 과발현 시키기 위해 벡터를 HeLa 세포에 일시적으로 형질 감염시켰다. GADD34를 과발현 시킨 HeLa 세포에 γ-terpinene을 처리한 후 MTT assay를 수행하였고, GADD34가 과발현된 HeLa 세포는 γ-terpinene에 의한 생존률 감소가 복구되었다(도 3A). 마찬가지로 GADD34가 과발현된 HeLa 세포의 경우 γ-terpinene에 의한 eIF2α의 인산화가 감소하고 PARP 및 Caspase7의 cleavage가 복구되었다(도 3B). 또한 GADD34의 과발현은 eIF2α의 인산화를 감소시켜 γ-terpinene 매개 탈인산화에 의해 유도된 단백질 합성 저해를 복구시켰다(도 3C).

감마-테르피넨과 구아나벤즈(Guanabenz)의 조합은 상승적 세포사멸 효과를 초래한다(도 4)

구아나벤즈(Guanabenz)는 GADD34(growth arrest and DNA damage-inducible 34)에 의한 eIF2α의 탈인산화를 막는 것으로 알려져 있다. 따라서 감마-테르피넨 및 구아나벤즈(guayabenz)로 세포를 처리하였다 (Tsaytler et al. 2011). 구아나벤즈로 전처리 후에 γ-terpinene을 함께 처리하면 세포 생존률이 더 감소하는 경향을 보였다(도 4A). 유사하게, eIF2α의 인산화는 γ-테르피넨 단독 치료와 비교하여 구아나벤즈와 감마-테르피넨을 병용하였을 때 현저히 증가했으며, PARP 및 Caspase-7의 분해된 단편은 구아나벤즈와 감마-테르피넨을 병용하였을 때 증가하였다(도 4B). 또한, 구아나벤즈를 처리하여 eIF2α의 탈인산화를 막으면 γ-terpinene에 의한 세포사멸 효과는 증가하고 단백질의 합성은 감소한다(도 4C). 따라서 구아나벤즈는 PERK-eIF2α 경로의 활성화를 통해 감마-테르피넨 매개 세포사멸을 증가시켰다. 이러한 결과는 eIF2α의 인산화가 γ-terpinene에 의한 세포사멸에 밀접한 관련이 있음을 알 수 있다.

PERK는 감마-테르피넨-매개 eIF2α의 인산화에 역할을 한다(도 5).

PERK는 ER 스트레스 조건 하에서 eIF2α를 인산화시키는 ER 막 단백질이다 (Zhang and Kaufman, 2006). 따라서 PERK가 감마-테르피넨 처리에 의해 활성화 된 이후, 야생형 (PERK +/+) 또는 PERK 낙아웃 (PERK -/-) 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts; MEFs)를 사용하여 γ- 테르피넨 매개 세포사멸이 PERK와 관련있는지 확인하였다.

그 결과, PERK가 낙아웃(KO)된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)에서 세포 생존력은 PERK +/+ MEF보다 γ-테르피넨 처리 PERK -/- MEF에서 유의하게 증가하였다 (도 5A). 마찬가지로, PERK -/- MEFs에서도 eIF2α의 인산화, PARP 및 Caspase-7의 절단 형태가 감소했다(도 5B). 따라서, PERK 인산화/활성화는 eIF2α 인산화의 상향 조절을 통해 감마-테르피넨 매개 세포사멸을 유도하는 것으로 보인다. ERK 억제제인 GSK2606414를 γ-terpinene과 같이 처리하면 PERK KO MEFs와 동일하게 생존력이 복구되었으며(도 5C), eIF2α의 인산화와 PARP와 Caspase7의 cleavage도 마찬가지 경향으로 감소하였다(도 5D). 결국, GSK2606414는 PERK의 인산화를 억제하여 eIF2α4- 인산화를 억제함으로써 γ-테르피넨 매개 세포사멸을 감소시켰다. 이 결과는 γ-Terpinene이 PERK의 인산화를 통해 eIF2α의 인산화 및 세포사멸을 유도하는 것을 의미한다.

