JP6352952B2 - グリアジンペプチドを用いた癌の治療のためのキットおよび方法 - Google Patents

Description

本出願は、本開示の別の部分として、コンピューターに読み込み可能な形式で配列リスト（ファイル名：４７３２１Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、容量：７９５バイト、２０１４年３月４日作成）を含み、参照によってその全体が組み込まれている。

関連案件の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１３年３月７日に出願した米国特許仮出願第６１／７７４，２８５号の優先権を主張し、参考として本明細書に援用される。

本発明は、グリアジンペプチドを含む癌を治療するためのキットおよびグリアジンペプチドの患者への投与を含む癌を治療するための方法に関する。グリアジンペプチドは受容体チロシンキナーゼ阻害剤のような少なくとも１種類の化学療法剤と併用投与して、化学療法剤の抗癌効果を増加することができる。

世界中で毎年数百万人が癌によって死亡しており、治療法の選択肢を改善する必要性が常に存在する。多くの化学療法剤が、様々な形態の疾患と戦うことを目指して開発されている。化学療法剤の分類例には、アルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗物質、分化誘導剤、分裂抑制剤、ステロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、およびチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が含まれる。ＴＫＩはタンパク質のリン酸化を妨げて、腫瘍の発症および進行を支えるシグナル伝達経路の活性化を阻害する。受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＲＴＫＩ）は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、および血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）などの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）タンパク質の活性を特異的に標的とするＴＫＩである。しかしＲＴＫＩおよび他の化学療法剤の効果は、抗癌剤に対する癌細胞の本来または獲得された抵抗性によってしばしば妨げられる。

化学療法に対する腫瘍の抵抗性に関与する一つの要因は、癌細胞集団における癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在である。ＣＳＣは癌細胞の小サブセット（典型的には１０％未満）を構成する未分化細胞である。ＣＳＣは胚幹細胞の性質のいくつかを有するためにこのように名付けられ、様々な癌細胞型に分化できる。従ってＣＳＣは腫瘍原性であり、癌の再発および転移を引き起こすことができる。多くの化学療法剤は分化した癌細胞を殺すが、ＣＳＣを効果的に排除できず、これらの細胞を増殖および癌を持続させ、結果として根絶に対する腫瘍の全体としての抵抗性となる。

癌の治療に使用が承認されている２種類のＲＴＫＩはエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標），ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびゲフィチニブ（（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。両剤はＥＧＦＲを標的として阻害する。上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）または別のリガンドと受容体の結合によるＥＧＦＲの活性化は、受容体の細胞内領域に位置するチロシン残基のＡＴＰ誘導リン酸化を生じる。そしてリン酸化されたチロシンは他の細胞内タンパク質と相互作用してシグナル伝達経路を活性化し、細胞の生存および増殖を促進する。ＥＧＦＲの活性化増加は様々な癌のタイプ、特に上皮細胞を由来とする腫瘍と関連する。受容体活性の増加は、ＥＧＦＲのキナーゼ領域における変異、ＥＧＦＲ遺伝子発現の増幅、またはＥＧＦＲタンパク質の過剰発現から起こり得る （Ｙａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２００５；１１（２４）：８６８６-９８）。エルロチニブおよびゲフィチニブは、他のＲＴＫＩと同様に、ＲＴＫのＡＴＰ結合領域に干渉して受容体活性を抑制して下流のシグナル伝達経路を妨げる。

エルロチニブおよびゲフィチニブは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療における使用について承認された最初のＲＴＫＩだった。肺癌は世界中で癌死亡の主要原因であり、肺癌患者の約８５〜９０％がＮＳＣＬＣを有している（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１２； ７７（１）：１８３-９１）。治療の開始後に疾患進行を示し続けるほとんどの患者では、ＮＳＣＬＣの治療におけるエルロチニブおよびゲフィチニブの効果は限定されている（Ｗｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２００６； ６６（２）：９４４-９５０）。ある種のＥＧＦＲ変異を有する患者は、野生型ＥＧＦＲを有する患者よりもＲＴＫＩによる治療に良く反応することが認められている。ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者の約７０〜８０％はＲＴＫＩ療法に感受性があるが、実際上はすべての患者に最終的には耐性がもたらされる（Ｓｕｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２０１１； ６（７）：１１５２−６１）。さらに変異の保有は比較的まれであり、患者の２０％未満で生じる（Ｙａｕｃｈ ２００５， ｓｕｐｒａ）。全体として、白人のＮＳＣＬＣ患者の約１０％のみがエルロチニブまたはゲフィチニブによる治療後に疾患の進行に有意な変化を示しており（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ ２０１２， ｓｕｐｒａ）、改良された治療方法の必要性が明確に示される。

グリアジンはコムギおよび関連穀類に認められるタンパク質であり、グルテンの主成分の一つである。グリアジンの４種類の主なタイプは、α、β、γ、およびωである。グリアジンは多くの活性ペプチドへ消化され、Ｔ細胞免疫性および細胞毒性を誘発するいくつかの種類が含まれる。グリアジンは食事性グルテンと関連する慢性炎症性症状であるセリアック病においてその役割が広く研究されているが、単独または他の従来化学療法剤との併用のいずれでも抗癌剤としての使用は公開または示唆されていていない。実際、グリアジンペプチドによる癌細胞を含む様々な細胞型の治療がＥＧＦＲ経路を活性化して細胞増殖を誘発することが実証されており（Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｕｔ． ２００７；５６（４）：４８０-４８８）、グリアジン投与が癌の治療に禁忌であることを強く示唆する。

本発明は、グリアジンペプチドを含む医薬組成物および癌患者への当該ペプチドの治療上効果的な量の投与に関する使用説明書を含むキットを提供する。本発明によるキットは、少なくとも１種類の化学療法剤を含む医薬組成物ならびに癌患者への治療上効果的な量のグリアジンペプチドおよび化学療法剤の併用投与に関する使用説明書をさらに含むことができる。

本発明はまた、治療上効果的な量のグリアジンペプチドを癌患者に投与することを含む癌の治療方法を提供する。本発明による方法は、治療上効果的な量の少なくとも１種類の化学療法剤を癌患者に併用投与することをさらに含むことができる。

本発明によるグリアジンペプチドは、α−グリアジンペプチドであることができる。適切なα−グリアジンペプチドの例は少なくともα−グリアジンペプチドの３１〜４３位を含み、例えばα−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、およびα−グリアジンペプチド３１〜５５である。一つの態様では、本発明による少なくとも１種類の化学療法剤はＲＴＫＩである。本発明によるＲＴＫＩはＥＧＦＲ阻害剤であることができる。適切なＥＧＦＲ阻害剤の例にはゲフィチニブおよびエルロチニブを含む。一つの実施形態では、癌患者へのグリアジンペプチドおよびＲＴＫＩの併用投与はＲＴＫＩに対する癌の抵抗性を低下または防止するのに効果的である。

本発明は、グリアジンペプチドを患者に投与することを含む癌を治療するためのキットおよび方法を提供する。本発明によるキットはグリアジンペプチドを含む医薬組成物を含み、癌患者への本ペプチドの治療上効果的な量の投与のための使用説明書をさらに含むことができる。本キットは、ＲＴＫＩのような少なくとも１種類の化学療法剤を含む医薬組成物ならびに癌患者に治療上効果的な量のグリアジンペプチドおよび化学療法剤を併用投与するための使用説明書をさらに含むことができる。本発明による癌を治療する方法は、治療上効果的な量のグリアジンペプチドを癌患者に投与することを含む。本方法は治療上効果的な量のＲＴＫＩのような少なくとも１種類の化学療法剤を癌患者に併用投与することをさらに含むことができる。

