KR102230514B1 - 글리아딘 펩타이드를 사용한 암 치료용 키트 및 방법 - Google Patents

글리아딘 펩타이드를 사용한 암 치료용 키트 및 방법 Download PDF

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Abstract

글리아딘 펩타이드를 환자에게 투여함을 포함하는 암을 치료하기 위한 키트 및 방법이 본원에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 키트는 글리아딘 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 펩타이드를 환자에게 투여하기 위한 지침서를 포함한다. 상기 키트는 수용체 티로신 키나제 억제제와 같은 하나 이상의 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 화합물을 동시 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 암을 치료하기 위한 방법은 글리아딘 펩타이드를 환자에게 투여함을 포함하고 수용체 티로신 키나제 억제제와 같은 하나 이상의 화학요법제를 동시 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 글리아딘 펩타이드 및 수용체 티로신 키나제 억제제의 암 환자에게로의 동시 투여는 수용체 티로신 키나제 억제제에 대한 암의 내성을 감소시키거나 예방하기 위해 효과적이다.

Description

글리아딘 펩타이드를 사용한 암 치료용 키트 및 방법{KITS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER USING GLIADIN PEPTIDES}
본 출원은 별도의 개시 부분으로서 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 컴퓨터 판독 형태의 서열 목록(파일명: 47321A_SeqListing.txt; 크기: 795 바이트; 작성: 2014년 3월 4일)을 포함한다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2013년 3월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/774,285호의 우선권을 주장하며, 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 글리아딘 펩타이드를 포함하는 암 치료용 키트 및 글리아딘 펩타이드를 환자에게 투여함을 포함하는 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 글리아딘 펩타이드는 화학요법제(들)의 항암 효과를 증가시키기 위해 수용체 티로신 키나제 억제제와 같은 하나 이상의 화학요법제와 동시 투여될 수 있다.
전세계 수백만 사람들이 해마다 암으로 사망하고 있고 지금까지도 개선된 치료학적 옵션에 대한 필요성이 존재한다. 다수의 화학요법제가 다양한 형태의 질환에 대항하기 위한 노력으로 개발되었다. 화학요법제 부류의 예는 알킬화제, 항생제, 항대사물, 분화제(differentiating agent), 유사분열 억제제, 스테로이드, 토포이소머라제 억제제 및 티로신 키나제 억제제(TKI)를 포함한다. TKI는 단백질의 인산화를 차단하여 종양 발병 및 진행을 지지히는 시그날 전달 경로의 활성화를 억제한다. 수용체 티로신 키나제 억제제(RTKI)는 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR), 혈소판-유래된 성장 인자 수용체(PDGFR) 및 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)과 같은 수용체 티로신 키나제(RTK)의 활성을 특이적으로 표적화하는 TKI이다. 그러나, RTKI 및 다른 화학치료약물의 효과는 흔히 암 세포의 항암제에 대한 고유 내성 또는 후천적 내성에 의해 방해된다.
화학치료요법에 대한 종양의 내성에 기여하는 한가지 인자는 암 세포 집단내 암 줄기 세포(CSC)의 존재이다. CSC는 작은 서브세트(전형적으로 10% 미만)의 암 세포를 구성하는 미분화된 세포이다. CSC는 그래서 이들이 배아 줄기 세포의 일부 특성을 갖고 있고 다양한 암 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에 붙여진 이름이다. 따라서, CSC는 발암성이고 암 재발 및 전이를 유도할 수 있다. 많은 화학치료학적 약물은 분화된 암 세포를 사멸시키지만 CSC를 효과적으로 제거하는데 실패하여, 이들 세포들을 증식하고 존속하게 허용하면서, 박멸에 대한 종양의 전체 내성을 야기한다.
암 치료용으로 승인된 2개의 RTKI는 에를로티니브(erlotinib) (Tarceva®, OSI Pharmaceuticals) 및 게피니티브(gefitinib) (Iressa®, AstraZeneca)이다. 약물 둘다는 EGFR을 표적화하고 이를 억제한다. 상피 성장 인자(EGF) 또는 또 다른 리간드의 수용체로의 결합 후 EGFR의 활성화는 수용체의 세포내 도메인에 위치한 티로신 잔기의 ATP-구동된 인산화를 유도한다. 인산화된 티로신은 이어서 다른 세포내 단백질과 상호작용하고 시그날 전달 경로를 활성화하여 세포 생존 및 증식을 촉진시킨다. EGFR의 증가된 활성화는 다양한 암유형, 특히 상피 세포로부터 유래된 종양과 연관된다. 수용체 활성의 증가는 EGFR의 키나제 도메인내 돌연변이, EGFR 유전자 발현의 증폭 또는 EGFR 단백질의 과발현으로부터 비롯될 수 있다(문헌참조: Yauch et al., Clinical Cancer Research. 2005;11(24):8686-98). 다른 RTKI 뿐만 아니라 에를로티니브 및 게피티니브는 RTK의 ATP 결합 도메인을 방해하여 수용체 활성화를 억제하고 다운스트림 시그날 전달을 차단한다.
에를로티니브 및 게피티니브는 비-소 세포 폐암(NSCLC)에 사용하기 위해 승인된 제1 RTKI이다. 폐암은 전세계 암 사망의 주요 원인이고 폐암 환자들의 약 85 내지 90%는 NSCLC를 갖는다(문헌참조: Gottschling et al. Lung Cancer. 2012; 77(1): 183-91). NSCLC를 치료하는데 있어서 에를로티니브 및 게피티니브의 효과는 제한되었고 대부분의 환자들은 치료 개시 후 질환 진행을 나타낸다(문헌참조: Witta et al., Cancer Research. 2006; 66(2):944-950). 특정 EGFR 돌연변이를 갖는 환자들은 야생형 EGFR을 갖는 환자들 보다 RTKI를 사용한 치료에 보다 잘 반응하는 것으로 밝혀졌다. EGFR 돌연변이를 갖는 대략적으로 70 내지 80%의 NSCLC 환자들은 RTKI 치료제에 민감하지만 실제로 모든 환자들은 결국 내성을 획득한다(문헌참조: Suda et al. Journal of Thoracic Oncology. 2011; 6(7): 1152-61). 추가로, 돌연변이의 출현율은 비교적 드물고 20% 미만의 환자들에서 나타난다(문헌참조: Yauch 2005, supra). 전체적으로, 백인 NSCLC 환자들의 약 10%만이 에를로티니브 또는 게피티니브를 사용한 치료 후 질환 진행에서 상당한 변화를 나타내고(문헌참조: Gottschling 2012, supra), 개선된 치료학적 방법의 필요성을 강조한다.
글리아딘은 밀 및 관련 곡물에서 발견되는 단백질이고 글루텐의 주요 성분들 중 하나이다. 4개 주요 유형의 글리아딘은 알파, 베타, 감마 및 오메가이다. 글리아딘은 T-세포 면역력 또는 세포독성을 유발하는 펩타이드들을 포함하는 다수의 활성 펩타이드들로 분해될 수 있다. 글리아딘은 식이 글루텐과 관련된 만성 염증 병태인 셀리악 병에서의 이의 역할에 대해 광범위하게 연구되었지만 단독으로 또는 통상의 화학요법제와 병용되는 항암제로서의 용도에 대해서는 기재되거나 시사된바 없다. 실제로, 암 세포를 포함하는 다양한 세포 유형에 대해 글리아딘 펩타이드를 사용하는 치료는 EGFR 경로를 활성화시켜 세포 증식을 유도하는 것으로 입증되었고(문헌참조: Barone et al. Gut. 2007;56(4):480-488), 이는 글리아딘 투여가 암 치료용으로는 사용되지 말아야함을 강하게 시사한다.
발명의 요약
본 발명은 글리아딘 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물, 및 상기 펩타이드의 치료학적 유효량을 암 환자에게 투여하기 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 하나 이상의 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제(들)의 치료학적 유효량을 암 환자에게 동시 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 글리아딘 펩타이드를 암 환자에게 투여함을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 치료학적 유효량의 하나 이상의 화학요법제를 암 환자에게 동시 투여함을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 글리아딘 펩타이드는 알파-글리아딘 펩타이드일 수 있다. 적합한 알파-글리아딘 펩타이드의 예는 적어도 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 예를 들어, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49 및 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55를 포함한다. 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 화학요법제는 RTKI이다. 본 발명에 따른 RTKI는 EGFR 억제제일 수 있다. 적합한 EGFR 억제제의 예는 게피티니브 및 에를로티니브를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 글리아딘 펩타이드 및 RTKI의 암 환자에게로의 동시 투여는 RTKI에 대한 암의 내성을 감소시키거나 예방하기 위해 효과적이다.