감마-테르피넨 매개 세포사멸은 ROS와 관련이 없다(도 6).

ROS는 ER 응력과 밀접한 관련이 있으므로 ROS와 감마-테르피넨 사이의 관계를 확인하였다. 그 결과, HeLa 세포가 NAC 및 감마-테르피넨으로 처리되었을 때 세포 생존력이 회복되는 경향이 있었다(도 6A). 면역 블롯 분석에서, γ-테르피넨 처리 세포에서 관찰된 PARP의 절단 형태는 NAC 처리 세포에서 감소하였다(도 6B). 예상외로, 세포 내 ROS가 디클로로-디하이드로-플루오레신 다이아세테이트 (DCFH-DA) 및 유세포 분석법을 사용하여 측정되었을 때, ROS의 축적은 전혀 검출되지 않았다(도 6C 및 8D). 이러한 결과는 γ- 테르피넨 매개 세포사멸이 ROS 세대와 관련이 없음을 보여준다. NAC 치료에 의한 세포 생존력의 증가는 NAC의 ROS 소거 효과와 아무 관련이 없는 것으로 보인다.

CHOP는 감마-테르피넨 매개 세포사멸과 관련이 없다(도 7)

CHOP의 발현은 세포 사멸의 유도와 관련이있는 것으로 알려져있다. 이 연구에서 감마-테르피넨의 처리는 CHOP mRNA의 발현을 유도했다 (도 2C). 그러므로, CHOP가 낙다운 시스템을 이용하여 HeLa 세포의 세포사멸에 관여 하는지 시험하였다. 그러나 렌티 바이러스로 발현된 shRNA를 이용하여 낙다운 실험을 수행한 결과, MTT 분석 결과 HeLa 세포의 생존 가능성은 의미있게 변화하지 않았다(도 7B). 따라서, CHOP는 γ- 테르피넨 매개 세포사멸에서 pro-apoptotic factor로 작용하지 않는 것으로 보인다.

<110> > Industry-Academic Cooperation Foundation, Konkuk University <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CERVICAL CANCER COMPRISING GAMMA-TERPINENE <130> 1064439 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHOP forward primer <400> 1 tggaagcctg gtatgaggac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHOP reverse primer <400> 2 gttctttctc cttcatgcgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 forward primer <400> 3 taacgtatgg tgctgctgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 reverse primer <400> 4 gtcaggcgat tctggtcatt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 cgagatccct ccaaaatcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 gctttctggg tggcagtgat 20 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shCHOP sense strand <400> 7 ccgggaggaa gaagaggaag atcaactcga gttgatcttc ctcttcttcc tctttttg 58 <210> 8 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shCHOP antisense strand <400> 8 aattcaaaaa agaactagga aacggaaaca ctcgagtgtt tccgtttcct agttctt 57

Claims (12)

1. 감마-테르피넨(γ-Terpinene) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암(Cervical cancer) 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 감마-테르피넨은 PERK 및 eIF2α의 인산화를 유도하여 자궁경부암 세포의 성장억제 및 세포사멸의 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 예방 또는 치료방법.
   
4. 감마-테르피넨 및 GADD34 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 GADD34 억제제는 구아나벤즈인 것인, 약학 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 감마-테르피넨은 PERK 및 eIF2α의 인산화를 유도하여 자궁경부암 세포의 성장억제 및 세포사멸의 유도 활성을 갖는 것이고,
   상기 GADD34 억제제는 GADD34에 의한 eIF2α의 탈인산화를 방지하여 eIF2α의 인산화를 연장시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
7. 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 감마-테르피넨은 자궁경부암 항암제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 항암 보조용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 토포테칸(topotecan)을 포함하는 것인, 항암 보조용 조성물.
   
10. 감마-테르피넨 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 항암제와 함께 개체 내에 투여하는 단계를 포함하는, 항암제의 암세포에 대한 세포사멸 증진 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 항암제는 자궁경부암의 치료를 위해 사용되는 화학요법제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 화학요법제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 토포테칸(topotecan)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    

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