CN105120881A - 使用麦胶蛋白肽治疗癌症的套件和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供用于治疗癌症的套件和方法,其包括对患者施用麦胶蛋白肽。根据本发明所述的套件包含含有麦胶蛋白肽的药物组合物和用于对患者施用所述肽的说明书。所述套件可进一步包含含有至少一种化学治疗剂如受体酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物和用于共同施用所述化合物的说明书。根据本发明所述的用于治疗癌症的方法包括对患者施用麦胶蛋白肽并且可进一步包括共同施用至少一种化学治疗剂,如受体酪氨酸激酶抑制剂。对癌症患者共同施用麦胶蛋白肽和受体酪氨酸激酶抑制剂可有效降低或防止所述癌症对所述受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。
Description
本申请含有以电脑可读形式的序列表(文件名:47321A_SeqListing.txt;大小:795个字节;创建日期:2014年3月4日)作为本公开的独立部分,其以全文引用的方式并入本文中。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月7日提交的美国临时专利申请序列号61/774,285根据35U.S.C.§119(e)的权益,这个临时专利申请以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的套件,其包含麦胶蛋白肽,以及治疗癌症的方法,所述方法包括对患者施用麦胶蛋白肽。所述麦胶蛋白肽可与至少一种化学治疗剂如受体酪氨酸激酶抑制剂共同施用来增加所述化学治疗剂的抗癌效应。
背景技术
随着每年全球数百万人死于癌症,一直存在改良治疗选择的需求。已努力开发许多化学治疗剂以与各种形式的疾病进行抗争。化学治疗剂的类别实例包括烷化剂、抗生素、抗代谢药物、分化剂、有丝分裂抑制剂、类固醇、拓扑异构酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。TKI阻断蛋白质磷酸化来抑制支持肿瘤发育和进展的信号转导路径的活化。受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)为特异性靶向受体酪氨酸激酶(RTK)蛋白质(诸如表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板源生长因子受体(PDGFR)和血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR))的活性的TKI。然而,RTKI和其它化学治疗药物的效用通常被癌细胞对抗癌剂的固有或获得性耐药性所阻碍。
肿瘤对化学治疗剂的耐药性的一个促成因素为癌细胞群内存在癌症干细胞(CSC)。CSC是构成一小子集(通常小于10%)癌细胞的未分化细胞。称作CSC是因为这些细胞具有胚胎干细胞的一些特性并且可分化成各种癌细胞类型。CSC因此具有致瘤性并且可导致癌症复发和转移。许多化学治疗药物杀死分化的癌细胞,但无法有效清除CSC,从而允许这些细胞增殖以及癌症持续,从而导致难以整体根除肿瘤。
已批准用于治疗癌症的两种RTKI为埃罗替尼(OSI制药公司)及吉非替尼(阿斯利康公司)。两种药物均靶向和抑制EGFR。表皮生长因子(EGF)或另一配体结合至受体后的EGFR活化导致位于所述受体的细胞内结构域中的酪氨酸残基的ATP驱动型磷酸化。磷酸化的酪氨酸随后与其它细胞内蛋白质相互作用并且活化信号转导路径以促进细胞存活和增殖。EGFR的活化增加与各种癌症类型有关,尤其与衍化自表皮细胞的肿瘤有关。受体活性的增加可源自EGFR的激酶结构域中的突变、EGFR基因表达的扩增或EGFR蛋白质的过度表达(Yauch等人,ClinicalCancerResearch.2005;11(24):8686-98)。埃罗替尼和吉非替尼以及其它RTKI干扰RTK的ATP结合域来抑制受体活化并阻断下游信号转导。
埃罗替尼和吉非替尼是最先批准用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的RTKI。肺癌是全球癌症死亡的首要原因,并且约85-90%的肺癌患者罹患NSCLC(Gottschling等人,LungCancer.2012;77(1):183-91)。埃罗替尼和吉非替尼在治疗NSCLC中的效用已经受到限制,大多数患者在初次治疗后持续显现疾病进展(Witta等人,CancerResearch.2006;66(2):944-950)。已经发现具有某些EGFR突变的患者比那些具有野生型EGFR的患者对RTKI治疗的反应更好。约70-80%的具有EGFR突变的NSCLC患者对RTKI疗法敏感,然而,实际上所有患者最终获得耐药性(Suda等人,JournalofThoracicOncology.2011;6(7):1152-61)。另外,突变的发生率相当少见,发生于低于20%的患者中(Yauch2005,同上)。总体而言,仅约10%的高加索NSCLC患者在用埃罗替尼或吉非替尼治疗后显现疾病进展的明显变化(Gottschling2012,同上),从而凸显出对改良治疗方法的需求。
麦胶蛋白是一种发现于小麦和相关谷物中的蛋白质并且是面筋的主要成分之一。四种主要类型的麦胶蛋白为α、β、γ和ω。麦胶蛋白可被消化成多种活性肽,包括一些触发T细胞免疫或细胞毒性的活性肽。已广泛研究麦胶蛋白在乳糜泻(一种与膳食面筋相关的慢性炎症)中的作用,但尚未公开或提出单独或组合常规化学治疗剂用作抗癌剂。事实上,已经证实用麦胶蛋白肽处理各种细胞类型(包括癌细胞)会活化EGFR路径并且诱导细胞增殖(Barone等人,Gut.2007;56(4):480-488),从而强烈建议禁止施用麦胶蛋白来治疗癌症。
发明内容
本发明提供一种套件,所述套件包含含有麦胶蛋白肽的药物组合物和用于对癌症患者施用治疗上有效量的所述肽的说明书。根据本发明的套件可进一步包含含有至少一种化学治疗剂的药物组合物和用于对癌症患者共同施用治疗上有效量的所述麦胶蛋白肽和化学治疗剂的说明书。
本发明也提供一种治疗癌症的方法,所述方法包括对癌症患者施用治疗上有效量的麦胶蛋白肽。根据本发明的方法可进一步包括对癌症患者共同施用治疗上有效量的至少一种化学治疗剂。
根据本发明的麦胶蛋白肽可为α-麦胶蛋白肽。适宜的α-麦胶蛋白肽的实例包括至少α-麦胶蛋白肽p31-43,例如α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49和α-麦胶蛋白肽p31-55。在一个方面,根据本发明的至少一种化学治疗剂为RTKI。根据本发明的RTKI可为EGFR抑制剂。适宜的EGFR抑制剂的实例包括吉非替尼和埃罗替尼。在一个实施方案中,对癌症患者共同施用麦胶蛋白肽和RTKI可有效降低或防止癌症对RTKI的耐药性。
具体实施方式
本发明提供用于治疗癌症的套件和方法,所述方法包括对患者施用麦胶蛋白肽。根据本发明的套件包含含有麦胶蛋白肽的药物组合物并且可进一步包含用于对癌症患者施用治疗上有效量的所述肽的说明书。所述套件可进一步包含含有至少一种化学治疗剂如RTKI的药物组合物和用于对癌症患者共同施用治疗上有效量的麦胶蛋白肽和化学治疗剂的说明书。根据本发明所述的用于治疗癌症的方法包括对癌症患者施用治疗上有效量的麦胶蛋白肽。所述方法可进一步包括对癌症患者共同施用治疗上有效量的至少一种化学治疗剂如RTKI。
麦胶蛋白肽可为α、β、γ或ω麦胶蛋白肽。在一个方面,根据本发明的麦胶蛋白肽为α-麦胶蛋白肽或其衍生物或片段。适宜的α-麦胶蛋白肽实例包括至少α-麦胶蛋白肽p31-43,例如α-麦胶蛋白肽p31-55、α-麦胶蛋白肽p31-49和α-麦胶蛋白肽p31-43。在一个优选实施方案中,α-麦胶蛋白肽为α-麦胶蛋白肽p31-43或其衍生物或片段。α-麦胶蛋白肽p31-43具有氨基酸序列LGQQQPFPPQQPY(SEQIDNO:1)并且通常称作“毒性”麦胶蛋白肽,因为其诱导先天炎症免疫反应并且导致肠道损伤。用α-麦胶蛋白肽p31-43处理癌细胞会诱导细胞增殖(Barone等人,PLoSONE.2010;5(8):e12246),因此尚未报道所述肽用于治疗肿瘤,更别说包含于用于治疗肿瘤的药物组合物或套件中。根据本发明的麦胶蛋白肽可在酶消化麦胶蛋白后获得或可使用相关领域中已知的常规方法进行化学合成。含有麦胶蛋白肽的药物组合物包含所述肽与药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂的组合。适宜对患者施用包含麦胶蛋白的药物组合物的施用途径包括(但不限于)口服、肌肉内、静脉内、呼吸/吸入和皮下。