본 발명은 글리아딘 펩타이드를 환자에게 투여함을 포함하는 암을 치료하기 위한 키트 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 글리아딘 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하고 상기 펩타이드의 치료학적 유효량을 암 환자에게 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 RTKI와 같은 하나 이상의 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제(들)의 치료학적 유효량을 암 환자에게 동시 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 암을 치료하기 위한 방법은 치료학적 유효량의 글리아딘 펩타이드를 암 환자에게 투여함을 포함한다. 상기 방법은 RTKI와 같은 치료학적 유효량의 하나 이상의 화학요법제를 암 환자에게 동시 투여함을 추가로 포함할 수 있다.
글리아딘 펩타이드는 알파, 베타, 감마 또는 오메가 글리아딘 펩타이드일 수 있다. 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 글리아딘 펩타이드는 알파-글리아딘 펩타이드 또는 이의 유도체 또는 단편이다. 적합한 알파-글리아딘 펩타이드의 예는 적어도 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 예를 들어, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 및 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 알파-글리아딘 펩타이드는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 또는 이의 유도체 또는 단편이다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43은 아미노산 서열 LGQQQPFPPQQPY (서열번호 1)을 갖고 흔히 이것은 선천적 염증 면역 반응을 유도하고 장 손상을 유발하기 때문에 "독성" 글리아딘 펩타이드로서 언급된다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43을 사용한 암 세포의 치료는 세포 증식을 유도하여(문헌참조: Barone et al. PLoS ONE. 2010; 5(8):el2246), 상기 펩타이드는 약제학적 조성물 중에 훨씬 적게 포함되어, 종양을 치료하는데 사용하거나 종양을 치료하기 위한 키트에 사용하기 위해 보고되지 않았다. 본 발명에 따른 글리아딘 펩타이드는 글리아딘 단백질의 효소적 분해 후 수득될 수 있거나 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 글리아딘 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제(들)과 함께 상기 펩타이드를 포함한다. 글리아딘을 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하기 위해 적합한 투여 경로는 경구, 근육내, 정맥내, 호흡/흡입 및 피하를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 글리아딘 펩타이드는 하나 이상의 화학요법제와 함께 암 환자에게 동시 투여될 수 있다. 글리아딘 펩타이드와 동시 투여될 수 있는 화학요법제의 예는 알킬화제, 항생제, 항대사물, 분화제, 유사분열 억제제, 스테로이드, 토포이소머라제 억제제, TKI(예를 들어, RTKI) 및 이의 병용제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양상에서, 글리아딘 펩타이드는 하나 이상의 RTKI와 동시 투여될 수 있다. RTKI의 예는 아파티니브, 악시티니브, 카네르티니브, 세디라니브, 에를로티니브, 게피티니브, 그란디닌, 이마티니브, 라파티니브, 레플루노미드, 레스타우르티니브, 네라티니브, 파조파니브, 퀴자르티니브, 레고라페니브, 세막사니브, 소라페니브, 수니티브, 수텐트, 티보자니브, 토세라비브, 반데타니브, 바탈라니브, 특이적 RTK에 결합하는 모노클로날 항체, 및 이의 병용물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 바람직한 RTKI는 EGFR의 억제제이다. EGFR 억제제의 예는 게피티니브 및 에를로티니브를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 실시형태에서, 암 환자에게 글리아딘 펩타이드와 RTKI의 동시 투여는 RTKI에 대한 암의 내성을 감소시키거나 예방하기 위해 효과적이다.
본원에 기재된 키트 및 방법은 사람 암 환자 또는 임의의 다른 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 신장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 피부암 및 갑상선암을 포함하는 많은 유형의 암을 치료하기 위해 유용하다. 본 발명은 특히 암의 진행이 세포내 접착에서의 변화에 의존하는 암을 치료하기 위해 효과적이다. 하나의 양상에서, 본 발명은 NSCLC를 포함하는 폐암을 치료하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 하기의 정의는 본 발명을 이해하기 위해 당업자를 도와주는데 유용할 수 있다:
상기 용어 "치료학적 유효량"은 환자의 상태 및 투여되는 특정 화합물에 의존한다. 상기 용어는 목적하는 임상 효과를 달성하는데 효과적인 양을 언급한다. 일부 실시형태에서, 치료학적 유효량은 암 세포의 성장을 억제하거나, 전이를 예방하거나 세포사를 유도하기에 효과적인 양이다. 공지된 화학요법제의 치료학적 유효량은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, RTKI의 치료학적 유효량은 약물에 따라, 일반적으로 약 5 mg/kg/day 내지 약 150 mg/kg/day, 약 10 mg/kg/day 내지 약 100 mg/kg/day, 및/또는 약 25 mg/kg/day 내지 약 75 mg/kg/day이다. 글리아딘 펩타이드에 대해, 치료학적 유효량은 약 5㎍/mL 내지 약 200㎍/mL, 약 10㎍/mL 내지 약 100㎍/mL, 및/또는 약 15㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 예를 들어, 약 20㎍/mL의 혈장 농도를 달성하기에 필요한 용량이다. 본 발명의 개시내용에 따라 사용하기 위한 용량 및 투여 횟수는 투여 경로, 치료될 질환의 특성 및 중증도 및 환자의 크기 및 일반적 상태와 같은 인자들에 따라 다양할 수 있다. 적합한 용량은 당업계에 공지된 과정, 예를 들어, 용량 증가 시험을 포함할 수 있는 임상 시험 및 본원에 기재된 프로토콜에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 임상의는 용량을 적정하고 투여 경로를 변형시켜 최적으로 치료학적 효과를 수득한다. 순수하게 설명을 목적으로, 치료학적 유효량을 달성하기 위해 필요한 글리아딘 펩타이드의 용량은 상기 언급된 인자들에 의존하여, 약 100㎍/kg/일 내지 약 100mg/kg/day, 약 200㎍/kg/일 내지 약 75mg/kg/day, 약 500㎍/kg/일 내지 약 50mg/kg/day, 약 750㎍/kg/일 내지 약 25mg/kg/day, 및/또는 약 1mg/kg/day 내지 약 15 mg/kg/day의 범위이다. 일부 병태는 지속적인 치료를 필요로 하고 이것은 다중 투여시 보다 낮은 용량으로 투여함을 필요로 할 수 있거나 아닐 수 있다. 경우에 따라, 용량은 하루 전반에 걸쳐 적당한 간격으로 별도로 투여되는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 분할-용량(sub-dose)으로서 투여된다. 상기 치료 기간은 특정 병태에 따라 다양할 것이고 1일 내지 수일, 수주, 수개월 또는 수년 지속할 수 있다.
용어 "단독치료요법"은 글리아딘 펩타이드가 암 세포 및 종양에 대한 이의 약리학적 효과가 화학요법제의 약리학적 효과와 중첩되지 않도록 하는 방식으로 투여됨을 의미한다. 단독치료요법 동안에, 글리아딘 펩타이드는 필연적으로 단독으로 투여된다. 글리아딘 펩타이드 단독치료요법은 화학요법제가 글리아딘 펩타이드가 투여되는 시점에 더 이상 치료학적으로 효과적이지 못한 이상 화학요법제를 사용한 치료 전, 후 또는 전후에 수행할 수 있다.
용어 "동시-투여하는" 및 "병용 치료요법"은 글리아딘 펩타이드 및 하나 이상의 화학요법제가 중첩 시간 기간동안에 모든 화합물이 약리학적 효과를 나타내도록 허용하는 방식으로 투여됨을 의미한다. 상기 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제(들)은 동일한 약제학적 조성물로 또는 별도의 조성물로 투여될 수 있고 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제(들)은 화합물 둘다가 중첩 시간 기간동안에 약리학적 효과를 나타내는 한, 동일한 시점에 또는 상이한 시점에 동시 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 둘다 약 2, 4, 6, 8, 12, 24, 또는 48 시간의 시간 간격내에서 환자에게 투여될 수 있다. 글리아딘 펩타이드 또는 화학요법제(들)이 먼저 투여될 수 있다. 제1 화합물의 치료학적 유효 농도가 잔류하는 동안에 후속적 화합물이 투여되는 한, 상기 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제(들)은 본 발명의 교시에 따라 동시 투여되는 것으로 고려된다.
용어 "화학요법제"는 암 세포와 관련하여 독성인 임의의 화합물을 의미한다. 화학요법제는 소분자, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 및 이의 병용물일 수 있다. 예시적인 부류의 화학요법제들이 상기 제공된다. 화학요법제들의 특정 예는 아자시티딘, 악사티오프린, 베바시주맙, 블레오마이신, 카페시타빈, 카보플라틴, 클로라부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 플루오로우라실, 겜시타빈, 헤르셉틴, 이다루비신, 메클로레타민, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 타플루포시드, 테니포시드, 티오구아닌, 레티노산, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 상기 열거된 특정 예시적인 RTKI, 및 이의 병용물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 화학요법제의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다.