グリアジンペプチドはα、β、γ、またはω−グリアジンペプチドであることができる。一つの態様では、本発明によるグリアジンペプチドはα−グリアジンペプチドあるいはこの誘導体またはフラグメントである。適切なα−グリアジンの例は少なくともα−グリアジンペプチドの３１〜４３位を含み、例えばα−グリアジンペプチド３１〜５５、α−グリアジンペプチド３１〜４９、およびα−グリアジンペプチド３１〜４３である。好ましい実施形態では、α−グリアジンペプチドはα−グリアジンペプチド３１〜４３あるいはこの誘導体またはフラグメントである。α−グリアジンペプチド３１〜４３はアミノ酸配列ＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有し、本来の炎症性免疫反応を誘発して腸損傷を生じることから「毒性」グリアジンペプチドとしばしばいわれる。α−グリアジンペプチド３１〜４３による癌細胞の処理は細胞増殖を誘発し（Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１０； ５（８）：ｅ１２２４６）、そのため本ペプチドは腫瘍の治療に関して報告されておらず、まして腫瘍を治療するための医薬組成物またはキットには含まれない。本発明によるグリアジンペプチドはグリアジンタンパク質の酵素消化後に得ることができ、また従来技術で知られている方法を用いて化学的に合成できる。グリアジンペプチドを含む医薬組成物は、本ペプチドを医薬品として許容可能な基剤、希釈剤、および／または賦形剤と組合せて含む。グリアジンを含む医薬組成物を患者に投与するのに適した投与経路は、限定されないが、経口、筋肉内、静脈内、呼吸／吸入、および皮下を含む。

本発明により、グリアジンペプチドは癌患者に少なくとも１種類の化学療法剤と併用投与できる。グリアジンペプチドと併用投与できる化学療法剤の例には、限定されないが、アルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗物質、分化誘導剤、分裂抑制剤、ステロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ＴＫＩ（ＲＴＫＩなど）、およびこれらの組合せが含まれる。一つの態様では、グリアジンペプチドは少なくとも１種類のＲＴＫＩと併用投与できる。ＲＴＫＩの例は、限定されないが、アファチニブ、アキシチニブ、カネルチニブ、セディラニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、グランジニン、イマチニブ、ラパチニブ、レフルノミド、レスタウルチニブ、ネラチニブ、パゾパニブ、クイザルチニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチブ、スーテント、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、バタラニブ、特定のＲＴＫと結合するモノクローナル抗体、およびこれらの組合せを含む。本発明による好ましいＲＴＫＩはＥＧＦＲの阻害剤である。ＥＧＦＲ阻害剤の例は、限定されないが、ゲフィチニブおよびエルロチニブを含む。一つの実施形態では、癌患者へのグリアジンペプチドおよびＲＴＫＩの併用投与は、ＲＴＫＩに対する癌の抵抗性を低下または防止するのに効果的である。

本明細書に開示されるキットおよび方法は、癌を有するヒト患者または他の哺乳動物を治療するために使用できる。本発明は膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病、肺癌、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、および甲状腺癌を含む多くのタイプの癌を治療するために有効である。本発明は、進行が細胞間接着における変化に依存する癌を治療するために特に効果的である。一つの態様では、本発明はＮＳＣＬＣを含む肺癌を治療するために使用される。

本明細書で使用されるとき、次の定義が本発明の理解における技術習熟者の支援に使用できる。

用語「治療上効果的」は、患者の症状および投与される特定化合物に依存する。本用語は目的の臨床効果を達成するのに効果的な量を意味する。いくつかの実施形態では、治療上効果的な量は、癌細胞の増殖を阻害する、転移を防止する、または細胞死を生じるのに効果的な量である。既知の化学療法剤の治療上効果的な量は従来技術で知られている。例えば、ＲＴＫＩの治療上効果的な量は一般的には薬剤によって、約５〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、および／または約２５〜約７５ｍｇ／ｋｇ／日である。グリアジンペプチドでは、治療上効果的な量は一般的には約５〜約２００μｇ／ｍＬ、約１０〜約１００μｇ／ｍＬ、および／または約１５〜約５０μｇ／ｍＬ、例えば約２０μｇ／ｍＬの血漿濃度を達成するのに必要な投与量である。本開示による使用のための投与量および投与の頻度は、投与経路、治療する疾患の性質および重篤度、ならびに患者の大きさおよび全身症状のような要因に従って変えることができる。適切な投与量は、本明細書で記載される用量漸増試験およびプロトコールを含むことができる臨床試験などの関連技術で知られている処置によって決めることができる。一般的に臨床医は最適な治療効果を得るため、投与量を調整して投与経路を変更する。純粋に説明の目的において、治療上効果的な量を達成するのに必要なグリアジンペプチドの投与量は、前述の要因に依存して、約１００μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約２００μｇ／ｋｇ／日〜約７５ｍｇ／ｋｇ／日、約５００μｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約７５０μｇ／ｋｇ／日〜約２５ｍｇ／ｋｇ／日、および／または約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。症状によっては治療の延長を必要とし、このときには複数投与において投与量を下げて投与することを伴う場合と伴わない場合がある。必要であれば、１回の量は、１日を通して適切な間隔に分けて２、３、４、５、６、またはそれ以上の分割量として投与される。治療期間は個別の症状に依存し、１日から数日、数週間、数月、または数年続くことがある。

用語「単剤療法」は、グリアジンペプチドが癌細胞および腫瘍に対するその薬理学的効果と化学療法剤の薬理学的効果が重ならないような方法で投与されることを意味する。単剤療法の際、グリアジンペプチドは必ず単独で投与される。グリアジンペプチド単剤療法は化学療法剤を用いる治療の前、後、または前と後の両方で行うことができ、グリアジンペプチドが投与される時点ではもはや化学療法剤の治療上の効果はない。

用語「併用投与」および「併用療法」は、グリアジンペプチドおよび少なくとも１種類の化学療法剤が、重なる期間ですべての化合物が薬理学的効果を発揮できる方法で投与されることを意味する。グリアジンペプチドおよび化学療法剤は、同一医薬組成物または別々の組成物、および同一または異なる投与経路によって投与することができる。グリアジンペプチドおよび化学療法剤は、両化合物が重なる時間に薬理学的効果を発揮する限り、同時または異なる時間に併用投与できる。例えば、化合物は約２、４、６、８、１２、２４、または４８時間の時間内で共に患者に投与できる。グリアジンペプチドまたは化学療法剤のいずれかを最初に投与できる。最初の化合物の治療上効果的な濃度が存在する間に次ぎの化合物が投与される限り、グリアジンペプチドおよび化学療法剤は本発明の教示に従って併用されるものと考えられる。

用語「化学療法剤」は癌細胞に対して毒性である化合物を意味する。化学療法剤は、小分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、およびこれらの組合せであることができる。化学療法剤のクラスの例は前述で示される。化学療法剤の具体的な例は、限定されないが、アザシチジン、アキサチオプリン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、クロラブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ハーセプチン、イダルビシン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、レチノイン酸、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、前述で具体例として挙げたＲＴＫＩ、およびこれらの組合せを含む。化学療法剤のさらなる例が、当該技術分野で知られている。

用語「受容体チロシンキナーゼ阻害剤」または「ＲＴＫＩ」は、タンパク質の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバーの活性を阻害できる化合物を意味する。ＲＴＫＩは小分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、およびこれらの組合せであることができる。ＲＴＫＩのタンパク質標的の例は、限定されないが、ＲＴＫファミリーのメンバーであるエフリン受容体、上皮細胞増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、ニュートロピン受容体、血小板由来増殖因子受容体、および血管内皮細胞増殖因子受容体を含む。具体的なＲＴＫＩの例は前述で示される。

用語「誘導体またはフラグメント」は、グリアジンペプチドと同じ構造および生物学的活性を有するペプチドを意味する。誘導体またはフラグメントはグリアジンペプチドと少なくとも７０％、８０％、または９０％のアミノ酸配列相同性を共有する。種々の実施形態では、誘導体またはフラグメントはα−グリアジンペプチド３１〜５５、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜４３と少なくとも７０％、８０％、または９０％のアミノ酸配列相同性を共有する。誘導体またはフラグメントは化学的に修飾されたグリアジンペプチドであることができる。例えば、誘導体またはフラグメントはペプチドの安定性、膜貫通性、または免疫原性を改善するために化学的に修飾されたグリアジンペプチドであることができる。グリアジンペプチドの誘導体およびフラグメントを形成するために使用できる化学的修飾の例は、限定されないが、ポリマー共役体、脂質化、アミノ酸アナログの利用、グリコシル化、およびカチオン化を含む。一つの態様では、グリアジンペプチドの適切な誘導体またはフラグメントは少なくともアミノ酸配列ＰＰＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む。