根据本发明,麦胶蛋白肽可与至少一种化学治疗剂共同施用给癌症患者。可与麦胶蛋白肽共同施用的化学治疗剂的实例包括(但不限于)烷化剂、抗生素、抗代谢药物、分化剂、有丝分裂抑制剂、类固醇、拓扑异构酶抑制剂、TKI(如RTKI)和其组合。在一个方面,麦胶蛋白肽可与至少一种RTKI共同施用。RTKI的实例包括(但不限于)阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、卡奈替尼(canertibib)、西地替尼(cediranib)、埃罗替尼、吉非替尼、格兰蒂尼(grandinin)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来氟米特(leflunomide)、来他替尼(lestaurtinib)、来那替尼(neratinib)、帕唑替尼(pazopanib)、奎扎替尼(quizartinib)、瑞格菲尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉菲尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitib)、舒癌特(sutent)、替沃扎尼(tivozanib)、替舒替尼(tocerabib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、结合特异性RTK的其它单克隆抗体和其组合。根据本发明的优选RTKI为EGFR抑制剂。EGFR抑制剂的实例包括(但不限于)吉非替尼和埃罗替尼。在一个实施方案中,对癌症患者共同施用麦胶蛋白肽和RTKI可有效降低或防止癌症对RTKI的耐药性。
本文所公开的套件和方法可用于治疗人类癌症患者或任何其它哺乳动物。本发明可用于治疗许多类型的癌症,包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌和甲状腺癌。本发明可特别有效地治疗依赖于细胞间粘着变化而进展的癌症。在一个方面,本发明用于治疗肺癌,包括NSCLC。
如文中所使用,以下定义可用于帮助熟练的从业者了解本发明:
术语“治疗上有效”取决于患者病症和施用的具体化合物。所述术语指可有效达成所需临床效应的量。在一些实施方案中,治疗上有效量为有效抑制癌细胞生长、阻止转移或导致细胞死亡的量。已知化学治疗剂的治疗上有效量为相关领域中已知。例如,RTKI的治疗上有效量通常为约5mg/kg/天到约150mg/kg/天、约10mg/kg/天到约100mg/kg/天、和/或约25mg/kg/天到约75mg/kg/天,视药物而定。对于麦胶蛋白肽,治疗上有效量通常为达成约5μg/mL到约200μg/mL、约10μg/mL到约100μg/mL和/或约15μg/mL到约50μg/mL(例如约20μg/mL)的血浆浓度所需的剂量。根据本发明使用的施用剂量和频率可根据诸如施用途径、待治疗疾病的性质和严重程度,以及患者大小及一般状况的因素而变化。可通过相关领域中已知的程序(例如,可涉及文中所述的剂量递增研究和方案的临床试验)判定适当剂量。通常,临床医生滴定剂量并且修改施用途径来获得最佳治疗效应。仅说明性而言,达成治疗上有效量所需的麦胶蛋白肽剂量介于约100μg/kg/天到约100mg/kg/天、约200μg/kg/天到约75mg/kg/天、约500μg/kg/天到约50mg/kg/天、约750μg/kg/天到约25mg/kg/天和/或约1mg/kg/天到约15mg/kg/天,视上文提到的因素而定。一些情况需要延长治疗,这种情况下可能需要或不需要施用较低剂量进行多次施用。若需要,则在一天中以适当间隔分开施用二、三、四、五、六个或更多个子剂量的形式来施用剂量。治疗时间将取决于具体病症并且可持续一天到数天、数周、数月或数年。
术语“单药疗法”意指麦胶蛋白肽以使得其对癌细胞和肿瘤的药理效应不与化学治疗剂的药理效应重叠的方式施用。在单药疗法期间,麦胶蛋白肽必须单独施用。麦胶蛋白肽单药疗法可发生在使用化学治疗剂治疗前、后或前后,只要所述化学治疗剂在施用所述麦胶蛋白肽时不再治疗上有效即可。
术语“共同施用”和“组合疗法”意指麦胶蛋白肽和至少一种化学治疗剂以使得允许所有化合物在重叠时间段内发挥药理效应的方式施用。所述麦胶蛋白肽和化学治疗剂可在相同药物组合物中施用或在不同组合物中施用,并且经由相同或不同施用途径施用。所述麦胶蛋白肽和化学治疗剂可在同一时间下或在不同时间下共同施用,只要两种化合物在重叠时间段内均发挥药理效应即可。例如,所述化合物均可在约2、4、6、8、12、24或48小时的时间段内施用给患者。可先施用麦胶蛋白肽或化学治疗剂。只要施用后续化合物的同时仍存在第一化合物的治疗上有效浓度,则所述麦胶蛋白肽和所述化学治疗剂视为根据本发明教示共同施用。
术语“化学治疗剂”意指针对癌细胞具有毒性的任何化合物。化学治疗剂可为小分子、蛋白质、多肽、肽、核酸和其组合。上文已提供化学治疗剂的示例性类别。化学治疗剂的具体实例包括(但不限于)阿札胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(axathioprine)、贝伐单抗(bevacizumab)、伯莱霉素(bleomycin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、苯丁酸氮芥(chlorabucil)、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、道诺霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、赫赛汀(herceptin)、伊达比星(idarubicin)、双氯乙基甲胺、美法仑(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、他氟泊苷(tafluposide)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、视黄酸、戊柔比星(valrubicin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、上文所列的具体示例性RTKI和其组合。化学治疗剂的其它实例为相关领域中已知。
术语“受体酪氨酸激酶抑制剂”或“RTKI”意指能够抑制受体酪氨酸激酶(RTK)蛋白质家族成员的活性的任何化合物。RTKI可为小分子、蛋白质、多肽、肽、核酸和其组合。RTKI的蛋白质标靶的实例包括(但不限于)以下RTK家族成员:肝配蛋白受体、表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、神经营养因子受体、血小板源生长因子受体和血管内皮细胞生长因子受体。具体示例性RTKI列于上文中。
术语“衍生物或片段”意指具有类似于麦胶蛋白肽的结构和生物活性的肽。衍生物或片段与麦胶蛋白肽具有至少70%、80%或90%氨基酸序列同源性。在各种实施方案中,衍生物或片段与α-麦胶蛋白肽p31-55、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-43具有至少70%、80%或90%氨基酸序列同源性。衍生物或片段可为化学改性麦胶蛋白肽。例如,衍生物或片段可为经化学改性以改良所述肽的稳定性、膜渗透或免疫原性。可用于形成麦胶蛋白肽的衍生物和片段的化学改性的实例包括(但不限于)聚合物共轭、脂化、使用氨基酸类似物、糖基化和阳离子化。在一个方面,麦胶蛋白肽的适宜衍生物或片段至少含有氨基酸序列PPQQPY(SEQIDNO:2)。
有利地,对癌症患者共同施用麦胶蛋白肽和至少一种化学治疗剂(如RTKI)可有效降低或防止癌细胞对所述化学治疗剂的耐药性。因此,共同施用麦胶蛋白肽和至少一种化学治疗剂提高并且延长所述化学治疗剂的效力。虽然不希望受单一理论束缚,但据信从根据本发明单独施用麦胶蛋白肽或施用麦胶蛋白肽与至少一种化学治疗剂的组合所获得的抗癌效应可归因于所述麦胶蛋白肽对细胞内货物(cargo)转运的影响。