상기 용어 "수용체 티로신 키나제 억제제" 또는 "RTKI"는 수용체 티로신 키나제(RTK) 계열의 단백질의 구성원의 활성을 억제할 수 있는 임의의 화합물을 의미한다. RTKI는 소분자, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산 및 이의 병용물일 수 있다. RTKI에 대한 단백질 표적의 예는 하기의 RTK 계열의 구성원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 에프린 수용체, 상피 성장 인자 수용체, 섬유아세포 성장 인자 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 수용체, 뉴트로핀 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 및 혈관 내피 성장 인자 수용체. 특이 예시적인 RTKI는 상기 열거되어 있다.
상기 용어 "유도체 또는 단편"은 글리오딘 펩타이드와 유사한 구조 및 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 의미한다. 유도체 또는 단편은 글리아딘 펩타이드와 적어도 70%, 80% 또는 90%의 아미노산 서열 상동성을 공유한다. 다양한 실시형태에서, 유도체 또는 단편은 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43와 70%, 80% 또는 90%의 아미노산 서열 상동성을 공유한다. 유도체 또는 단편은 화학적으로 변형된 글리아딘 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 유도체 또는 단편은 펩타이드의 안정성, 막 침투 또는 면역원성을 개선시키기 위해 화학적으로 변형된 글리아딘 펩타이드일 수 있다. 글리아딘 펩타이드의 유도체 및 단편을 형성하기 위해 사용될 수 있는 화학적 변형의 예는 중합체 접합, 지질화, 아미노산 유사체의 사용, 당화 및 양이온화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양상에서, 글리아딘 펩타이드의 적합한 유도체 또는 단편은 적어도 아미노산 서열 PPQQPY (서열번호 2)를 포함한다.
유리하게, 글리아딘 펩타이드와, RTKI와 같은 하나 이상의 화학요법제를 환자에게 동시 투여하는 것은 화학요법제(들)에 대한 암 세포의 내성을 감소시키거나 예방하는데 효과적이다. 따라서, 글리아딘 펩타이드와 하나 이상의 화학요법제의 동시 투여는 화학요법제(들)의 효능을 증가시키고 연장한다. 단일 이론으로 국한되도록 하지 않으면서, 단독으로 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 화학요법제와 병용하여 글리아딘 펩타이드를 투여함으로부터 달성되는 항암 효과가 카고(cargo)의 세포내 수송에 대한 글리아딘 펩타이드의 영향에 기인할 수 있는 것으로 사료된다.
단백질 및 다른 분자들은 세포내이입 경로의 일부로서 엔도좀으로서 공지된 소포내 세포의 세포질 격실내에 트래픽킹(trafficking)한다. 초기 엔도좀은 혈장막으로부터 내재화된 분자를 수용하는 소포이다. 초기 엔도좀은 또한 다세포체(MVB)로서 공지된 후기 엔도좀으로 성숙한다. 후기 엔도좀/MVB는 결국 리소좀과 융합하여 내재화된 카고의 효소적 분해를 유도한다. 리소좀 분해에 대한 또 다른 경우로서, 일부 분자들은 재순환 엔도좀으로 분류되고 혈장막 또는 다른 세포내 부위로 트래픽킹하여 복귀한다. 글리아딘 펩타이드, 특히 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43은 초기 엔도좀의 후기 엔도좀으로의 성숙화를 지연시킴에 의해 세포내이입 경로를 방해하는 것으로 나타났다(문헌참조: Barone 2010, supra). 따라서, 글리아딘 펩타이드는 세포질 격실내 엔도좀내에 트래픽킹된 단백질, 화학요법제 및 다른 분자들의 분해를 방해한다. 세포내 분자들의 분해를 방지함에 의해, 글리아딘 펩타이드들은 화학요법제들의 항암 활성을 증진시킬 수 있다.
수송을 위해 요구되는 엔도좀 복합체 (ESCRT)인 단백질 복합체(ESCRT-0, ESCRT- 1, ESCRT-2, 및 ESCRT-3)은 리소좀내 궁극적 분해를 위한 카고의 MVB로의 분류를 조절한다. 간세포 성장 인자 조절된 티로신 키나제 기질(HRS)인, ESCRT-0의 성분은 초기 및 후기 엔도좀에서 분자의 트래픽킹을 조절한다(문헌참조: Henne et al. Developmental Cell. 2011; 21(1):77-91; Barone 2010, supra). 카복실 말단에 위치한 HRS의 아미노산 719-731은 HRS의 엔도좀 막으로 위치시키는데 필요한 결합 도메인을 함유한다(문헌참조: Barone 2010, supra). HRS 아미노산 719-731 (PSQDASLPPQQPY; 서열번호 3)의 서열은 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 펩타이드와 매우 유사하다. 13개 잔기 중에서, 6개의 연속 아미노산(PPQQPY; 서열번호 2)을 포함하는 7개는 동일하고 2개는 서열간에 유사하고 단지 상당한 차이는 HRS 719-731에서는 프롤린인데 비해 알파-글라이딘 펩타이드 p31-43에서는 N-말단 류신이라는 것이다(문헌참조: Barone 2010, supra). 따라서, 적어도 알파-글리아딘 p31-43, 예를 들어, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49 및 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55를 포함하는 알파-글리아딘 펩타이드는 HRS 결합과 경쟁할 수 있음에 따라 엔도좀 막내에 HRS가 위치하는 것을 방해한다(문헌참조: Barone 2010, supra). 결과로서, 세포가 알파-글라이딘 펩타이드 p31-43으로 처리된 후, 세포질 내 HRS의 양은 증가하는 반면 막-연합된 HRS는 감소한다(문헌참조: Barone 2010, supra). 엔도좀 막내 HRS의 감소된 존재는 세포내 카고의 정상적인 트래픽킹을 분쇄하여 세포내 분자의 손상된 분해를 유도한다. 그렇지 않으면 세포로부터 통상적으로 제거될 독성 분자를 포함하는 카고의 보유를 촉진시킴에 의해, 환자로의 글리아딘 펩타이드의 투여는 세포 생존력을 감소시킬 수 있고, 이는 암 치료용 펩타이드로서의 용도를 지지한다.
추가의 치료학적 제제 없이 암을 치료하는데 사용하기 위한 이들의 잠재력 뿐만 아니라, 글리아딘 펩타이드는 또한 세포내이입 경로에 대한 상기 펩타이드의 영향이 화학요법제 및 이들의 표적의 트래픽킹에 영향을 줄 수 있기 때문에 하나 이상의 화학요법제와 병용하여 사용하기 위한 전망을 보여준다. 엔도좀 막과 연합된 결합 부위에 대한 HRS과의 경쟁에서 압도한 후, 적어도 알파-글리아딘 p31-43, 예를 들어, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드p31-49 및 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55를 포함하는 알파-글리아딘 펩타이드는 엔도좀에 위치한다. 적어도 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43을 포함하는 알파-글리아딘 펩타이드를 운반하는 소포는 정상적인 소포 보다 더 느리게 이동한다(문헌참조: Barone 2010, supra). 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43에 의해 유도된 세포내 수송의 지연은 소포내 카고에 의해 영향받지 않아 화학요법제를 포함하는 세포내로 트래픽킹된 모든 분자는 잠재적으로 영향받는다(문헌참조: Barone 2010, supra). 카고의 지연된 세포질 이동은 화학요법제가 축적할 수 있는 시간을 연장시켜 약물의 세포내 보다 높은 농도 및 증가된 세포 독성을 유도한다. 세포내 약물의 연장된 존재는 또한 약물이 세포내에서 장기간동안 이의 약리학적 효과를 나타내도록 하여 약물의 효능을 증진시킨다. 따라서, 글리아딘 펩타이드와 하나 이상의 화학요법제의 동시 투여는 다양한 작용 기작을 갖는 광범위한 항암 약물의 활성을 강화시킬 수 있다.