有利には、癌患者へのグリアジンペプチドおよびＲＴＫＩのような少なくとも１種類の化学療法剤の併用投与は、化学療法剤に対する癌細胞の抵抗性を低下または防止するのに効果的である。従って、グリアジンペプチドおよび少なくとも１種類の化学療法剤の併用投与は化学療法剤の有効性を増加および延長する。ただ一つの理論に縛られることは意図しないが、本発明によるグリアジンペプチドを単独または少なくとも１種類の化学療法剤との併用で投与することから達成される抗癌効果は、移送物質の細胞内輸送に対するグリアジンペプチドの影響に起因するものと考えられる。

タンパク質および他の分子は、エンドサイトーシス経路の一部で、エンドソームとして知られる小胞における細胞の細胞質区画内で輸送される。初期エンドソームは細胞膜から内在化された分子を受ける小胞である。初期エンドソームは後期エンドソームに成熟し、また多小胞体（ＭＶＢ）としても知られる。後期エンドソーム／ＭＶＢは最終的にリソソームと融合し、内在化した移送物質の酵素分解を引き起こす。リソソーム分解に代えて、いくつかの分子は再生エンドソームに分類され、細胞膜または他の細胞内部位に逆送される。グリアジンペプチド、特にα−グリアジンペプチド３１〜４３は、初期エンドソームの後期エンドソームへの成熟を遅らせることによってエンドサイトーシス経路に干渉することが示されている（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，上記参照）。このため、グリアジンペプチドは、細胞質区画のエンドソーム内に輸送されるタンパク質、化学療法剤、および他の分子の分解に干渉する。細胞内分子の分解を防ぐことによって、グリアジンペプチドは化学療法剤の抗癌活性を高めることができる。

エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）タンパク質複合体（ＥＳＣＲＴ−０、ＥＳＣＲＴ−１、ＥＳＣＲＴ−２、およびＥＳＣＲＴ−３）は、リソソーム内の最終的分解のために移送物質のＭＶＢへの分類を調節する。肝細胞増殖因子調節チロシンキナーゼ基質（ＨＲＳ）はＥＳＣＲＴ−０の成分であり、初期および後期エンドソームにおける分子輸送を調節する （Ｈｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ． ２０１１； ２１（１）：７７-９１； Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，上記参照）。ＨＲＳの７１９〜７３１位アミノ酸はカルボキシル端に位置し、ＨＲＳのエンドソーム膜への局在化に必要な結合領域が含まれる（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，上記参照）。ＨＲＳのアミノ酸７１９〜７３１位の配列（ＰＳＱＤＡＳＬＰＰＱＱＰＹ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、α−グリアジンペプチド３１〜４３ペプチドと非常に類似している。１３個の残基のうち、６個の連続したアミノ酸（ＰＰＱＱＰＹ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含め７個が同じであり、２個が配列間で同一であり、α−グリアジンペプチド３１〜４３におけるＮ端のリジンが、ＨＲＳ７１９〜７３１におけるプロリンと比べて唯一の大きな差である（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，同上参照）。従って、少なくともα−グリアジンの３１〜４３位を含むα−グリアジンペプチド、例えばα−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、およびα−グリアジンペプチド３１〜５５は、ＨＲＳ結合と競合でき、これによってエンドソーム膜内のＨＲＳ局在化に干渉することができる（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，同上参照）。結果として、細胞がα−グリアジンペプチド３１〜４３で処理されると、細胞質内のＨＲＳ量が増加し、一方、膜関連ＨＲＳが低下する（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，同上参照）。エンドソーム膜中ＨＲＳの存在の低下によって、細胞内の輸送物質の正常な輸送が妨げられ、細胞内分子の分解が損なわれる。通常は細胞から取り除かれる毒性物質を含めた移送物質の保持を促進することによって、グリアジンペプチドの患者への投与が細胞の生存能力を低下でき、このことが本ペプチドの癌治療への利用を裏付ける。

別の治療剤なしで癌の治療に使用できるこれらの能力に加えて、グリアジンペプチドはまた１種類以上の化学療法剤との併用使用が有望であることを示しており、これはエンドサイトーシス経路における本ペプチドの影響が化学療法剤の輸送およびこれらの標的に影響することができるためである。エンドソーム膜と関連する結合部位でＨＲＳを競合して追い出した後、少なくともα−グリアジンの３１〜４３位を含むα−グリアジンペプチド、例えばα−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、およびα−グリアジンペプチド３１〜５５は、エンドソームに局在化する。少なくともα−グリアジンペプチド３１〜４３を含むα−グリアジンペプチドを有する小胞は、正常な小胞よりもゆっくりと動く（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，同上参照）。α−グリアジンペプチド３１〜４３によって誘発される細胞内輸送の遅れは小胞内の移送物質によって影響されず、そのため化学療法剤を含め、細胞内に輸送されたすべての分子は影響を受ける可能性がある（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０， ｓｕｐｒａ）。移送物質の遅延した細胞質輸送は、化学療法剤が蓄積できるときまで延ばすことができ、薬剤の細胞内濃度を高めて細胞毒性を増加させる。細胞内の遅延した薬剤の存在はまた、長期間にわたって細胞内にその薬理学的効果を発揮させて薬剤の有効性を高める。従って、グリアジンペプチドと少なくとも１種類の化学療法剤との併用投与は、様々の作用機構を有する抗癌剤の広範な活性を増強することができる。

エンドサイトーシス経路に対するグリアジンペプチドの効果はまた、細胞表現型に影響することによって抗癌治療効果を発揮することができる。上皮および間葉が細胞表現型の２つの主なクラスである。上皮細胞は、近隣細胞間の接着を維持する多数の細胞間結合によって高度に組織化される。これに反して、間葉細胞は組織化されず強い細胞間結合を欠如し、これらの移動能を増加させる。間葉移行（ＭＴ）として知られている過程の際、上皮細胞および非上皮細胞は間葉細胞に分化する。移行は細胞−細胞接着の欠如を生じ、細胞移動性を高め、ならびにアポトーシスへの抵抗を高め、これによって腫瘍の侵襲性、すなわち転移を促進する。ＭＴの際、ｅ−カドヘリンのような細胞結合タンパク質の発現が低下し、ビメンチンおよびフィブロネクチンのような間葉マーカーの発現が増加する。

ｅ−カドヘリンの低発現は、多くの細胞型の進行と関連している （Ｒａｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔ． ２０１１； ３５（９）：９４５-５１； Ｙｉｌｍａｚ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１０； １；８（５）：６２９-４２）。グリアジンペプチドの投与は、ｅ−カドヘリン分解を損なわせて、結合タンパク質を細胞質膜に戻す再利用を促進して細胞と細胞の接着を維持することによって間葉表現型を防ぐことができる。ｅ−カドヘリン保持に対するグリアジンの効果によって、血漿グリアジンの存在が未治療のセリアック患者における腸細胞の高さの低下および絨毛萎縮を引き起こす理由を説明でき（Ｂａｒｏｎｅ ２０１０，上記参照）、これはｅ−カドヘリンの欠如による細胞接着の変化が腸細胞の垂直な増殖を促進するために必要なためである。さらにＨＲＳおよびＥＳＣＲＴ複合体に干渉することによって、グリアジンペプチドは細胞外マトリックスに細胞を結合する焦点接着の分解を防止できる（Ｔｕ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ２０１０；１０７（３７）：１６１０７-１２）。また完全な焦点接着は非間葉表現型を維持して間葉状態への移行を阻害するのに役立つ。本発明によるグリアジンペプチドの投与はＭＴを妨げて細胞増殖および細胞移動（そしてこれによる癌細胞の転移）を防ぐため、本発明による治療は様々な癌のタイプを効果的に制御できる。