蛋白质和其它分子被运输至细胞胞质隔室内的称作内体的囊泡中,作为内吞路径的一部分。早期内体为接受自细胞质膜内化的分子的囊泡。早期内体成熟为晚期内体,亦称作多囊体(MVB)。晚期内体/MVB最终与溶酶体融合,从而酶降解内化的货物。作为溶酶体降解的一种替代,一些分子被分选为再循环内体中并且被运输回到细胞质膜或其它细胞内部位。已显示麦胶蛋白肽(特别是α-麦胶蛋白肽p31-43)通过延迟早期内体到晚期内体的成熟来干扰内吞路径(Barone2010,同上)。因此,麦胶蛋白肽干扰运输至胞质隔室中内体内的蛋白质、化学治疗剂及其它分子的降解。通过阻止细胞内分子的降解,麦胶蛋白肽可增强化学治疗剂的抗癌活性。
转运必需内体分选复合体(ESCRT)蛋白质复合体(ESCRT-0、ESCRT-1、ESCRT-2和ESCRT-3)调节货物分选至MVB中以在溶酶体进行最终降解。肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物(HRS)(ESCRT-0的成员)调节分子在早期和晚期内体中的运输(Henne等人,DevelopmentalCell.2011;21(1):77-91;Barone2010,同上)。HRS中的氨基酸719-731(位于羧基端)含有将HRS定位到内体膜所需的结合域(Barone2010,同上)。HRS氨基酸719-731序列(PSQDASLPPQQPY;SEQIDNO:3)与α-麦胶蛋白肽p31-43肽非常相似。在13个残基中,7个相同,包括6个连续氨基酸(PPQQPY;SEQIDNO:2),并且2个在序列之间相似,唯一的明显区别在于α-麦胶蛋白肽p31-43中为N-端亮氨酸而在HRS719-731中为脯胺酸(Barone2010,同上)。至少包含α-麦胶蛋白p31-43的α-麦胶蛋白肽(例如α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49和α-麦胶蛋白肽p31-55)因此可与HRS结合竞争,从而干扰HRS在内体膜内的定位(Barone2010,同上)。因此,在用α-麦胶蛋白肽p31-43处理细胞后,胞质中的HRS量增加,同时膜相关HRS减少(Barone2010,同上)。内体膜中HRS的存在减少破坏货物在细胞内的正常运输,从而削弱细胞内分子的降解。通过促进货物(包括毒性分子)(其原本将以其它方式自细胞移除)的滞留,对患者施用麦胶蛋白肽可降低细胞活力,从而支持使用所述肽用于治疗癌症。
除无需额外治疗剂的情况下就可用于治疗癌症的潜力以外,麦胶蛋白肽亦表现出与一或多种化学治疗剂组合使用的前景,因为所述肽对内吞路径的影响可影响化学治疗剂和其标靶的运输。在竞争过HRS得到与内体膜相关的结合位点后,至少包含α-麦胶蛋白p31-43的α-麦胶蛋白肽(例如α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49和α-麦胶蛋白肽p31-55)定位至内体。携载至少包含α-麦胶蛋白肽p31-43的α-麦胶蛋白肽的囊泡比正常囊泡移动缓慢得多(Barone2010,同上)。α-麦胶蛋白肽p31-43诱导的细胞内转运的延迟不受囊泡内的货物影响,因此细胞内运输的所有分子(包括化学治疗剂)可能受到影响(Barone2010,同上)。货物的延时胞质中转可延长化学治疗剂能积累的时间,从而导致更高细胞内药物浓度及细胞毒性增加。延长药物在细胞内的存在时间亦显示药物在细胞内更长久地发挥其药理效应,从而增强药物的效力。因此,共同施用麦胶蛋白肽和至少一种化学治疗剂可强化广泛的具有各种作用机制的抗癌药物的活性。
麦胶蛋白肽对内吞途径的效应亦可通过影响细胞表型来发挥抗癌治疗效应。上皮和间质为两种主要类别的细胞表型。上皮细胞高度组织化,存在多种维持相邻细胞粘着的细胞连接。相反,间质细胞非组织化并且缺乏细胞间连接,从而增加其迁移可能性。在称作间质转变(MT)的过程中,上皮细胞和非上皮细胞分化成间质细胞。这个转变导致细胞间粘着损失并且细胞迁移性增加,以及对细胞凋亡的耐受性增加,从而促进肿瘤侵袭(亦即转移)。在MT期间,细胞连接蛋白质(诸如e-钙粘蛋白(e-cadherin))的表达减少,并且间质标志物(诸如波形蛋白和纤连蛋白)的表达增加。
e-钙粘蛋白的低表达已与许多癌症类型的进展有关(Rao等人,CellBiol.Int.2011;35(9):945-51;Yilmaz等人,MolecularCancerResearch.2010;1;8(5):629-42)。施用麦胶蛋白肽可通过削弱e-钙粘蛋白降解并且促进连接蛋白质再循环回到细胞质膜来维持细胞间黏附而阻止间质表型。麦胶蛋白对e-钙粘蛋白滞留的效应可解释为什么血浆麦胶蛋白的存在会导致未治疗的乳糜泻患者的肠上皮细胞高度降低和绒毛萎缩(Barone2010,同上),因为通过e-钙粘蛋白损失所造成的细胞粘着变化必然会促进肠细胞的垂直生长。另外,通过干扰HRS和ESCRT复合体,麦胶蛋白肽可阻止连接细胞至细胞外基质的粘着斑(focaladhesions)降解(Tu等人,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.2010;107(37):16107-12)。完整粘着斑亦帮助维持非间质表型并且抑制转变成间质状态。因为施用根据本发明的麦胶蛋白肽可阻断MT并且阻止细胞生长和细胞迁移(且因此癌细胞的转移),根据本发明的治疗可有效控制广泛的癌类型。
麦胶蛋白肽对MT的效应还可增加共同施用的化学治疗剂的效力。肿瘤转移使癌症治疗变复杂并且为患者死亡的主要原因。间质表型已识别作为药物敏感性的预测,间质标志物的表达传递对化学治疗反应较弱的信号(Yauch2005,同上;Buck等人,MolecularCancerTherapeutics.2007;6(2):532-41;Frederick等人,MolecularCancerTherapeutics.2007;6(6):1683-1691)。e-钙粘蛋白表达在耐药性癌细胞系中实质上不存在,并且e-钙粘蛋白表达的复原可增加药物敏感性,从而在治疗后导致细胞生长抑制和细胞凋亡(Witta2006,同上)。因此,施用麦胶蛋白肽来促进e-钙粘蛋白和非间质表型的滞留可改良癌细胞对共同施用的化学治疗剂的反应。例如,间质表型与较低量的e-钙粘蛋白有关并且在NSCLC中与对EGFR-特异性RTKI的固有和获得性耐药性有关(Suda2011,同上)。非间质细胞依赖于EGFR介导路径进行细胞存活和增殖,但在间质状态下,EGFR信号传递降低并且据信细胞依赖于EGFR-非依赖性机制进行细胞存活和增殖(Thomson等人,Clin.Exp.Metastasis.2008;25(8):843-54)。因此,使用麦胶蛋白肽来维持e-钙粘蛋白并且阻止转变成间质状态将降低耐药性并且延长癌细胞对EGFR-特异性RTKI(如吉非替尼或埃罗替尼)细胞毒性效应的敏感性。预期共同施用麦胶蛋白肽与其它类别的化学治疗剂同样起到协同效应,从而改良治疗癌症的组合疗法的选择。
从根据本发明单独施用麦胶蛋白肽或施用麦胶蛋白肽与至少一种化学治疗剂的组合所获得的抗癌效应亦可归因于所述麦胶蛋白肽对未分化细胞的出乎意料的有利效应。麦胶蛋白肽可令人惊讶地有效杀死对其它化学治疗剂具耐药性的CSC,使其在单独使用时(亦即作为单药疗法)成为有效抗癌剂。例如,麦胶蛋白肽可作为初次(一线)疗法施用,亦即,在尝试其它抗癌疗法(例如,化学治疗剂、辐射和/或外科手术)前。作为另一个实例,麦胶蛋白肽可在不再治疗上有效的抗癌疗法后作为后续(例如,二线或三线)疗法施用。
相比与化学治疗剂共同施用的麦胶蛋白,作为单药疗法单独施用的麦胶蛋白肽的治疗效应可受到所述化学治疗剂的作用机制的影响。具体而言,已发现:在用主要作用部位在细胞核中的化学治疗剂(例如烷化剂、抗生素、拓扑异构酶抑制剂和其它破坏DNA的治疗剂)治疗后,单药疗法施用麦胶蛋白肽可令人惊讶地有效抑制在用所述化学治疗剂治疗后存活下来的耐药性癌细胞,特别相对于共同施用两种化合物而言。对于此类化学治疗剂,理论上认为使用麦胶蛋白肽的单药疗法可阻止干扰所述化学治疗剂定位至细胞核中(而理论上认为共同施用可促进此类干扰,从而可能衰减所述化学治疗剂的治疗效应)。对于主要作用部位在细胞核外的化学治疗剂(例如,分化剂、有丝分裂抑制剂、类固醇和TKI),共同施用麦胶蛋白肽和所述化学治疗剂可令人惊讶地有效抑制癌细胞生长并且可令人惊讶地达成比单独用麦胶蛋白肽或化学治疗剂进行单药疗法更大的协同治疗效力。因此,在用至少一种化学治疗剂治疗前和/或后(例如,当所述化合物在重叠时间段内不发挥药理效应时的单药疗法)或在施用至少一种化学治疗剂期间(亦即,当所述化合物在重叠时间段内发挥药理效应时的共同施用)施用麦胶蛋白肽可有效减少CSC的数量并且阻止癌症复发和转移。