세포내이입 경로에 대한 글리아딘 펩타이드의 효과는 또한 세포 표현형에 영향을 미침에 의해 항암 치료학적 효과를 나타낼 수 있다. 상피 및 간엽은 2개의 주요 부류의 세포 표현형이다. 상피 세포는 이웃하는 세포들 사이에 접착을 유지시키는 다수의 세포 접합부와 고도로 조직화되어 있다. 대조적으로, 간엽 세포는 조직화되어 있지 않고 강한 세포간 접합부가 없어 이는 이들의 이동 잠재력을 증가시킨다. 간엽 전이(MT)로서 공지된 공정 동안에, 상피 세포 및 비-상피 세포는 간엽 세포로 분화한다. 전이는 세포-세포 접착의 상실 및 증가된 세포 이동성을 유도하고 세포사멸에 대한 내성을 증가시켜 종양의 침투, 즉, 전이를 촉진시킨다. MT 동안에, e-캐드헤린과 같은 세포 접착 단백질의 발현을 감소시키고 비멘틴 및 피브로넥틴과 같은 간엽 마커의 발현을 증가시킨다.
e-캐드헤린의 낮은 발현은 다수의 암 유형의 진행과 연관되어 있다(문헌참조: Rao et al. Cell Biol. Int. 2011; 35(9):945-51; Yilmaz et al. Molecular Cancer Research. 2010; l;8(5):629-42). 글리아딘 펩타이드의 투여는 e-캐드헤드린 분해를 손상시키고 접착 단백질의 혈장 막으로의 복귀를 촉진시켜 세포 대 세포 접착을 유지시킴에 의해 간엽 표현형을 예방할 수 있다. e-캐드헤린 체류에 대한 글리아딘의 효과는, e-캐드헤린의 상실로 세포 접착에서의 변화가 장 세포의 수직 성장을 촉진시키기 위해 필요하기 때문에 혈장 글리아딘의 존재가 비처리된 셀리악 환자에서 감소된 장세포 높이 및 융모 위축을 유도하는 이유를 설명할 수 있다(문헌참조: Barone 2010, supra). 추가로, HRS와 ESCRT 복합체를 방해함에 의해 글리아딘 펩타이드는 세포를 세포외 매트릭스와 연결시키는 중심 접착의 분해를 예방할 수 있다(문헌참조: Tu et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010;107(37): 16107-12). 상기 온전한 중심 접착은 또한 비-간엽 표현형을 유지시키고 간엽 상태로의 전이를 억제하는 것을 도와준다. 본 발명에 따른 글리아딘 펩타이드의 투여는 MT를 차단하고 세포 성장 및 세포 이동(및 따라서 암 세포의 전이)을 막을 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 치료는 광범위한 암 유형을 효과적으로 제어할 수 잇다.
MT에 대한 글리아딘 펩타이드의 효과는 또한 동시 투여된 화학요법제의 효능을 증가시킬 수 있다. 종양 전이는 암 치료를 복잡하게 하고 환자 사망의 주요 기여 인자이다. 간엽 표현형은 약물 민감성을 예측하는 것으로 확인되었고, 간엽 마커의 발현은 화학치료요법에 대한 불량한 반응을 신호하는 것이다(문헌참조: Yauch 2005, supra; Buck et al. Molecular Cancer Therapeutics. 2007;6(2):532-41; Frederick et al. Molecular Cancer Therapeutics. 2007;6(6): 1683-1691). E-캐드헤린 발현은 실질적으로 내성 암 세포주에서는 부재이고, e-캐드헤린 발현의 복구는 약물 민감성을 증가시켜 치료 후 세포 성장 억제 및 세포사멸을 유도할 수 있다(문헌참조: Witta 2006, supra). e-캐드헤린 및 비-간엽 표현형의 보유를 촉진시키기 위한 글리아딘 펩타이드의 투여는 따라서 동시 투여된 화학요법제에 대한 암 세포의 반응을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 간엽 표현형은 보다 낮은 양의 e-캐드헤린과 관련되고 NSCLC내 EGFR-특이적 RTKI에 대한 고유 및 후천적 내성 둘다와 관련된다(문헌참조: Suda 2011, supra). 비-간엽 세포는 세포 생존 및 증식을 위해 EGFR-매개된 경로에 의존하지만, 간엽 상태에서는 EGFR 시그날 전달이 감소되고 세포는 세포 생존 및 증식을 위해 EFGF-독립적 기작에 의존하는 것으로 사료된다(문헌참조: Thomson et al. Clin. Exp. Metastasis. 2008;25(8):843-54). 따라서, e-캐드헤린을 유지하고 간엽 상태로의 전이를 차단하기 위한 글리아딘 펩타이드의 용도는 약물 내성을 감소시키고 게피니티브 또는 에를로티니브와 같은 EGFR-특이적 RTKI의 세포독성 효과에 대한 암 세포의 민감성을 연장시킨다. 글리아딘 펩타이드의 동시 투여는 또한 다른 부류의 화학요법제와 상승작용하여 암을 치료하기 위한 병용 치료요법에 대한 개선된 옵션을 야기하는 것으로 예상된다.
단독 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 화학요법제와 병용되는 글리아딘 펩타이드를 투여하여 달성되는 항암 효과는 또한 미분화된 세포에 대한 글리아딘 펩타이드의 예상치 않은 유리한 효과에 기인할 수 있다. 글리아딘 펩타이드는 놀랍게도 다른 화학요법제에 내성인 CSC를 사멸시키는데 효과적이고 이들이 단독으로 사용되는 경우, 즉 단독치료요법으로서 상기 제제가 효과적인 항암 제제가 되게 한다. 예를 들어, 글리아딘 펩타이드는 초기(제1 선) 치료요법, 즉, 다른 항암 치료요법 (예를 들어, 화학요법제, 방사선 및/또는 수술)이 시도되기 전에 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 글리아딘 펩타이드는 더 이상 치료학적으로 효과적이지 않은 항암 치료요법 후 후속 (예를 들어, 제2 선 또는 제3 선) 치료요법으로서 투여될 수 있다.
화학요법제와 동시 투여된 글리아딘과 비교하여 단독치료요법으로서 단독으로 투여되는 글리아딘 펩타이드의 치료학적 효과는 화학요법제의 작용 기작에 의해 영향받을 수 있다. 특히, 주요 작용 부위가 핵내에 있는 화학요법제, 예를 들어, 알킬화제, 항생제, 토포이소머라제 억제제 및 DNA를 손상시키는 다른 제제를 사용한 치료 후 글리아딘 펩타이드의 단독치료요법 투여는 놀랍게도 특히, 2개 화합물의 동시 투여와 상대적으로 화학요법제를 사용한 치료로부터 생존하는 내성 암 세포를 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 상기 화학요법제에 대하여, 글리아딘 펩타이드를 사용한 단독치료요법이 화학요법제의 핵으로 위치하는데 있어서의 방해를 차단할 수 있는 것으로 이론화되었다(반면, 동시 투여는 상기 방해를 촉진시켜 능히 화학요법제의 치료학적 효과를 약화시킬 수 있는 것으로 이론화되어 있다). 이의 주요 작용 부위가 핵 외부에 있는 화학요법제, 예를 들어, 분화제, 유사분열 억제제, 스테로이드 및 TKI에 대하여, 글리아딘 펩타이드와 상기 화학요법제의 동시 투여는 놀랍게도 암 세포 성장을 억제하는데 효과적이고 놀랍게도 단독의 글리아딘 펩타이드 또는 화학요법제의 단독치료요법 보다 큰 공동상승 작용 치료학적 효능을 달성할 수 있다. 하나 이상의 화학치료제를 사용한 치료 전 및/또는 후 (예를 들어, 상기 화합물이 중첩 시간 기간동안에 약리학적 효과를 나타내지 않는 경우의 단독치료요법) 또는 하나 이상의 화학치료제의 투여 동안에 (즉, 화합물이 중첩 시간 기간동안에 약리학적 효과를 나타내는 경우의 동시 투여) 글리아딘 펩타이드의 투여는 따라서 CSC의 수를 감소시키고 암 재발 및 전이를 예방하는데 효과적이다.
동시 투여된 화학요법제를 증가시키는 글리아딘 펩타이드의 능력은 또한 부분적으로 미분화된 표현형을 유지시키기 위해 중요한 단백질과 글리아딘 펩타이드의 상호작용에 기인할 수 있다. HRS에 추가로, 상기 알파 글리아딘 펩타이드 p31-43은 사이클린-의존성 키나제 12(CDK12)의 키나제 도메인내에서 발견된 잔기들과 6개의 아미노산 서열 PPQQPY (서열번호 2)를 공유한다. CDK12의 키나제 도메인은 사이클린 K(CycK)와의 상호작용을 위해 중요하다(문헌참조: Dai et al., J. Biol. Chem. 2012; 287(30):25344-52). CDK12 및 CycK 둘다는 배아 줄기 세포에서 고도로 발현되지만 이들의 발현은 분화시 감소한다(문헌참조: Dai 2012, supra). 상기 단백질은 배아 줄기 세포의 자기 재생을 위해 중요하고 이의 억제는 세포 분화를 유도한다(문헌참조: Dai 2012, supra). 이전에 개시된 내용 및 하기 실시예에 나타낸 결과를 토대로, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43이 CDK12와 CycK 간의 상호작용을 방해하여 2개의 단백질의 활성을 억제하므로써 세포 분화를 촉진하여 잠재적으로 화학요법제에 대한 종양의 민감성을 증가시킬 수 있는 것으로 사료된다. 글리아딘 펩타이드가 CSC를 사멸시키고/시키거나 세포 분화를 촉진시키는 능력은 예상치 않게 다른 화학요법제로부터 수득되지 않는 잇점을 제공한다. 암을 치료하기 위해 글리아딘 펩타이드와 하나 이상의 화학요법제의 병용제를 사용하여 달성할 수 있는 치료학적 효능은 반대되는 화합물의 활성의 특징을 고려했을 때 놀랍고 예상치 않은 것이다. 예를 들어, 글리아딘 펩타이드는 세포를 세포 주기의 S-단계로 유도함으로써 세포 증식을 촉진시키는 것으로 공지되어 있는 반면(문헌참조: Barone 2007, supra), 화학요법제는 일반적으로 특히 신속하게 분열하는 세포에 세포독성이다. 에를로티니브 및 게피티니브와 같은 RTKI는 일반적으로 G1 단계로 세포를 정지시켜 세포 성장을 억제하는 작용을 한다(문헌참조: Arora et al., JPET. 2005;315(3):971-79). 따라서, 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제의 활성은 적어도 서로에 반대하는 작용을 할것으로 예상된다. 유사하게, 글리아딘 펩타이드와 같은 EGFR 활성화제와 RTKI와 같은 EGFR 억제제의 활성은 서로 정반대인 것으로 예상된다. 그러나, 글리아딘 펩타이드는 EGFR 및 다른 수용체가 리소좀내 분해되는 것 대신 세포막으로 다시 재순환되도록 하기 때문에, EGFR이 인산화된 상태로 유지되는 시간은 연장된다(문헌참조: Barone 2007, supra; Barone 2010, supra). EGFR 및 다른 PTK의 상기 연장된 활성화는 RTKI에 대한 세포의 민감성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 글리아딘 펩타이드와 EGFR-특이적 RTKI의 동시 투여는 야생형 EGFR을 갖는 환자들 및 돌연변이체 수용체 단백질을 발현하는 환자들을 치료하기 위해 효과적이다.