また、ＭＴに対するグリアジンペプチドの効果は併用投与される化学療法剤の有効性を増加できる。腫瘍転移は癌治療を複雑にしており、患者の死に関与する重要な要因である。間葉表現型は化学療法への乏しい反応をシグナル化する間葉マーカーの発現によって、薬剤感受性を予測するものとして特定されている。（Ｙａｕｃｈ ２００５， ｓｕｐｒａ； Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ２００７；６（２）：５３２-４１； Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ２００７；６（６）：１６８３-１６９１）。ｅ−カドヘリン発現は耐性癌細胞株にはほとんど存在せず、ｅ−カドヘリン発現の復元によって薬剤感受性を増加でき、治療による細胞増殖阻害およびアポトーシスを生じる（Ｗｉｔｔａ ２００６，前記参照）。グリアジンペプチドの投与はｅ−カドヘリンの保持を促進し、従って非間葉表現型が併用投与された化学療法剤に対する癌細胞の反応を高める。例えば、間葉表現型はＮＳＣＬＣにおけるｅ−カドヘリンの低い量ならびにＥＧＦＲ特異的ＲＴＫＩに対する本来および獲得された抵抗性の両方と関連する（Ｓｕｄａ ２０１１， ｓｕｐｒａ）。非間葉細胞は細胞生存および増殖のためにＥＧＦＲ仲介経路に依存しているが、間葉状態ではＥＧＦＲシグナル化は低下され、細胞は細胞生存および増殖のためにＥＧＦＲ非依存性メカニズムに依存すると考えられる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． ２００８；２５（８）：８４３-５４）。従って、ｅ−カドヘリンを維持して間葉状態への移行を防ぐためのグリアジンペプチドの利用は、薬剤耐性を低下してゲフィチニブまたはエルロチニブのようなＥＧＦＲ特異的ＲＴＫＩの細胞毒性効果に対する癌細胞の感受性を延長させる。グリアジンペプチドの併用投与はその上、他の化学療法剤のクラスと相乗的に作用することが予期され、癌を治療する併用療法のために改善された選択肢をもたらす。

また本発明によるグリアジンペプチドの単独または少なくとも１種類の化学療法剤との併用投与から達成される抗癌効果は、未分化細胞に対するグリアジンペプチドの予期されなかった有利な効果の結果と考えられる。グリアジンペプチドは他の化学療法剤に耐性であるＣＳＣを殺すのに驚くほど効果的であり、単独すなわち単剤療法として使用されるときにこれらは効果的な抗癌剤となる。例えば、グリアジンペプチドは最初（第一）の療法、すなわち他の抗癌療法（例、化学療法剤、放射線、および／または手術）が試みられる前に、投与することができる。別の例では、グリアジンペプチドはもはや治療上効果的でない抗癌療法の後に、次の（例、第二、第三）療法として投与できる。

化学療法剤と併用投与されたグリアジンと比べて単剤療法として単独投与されたグリアジンペプチドの治療効果は、化学療法剤の作用のメカニズムによって影響される。特に作用の主要部位が核である化学療法剤、例えば、アルキル化剤、抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、および他のＤＮＡを損傷する薬剤、による治療に続くグリアジンペプチドの単剤療法投与は、化学療法剤による治療で生残する耐性癌細胞に、特に両化合物の併用投与と比べて、驚くほど効果的であることが認められている。このような化学療法剤では、グリアジンペプチドを用いた単剤療法が、核への化学療法剤の局在化に対する干渉を防止できると理論化されている（一方、併用投与はこのような干渉を促進でき、従って化学療法剤の治療効果を弱める可能性があると理論化されている）。作用の主要部位が核の外側である化学療法剤、例として分化誘導剤、分裂抑制剤、ステロイド、およびＴＫＩでは、グリアジンペプチドおよび化学療法剤の併用投与が癌細胞増殖の阻害に驚くほど効果的であり、グリアジンペプチドまたは化学療法剤の単独による単剤療法よりも大きい相乗的な治療有効性が驚くほど達成できる。少なくとも１種類の化学療法剤による治療の前および／または後（例、化合物が重なる期間の間で薬理学的効果を発揮しないときの単剤療法）、または少なくとも１種類の化学療法剤の投与の間（例、重なる期間で化合物が薬理学的効果を発揮しないときの併用投与）におけるグリアジンペプチドの投与は、従ってＣＳＣの数を低下して癌の再発および転移を防止するのに効果的である。

併用投与された化学療法剤の治療有効性を増加するグリアジンペプチドの能力は、グリアジンペプチドと未分化表現型を維持するために重要なタンパク質との相互作用に部分的に寄与できる。ＨＲＳに加えて、α−グリアジンペプチド３１〜４３は６個のアミノ酸配列ＰＰＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）をシクリン依存性キナーゼ１２（ＣＤＫ１２）のキナーゼ領域内に認められる残基と共有する。ＣＤＫ１２のキナーゼ領域はシクリンＫ（ＣｙｃＫ）とのその相互作用のために重要である（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０１２； ２８７（３０）：２５３４４−５２）。ＣＤＫ１２およびＣｙｃＫはともに胚幹細胞で高く発現されるが、これらの発現は分化の際に低下する（Ｄａｉ ２０１２，前記参照）。これらのタンパク質は胚幹細胞の自己再生ために重要であり、いずれかの阻害が細胞分化を引き起こす（Ｄａｉ ２０１２， 前記参照）。前述および後述される実施例で示される結果に基づき、α−グリアジンペプチド３１〜４３はＣＤＫ１２とＣｙｃＫの間の相互作用に干渉して２つのタンパク質の活性を阻害し、これによって細胞分化を促進して化学療法剤に対する腫瘍の感受性を増加する可能性があると考えられる。グリアジンペプチドがＣＳＣを殺すおよび／または細胞分化を促進する能力は、他の化学療法剤から得られない利点を予想外にもたらす。癌を治療するためにグリアジンペプチドおよび少なくとも１種類の化学療法剤の併用を用いて達成可能な治療有効性は、化合物の活性の特性が反対であることを考えると驚くべきであり予想外である。例えば、グリアジンペプチドは細胞周期のＳ期に細胞を誘導することが知られており、これによって細胞増殖を促進し（Ｂａｒｏｎｅ ２００７，前記参照）、一方、化学療法剤は一般的に細胞毒性であり、特に迅速に分裂する細胞に対して毒性である。エルロチニブおよびゲフィチニブのようなＲＴＫＩは一般的にＧ１期で細胞を休止させるように作用して細胞増殖を阻害する（Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．， ＪＰＥＴ． ２００５；３１５（３）：９７１−７９）。このため、グリアジンペプチドおよび化学療法剤の活性は、少なくとも互いに対抗することが予期される。同様に、グリアジンペプチドのようなＥＧＦＲ活性化剤およびＲＴＫＩのようなＥＧＦＲ阻害剤は互いに正反対であることが予期される。しかし、グリアジンペプチドはＥＧＦＲおよび他の受容体がリソソーム内で分解される代わりに細胞膜に戻して再生させるため、ＥＧＦＲがリン酸化されている期間は延長される（Ｂａｒｏｎｅ ２００７， 前記参照； Ｂａｒｏｎｅ ２０１０， 前記参照）。このようなＥＧＦＲおよび他のＲＴＫの延長された活性化は、ＲＴＫＩに対する細胞の感受性を増加する。従って、グリアジンペプチドおよびＥＧＦＲ特異的ＲＴＫＩの併用投与は、野生型ＥＧＦＲを有する患者および変異受容体タンパク質を発現する患者を治療するために効果的である。