麦胶蛋白肽增加共同施用的化学治疗剂的治疗效力的能力还可部分归因于所述麦胶蛋白肽与对维持未分化表型而言重要的蛋白质的相互作用。除HRS以外,α麦胶蛋白肽p31-43与细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)的激酶结构域内发现的残基共用六个氨基酸序列PPQQPY(SEQIDNO:2)。CDK12的激酶结构域对于其与细胞周期蛋白K(CycK)的相互作用而言重要(Dai等人,J.Biol.Chem.2012;287(30):25344-52)。CDK12和CycK在胚胎干细胞中高度表达,但分化后其表达降低(Dai2012,同上)。所述蛋白质对于胚胎干细胞的自我更新而言重要,并且抑制任何一者均会导致细胞分化(Dai2012,同上)。基于前述和下文实例中所示的结果,据信α-麦胶蛋白肽p31-43可干扰CDK12与CycK之间的相互作用并且抑制所述两种蛋白质的活性,从而促进细胞分化并且可潜在地增加肿瘤对化学治疗剂的敏感性。麦胶蛋白肽杀死CSC和/或促进细胞分化的能力出乎意料地提供未从其它化学治疗剂获得的优点。考虑到所述化合物的活性的表征是相反的,使用麦胶蛋白肽与至少一种化学治疗剂的组合来治疗癌症可获得的治疗效力是令人惊讶和出乎意料的。例如,已知麦胶蛋白肽会驱动细胞进入细胞周期的S期,从而促进细胞增殖(Barone2007,同上),而化学治疗剂通常具有细胞毒性,特别对于快速分裂中的细胞而言。RTKI(诸如埃罗替尼和吉非替尼)通常起到使细胞阻滞于G1期以抑制细胞生长的作用(Arora等人,JPET.2005;315(3):971-79)。因此,预期麦胶蛋白肽和化学治疗剂的活性至少相互抵消。类似地,预期EGFR活化剂(诸如麦胶蛋白肽)和EGFR抑制剂(诸如RTKI)的活性相互抵消。然而,因为麦胶蛋白肽使EGFR和其它受体再循环回到细胞膜而非在溶酶体内被降解,所以EGFR保持磷酸化的时间延长(Barone2007,同上;Barone2010,同上)。EGFR和其它RTK活化的此类延长可增加细胞对RTKI的敏感性。因此,共同施用麦胶蛋白肽和EGFR-特异性RTKI可有效用于治疗具有野生型EGFR的患者和那些表达突变受体蛋白质的患者。
共同施用麦胶蛋白肽和至少一种化学治疗剂(如RTKI)提供出乎意料且令人惊讶的有效抗癌疗法。所述麦胶蛋白肽与所述化学治疗剂协同作用来达成增强的治疗效力。当麦胶蛋白肽和RTKI共同施用给癌症患者时,癌症对RTKI的耐药性降低或被防止。可预期罹患未治疗乳糜泻和癌症的患者对使用RTKI或其它化学治疗剂的抗癌疗法的反应更好。乳糜泻是一种小肠慢性炎症疾病,这种疾病涉及对小麦面筋和类似蛋白质的免疫原反应。采用无小麦膳食减轻乳糜泻的症状。与健康个体和经过治疗的乳糜泻患者相比,在罹患乳糜泻的患者中,麦胶蛋白肽抗降解并且以明显更高的量被完整转运至血清中(Matysiak-Budnik等人,Gastroenterology.2003;125(3):696-707),从而产生称作“肠漏综合症”的病症。麦胶蛋白穿过消化道内壁并进入到体循环中的穿透率增加将会使麦胶蛋白肽到达肿瘤部位并且增加癌细胞对化学治疗剂的敏感性。因此,根据一个方面,待治疗的患者未罹患乳糜泻。
通过以下实例进一步解释本发明,这些实例不应理解为限制本发明的范围。
实例1
从美国典型培养物保藏中心(ATCC;Manassas,VA)或癌症患者的活体组织切片获得各种类型的癌细胞(包括NSCLC)并且维持在生长培养基中。将细胞接种于多孔细胞培养板中并且分成以下实验组:(1)只用生长培养基培养的细胞;(2)用补充有5μg/mL到200μg/mL中多种浓度的α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55的生长培养基培养的细胞;(3)用补充有0.1μM到10μM中多种浓度的埃罗替尼的生长培养基培养的细胞;(4)用补充有5μg/mL到200μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55和0.1μM到10μM埃罗替尼的生长培养基培养的细胞;(5)用补充有0.1μM到10μM中多种浓度的吉非替尼的生长培养基培养的细胞;和(6)用补充有5μg/mL到200μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55和0.1μM到10μM吉非替尼的生长培养基培养的细胞。
在3到5天后,测量细胞活力并且从剂量-反应曲线确定半数最大抑制剂浓度(IC50)。与单独施用埃罗替尼的IC50相比,利用麦胶蛋白肽和埃罗替尼的共同处理明显降低埃罗替尼的IC50。类似地,相比单独施用吉非替尼的IC50,利用麦胶蛋白肽和吉非替尼的共同处理明显降低吉非替尼的IC50。
实例2
对小鼠侧腹区域皮下注射NSCLC细胞。让肿瘤生长到约100立方毫米到200立方毫米。将这些动物分成以下实验组并且处理14天:(1)接受每天一次盐水注射至肿瘤部位中的动物;(2)接受每天一次注射5μg/mL到200μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55至肿瘤部位中的动物;(3)接受每天一次口服剂量高达100mg/kg埃罗替尼的动物;(4)接受每天一次口服剂量高达100mg/kg吉非替尼的动物;(5)接受每天一次注射5μg/mL到200μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55至肿瘤部位中并且每天一次口服剂量高达100mg/kg埃罗替尼的动物;(6)接受每天一次注射5μg/mL到200μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55至肿瘤部位中并且每天一次口服剂量高达100mg/kg吉非替尼的动物。
在处理过程中使用测径器评估肿瘤体积来测定生长抑制。与单独施用埃罗替尼或吉非替尼相比,共同施用麦胶蛋白肽和埃罗替尼或麦胶蛋白肽和吉非替尼导致明显抑制肿瘤生长。
实例3
在人类中进行效力研究以评估在NSCLC患者中共同施用(1)α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55和吉非替尼或(2)α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55和埃罗替尼的效应。对对照组患者投药高达每天250mg吉非替尼或高达每天150mg埃罗替尼。在实验组中,除吉非替尼或埃罗替尼外,对患者还每天施用α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55。施用α-麦胶蛋白肽p31-43、α-麦胶蛋白肽p31-49或α-麦胶蛋白肽p31-55来达成约5μg/mL到约200μg/mL的血浆浓度。在一个月、两个月和三个月疗法后,评估肿瘤质量和转移。与单独接受RTKI的患者相比,除RTKI外还接受麦胶蛋白肽的患者的肺中显示原发性肿瘤质量明显减小。与对照组患者相比,接受组合疗法的患者还显示明显更少的转移肿瘤。临床试验证实在组合疗法中包括性施用麦胶蛋白肽来治疗癌症的价值。
实例4
对于实例4到8,从ATCC获得人类癌细胞系A549、NCI-H1975和PANC-1并且维持于含有10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1%抗生素抗真菌溶液(10个单位/μL青霉素、10μg/μL链霉素和25μg/mL两性霉素B)的RPMI1640培养基(生命科技公司,GrandIsland,NY)中。将细胞保持在37℃下和5%CO2加湿气氛下并且生长,直到细胞达到90%汇合度。然后,清洗细胞,胰蛋白酶处理,并且使用库尔特计数器(Coultercounter)进行计数。(Beckman,Brea,CA)。