글리아딘 펩타이드와 RTKI와 같은 하나 이상의 화학요법제의 동시 투여는 예측되지 않고 놀랍게도 효과적인 항암 치료요법을 제공한다. 상기 글리아딘 펩타이드는 화학요법제(들)과 협력하여 작용하여 증진된 치료학적 효능을 성취한다. 글리아딘 펩타이드와 RTKI가 암 환자에게 동시 투여되는 경우, RTKI에 대한 암의 내성은 감소되거나 예방된다. 비치료된 셀리악 병과 암 둘다를 앓는 환자는 RTKI 또는 다른 화학요법제를 사용한 항암 치료요법에 보다 잘 응답하는 것으로 예측될 수 있다. 셀리악 병은 밀 글루텐 및 유사 단백질에 대한 면역원성 응답을 포함하는 소장의 만성 염증 질환이다. 글루텐 부재 식이를 채택하는 것은 셀리악 병의 증상을 완화시킨다. 셀리악 병을 앓는 환자에서, 글리아딘 펩타이드는 분해에 내성이고 건강한 대상체 및 치료된 셀리악 병을 앓는 환자와 비교하여 상당히 고용량으로 온전하게 혈청으로 수송되어(문헌참조: Matysiak-Budnik et al. Gastroenterology. 2003;125(3):696-707), "장 누수 증후군"으로서 공지된 병태를 생성한다. 소화관의 라이닝(lining)을 통하고 전신 순환계로의 글리아딘의 증가된 침투는 글리아딘 펩타이드가 종양 부위에 도달하도록 하여 화학치료요법에 대한 암 세포의 민감성을 증가시킨다. 따라서, 하나의 양상에 따라, 치료될 환자는 셀리악 병을 앓지 않는다.
본 발명은 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1
NSCLC를 포함하는 다양한 유형의 암 세포는 기탁기관[American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)] 또는 암 환자 기원의 생검으로부터 수득하였고 성장 배지에 유지시켰다. 세포는 다중-웰 세포 배양 플레이트에 분주하고 하기의 실험 그룹으로 나눈다: (1) 단지 성장 배지로 배양된 세포; (2) 5㎍/mL 내지 200㎍/mL의 다중 농도의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55가 보충된 성장 배지로 배양된 세포; (3) 0.1μM 내지 10μM의 다중 농도의 에를로티니브가 보충된 성장 배지로 배양된 세포; (4) 5㎍/mL 내지 200㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55 및 0.1μM 내지 10μM의 에를로티니브가 보충된 성장 배지로 배양된 세포; (5) 0.1μM 내지 10μM의 다중 농도의 게피티니브가 보충된 성장 배지로 배양된 세포; 및 (6) 5㎍/mL 내지 200㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55 및 0.1μM 내지 10μM의 게피티니브가 보충된 성장 배지로 배양된 세포.
세포 생존능은 3 내지 5일 후 측정하고 절반-최대 억제제 농도(IC50)는 용량-반응 곡선으로부터 결정한다. 글리아딘 펩타이드와 에를로티니브를 사용한 동시 치료는 단독으로 투여된 에를로티니브에 대한 IC50과 비교하여 에를로티니브의 IC50을 상당히 감소시킨다. 유사하게, 글리아딘 펩타이드와 게피티니브를 사용한 동시 치료는 단독으로 투여된 게피티니브의 IC50과 비교하여 게피티니브의 IC50을 상당히 감소시킨다.
실시예 2
옆구리 영역에서 NSCLC 세포를 마우스에 피하내 주사한다. 종양은 약 100 세제곱 밀리미터 내지 200 세제곱 밀리미터로 성장하도록 한다. 상기 동물은 하기의 실험 그룹으로 나누고 14일동안 치료하였다: (1) 종양 부위내로 하루 1회 식염수를 주사 투여받은 동물; (2) 종양 부위내로 하루 1회 5㎍/mL 내지 200㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55를 주사 투여받은 동물; (3) 하루 1회 100mg/kg 이하의 에를로티니브의 경구 용량을 투여받은 동물; (4) 하루 1회 100mg/kg 이하의 게피티니브의 경구 용량을 투여 받은 동물; (5) 하루 1회 종양 부위로 5㎍/mL 내지 200㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55을 주사 투여 받고 하루 1회 100mg/kg 이하의 에를로티니브의 경구 용량을 투여받은 동물; (6) 하루 1회 종양 부위내로 5㎍/mL 내지 200㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55를 주사 투여 받고 하루 1회 100mg/kg 이하의 게피티니브의 경구 용량을 투여받은 동물.
종양 용적은 성장 억제를 결정하기 위해 치료 과정 동안에 캘리퍼를 사용하여 평가하였다. 글리아딘 펩타이드와 에를로티니브 또는 글리아딘 펩타이드 및 게피티니브의 동시 투여는 단독의 에를로티니브 또는 게피티니브의 투여와 비교하여 종양 성장의 상당한 억제를 유도한다.
실시예 3
사람에서 효능 연구는 NSCLC를 앓는 환자에서 (1) 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55 및 게피티니브 또는 (2) 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55 및 에를로티니브의 동시 투여 효과를 평가하기 위해 수행한다. 대조군 그룹 환자들에 하루에 250mg 이하의 게피티니브 또는 하루 150mg 이하의 에를로티니브를 투여한다. 상기 실험 그룹에서, 환자에게 게피티니브 또는 에를로티니브 뿐만 아니라 하루 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55를 투여한다. 상기 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49, 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55는 혈장 농도가 약 5㎍/mL 내지 약 200㎍/mL이 되도록 투여한다. 종양 덩어리 및 전이는 치료요법 1, 2 및 3 개월 후에 평가한다. RTKI 뿐만 아니라 글리아딘 펩타이드를 투여받은 환자들은 단독의 RTKI를 투여받은 환자와 비교하여 폐에서 상당히 감소된 1차 종양 덩어리를 나타낸다. 병용 치료요법을 투여받은 환자는 또한 대조군 그룹 환자에 비해 상당히 적은 전이 종양을 나타낸다. 임상 시험은 암을 치료하기 위한 병용 치료요법에서 글리아딘 펩타이드의 투여를 포함하는 값을 입증한다.
실시예 4
실시예 4 내지 8을 위해, 사람 암 세포주 A549, NCI-H1975, 및 PANC-1은 ATCC로부터 수득하고, 10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민 및 1% 항생제-항진균제 용액(10유니트/μL의 페니실린, 10㎍/μL의 스트렙토마이신 및 25㎍/mL의 앰포테리신 B)을 함유하는 RPMI 1640 배지 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)에서 유지시켰다. 세포들은 5% CO2의 습화된 대기에서 37℃에서 유지시키고 이들이 90% 컨플루언스에 도달할때까지 성장시킨다. 이어서 세포는 세척하고 트립신 처리하고 쿨터 카운터(Beckman, Brea, CA)를 사용하여 계수하였다.