グリアジンペプチドおよびＲＴＫＩのような少なくとも１種類の化学療法剤の併用投与は、予想外の驚くべき効果的な抗癌療法をもたらす。グリアジンペプチドは化学療法剤と協力して作用して高い治療有効性を達成する。グリアジンペプチドおよびＲＴＫＩが癌患者に併用投与される場合、ＲＴＫＩに対する癌の抵抗性は低下または防止される。未治療のセリアック病および癌の両方を有している患者は、ＲＴＫＩまたは他の化学療法剤を用いた抗癌療法に良好な反応が期待できる。セリアック病はコムギグルテンおよび同様なタンパク質に対する免疫原性反応を含む小腸の慢性炎症性疾患である。グルテンフリー食を採用するとセリアック病の症状は軽減する。セリアック病を有する患者では、グリアジンペプチドは分解に対して耐性であり、健常者およびセリアック病が治療された患者と比べて有意に高い量で血清にそのまま輸送され（Ｍａｔｙｓｉａｋ−Ｂｕｄｎｉｋ ｅｔ ａｌ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２００３；１２５（３）：６９６-７０７）、「腸管壁浸漏症候群」として知られている症状を生じる。消化管の内膜を通って全身循環に入るグリアジンの透過性の増加によって、グリアジンペプチドは腫瘍部位に達して化学療法に対する癌細胞の感受性を増加する。このため一つの態様により、治療されるべき当該患者はセリアック病を有さない。

本発明は次の実施例によってさらに説明されるが、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。

実施例１
ＮＳＣＬＣを含む種々のタイプの癌細胞を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ； Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）または癌患者の生検から得、増殖培地で維持した。細胞は多ウェル細胞培養プレートに加え、実験群として（１）増殖培地のみで培養した細胞、（２）α−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５を５〜２００μｇ／ｍｌの複数濃度で添加した増殖培地で培養した細胞、（３）エルロチニブを０．１〜１０μＭの複数濃度で添加した増殖培地で培養した細胞、（４）α−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５を５〜２００μｇ／ｍｌおよびエルロチニブを０．１〜１０μＭで添加した増殖培地で培養した細胞、（５）ゲフィチニブを０．１〜１０μＭの複数濃度で添加した増殖培地で培養した細胞、（６）α−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５を５〜２００μｇ／ｍｌおよびゲフィチニブを０．１〜１０μＭで添加した増殖培地で培養した細胞、に分けた。

細胞の生存を３から５日後に測定し、半数阻害濃度（ＩＣ₅₀）を容量反応曲線から決定した。グリアジンペプチドおよびエルロチニブの併用処理は、単独投与されたエルロチニブのＩＣ₅₀と比べてエルロチニブのＩＣ₅₀が有意に低下した。同様にグリアジンペプチドおよびゲフィチニブの併用処理は、単独投与されたゲフィチニブのＩＣ₅₀と比べてゲフィチニブのＩＣ₅₀が有意に低下した。

実施例２
マウスの脇腹領域にＮＳＣＬＣ細胞を皮下注射する。腫瘍を約１００〜２００ｍｍ³まで増殖させる。マウスを実験群として、（１）生理食塩水を腫瘍部位に毎日１回注射を受けるマウス、（２）５〜２００μｇ／ｍＬのα−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５を腫瘍部位に毎日１回注射を受けるマウス、（３）１００ｍｇ／ｋｇまでのエルロチニブを毎日１回経口投与されるマウス、（４）１００ｍｇ／ｋｇまでのゲフィチニブを毎日１回経口投与されるマウス、（５）５〜２００μｇ／ｍＬのα−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５を腫瘍部位に毎日１回の注射、および１００ｍｇ／ｋｇまでのエルロチニブの毎日１回の経口投与を受けるマウス、（６）５〜２００μｇ／ｍＬのα−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５を腫瘍部位に毎日１回の注射、および１００ｍｇ／ｋｇまでのゲフィチニブの毎日１回の経口投与を受けるマウス、に分けて１４日間処置する。

腫瘍容積を処置期間にわたってカリパスを用いて評価し、増殖阻害を測定する。グリアジンペプチドおよびエルロチニブ、またはグリアジンペプチドおよびゲフィチニブの併用投与は、エルロチニブまたはゲフィチニブの単独投与と比べて腫瘍増殖の有意な阻害をもたらす。

実施例３
ヒトにおける有効性試験を、ＮＳＣＬＣ患者における（１）α−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５、およびゲフィチニブ、あるいは（２）α−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５、およびエルロチニブ、の併用投与の効果を評価するために実施する。対照群患者は毎日２５０ｍｇまでのゲフィチニブまたは毎日１５０ｍｇまでのエルロチニブが投与される。実験群では、ゲフィチニブまたはエルロチニブに加えて、α−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５が毎日投与される。α−グリアジンペプチド３１〜４３、α−グリアジンペプチド３１〜４９、またはα−グリアジンペプチド３１〜５５は、約５〜約２００μｇ／ｍＬの血漿濃度が達成されるように投与される。腫瘍量および転移は治療の１、２、および３か月後に評価する。ＲＴＫＩに加えてグリアジンペプチドを受ける患者は、ＲＴＫＩを単独で受ける患者に比べて肺における原発性腫瘍量の有意な低下を示す。また併用療法を受ける患者は対照群と比べて転移性腫瘍が有意に少ないことを示す。臨床試験によって、癌治療に併用療法でグリアジンペプチドの投与を含むことの価値が実証される。

実施例４
実施例４〜８では、ヒト癌細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、およびＰＡＮＣ−１をＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１％抗菌−抗真菌溶液（１０単位／μＬペニシリン、１０μｇ／μＬストレプトマイシン、および２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で維持した。細胞は５％ＣＯ₂の加湿大気中に３７℃で維持して９０％の密集度に達するまで増殖させた。ついで細胞を洗浄し、トリプシン処理してコールターカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて計数した。

Ａ５４９ ＮＳＣＬＣ細胞を上記のように維持して培養した。α−グリアジンペプチド３１〜４３（Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ゲフィチニブ（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、およびエルロチニブ（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して細胞を処理した。細胞は２４ウェル細胞培養プレートに１０，０００個／ウェルの密度で加え２４時間付着させた。ついで細胞を、（１）賦形剤（ＤＭＳＯ／水）、（２）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３、（３）１μＭゲフィチニブ含有ＤＭＳＯ／水、（４）１μＭエルロチニブ、（５）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３および１μＭゲフィチニブ含有ＤＭＳＯ／水、あるいは（６）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３および１μＭエルロチニブ含有ＤＭＳＯ／水、とともに７２時間培養した。すべての実験は六重測定で実施した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブ／エルロチニブを用いた併用療法では、２つの化合物は細胞に同時に加えた。７２時間の処理後、増殖阻害を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって、製造業者の取扱説明書に従って評価した。５７０ｎｍの吸収を、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ， Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて測定した。表１は５７０ｎｍでの平均吸光度および賦形剤処理細胞と比較したグリアジンおよびＲＴＫＩ処理したＡ５４９細胞の増殖阻害率を示す。

２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬのα−グリアジンペプチド３１〜４３単独で処置されたＡ５４９細胞は、ゲフィチニブまたはエルロチニブ単独で処理された細胞と同等な増殖阻害を示した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブまたはエルロチニブの併用による処理は、α−グリアジンペプチド３１〜４３または各ＲＴＫＩ単独と比べて高い増殖阻害をもたらした。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブまたはエルロチニブの併用療法は、増殖阻害に驚くほど相乗効果を有し、併用療法はα−グリアジンペプチド３１〜４３およびＲＴＫＩの個別の増殖阻害効果の合計よりも高い増殖阻害を生じた。

全体として、本結果は単独で投与されたグリアジンペプチドは効果的な抗癌治療であり、標準的な化学療法剤と同じように癌細胞増殖を阻害したことを示した。グリアジンペプチドおよびＲＴＫＩを用いた併用療法は、グリアジンペプチドまたはＲＴＫＩのいずれかの単独と比べて癌細胞増殖を高める有利な結果であり、また驚くべき予想外な相乗的な抗腫瘍効果をもたらした。