如上文所述,维持并培养A549NSCLC细胞。使用α-麦胶蛋白肽p31-43(艾纳派克生物科技公司,Fremont,CA)、吉非替尼(LC实验室,Woburn,MA)和埃罗替尼(LC实验室)处理细胞。将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种于24-孔细胞培养板中并且让其粘着24小时。然后用以下物质培养这些细胞72小时:(1)媒剂(DMSO/水);(2)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43;(3)1μM吉非替尼的DMSO/水溶液;(4)1μM埃罗替尼;(5)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和1μM吉非替尼的DMSO/水溶液;或(6)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和1μM埃罗替尼的DMSO/水溶液。所有实验进行一式六份。对于使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼/埃罗替尼的组合疗法,对细胞同时施用这两种化合物。72小时处理后,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴盐(MTT)分析(罗氏诊断公司,Indianapolis,IN),根据制造商说明书评估生长抑制。使用板读取仪(美国伯腾仪器有限公司,Winooski,VT)测量在570nm下的吸光度。表1显示麦胶蛋白-和RTKI-处理过的A549细胞与媒剂处理过的细胞相比在570nm下的平均吸光度和生长抑制百分比。
表1:单独α-麦胶蛋白肽p31-43或α-麦胶蛋白肽p31-43与吉非替尼或埃罗替尼组合在72小时处理后对A549细胞增殖的影响
与单独用吉非替尼或埃罗替尼处理过的A549细胞相比,单独用20μg/mL或70μg/mL剂量的α-麦胶蛋白肽p31-43处理过的A549细胞显示可比较的生长抑制。与单独α-麦胶蛋白肽p31-43或各RTKI相比,α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼或埃罗替尼的组合疗法导致生长抑制增加。令人惊讶地,共同施用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼或埃罗替尼对生长抑制具有协同效应,组合疗法导致生长抑制大于α-麦胶蛋白肽p31-43和RTKI的个别生长抑制效应的总和。
总体而言,这些结果证实单独施用的麦胶蛋白肽为一种有效抗癌治疗并且和基准化学治疗剂一样抑制癌细胞生长。与单独用麦胶蛋白肽或RTKI相比,使用麦胶蛋白肽和RTKI的组合疗法有利地导致癌细胞生长抑制增加并且还产生令人惊讶且出乎意料的协同抗肿瘤效应。
实例5
如实例4中所述,维持和培养NCI-H1975NSCLC细胞。NCI-H1975细胞在EGFR中具有活化突变(L858R)以及额外突变(T790M),其赋予对EGFRTKI(包括埃罗替尼和吉非替尼)的耐药性。使用α-麦胶蛋白肽p31-43、吉非替尼和埃罗替尼处理细胞。将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种于24-孔细胞培养板中并且让其粘着24小时。然而用以下物质培养这些细胞72小时:(1)媒剂(DMSO/水);(2)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43的DMSO/水溶液;(3)1μM吉非替尼的DMSO/水溶液;(4)1μM埃罗替尼的DMSO/水溶液;(5)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和1μM吉非替尼的DMSO/水溶液;或(6)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和1μM埃罗替尼的DMSO/水溶液。所有实验进行一式六份。对于使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼/埃罗替尼的组合疗法,对细胞同时施用这两种化合物。72小时处理后,通过MTT分析,根据制造商说明书评估生长抑制。使用板读取仪测量在570nm下的吸光度。表2显示麦胶蛋白-和RTKI-处理过的NCI-H1975细胞与媒剂处理过的细胞相比在570nm下的平均吸光度和生长抑制百分比。
表2:单独α-麦胶蛋白肽p31-43或α-麦胶蛋白肽p31-43与吉非替尼或埃罗替尼组合在72小时处理后对NCI-H1975细胞增殖的影响
与对照细胞相比,单独用α-麦胶蛋白肽p31-43处理过的NCI-H1975细胞显示明显生长抑制。单独用α-麦胶蛋白肽p31-43处理过的细胞的生长抑制大于单独用吉非替尼或埃罗替尼处理过的细胞。使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼或埃罗替尼的组合的处理在所有测试浓度下达成明显的癌细胞生长抑制。另外,与单独用α-麦胶蛋白肽p31-43或各RTKI相比,组合疗法导致生长抑制增加。如表2中所示,令人惊讶地,共同施用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼或埃罗替尼能对生长抑制具有协同效应,组合疗法导致生长抑制大于α-麦胶蛋白肽p31-43和RTKI的个别生长抑制效应的总和。
总体而言,这些结果证实单独施用的麦胶蛋白肽可有效地明显抑制RTKI耐药性癌细胞的生长并且达成比基准RTKI更大的治疗效力。与单独用麦胶蛋白肽或RTKI相比,使用麦胶蛋白肽和RTKI的组合疗法有利地导致癌细胞生长抑制明显增加并且还产生令人惊讶且出乎意料的协同抗肿瘤效应。
实例6
如实例4中所述,维持和培养PANC-1胰腺癌细胞。使用α-麦胶蛋白肽p31-43、吉非替尼和埃罗替尼处理细胞。将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种于24-孔细胞培养板中并且让其粘着24小时。用以下物质培养细胞72小时:(1)媒剂(DMSO/水);(2)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43的DMSO/水溶液;(3)1μM吉非替尼的DMSO/水溶液;(4)1μM埃罗替尼的DMSO/水溶液;(5)5μg/mL、20μg/mL的DMSO/水溶液或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和1μM吉非替尼的DMSO/水溶液;或(6)5μg/mL、20μg/mL或70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和1μM埃罗替尼的DMSO/水溶液。所有实验进行一式六份。对使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼/埃罗替尼的组合疗法,对细胞同时施用这两种化合物。72小时处理后,通过MTT分析,根据制造商说明书评估生长抑制。使用板读取仪测量在570nm下的吸光度。表3显示麦胶蛋白-和RTKI-处理过的PANC-1与媒剂-处理过的细胞相比在570nm下的平均吸光度和生长抑制百分比。
表3:单独α-麦胶蛋白肽p31-43或α-麦胶蛋白肽p31-43与吉非替尼或埃罗替尼的组合在72小时处理后对PANC-1细胞增殖的影响
与单独用吉非替尼或埃罗替尼处理过的细胞相比,单独用α-麦胶蛋白肽p31-43处理过的PANC-1细胞显示更大的生长抑制。使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼或埃罗替尼的组合的治疗达成癌细胞的明显生长抑制。另外,与单独用α-麦胶蛋白肽p31-43或各RTKI相比,组合疗法导致生长抑制明显增加。如表3中所示,令人惊讶地,共同施用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼或埃罗替尼可对生长抑制具有协同效应,组合疗法导致生长抑制大于α-麦胶蛋白肽p31-43和RTKI的个别生长抑制效应的总和。
总体而言,这些结果证实单独施用的麦胶蛋白肽可有效地抑制RTKI耐药性癌细胞并且达成大于基准RTKI的治疗效力。与单独用麦胶蛋白肽或RTKI相比,使用麦胶蛋白肽和RTKI的组合疗法有利地导致癌细胞生长抑制明显增加并且还产生令人惊讶且出乎意料的协同抗肿瘤效应。实例4到6证实共同施用麦胶蛋白肽和化学治疗剂提供有利的治疗效应。
实例7
如实例4中所述,维持并培养PANC-1人类胰腺癌细胞(ATCC)。使用α-麦胶蛋白肽p31-43和5-氟尿嘧啶(5-FU)(飞世尔科技公司,Pittsburgh,PA)处理细胞。将细胞(27代)以1x104个细胞/孔的密度接种于24-孔细胞培养板中并且让其粘着24小时。然后用媒剂(水)或渐增浓度的5-FU处理细胞72小时。所有实验进行一式三份。用0μM到400μM范围浓度的5-FU培养后,用胰蛋白酶使细胞脱离并且计数。表4显示用5-FU处理后的平均细胞数量和生长抑制百分比。
表4:5-FU在72小时处理后对PANC-1细胞的抗增殖影响