A549 NSCLC 세포를 상기된 바와 같이 유지하고 배양하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 (Anaspec Inc., Fremont, CA), 게피티니브(LC Laboratories, Woburn, MA), 및 에를로티니브(LC Laboratories)를 사용하여 상기 세포를 처리하였다. 세포는 24웰 세포 배양 플레이트에 10,000 세포/웰의 밀도로 분주하고 24시간 동안 접착하도록 방치하였다. 상기 세포를 이어서 하기와 같이 72시간동안 항온처리하였다: (1) 비히클(DMSO/물); (2) 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43; (3) DMSO/물 중의 1μM 게피티니브; (4) 1μM의 에를로티니브; (5) DMSO/물 중 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 1μM의 게피티니브; 또는 (6) DMSO/물 중의 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 1μM의 에를로티니브. 모든 실험은 6회 수행하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브/에를로티니브를 사용한 병용 치료요법을 위해, 상기 2개의 화합물은 세포에 동시에 투여하였다. 72시간 처리 후, 성장 억제는 제조업자의 지침에 따라 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)에 의해 평가하였다. 570nm에서 흡광도는 플레이트 판독기(BioTek, Winooski, VT)를 사용하여 측정하였다. 표 1은 570nm에서 평균 흡광도 및 비히클-처리된 세포에 비해 글리아딘- 및 RTKI-처리된 A549 세포에 대한 성장 억제 %를 보여준다.
표 1: 72시간 처리 후 A549 세포 증식에 대한 단독으로 또는 게피티니브 또는 에를로티니브와 병용된 알파-글리아딘 펩타이드 p31 -43의 효과
용량 평균 흡광도
( 570 nm ) 		S.E . 억제 % p-값
대조군 (DMSO/물) 1.49 0.35 -- --
5 ㎍/mL 글리아딘 1.54 0.25 0 p > 0.05
20 ㎍/mL 글리아딘 1.44 0.15 3.4 p > 0.05
70 ㎍/mL 글리아딘 1.35 0.18 9.4 p > 0.05
1 ㎍/mL 게피티니브 1.35 0.19 9.4 p > 0.05
1 ㎍/mL 에를로티니브 1.44 0.12 3.4 p > 0.05
5 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.50 0.12 0 p > 0.05
20 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.19 0.08 20.1 p > 0.05
70 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 0.86 0.04 42.3 p < 0.05
5 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.24 0.04 16.8 p > 0.05
20 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.14 0.02 23.5 p > 0.05
70 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.30 0.16 12.8 p > 0.05
20㎍/mL 또는 70㎍/mL의 용량에서 단독으로 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리된 A549 세포는 단독의 게피티니브 또는 에를로티니브로 처리된 세포에 비해 상당한 성장 억제를 나타냈다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브 또는 에를로티니브의 병용물을 사용한 처리는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 또는 단독의 각각의 RTKI에 비해 증가된 성장 억제를 유도하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브 또는 에를로티니브의 동시 투여는 놀랍게도 성장 억제에 대해 상승작용 효과를 가졌고 상기 병용 치료요법은 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 RTKI의 개별 성장 억제 효과의 합 보다 큰 성장 억제를 유도하였다.
총체적으로, 상기 결과는 단독으로 투여된 글리아딘 펩타이드가 벤치마크 화학요법제 뿐만 아니라 효과적인 항암 치료이고 암 세포 성장을 억제하였음을 입증하였다. 글리아딘 펩타이드 및 RTKI를 사용한 병용 치료요법은 유리하게 단독의 글리아딘 펩타이드 또는 RTKI에 비해 암 세포 성장의 증가된 억제를 유도하였고, 또한 놀랍고 예상치 않은 상승작용 항종양 효과를 생성시켰다.
실시예 5
NCI-H1975 NSCLC 세포는 실시예 4에 기재된 바와 같이 유지시키고 배양하였다. NCI-H1975 세포는 EGFR (L858R)에서 활성화 돌연변이를 함유하고 에를로티니브 및 게피티니브를 포함하는 EGFR TKI에 대해 내성을 부여하는 추가의 돌연변이(T790M)를 함유한다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 게피티니브, 및 에를로티니브를 사용하여 상기 세포를 처리하였다. 세포는 24웰 세포 배양 플레이트에서 10,000세포/웰의 밀도로 분주하고 24시간동안 접착하도록 방치하였다. 이어서 상기 세포는 하기된 바와 같이 72시간동안 항온처리하였다: (1) 비히클 (DMSO/물); (2) DMSO/물 중의 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43; (3) DMSO/물 중의 1μM의 게피티니브; (4) DMSO/물 중의 1μM의 에를로티니브; (5) DMSO/물 중의 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 1μΜ의 게피티니브; 또는 (6) DMSO/물 중의 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 1μΜ의 에를로티니브. 모든 실험은 6회 수행하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브/에를로티니브를 사용한 병용 치료요법을 위해, 상기 2개의 화합물을 세포에 동시에 투여하였다. 72시간 치료 후, 성장 억제는 제조업자의 지침에 따른 MTT 분석에 의해 평가하였다. 570nm에서 흡광도는 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 표 2는 570nm에서 평균 흡광도 및 비히클-처리된 세포에 비해 글리아딘- 및 RTKI-처리된 NCI-H1975 세포에 대한 성장 억제 %를 보여준다.
표 2: 72시간 처리 후 NCI -H1975 세포 증식에 대한 단독으로 또는 게피티니브 또는 에를로티니브와 병용된 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43의 효과
용량 평균 흡광도
( 570 nm ) 		S.E . 억제 % p-값
대조군 (DMSO/물) 2.04 0.17 -- --
5 ㎍/mL 글리아딘 1.51 0.08 26.0 p < 0.05
20 ㎍/mL 글리아딘 1.61 0.13 21.1 p > 0.05
70 ㎍/mL 글리아딘 1.30 0.07 36.3 p < 0.001
1 ㎍/mL 게피티니브 1.68 0.15 17.6 p > 0.05
1 ㎍/mL 에를로티니브 1.73 0.11 15.2 p > 0.05
5 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.23 0.10 39.7 p < 0.001
20 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.00 0.11 51.0 p < 0.001
70 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.24 1.12 39.2 p < 0.001
5 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.33 0.05 34.8 p < 0.001
20 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.11 0.06 45.6 p < 0.001
70 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 0.79 0.06 61.3 p < 0.001
단독의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리된 NCI-H1975 세포는 대조군 세포에 비해 상당한 억제를 나타냈다. 단독의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리된 세포에서 성장 억제는 단독의 게피티니브 또는 에를로티니브로 처리된 세포에서 보다 컸다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브 또는 에를로티니브의 병용물을 사용한 처리는 시험된 모든 농도에서 암 세포의 상당한 성장 억제를 달성하였다. 추가로, 상기 병용 치료요법은 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 또는 단독의 RTKI에 비해 증가된 성장 억제를 유도하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브 또는 에를로티니브의 동시 투여는 놀랍게도 성장 억제에 대한 상승작용 효과를 가질 수 있었고 상기 병용 치료요법은 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 RTKI의 개별 성장 억제 효과의 합 보다 큰 성장 억제를 유도하였다.
총체적으로, 상기 결과는 단독으로 투여된 글리아딘 펩타이드가 RTKI 내성 암 세포의 성장을 상당히 억제하는데 효과적이고 벤치마크 RTKI 보다 큰 치료학적 효능을 달성했음을 입증하였다. 글리아딘 펩타이드 및 RTKI를 사용한 병용 치료요법은 유리하게도 단독의 글리아딘 펩타이드 또는 RTKI에 비해 암 세포 성장의 상당히 증가된 억제를 유도하였고 또한 놀랍고 예상치 않은 상승작용 항종양 효과를 생성하였다.
실시예 6
PANC-1 췌장 암종 세포는 실시예 4에 기재된 바와 같이 유지하고 배양하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43, 게피티니브, 및 에를로티니브를 사용하여 상기 세포를 처리하였다. 세포는 24웰 세포 배양 플레이트에서 10,000 세포/웰의 밀도로 분주하고 24시간동안 접착하도록 방치하였다. 이어서 상기 세포는 하기와 같이 72시간동안 항온처리하였다: (1) 비히클 (DMSO/물); (2) DMSO/물 중의 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43; (3) DMSO/물 중의 1μΜ의 게피티니브; (4) DMSO/물 중의 1μΜ의 에를로티니브; (5) 5㎍/mL, DMSO/물 중의 20㎍/mL, 또는 DMSO/물 중의 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 1 μΜ의 게피티니브; 또는 (6) DMSO/물 중의 5㎍/mL, 20㎍/mL, 또는 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 1μΜ의 에를로티니브. 모든 실험은 6회 수행하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브/에를로티니브를 사용한 병용 치료요법을 위해, 2개의 화합물을 상기 세포에 동시에 투여하였다. 치료 72시간 후, 성장 억제는 제조업자의 지침에 따른 MTT 분석에 의해 평가하였다. 570nm에서 흡광도는 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 표 3은 570nm에서 평균 흡광도 및 비히클 처리된 세포에 비해 글리아딘- 및 RTKI 처리된 PANC-1에 대해 성장 억제 %를 보여준다.