実施例５
ＮＣＩ−Ｈ１９７５ ＮＳＣＬＣ細胞は実施例４で説明したように維持して培養した。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞は、ＥＧＦＲに活性化変異（Ｌ８５８Ｒ）、およびエルロチニブおよびゲフィチニブを含むＥＧＦＲ ＴＫＩに耐性を付与する別の変異（Ｔ７９０Ｍ）を有する。α−グリアジンペプチド３１〜４３、ゲフィチニブ、およびエルロチニブを使用して細胞を処理した。細胞は２４ウェル細胞培養プレートに１０，０００個／ウェルの密度で加え２４時間付着させた。ついで細胞を、（１）賦形剤（ＤＭＳＯ／水）、（２）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３含有ＤＭＳＯ／水、（３）１μＭゲフィチニブ含有ＤＭＳＯ／水、（４）１μＭエルロチニブ含有ＤＭＳＯ／水、（５）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３および１μＭゲフィチニブ含有ＤＭＳＯ／水、あるいは（６）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３および１μＭエルロチニブ含有ＤＭＳＯ／水、とともに７２時間培養した。すべての実験は六重測定で実施した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブ／エルロチニブを用いた併用療法では、２つの化合物は細胞に同時に加えた。７２時間の処理後、増殖阻害をＭＴＴアッセイによって、製造業者の取扱説明書に従って評価した。５７０ｎｍの吸収を、プレートリーダーを用いて測定した。表２は５７０ｎｍでの平均吸光度および賦形剤処理細胞と比較したグリアジンおよびＲＴＫＩ処理したＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖阻害率を示す。

α−グリアジンペプチド３１〜４３単独で処理されたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞は、対照細胞と比べて著しい増殖阻害を示した。α−グリアジンペプチド３１〜４３単独で処理された細胞における増殖阻害は、ゲフィチニブまたはエルロチニブ単独で処理された細胞よりも大きかった。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブまたはエルロチニブの併用による処理は、試験したすべての濃度で癌細胞の著しい増殖阻害を達成した。さらに、併用療法はα−グリアジンペプチド３１〜４３または各ＲＴＫＩ単独と比べて、高い増殖阻害をもたらした。表２に示すように、α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブまたはエルロチニブの併用投与は、驚くほど増殖阻害に相乗効果を有することができ、併用療法はα−グリアジンペプチド３１〜４３およびＲＴＫＩの個別の増殖阻害効果の合計よりも高い増殖阻害を生じた。

全体として、本結果は単独で投与されたグリアジンペプチドはＲＫＴＩ耐性癌細胞の増殖を著しく阻害する効果があり、標準的なＲＴＫＩよりも高い治療有効性を達成したことを示した。グリアジンペプチドおよびＲＴＫＩを用いた併用療法は、グリアジンペプチドまたはＲＴＫＩのいずれかの単独と比べて癌細胞増殖を著しく高める有利な結果であり、また驚くべき予想外な相乗的な抗腫瘍効果をもたらした。

実施例６
ＰＡＮＣ−１膵臓癌細胞は実施例４で説明したように維持して培養した。α−グリアジンペプチド３１〜４３、ゲフィチニブ、およびエルロチニブを使用して細胞を処理した。細胞は２４ウェル細胞培養プレートに１０，０００個／ウェルの密度で加え２４時間付着させた。ついで細胞を、（１）賦形剤（ＤＭＳＯ／水）、（２）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３含有ＤＭＳＯ／水、（３）１μＭゲフィチニブ含有ＤＭＳＯ／水、（４）１μＭエルロチニブ含有ＤＭＳＯ／水、（５）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３および１μＭゲフィチニブ含有ＤＭＳＯ／水、あるいは（６）５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３および１μＭエルロチニブ含有ＤＭＳＯ／水、とともに７２時間培養した。すべての実験は六重測定で実施した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブ／エルロチニブを用いた併用療法では、２つの化合物は細胞に同時に加えた。７２時間の処理後、増殖阻害をＭＴＴアッセイによって、製造業者の取扱説明書に従って評価した。５７０ｎｍの吸収を、プレートリーダーを用いて測定した。表３は５７０ｎｍでの平均吸光度および賦形剤処理細胞と比較したグリアジンおよびＲＴＫＩ処理したＰＡＮＣ−１細胞の増殖阻害率を示す。

α−グリアジンペプチド３１〜４３単独で処理されたＰＡＮＣ−１細胞は、ゲフィチニブまたはエルロチニブ単独で処理された細胞よりも高い増殖阻害を示した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブまたはエルロチニブの併用による処理は、癌細胞の著しい増殖阻害を達成した。さらに、併用療法はα−グリアジンペプチド３１〜４３または各ＲＴＫＩ単独と比べて、著しく高い増殖阻害をもたらした。表３に示すように、α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブまたはエルロチニブの併用投与は、驚くほど増殖阻害に相乗効果を有することができ、併用療法はα−グリアジンペプチド３１〜４３およびＲＴＫＩの個別の増殖阻害効果の合計よりも高い増殖阻害を生じた。

全体として、本結果は単独で投与されたグリアジンペプチドはＲＫＴＩ耐性癌細胞の増殖を阻害する効果があり、標準的なＲＴＫＩよりも高い治療効果を達成したことを示した。グリアジンペプチドおよびＲＴＫＩを用いた併用療法は、グリアジンペプチドまたはＲＴＫＩのいずれかの単独と比べて癌細胞増殖を著しく高める有利な結果であり、また驚くべき予想外な相乗的な抗腫瘍効果を生じた。実施例４〜６はグリアジンペプチドおよび化学療法剤の併用投与が有利な治療効果を与えることを実証した。

実施例７
ＰＡＮＣ−１ヒト膵癌細胞（ＡＴＣＣ）を実施例４で説明したように維持して培養した。α−グリアジンペプチド３１〜４３および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して細胞を処理した。細胞（２７継代）を２４ウェル細胞培養プレートに１×１０⁴個 ／ウェルの密度で加え、２４時間付着させた。ついで細胞を賦形剤（水）または増加させた各濃度の５−ＦＵを加えて７２時間培養した。すべての実験は三重測定で実施した。０〜４００μＭの濃度の５−ＦＵとの培養後、細胞をトリプシンで引き離して計数した。表４に平均細胞数および５−ＦＵ処理による増殖阻害率を示す。

ついで、細胞（３０継代）を２４ウェル細胞培養プレートに５×１０³個 ／ウェルの密度で加え、２４時間付着させた。細胞を、（１）賦形剤（ＤＭＳＯ／水）、（２）６．２５μＭ ５−ＦＵ、（３）７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３、（４）６．２５μＭ ５−ＦＵおよび７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３、（高量併用）、または（５）３．１μＭ ５−ＦＵおよび３５μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３、（低量併用）、とともに培養した。すべての処理は三重測定した。α−グリアジンペプチド３１〜４３および５−ＦＵを用いた併用療法では、２つ化合物を細胞に同時に投与した。培地は７２時間毎にそれぞれの処理を用いて新鮮な培地に交換した。１４日の処理後、細胞をトリプシン処理して計数した。表５は処理後の平均細胞数および増殖阻害率を示す。

５−ＦＵに延長した期間（１４日）暴露されたＰＡＮＣ−１細胞に対するα−グリアジンペプチド３１〜４３の効果を試験するため、先の実験から得た生残した、すなわち耐性のある細胞集団（４％）で実験を実施した。簡単に説明すると、処理１４日目に生きた細胞を計数した後、生残細胞をウェルあたり５，０００個の密度で再度加えた。次の日、細胞を賦形剤あるいは１００μｇ／ｍＬまたは２００μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３で処理した。それぞれの処置を含む培地を３日目および６日目に新鮮なものに交換した。７日目に細胞をトリプシン処理して計数した。表６はα−グリアジンペプチド３１〜４３による処理後の平均細胞数および増殖阻害率を示す。

ＤＮＡを損傷する化学療法剤５−ＦＵは、ＰＡＮＣ−１膵臓癌細胞の増殖を抑制した。この薬剤は６．２５μＭで１４日間の処理によって９６％までＰＡＮＣ−１細胞の増殖を阻害した。５−ＦＵおよびグリアジンペプチドの併用投与は対照細胞と比べて著しい増殖阻害を達成した。表３および表５に示す結果は、いずれかの単独と比べてグリアジンペプチドおよび化学療法剤の併用投与の治療有効性が、化学療法剤の作用部位（核または細胞質）によって影響される可能性があることを示唆する。