5-FU剂量(μM) | 平均细胞数量/mL | S.E. | 抑制% | p值 |
0(媒剂) | 317,600 | 7,738 | -- | -- |
6.25 | 116,500 | 2,342 | 63.3 | p<0.001 |
12.5 | 117,500 | 4,474 | 63.0 | p<0.001 |
25.0 | 118,200 | 4,288 | 62.8 | p<0.001 |
50.0 | 100,200 | 1,791 | 63.0 | p<0.001 |
100.0 | 117,600 | 2,006 | 68.5 | p<0.001 |
200.0 | 83,900 | 1,895 | 73.6 | p<0.001 |
400.0 | 66,200 | 1,935 | 79.2 | p<0.001 |
然后将细胞(30代)以5x103个细胞/孔的密度接种于24-孔细胞培养板中并且让其粘着24小时。用以下物质培养细胞:(1)媒剂(DMSO/水);(2)6.25μM5-FU;(3)70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43;(4)6.25μM5-FU和70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43(高组合);和(5)3.1μM5-FU和35μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43(低组合)。所有处理进行一式三份。对于使用α-麦胶蛋白肽p31-43和5-FU的组合疗法,对细胞同时施用这两种化合物。对各处理每72小时更新培养基。处理14天后,用胰蛋白酶处理细胞并且计数。表5显示处理后的平均细胞数量和生长抑制百分比。
表5:单独用5-FU或5-FU与α-麦胶蛋白肽p31-43组合在14天处理方案后对PANC-1细胞增殖的影响
为检验α-麦胶蛋白肽p31-43对接触5-FU较长时间(14天)的PANC-1细胞的影响,对来自前一实验的存活(亦即耐药性)细胞群(4%)进行实验。简言之,在处理的第14天计数活细胞后,以5,000个细胞/孔的密度再接种存活细胞。第二天,用媒剂或100μg/mL或200μg/mL的α-麦胶蛋白肽p31-43处理细胞。在第3天和第6天更新含有各自处理的培养基。在第7天,用胰蛋白酶处理细胞并且计数。表6显示用α-麦胶蛋白肽p31-43处理后的平均细胞数量和生长抑制百分比。
表6:α-麦胶蛋白肽p31-43对5-FU耐药性PANC-1细胞的存活细胞群的影响
剂量 | 细胞数量/mL | 抑制% |
对照 | 8200 | -- |
100μg/mL麦胶蛋白 | 3700 | 55% |
200μg/mL麦胶蛋白 | 1900 | 77% |
破坏DNA的化学治疗剂5-FU抑制PANC-1胰腺癌细胞的增殖。所述药物在以6.25μM处理14天后抑制PANC-1细胞生长达96%。与对照细胞相比,共同施用5-FU和麦胶蛋白肽达成明显生长抑制。表3和5中所示的结果显示:与单独施用任何一者相比,共同施用麦胶蛋白肽和化学治疗剂的治疗效力可受化学治疗剂的作用部位(细胞核或细胞质)影响。
令人惊讶地,单独单药疗法地施用麦胶蛋白肽可有效杀死先前用5-FU处理无法清除的癌细胞。5-FU处理后,总计4%初始群体的5-FU耐药性细胞存活群保持活力。当使从5-FU处理过的PANC-1细胞存活下来的细胞群接触α-麦胶蛋白肽p31-43(100μg/mL或200μg/mL)再达7天时,显著抑制细胞增殖。麦胶蛋白肽有效杀死对强效化学治疗剂(如5-FU)具耐药性的细胞的能力是令人惊讶和出乎意料的。
实例8
如实例4中所述,维持和培养A549细胞。使用α-麦胶蛋白肽p31-43和顺铂(Biovision,Milpitas,CA)处理细胞。将细胞(32代)以1x104个细胞/孔的密度接种于24-孔细胞培养板并且让其粘着24小时。然后用媒剂(0.9%氯化钠)或渐增浓度的顺铂培养72小时。所有实验进行一式三份。用0μM到6.6μM范围浓度的顺铂培养后,用胰蛋白酶使细胞脱离并且计数。表7显示用顺铂处理后的平均细胞数量和生长抑制百分比。
表7:顺铂在72小时处理后对A549细胞的抗增殖效应
顺铂剂量(μM) | 平均细胞数量/mL | S.E. | 抑制% | p值 |
0(媒剂) | 193,017 | 3792 | -- | -- |
0.103 | 166,883 | 3217 | 13.5 | p<0.001 |
0.207 | 150,917 | 2484 | 21.8 | p<0.001 |
0.413 | 111,917 | 2146 | 42.0 | p<0.001 |
0.825 | 48,400 | 3546 | 74.9 | p<0.001 |
1.650 | 16,117 | 1762 | 91.6 | p<0.001 |
3.300 | 10,033 | 452 | 94.8 | p<0.001 |
3.600 | 3,222 | 136 | 98.3 | p<0.001 |
然后将细胞(34代)以5x103个细胞/孔的密度接种于24-孔细胞培养板中并且让其粘着24小时。用以下物质培养细胞:(1)媒剂(DMSO/水);(2)3.3μM顺铂;(3)70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43;(4)3.3μM顺铂和70μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43(高组合);或(5)1.65μM顺铂和35μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43(低组合)。所有处理进行一式三份。对于使用α-麦胶蛋白肽p31-43和顺铂的组合疗法,对细胞同时施用这两种化合物。对各处理每72小时更新培养基。处理14天后,用胰蛋白酶处理细胞并且计数。表8显示处理后的平均细胞数量和生长抑制百分比。
表8:单独用顺铂或顺铂与α-麦胶蛋白肽p31-43组合在14天处理方案后对A549细胞增殖的影响
为检验α-麦胶蛋白肽p31-43对接触顺铂延长时间(14天)的A549细胞的影响,对来自前一实验的存活(亦即耐药性)细胞群(2%)进行第二实验。简言之,在处理的第14天计数活细胞后,以5,000个细胞/孔的密度再接种存活细胞。第二天,用媒剂或100μg/mL或200μg/mL的α-麦胶蛋白肽p31-43处理细胞。在第3天和第6天更新含有各自处理的培养基。在第7天,用胰蛋白酶处理细胞并且计数。表9显示用α-麦胶蛋白肽p31-43处理后的平均细胞数量和生长抑制百分比。
表9:α-麦胶蛋白肽p31-43对顺铂耐药性A549细胞的存活细胞群的影响
剂量 | 细胞数量/mL | 抑制% |
对照 | 2,600 | -- |
100μg/mL麦胶蛋白 | 1,300 | 50% |
200μg/mL麦胶蛋白 | 900 | 65% |
破坏DNA并且表征为烷化剂的化学治疗剂顺铂抑制A549肺癌细胞的增殖。顺铂在以3.3μM处理14天后抑制A549细胞增殖达98%。与对照细胞相比,共同施用顺铂和麦胶蛋白肽达成明显生长抑制。表3和8中所示的结果显示:与单独施用任何一者相比,共同施用麦胶蛋白肽和化学治疗剂的治疗效力可受化学治疗剂的作用部位(细胞核或细胞质)影响。
令人惊讶地,单独施用麦胶蛋白肽可有效杀死先前用顺铂处理无法清除的癌细胞。顺铂处理后,总计2%初始群体的顺铂耐药性细胞存活群保持活力。当使从顺铂处理过的A549细胞存活下来的细胞群接触α-麦胶蛋白肽p31-43(100μg/mL或200μg/mL)再达7天时,显著抑制细胞增殖。麦胶蛋白肽有效杀死对强效化学治疗剂(如顺铂)具耐药性的细胞的能力是令人惊讶和出乎意料的。
总体而言,实例7和8中的结果证实共同施用麦胶蛋白肽和化学治疗剂可有效地明显抑制癌细胞的生长。令人惊讶地,单独施用麦胶蛋白肽达成明显抑制用强效化学治疗剂进行延长处理后仍存活的癌细胞。麦胶蛋白肽有利地且有效地杀死大多数耐药性癌细胞(例如CSC)的令人惊讶和出乎意料的能力表明麦胶蛋白肽可用于单药疗法或组合疗法中来抑制肿瘤生长和预防癌症复发。因此,施用麦胶蛋白肽可有效降低或阻止癌症对化学治疗剂的耐药性。
实例9
评估α-麦胶蛋白肽p31-43在动物中的毒性。对五周龄或六周龄雌性BALB/c小鼠每天一次皮下施用媒剂(100μLDMSO/盐水)持续五天(组1)或每天一次皮下施用200μgα-麦胶蛋白肽p31-43的媒剂溶液持续五天(组2)。为制备麦胶蛋白溶液,将70μL无菌DMSO添加到1mgα-麦胶蛋白肽p31-43中并且涡旋以溶解所述肽。溶解肽后,添加430μL无菌0.9%氯化钠并且涡旋以产生α-麦胶蛋白肽p31-43的1000μg/500μL溶液。