표 3: 72시간 처리 후 PANC -1 세포 증식에 대한 단독으로 또는 게피티니브 또는 에를로티니브와 병용된 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43의 효과
용량 평균 흡광도
( 570 nm ) 		S.E . 억제 % p-값
대조군 (DMSO/물) 1.87 0.11 -- --
5 ㎍/mL 글리아딘 1.59 0.18 15.0 p > 0.05
20 ㎍/mL 글리아딘 1.39 0.15 25.7 p > 0.05
70 ㎍/mL 글리아딘 1.38 0.14 26.2 p > 0.05
1 ㎍/mL 게피티니브 2.11 0.12 0 p > 0.05
1 ㎍/mL 에를로티니브 1.98 0.20 0 p > 0.05
5 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.35 0.11 27.7 p > 0.05
20 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.75 0.07 6.4 p > 0.05
70 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 에를로티니브 1.22 0.02 34.8 p < 0.05
5 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.33 0.06 28.9 p > 0.05
20 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.15 0.05 38.5 p < 0.001
70 ㎍/mL 글리아딘 + 1 ㎍/mL 게피티니브 1.14 0.07 39.0 p < 0.001
단독의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리된 PANC-1 세포는 단독의 게피티니브 또는 에를로티니브로 처리된 세포 보다 큰 성장 억제를 나타냈다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브 또는 에를로티니브의 병용물을 사용한 처리는 암 세포의 상당한 성장 억제를 달성했다. 추가로, 상기 병용 치료요법은 단독의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 또는 각각의 RTKI에 비해 상당히 증가된 성장 억제를 유도하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브 또는 에를로티니브의 동시 투여는 놀랍게도 성장 억제에 대해 상승작용 효과를 가질 수 있고 상기 병용 치료요법은 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 RTKI의 개별 성장 억제 효과의 합 보다 큰 성장 억제를 유도하였다.
총체적으로, 상기 결과는 단독으로 투여된 글리아딘 펩타이드가 RTKI 내성 암 세포의 성장을 억제하는데 효과적이고 벤치마크 RTKI 보다 큰 치료학적 효능을 달성했음을 입증하였다. 글리아딘 펩타이드 및 RTKI를 사용한 병용 치료요법은 유리하게도 단독의 글리아딘 또는 RTKI에 비해 암 세포 성장의 상당히 증가된 억제를 유도하였고 또한 놀랍고 예상치 않은 상승작용 항종양 효과를 생성하였다. 실시예 4 내지 6은 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제의 동시 투여가 유리한 치료학적 효과를 제공했음을 입증하였다.
실시예 7
PANC-1 사람 췌장 암종 세포(ATCC)는 실시예 4에 기재된 바와 같이 유지시키고 배양하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 5-플루오로우라실 (5-FU) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)을 사용하여 상기 세포를 처리하였다. 세포(계대 27)를 24웰 세포 배양 플레이트에서 1 x 104 세포/웰의 밀도로 분주하였고 24시간동안 접착하도록 방치하였다. 이어서 세포를 72시간동안 증가하는 농도로 비히클(물) 또는 5-FU로 항온처리하였다. 모든 실험은 3회 수행하였다. 0 μΜ 내지 400 μΜ의 범위의 농도에서 5-FU를 사용한 항온처리 후, 세포를 트립신으로 탈분리하고 계수하였다. 표 4는 5-FU를 사용한 처리 후 평균 세포수 및 성장 억제 %를 보여준다.
표 4: 72시간 처리 후 PANC -1 세포에 대한 5-FU의 항-증식 효과
5-FU 용량 ( μM ) 평균 세포수 /mL S.E . 억제 % p-값
0 (비히클) 317,600 7,738 -- --
6.25 116,500 2,342 63.3 p < 0.001
12.5 117,500 4,474 63.0 p < 0.001
25.0 118,200 4,288 62.8 p < 0.001
50.0 100,200 1,791 63.0 p < 0.001
100.0 117,600 2,006 68.5 p < 0.001
200.0 83,900 1,895 73.6 p < 0.001
400.0 66,200 1,935 79.2 p < 0.001
이어서 세포(계대 30)는 24웰 세포 배양 플레이트에서 5 x 103 세포/웰의 밀도로 분주하였고 24시간동안 접착하도록 방치하였다. 세포는 하기와 같이 항온처리하였다: (1) 비히클 (DMSO/물); (2) 6.25μΜ의 5-FU; (3) 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43; (4) 6.25μΜ의 5-FU 및 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 (높은 병용물); 또는 (5) 3.1μΜ의 5-FU 및 35㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 (낮은 병용물). 모든 처리는 3회 수행하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 5-FU를 사용한 병용 치료요법을 위해, 상기 2개의 화합물은 상기 세포에 동시에 투여하였다. 배지는 72시간 마다 각각의 처리물로 새롭게하였다. 처리한지 14일 후, 세포는 트립신 처리하고 계수하였다. 표 5는 처리 후 평균 세포수 및 성장 억제 %를 보여준다.
표 5: 14일 처리 용법 후 PANC -1 세포 증식에 대한 단독으로 또는 알파 -글리아딘 펩타이드 p31-43과 병용되는 5-FU의 효과
용량 평균 세포수 /mL S.E . 억제 % p-값
0 (비히클) 810,467 1300 -- --
6.25 μM 5-FU 33,233 255 96 p < 0.001
70 ㎍/mL 글리아딘 833,800 9500 0 p > 0.05
6.25 μM 5-FU + 70 ㎍/mL 글리아딘 49,367 575 94 p < 0.001
3.1 μM 5-FU + 35 ㎍/mL 글리아딘 42,033 135 95 p < 0.001
연장된 기간(14일) 동안 5-FU에 노출된 PANC-1 세포에 대한 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43의 효과를 조사하기 위해, 이전 실험으로부터의 생존, 즉, 내성 세포 집단(4%)에 대한 실험을 수행하였다. 간략하게, 처리 14일째 생존 세포를 계수한 후, 생존 세포는 웰당 5,000 세포의 밀도로 재분주하였다. 다음 날, 세포는 비히클 또는 100㎍/mL 또는 200㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리하였다. 각각의 처리물을 함유하는 배지는 3일 및 6일째에 새롭게하였다. 7일째, 세포는 트립신처리하고 계수하였다. 표 6은 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리 후 평균 세포수 및 성장 억제 %를 보여준다.
표 6: 5 -FU-내성 PANC -1 세포의 생존 세포 집단에 대한 알파 -글리아딘 펩타이드 p31-43의 효과
용량 세포수 /mL 억제 %
대조군 8200 --
100 ㎍/ml 글리아딘 3700 55%
200 ㎍/ml 글리아딘 1900 77%
DNA를 손상시키는 화학요법제 5-FU는 PANC-1 췌장 암 세포의 증식을 억제하였다. 상기 약물은 14일동안 6.25μΜ로 처리 후 96%까지 PANC-1 세포의 성장을 억제하였다. 5-FU 및 글리아딘 펩타이드의 동시 투여는 대조군 세포에 비해 상당한 성장 억제를 달성하였다. 표 3 및 5에 나타낸 결과는 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제를 동시 투여하는 치료학적 효능이 단독으로 투여된 것과 비교하여 화학요법제의 작용 부위(핵 또는 세포질)에 의해 영향받을 수 있음을 시사한다.
놀랍게도, 단독의 글리아딘 펩타이드의 단독치료요법 투여는 5-FU를 사용한 이전 처리가 제거하지 못한 암 세포를 사멸시키는데 효과적이었다. 5-FU 처리 후, 초기 집단의 4%에 달하는 5-FU-내성 세포의 생존 집단은 생존 상태로 있었다. 5-FU-처리된 PANC-1 세포 기원의 생존 세포 집단이 추가로 7일 동안 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43(100㎍/mL 또는 200㎍/mL)에 노출되는 경우, 세포 증식은 상당히 억제되었다. 5-FU와 같은 강력한 화학요법제에 내성인 세포를 효과적으로 사멸시키는 글리아딘 펩타이드의 능력은 놀랍고 예상치 못한 것이었다.
실시예 8
A549 세포는 실시예 4에 기재된 바와 같이 유지하고 배양하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 시스플라틴(Biovision, Milpitas, CA)을 사용하여 상기 세포를 처리하였다. 세포 (계대 32)는 24웰 세포 배양 플레이트에 1 x 104 세포/웰의 밀도로 분주하고 24시간동안 접착하도록 방치하였다. 이어서 세포를 72시간 동안 증가하는 농도에서 비히클(0.9% 염화나트륨) 또는 시스플라틴으로 배양하였다. 모든 실험은 3회 수행하였다. 0μΜ 내지 6.6μΜ 범위의 농도에서 시스플라틴과의 항온처리 후, 세포를 트립신으로 탈분리하고 계수하였다. 표 7은 시스플라틴으로 처리한 후 평균 세포 수 및 성장 억제 %를 보여준다.