驚くべきことに、グリアジンペプチド単独の単剤療法投与は、５−ＦＵによる先の処理で排除されなかった癌細胞を殺すのに効果的だった。５−ＦＵ処理後、最初の集団の４％である５−ＦＵ耐性細胞の生残集団が生き続けた。５−ＦＵ処理したＰＡＮＣ−１細胞から得る生存細胞集団を、α−グリアジンペプチド３１〜４３（１００μｇ／ｍＬまたは２００μｇ／ｍＬ）にさらに７日間暴露したとき、細胞増殖は著しく抑制された。５−ＦＵのような有効な化学療法剤に耐性である細胞を効果的に殺すグリアジンペプチドのこの能力は驚くべきであり予想外だった。

実施例８
Ａ５４９細胞を実施例４で説明したように維持して培養した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびシスプラチン（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を使用して細胞を処理した。細胞（３２継代）を２４ウェル細胞培養プレートに１×１０⁴個 ／ウェルの密度で加え、２４時間付着させた。ついで細胞を賦形剤（０．９％塩化ナトリウム）または増加させた各濃度のシスプラチンを加えて７２時間培養した。すべての実験は三重測定で実施した。０〜６．６μＭの濃度のシスプラチンとの培養後、細胞をトリプシンで引き離して計数した。表７に平均細胞数およびシスプラチン処理による増殖阻害率を示す。

ついで、細胞（３４継代）を２４ウェル細胞培養プレートに５×１０³個 ／ウェルの密度で加え、２４時間付着させた。細胞を、（１）賦形剤（ＤＭＳＯ／水）、（２）３．３μＭシスプラチン、（３）７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３、（４）３．３μＭシスプラチンおよび７０μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３、（高量併用）、または（５）１．６５μＭシスプラチンおよび３５μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３、（低量併用）、とともに培養した。すべての処理は三重測定した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびシスプラチンを用いた併用療法では、２つ化合物を細胞に同時に投与した。培地は７２時間毎にそれぞれの処理を用いて新鮮な培地に交換した。１４日の処理後、細胞をトリプシン処理して計数した。表８は処理後の平均細胞数および増殖阻害率を示す。

シスプラチンに延長した期間（１４日）暴露されたＡ５４９細胞に対するα−グリアジンペプチド３１〜４３の効果を試験するため、先の実験から得た生残した、すなわち耐性のある細胞集団（２％）で第２の実験を実施した。簡単に説明すると、処理１４日目に生きた細胞を計数した後、生残細胞をウェルあたり５，０００個の密度で再度加えた。次の日、細胞を賦形剤あるいは１００μｇ／ｍＬまたは２００μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３で処理した。それぞれの処置を含む培地を３日目および６日目に新鮮なものに交換した。７日目に細胞をトリプシン処理して計数した。表９はα−グリアジンペプチド３１〜４３による処理後の平均細胞数および増殖阻害率を示す。

ＤＮＡを損傷してアルキル化剤として特徴付けられる化学療法剤シスプラチンは、Ａ５４９肺癌細胞の増殖を抑制した。シスプラチンは３．３μＭで１４日間の処理によって９８％までＡ５４９細胞の増殖を阻害した。シスプラチンおよびグリアジンペプチドの併用投与は対照細胞と比べて著しい増殖阻害を達成した。表３および表８に示す結果は、いずれかの単独と比べてグリアジンペプチドおよび化学療法剤の併用投与の治療有効性が、化学療法剤の作用部位（核または細胞質）によって影響される可能性があることを示唆した。

驚くべきことに、グリアジンペプチド単独の投与は、シスプラチンによる先の処理で排除されなかった癌細胞を殺すのに効果的だった。シスプラチン処理後、最初の集団の２％であるシスプラチン耐性細胞の生残集団が生き続けた。シスプラチン処理したＡ５４９細胞から得る生存細胞集団を、α−グリアジンペプチド３１〜４３（１００μｇ／ｍＬまたは２００μｇ／ｍＬ）にさらに７日間暴露したとき、細胞増殖は著しく抑制された。シスプラチンのような有効な化学療法剤に耐性である細胞を効果的に殺すグリアジンペプチドのこの能力は驚くべきであり予想外だった。

全体として、実施例７および８の結果は、グリアジンペプチドおよび化学療法剤の併用投与が癌細胞の増殖を著しく阻害するのに効果的であることを実証した。驚くべきことに、グリアジンペプチド単独の投与は、有効な化学療法剤による延長処置で生残した癌細胞の増殖の著しい抑制を達成した。最も抵抗性なＣＳＣなどの癌細胞を有利に効果的に殺すグリアジンペプチドの驚くべき予想外な能力は、腫瘍細胞増殖を阻害および癌再発を防止するために単剤療法または併用療法に使用できることを示した。従って、グリアジンペプチドの投与は化学療法剤に対する癌の抵抗性を低下または防止するのに効果的だった。

実施例９
動物におけるα−グリアジンペプチド３１〜４３の毒性を評価した。５〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、賦形剤（１００μＬ ＤＭＳＯ／生理食塩水）を５日間、１日に１回皮下投与（第１群）、または賦形剤に含有するα−グリアジンペプチド３１〜４３の２００μｇを５日間、１日に１回皮下投与（第２群）した。グリアジン溶液を調製するため、７０μＬの無菌ＤＭＳＯを１ｍｇのα−グリアジンペプチド３１〜４３に加え、ボルテックスしてペプチドを溶解した。ペプチド溶解後、無菌０．９％塩化ナトリウムを４３０μＬ加えて、ボルテックスしてα−グリアジンペプチド３１〜４３の１０００μｇ／５００μＬ溶液を得た。

毒性を毎日の体重測定および行動評価を用いて評価した。α−グリアジンペプチド３１〜４３は、処置関連死と関係しなかった。試験の最後で、平均体重（±ＳＥ）は第１群で１９．８±０．４ｇ（ｎ＝５）、および第２群で２０．０±０．３ｇ（ｎ＝５）だった。対照群と比べてα−グリアジンペプチド３１〜４３処置マウスで行動変化が観察されなかった。従って、α−グリアジンペプチド３１〜４３は明らかな毒性がなく１０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で耐用性だった。

実施例１０
α−グリアジンペプチド３１〜４３の癌細胞におけるアポトーシス誘発能を評価した。Ａ５４９細胞を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１％抗菌−抗真菌溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地で維持して培養した。細胞は培養装置において３７℃、５％ＣＯ₂存在下で増殖させた。α−グリアジンペプチド３１〜４３単独処理またはゲフィチニブとの併用処理によるアポトーシスの誘発を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いて測定した。

簡単に説明すると、Ａ５４９細胞（１×１０⁵）をチャンバースライドに加えて一昼夜付着させた。細胞を、（１）賦形剤コントロール、（２）１μＭゲフィチニブ、（３）１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、または５００ｍｇ／ｍＬ α−グリアジンペプチド３１〜４３、（４）１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、または５００ｍｇ／ｍＬ α−グリアジンペプチド３１〜４３、および１μＭゲフィチニブ、とともに７２時間培養した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブを用いた併用療法では、２つの化合物を同時に細胞に投与した。７２時間処理後、細胞を４％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）によって室温で２５分間固定し、ついでＰＢＳで５分間２回洗浄して、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳ中で室温５分間透過処理し、最後にＰＢＳで５分間、２回洗浄した。アポトーシスはＤｅａｄＥｎｄ^TM Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて製造業者の使用説明書に従って測定した。測定の最後に、細胞を載せて顕微鏡下で観察した。アポトーシス細胞の染色はα−グリアジンおよび／またはゲフィチニブで処理された細胞で観察され、アポトーシス性の細胞の割合は代表的なサンプル内で染色された細胞の数を計数して測定した。表１０は各処置によってアポトーシス性だった細胞の割合、および対照細胞と比べたグリアジンおよびゲフィチニブ処理された細胞のデータの片側ＡＮＯＶＡ分析を用いて決められたｐ−値を示す。