使用每天体重测量和行为评定来评估毒性。α-麦胶蛋白肽p31-43与无处理相关死亡有关。在研究结束时,组1(n=5)的平均体重(±SE)为19.8±0.4克而组2(n=5)的平均体重(±SE)为20.0±0.3克。与对照小鼠相比,在α-麦胶蛋白肽p31-43处理过的动物中未观察到行为变化。因此,α-麦胶蛋白肽p31-43耐受10mg/kg/天的剂量水平而无明显毒性。
实例10
评定α-麦胶蛋白p31-43诱导癌细胞凋亡的能力。将A549细胞维持和培养在含有10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1%抗生素抗真菌溶液的RPMI1640培养基中。使细胞在5%CO2存在下在37℃下於培养箱中生长。单独用α-麦胶蛋白肽p31-43或与吉非替尼组合处理后,使用末端脱氧核苷酸基转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析测定诱导的细胞凋亡。
简言之,将A549细胞(1x105)接种于腔室载玻片(chamberslide)中并且让其粘着过夜。用以下物质培养细胞72小时:(1)媒剂对照;(2)1μM吉非替尼;(3)100μg/mL、200μg/mL或500μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43;(4)100μg/mL、200μg/mL或500μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和1μM吉非替尼。对于使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼的组合疗法,对细胞同时施用这两种化合物。72小时处理后,在室温下,用4%甲醛的PBS(pH7.4)溶液固定细胞25分钟,然后在PBS中清洗5分钟进行两次,在室温下於0.2%TritonX-100的PBS溶液中渗透5分钟,以及最后於PBS中清洗5分钟进行两次。使用DeadEndTM比色TUNEL系统(普洛麦格生物技术有限公司,Madison,WI)根据制造商说明书测量细胞凋亡。在分析结束时,在显微镜下计数并且观察细胞。对用α-麦胶蛋白和/或吉非替尼处理过的细胞观察凋亡细胞的染色,通过在代表性样本中计数染色细胞的数量来确定凋亡细胞的百分比。表10显示在各处理后凋亡的细胞百分比和对麦胶蛋白-和吉非替尼-处理过的细胞与对照细胞相比使用单因素ANOVA分析数据所测定的p值。
表10:单独用吉非替尼或吉非替尼与α-麦胶蛋白肽p31-43组合对诱导细胞凋亡的影响
与单独用媒剂或吉非替尼处理过的细胞相比,明显更高百分比的单独用α-麦胶蛋白肽p31-43处理过的细胞凋亡。另外,与单独用媒剂或吉非替尼处理过的细胞相比,明显更多细胞在进行使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼的组合疗法后凋亡。用于诱导细胞凋亡的最有效处理为500μg/mLα-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼的组合。总体而言,这些结果证实单独用α-麦胶蛋白肽或与吉非替尼组合为一种人类肺癌细胞凋亡的强效诱导剂。
实例11
使用A549人类肺癌异种移植模型,评估单独用吉非替尼或吉非替尼与α-麦胶蛋白肽p31-43组合的活性。将六周龄雌性裸小鼠(哈兰实验室,Indianapolis,IN)隔离3天并且每个笼子圈养5只小鼠,给予12小时明暗周期和50%相对湿度。将饮用水和食物随意提供给动物。所有动物圈养在无病原体条件下。在第4天,将5x106个A549细胞含在100μLRPMI1640培养基溶液中皮下注射至小鼠右侧腹中。接种后24小时开始,按照如下对动物每天一次给药,持续14天:组1-静脉内施用媒剂(2%DMS0的盐水溶液);组2-填喂施用150mg/kg吉非替尼;和组3-填喂施用150mg/kg吉非替尼和静脉施用200μgα-麦胶蛋白p31-43。对于使用α-麦胶蛋白肽p31-43和吉非替尼的组合疗法,对细胞同时施用这两种化合物。在14天处理期后,监测动物持续两周。一旦肿瘤形成可触摸的肿块时便开始进行肿瘤测量,并且每周测量两次。表11显示研究过程中处理组的平均体重。
表11:单独用吉非替尼或吉非替尼与α-麦胶蛋白肽p31-43组合对体重的影响
所有处理均耐受良好并且没有造成药物相关的死亡。注意到任一处理组没有明显体重损失。结束时的以克计的平均体重(±S.E.)为:组1=22.80±0.88;组2=22.50±0.44;和组3=22.92±0.44。表12显示研究过程中处理组的平均肿瘤体积。
表12:单独用吉非替尼或吉非替尼与α-麦胶蛋白肽p31-43组合对肿瘤体积的影响
在研究结束天(第28天),以立方毫米计的平均肿瘤体积(±S.E.)为:组1=402.86±95.4;组2=239.25±32.78;和组3=145.46±19374.。表13显示在研究过程中处理组的平均肿瘤体积。
表13:单独用吉非替尼或吉非替尼与α-麦胶蛋白肽p31-43组合对肿瘤体积的影响
平均肿瘤生长抑制百分比值,组2为40.6%而组3为63.9%。肿瘤增倍时间,组1为17.21天,组2为24.48天以及组3为22.89天。肿瘤生长抑制T/C比,组2为57.16而组3为44.06。
总体而言,这些结果证实使用吉非替尼和麦胶蛋白肽的组合疗法产生比单独用吉非替尼更优异的抗癌效应。所述组合疗法对动物耐受良好并且无毒性,但仍可有效减少肿瘤负荷。与对照动物相比,进行组合疗法后的平均肿瘤体积减少超过60%。与单独用吉非替尼治疗后的平均肿瘤体积相比,进行组合疗法后的平均肿瘤体积亦明显更小(约40%)。另外,所述组合疗法显示明显比单独用吉非替尼快得多的治疗效力,在一周内达成接近50%肿瘤生长抑制并且在停止治疗后维持大于60%生长抑制持续两周。
提供前述实例以进一步阐释本发明而不具限制性。这些数据证实麦胶蛋白肽为一种当单独使用时能够抑制衍生自各种不同癌症类型的耐药性癌细胞生长并且诱导其凋亡的有效抗癌剂。单独施用的麦胶蛋白肽出乎意料地可有效杀死甚至从强效化学治疗剂延长处理下存活的大多数耐药性癌细胞。对于多种化学治疗剂,显示共同施用麦胶蛋白肽和化学治疗剂明显抑制癌细胞生长。共同施用麦胶蛋白肽与RTKI导致比单独用麦胶蛋白肽或RTKI更大的治疗效力,并且令人惊讶地达成协同效应。尽管显示强效活体内抗肿瘤效应和显著降低肿瘤体积和生长的能力,但是施用麦胶蛋白肽不会引起总体毒性。
鉴于上述实例中描述的证据,单独或与化学治疗剂组合使用麦胶蛋白肽提供出乎意料和令人惊讶的有效抗癌疗法。
虽然已阐释和描述本发明的具体实施方案,但是相关领域技术人员将知晓可在不违背本发明精神和范围的情况下作出各种其它改变和修改。因此希望位于本发明范围内的所有此类改变和修改涵盖于权利要求书中。
Claims (54)
1.一种套件,其包含含有麦胶蛋白肽的药物组合物和用于对癌症患者施用治疗上有效量的所述肽的说明书。
2.根据权利要求1所述的套件,其进一步包含含有至少一种化学治疗剂的药物组合物和用于对癌症患者共同施用治疗上有效量的所述麦胶蛋白肽与化学治疗剂的说明书。
3.根据权利要求2所述的套件,其中所述至少一种化学治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。
4.根据任一前述权利要求所述的套件,其中所述麦胶蛋白肽为α-麦胶蛋白肽或其衍生物或片段。
5.根据权利要求4所述的套件,其中所述α-麦胶蛋白肽至少包含α-麦胶蛋白肽p31-43。
6.根据任一前述权利要求所述的套件,其中所述麦胶蛋白肽为选自由α-麦胶蛋白肽p31-55、p31-49、p31-43组成的群组的α-麦胶蛋白肽和其衍生物以及片段。
7.根据任一前述权利要求所述的套件,其中所述麦胶蛋白肽包含SEQIDNO:1或其衍生物或片段。
8.根据任一前述权利要求所述的套件,其中所述麦胶蛋白肽包含SEQIDNO:2。
9.根据权利要求3到8中任一权利要求所述的套件,其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
10.根据权利要求9所述的套件,其中所述EGFR抑制剂为吉非替尼。
11.根据权利要求9所述的套件,其中所述EGFR抑制剂为埃罗替尼。
12.一种治疗癌症的方法,其包括对癌症患者施用治疗上有效量的麦胶蛋白肽。
13.根据权利要求12所述的方法,其进一步包括共同施用治疗上有效量的至少一种化学治疗剂。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述至少一种化学治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。
15.根据权利要求12到14中任一权利要求所述的方法,其中所述麦胶蛋白肽为α-麦胶蛋白肽或其衍生物或片段。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述α-麦胶蛋白肽至少包含α-麦胶蛋白肽p31-43。
17.根据权利要求12到16中任一权利要求所述的方法,其中所述麦胶蛋白肽为选自由α-麦胶蛋白肽p31-55、p31-49、p31-43组成的群组的α-麦胶蛋白肽和其衍生物以及片段。
18.根据权利要求12到17中任一权利要求所述的方法,其中所述麦胶蛋白肽包含SEQIDNO:1或其衍生物或片段。
19.根据权利要求12到18中任一权利要求所述的方法,其中所述麦胶蛋白肽包含SEQIDNO:2。
20.根据权利要求14到19中任一权利要求所述的方法,其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述EGFR抑制剂为吉非替尼。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述EGFR抑制剂为埃罗替尼。
23.根据权利要求14到22中任一权利要求所述的方法,其中共同施用所述麦胶蛋白肽和受体酪氨酸激酶抑制剂可有效降低或防止所述癌症对所述酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。
24.根据权利要求12到23中任一权利要求所述的方法,其中所述患者为人类。
25.根据权利要求12到24中任一权利要求所述的方法,其中所述癌症为非小细胞肺癌。
26.根据权利要求12到25中任一权利要求所述的方法,其中所述患者不具有已知会增加对EGFR抑制剂敏感性的EGFR基因突变。
27.根据权利要求13所述的方法,其中共同施用所述麦胶蛋白肽和至少一种化学治疗剂可有效降低或防止所述癌症对所述化学治疗剂的耐药性。
28.根据权利要求13所述的方法,其中共同施用所述麦胶蛋白肽和至少一种化学治疗剂可有效增加所述化学治疗剂的效力。
29.根据权利要求27或28所述的方法,其中所述化学治疗剂是首先施用。
30.根据权利要求27到29中任一权利要求所述的方法,其中所述化学治疗剂是选自由以下各物组成的群组:阿札胞苷、硫唑嘌呤、贝伐单抗、伯莱霉素、卡培他滨、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、赫赛汀、伊达比星、双氯乙基甲胺、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、他氟泊苷、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、视黄酸、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和其组合。
31.一种包含麦胶蛋白肽的组合物,其用于治疗患者的癌症。
32.一种包含麦胶蛋白肽的组合物的用途,其用于制造用于治疗患者的癌症的药物。
33.根据权利要求31或32所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白肽是与至少一种化学治疗剂共同施用。
34.根据权利要求31到33中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述化学治疗剂是选自由以下各物组成的群组:阿札胞苷、硫唑嘌呤、贝伐单抗、伯莱霉素、卡培他滨、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、赫赛汀、伊达比星、双氯乙基甲胺、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、他氟泊苷、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、视黄酸、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、受体酪氨酸激酶抑制剂和其组合。
35.根据权利要求31到34中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述至少一种化学治疗剂为受体酪氨酸激酶抑制剂。
36.根据权利要求35所述的组合物或用途,其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
37.根据权利要求36所述的组合物或用途,其中所述EGFR抑制剂为吉非替尼。
38.根据权利要求36所述的组合物或用途,其中所述EGFR抑制剂为埃罗替尼。
39.根据权利要求31到38中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白肽为α-麦胶蛋白肽或其衍生物或片段。
40.根据权利要求39所述的组合物或用途,其中所述α-麦胶蛋白肽至少包含α-麦胶蛋白肽p31-43。
41.根据权利要求31到40中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白肽为选自由α-麦胶蛋白肽p31-55、α-麦胶蛋白肽p31-49、α-麦胶蛋白肽p31-43组成的群组和其衍生物以及片段。
42.根据权利要求31到41中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白肽包含SEQIDNO:1或其衍生物或片段。
43.根据权利要求31到42中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白肽包含SEQIDNO:2。
44.根据权利要求33到43中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述组合物和至少一种化学治疗剂以使得共同施用可有效降低或防止所述癌症对所述化学治疗剂的耐药性的量共同施用。
45.根据权利要求33到44中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述组合物和至少一种化学治疗剂以使得共同施用可有效提高所述化学治疗剂的效力的量共同施用。
46.根据权利要求33到45中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述化学治疗剂是在包含所述麦胶蛋白肽的组合物前施用。
47.根据权利要求31到46中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述患者为人类。
48.根据权利要求31到47中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述癌症为非小细胞肺癌。
49.根据权利要求31到48中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述患者不具有已知会增加对EGFR抑制剂敏感性的EGFR基因突变。
50.根据权利要求31到49中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述患者未罹患乳糜泻。
51.根据权利要求31或32所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白是作为单药疗法施用。
52.根据权利要求51所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白是在使用化学治疗剂治疗前作为单药疗法施用。
53.根据权利要求51所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白是在使用化学治疗剂治疗后作为单药疗法施用。
54.根据权利要求51到53中任一权利要求所述的组合物或用途,其中所述麦胶蛋白是在使用化学治疗剂治疗前后作为单药疗法施用。
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