α−グリアジンペプチド３１〜４３単独で処理された細胞の有意に高い割合が、賦形剤またはゲフィチニブ単独で処理された細胞に比べてアポトーシス性だった。さらに有意に多い細胞が、賦形剤またはゲフィチニブ単独で処理した細胞と比べてα−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブを用いた併用療法によってアポトーシス性だった。アポトーシスを誘発するために最も効果的な処理は５００μｇ／ｍＬα−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブの併用だった。全体として、結果はα−グリアジンペプチド単独またはゲフィチニブとの併用がヒト肺癌細胞におけるアポトーシスの有力な誘発物質であることを実証した。

実施例１１
ゲフィチニブ単独またはα−グリアジンペプチド３１〜４３との併用における活性を、Ａ５４９ヒト肺癌細胞異種移植モデルを用いて評価した。６週齢の雌ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、１２時間の明暗サイクル、５０％相対湿度で３日間隔離し、ケージあたり５匹ずつ飼育した。飲用水および食餌は不断給餌でマウスに与えた。すべてのマウスを無菌条件下で飼育した。４日目に、５×１０⁶個のＡ５４９細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１００μＬでマウスの右脇腹に皮下注射した。接種２４時間後に開始して、第１群−賦形剤（２％ＤＭＳＯ含有生理食塩水）を静脈内投与、第２群−１５０ｍｇ／ｋｇゲフィチニブを強制的に経口によって投与、ならびに第３群−１５０ｍｇ／ｋｇゲフィチニブを強制経口投与および２００μｇα−グリアジンペプチド３１〜４３を静脈内投与、に従ってマウスに１４日間毎日１回投与した。α−グリアジンペプチド３１〜４３およびゲフィチニブを用いた併用療法では、２つの化合物を同時に細胞に投与した。マウスは１４日間の処理期間に続いて２週間監視した。腫瘍測定は腫瘍が触診可能な大きさを形成した時点で開始し、週に２回測定した。表１１は本試験期間における処理群の平均体重を示す。

すべての処置は薬剤関連死に十分耐用性であり、関係しなかった。いずれの処理群も有意な体重低下は認められなかった。終了時点での平均体重（±Ｓ．Ｅ．）はｇで、第１群＝２２．８０±０．８８、第２群＝２２．５０±０．４４、および第３群＝２２．９２±０．４４だった。表１２は試験期間における処理群の平均腫瘍容積を示す。

試験最終日（２８日目）に、平均腫瘍容積（±Ｓ．Ｅ．）はｍｍ³で、第１群＝４０２．８６±９５．４、第２群＝２３９．２５±３２．７８、および第３群＝１４５．４６±１９．７４だった。表１３は試験期間における処置群の平均腫瘍容積を示す。

平均腫瘍増殖阻害率の値は、第２群が４０．６％および第３群が６３．９％だった。腫瘍の倍化期間は第１群が１７．２１日、第２群が２４．４８日、および第３群が２２．８９日だった。腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ比は第２群が５７．１６および第３群が４４．０６だった。

全体として、結果はゲフィチニブおよびグリアジンペプチドを用いる併用療法がゲフィチニブ単独と比べて優れた抗癌効果を生じることを実証した。併用療法は動物に十分耐用性であり毒性はなかったが、それでも腫瘍負荷を低下するのに効果的だった。併用療法による平均腫瘍容積は、対照動物と比べて６０％を超えて低下した。また平均腫瘍容積は、ゲフィチニブ単独による処理後の平均腫瘍容積と比べて併用療法によって有意に小さかった（約４０％）。さらに併用療法はゲフィチニブ単独よりも有意に速く治療有効性を示し、１週間以内で５０％近い腫瘍増殖阻害を達成し、治療の終了後２週間で６０％より高い増殖阻害を維持した。

前述の実施例は、限定されることなく本発明をさらに説明するために示される。データはグリアジンペプチドが単独で使用されたときに効果的な抗癌剤であり、種々の異なる癌タイプを由来とする薬剤耐性癌細胞における増殖を阻害してアポトーシスを誘発できることを実証した。単独投与されたグリアジンペプチドは、有効な化学療法剤による延長処理で生存した最も耐性な癌細胞さえ殺すのに予想外に効果的だった。グリアジンペプチドおよび化学療法剤の併用投与は、多くの化学療法剤で癌細胞の増殖を著しく阻害することが示された。グリアジンペプチドとＲＴＫＩの併用投与は、グリアジンペプチドまたはＲＴＫＩ単独よりも高い治療上の有効性をもたらし、相乗効果が驚くほど達成された。有効なインビボでの抗癌効果および劇的に腫瘍の容積および増殖を低下する能力にも関わらず、グリアジンペプチドの投与は全般的に毒性を生じなかった。

前記実施例で説明された証拠を考慮して、グリジアンペプチドの使用である、単独または化学療法剤との併用は抗癌療法に予期せぬ驚くべき効果をもたらす。

本発明の特定の実施形態が説明されて記載されているが、様々な他の変更および修正が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることは、従来技術の習熟者にとって明らかである。従って、本発明の範囲内にあるすべてのそのような変更および修正は請求項に含められることが意図されている。

Claims (15)

1. 癌治療剤であって、癌を有する患者に治療上効果的な量のグリアジンペプチドを含み、ここで前記グリアジンペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されたアミノ酸配列を含み、前記癌が非小細胞肺癌及び膵臓癌からなる群から選択される、癌治療剤。
2. 治療上効果的な量の少なくとも１種類の化学療法剤を併用投与するための癌治療剤である、請求項１に記載の癌治療剤。
3. 少なくとも１種類の前記化学療法剤が受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２に記載の癌治療剤。
4. 前記グリアジンペプチドがα−グリアジンペプチド３１〜５５、３１〜４９、ならびにこれらの誘導体およびフラグメントからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の癌治療剤。
5. 前記受容体チロシンキナーゼ阻害剤が上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤である、請求項３〜４のいずれかに記載の癌治療剤。
6. 前記ＥＧＦＲ阻害剤がゲフィチニブである、請求項５に記載の癌治療剤。
7. 前記ＥＧＦＲ阻害剤がエルロチニブである、請求項５に記載の癌治療剤。
8. グリアジンペプチドと受容体チロシンキナーゼ阻害剤を併用投与することが、受容体チロシンキナーゼ阻害剤に対する癌細胞の耐性を低下させる又は阻害するために有効である、請求項３〜７のいずれかに記載の癌治療剤。
9. 患者がヒトである、請求項１〜８のいずれかに記載の癌治療剤。
10. 前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を増加することが知られているＥＧＦＲ遺伝子に変異を有さない、請求項１〜９のいずれかに記載の癌治療剤。
11. グリアジンペプチドと少なくとも１種類の前記化学療法剤を併用投与することが、化学療法剤に対する癌細胞の耐性を低下させる又は阻害するために有効である、請求項２に記載の癌治療剤。
12. グリアジンペプチドと少なくとも１種類の前記化学療法剤を併用投与することが、化学療法剤による治療効果を増加させるために有効である、請求項２に記載の癌治療剤。
13. 前記化学療法剤が最初に投与される、請求項１１又は請求項１２に記載の癌治療剤。
14. 前記化学療法剤がアザシチジン、アキサチオプリン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、クロラブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、イダルビシン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、レチノイン酸、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、アファチニブ、アキシチニブ、カネルチニブ、セディラニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、グランジニン、イマチニブ、ラパチニブ、レフルノミド、レスタウルチニブ、ネラチニブ、パゾパニブ、クイザルチニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スーテント（登録商標）（スニチニブ）、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、バタラニブ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２〜１３のいずれかに記載の癌治療剤。
15. 経口、筋肉内、静脈内、呼吸／吸入、および皮下からなる群から選択された投与経路による投与用である、請求項１〜１４に記載の癌治療剤。