표 7: 72시간 처리 후 A549 세포에 대한 시스플라틴의 항증식 효과
시스플라틴 용량 ( μM ) 평균 세포 S.E . 억제 % p-값
0 (비히클) 193,017 3792 -- --
0.103 166,883 3217 13.5 p < 0.001
0.207 150,917 2484 21.8 p < 0.001
0.413 111,917 2146 42.0 p < 0.001
0.825 48,400 3546 74.9 p < 0.001
1.650 16,117 1762 91.6 p < 0.001
3.300 10,033 452 94.8 p < 0.001
3.600 3,222 136 98.3 p < 0.001
이어서 세포(계대 34)를 24웰 세포 배양 플레이트에서 5 x 103 세포/웰의 밀도로 분주하고 24시간동안 접착하도록 방치하였다. 세포는 하기와 같이 항온처리하였다: (1) 비히클(DMSO/물); (2) 3.3μΜ의 시스플라틴; (3) 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43; (4) 3.3μΜ의 시스플라틴 및 70㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 (높은 병용물); 또는 (5) 1.65μΜ의 시스플라틴 및 35㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 (낮은 병용물). 모든 처리는 3회 수행하였다. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 시스플라틴을 사용한 병용 치료요법을 위해, 상기 2개의 화합물은 상기 세포에 동시에 투여하였다. 상기 배지는 72시간 마다 각각의 처리물로 새롭게하였다. 14일의 처리 후, 세포는 트립신처리하고 계수하였다. 표 8은 처리 후 평균 세포 수 및 성장 억제 %를 보여준다.
표 8: 14일 치료 용법 후 A549 세포 증식에 대한 단독으로 또는 알파-글리아딘 펩 타이드 p31-43과 병용된 시스플라틴의 효과
용량 평균 세포수 /mL S.E . 억제 % p-값
0 (비히클) 364,683 5334 -- --
3.3 μM 시스플라틴 5,780 950 98 p < 0.001
70 ㎍/mL 글리아딘 325,217 1761 11 p > 0.05
3.3 μM 시스플라틴 + 70 ㎍/mL 글리아딘 ㎍/mL 91,100 2350 75 p < 0.001
1.65 μM 시스플라틴 + 35 ㎍/mL 글리아딘 35 ㎍/mL 132,783 1961 64 p < 0.001
연장된 기간(14일) 동안 시스플라틴에 노출된 A549 세포에 대한 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43의 효과를 조사하기 위해, 제2 실험을, 이전의 실험 기원의 생존, 즉 내성 세포 집단(2%)에 대해 수행하였다. 간략하게, 처리 14일째에 생존 세포를 계수한 후, 상기 생존 세포를 웰당 5,000 세포의 밀도로 재분주하였다. 다음 날, 세포는 비히클 또는 100㎍/mL 또는 200㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리하였다. 각각의 처리물을 함유하는 배지는 3일 및 6일째에 새롭게 하였다. 7일째에는 세포를 트립신처리하고 계수하였다. 표 9는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43을 사용한 처리 후 평균 세포 수 및 성장 억제를 보여준다.
표 9: 시스플라틴 내성 A549 세포의 생존 세포 집단에 대한 알파-글리아딘 펩타이 드의 효과
용량 세포수 /mL 억제 %
대조군 2,600 --
100 ㎍/mL글리아딘 1,300 50%
200 ㎍/mL 글리아딘 900 65%
DNA를 손상시키고 알킬화제로서의 특징을 갖는 상기 화학요법제인 시스플라틴은 A549 폐암 세포의 증식을 억제하였다. 시스플라틴은 14일 동안 3.3μΜ로 처리 후 98% 까지 A549 세포의 증식을 억제하였다. 시스플라틴과 글리아딘 펩타이드의 동시-투여는 대조군 세포와 비교하여 상당한 성장 억제를 달성했다. 표 3 및 8에 나타낸 결과는 단독의 투여와 비교하여 글리아딘 펩타이드 및 화학요법제를 동시 투여하는 치료학적 효능이 화학요법제의 작용 부위(핵 또는 세포질)에 의해 영향받을 수 있음을 시사했다.
놀랍게도, 단독의 글리아딘 펩타이드의 투여는 시스플라틴을 사용한 사전 처리가 제거하지 못한 암 세포를 사멸시키는데 효과적이었다. 시스플라틴 처리 후, 초기 집단의 2%에 달하는 시스플라틴-내성 세포의 생존 집단은 생존 상태로 남아있다. 시스플라틴-처리된 A549 세포로부터 생존 세포 집단이 추가로 7일 동안 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 (100㎍/mL 또는 200㎍/mL)에 노출되는 경우, 세포 집단은 상당히 억제되었다. 시스플라틴과 같은 강력한 화학요법제에 내성인 세포를 효과적으로 사멸시키는 글리아딘 펩타이드의 능력은 놀랍고 예상치 못하였다.
총체적으로, 실시예 7 및 8에서의 결과는 글리아딘 펩타이드와 화학요법제를 동시 투여하는 것이 암 세포의 성장을 상당히 억제하는데 효과적이었음을 입증하였다. 놀랍게도, 단독의 글리아딘 펩타이드를 투여하는 것이 강력한 화학요법제로 연장된 처리로부터 생존한 암 세포의 상당한 억제를 달성하였다. 가장 내성의 암 세포, 예를 들어, CSC를 유리하게 그리고 효과적으로 사멸시키는 놀랍고 예상치 않은 능력은 글리아딘 펩타이드가 종양 성장을 억제하고 암 재발을 예방하기 위한 단독치료요법 또는 병용 치료요법에서 사용될 수 있음을 지적했다. 따라서, 글리아딘 펩타이드의 투여는 화학요법제에 대한 암의 내성을 감소시키거나 예방하기 위해 효과적이었다.
실시예 9
동물에서 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43의 독성을 평가하였다. 5 내지 6주령 암컷 BALB/c 마우스에 5일동안 하루 1회 피하내 투여되는 비히클(100㎕ DMSO/식염수) (그룹 1) 또는 5일 동안 하루 1회 피하내 투여되는 비히클 중 200㎍의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 (그룹 2)를 복용시켰다. 글리아딘 용액을 제조하기 위해, 70㎕의 멸균 DMSO를 1mg의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43에 첨가하고 소용돌이시켜 상기 펩타이드를 용해시켰다. 펩타이드가 용해된 후, 430㎕의 멸균 0.9%의 염화나트륨을 첨가하고 소용돌이시켜 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43의 1000㎍/500㎕ 용액을 제조하였다.
독성은 매일 체중 측정 및 거동 평가를 사용하여 평가하였다. 상기 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43은 어떠한 처리 관련된 사망과 관련이 없었다. 연구 말기에, 평균 체중 (± SE)은 그룹 1(n=5)에 대해 19.8 ± 0.4 그람이었고 그룹 2(n=5)에 대해서는 20.0 ± 0.3 그람이었다. 어떠한 거동 변화는 대조군 마우스와 비교하여 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 처리된 동물에서 관찰되지 않았다. 따라서, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43은 겉보기 독성 없이 10mg/kg/day의 용량 수준에서 허용되었다(tolerated).
실시예 10
암 세포에서 세포사멸을 유도하는 알파-글리아딘 p31-43의 능력을 평가하였다. A549 세포는 10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민 및 1% 항생제-항진균류 용액을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 유지시키고 배양하였다. 세포는 배양기에서 37℃에서 5% CO2의 존재하에 성장시켰다. 단독으로 또는 게피티니브와 병용된 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43을 사용한 처리 후 세포사멸의 유도는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 눈금-말단 표지화(TUNEL) 분석을 사용하여 결정하였다.
간략하게, A549 세포 (1 x 105)는 챔버 슬라이드에 분주하고 밤새 접착하도록 방치하였다. 상기 세포는 하기로 72시간동안 항온처리하였다: (1) 비히클 대조군; (2) 1μΜ의 게피티니브; (3) 100㎍/mL, 200㎍/mL, 또는 500㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43; (4) 100㎍/mL, 200㎍/mL, 또는 500㎍/mL의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 1μΜ의 게피티니브. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브를 사용한 병용 치료요법을 위해, 상기 2개의 화합물은 상기 세포에 동시에 투여하였다. 72시간 처리 후, 상기 세포는 실온에서 25분동안 PBS(pH 7.4) 중에서 4% 포름알데하이드로 고정화시키고 이어서 5분동안 PBS 중에서 2회 세척하고, 실온에서 5분동안 PBS 중에서 0.2% Triton X-100 용액 중에 투과시키고 최종적으로 5분동안 PBS 중에서 2회 세척하였다. 세포사멸은 제조업자 지침에 따라 DeadEnd™ 비색 TUNEL 시스템(Promega, Madison, WI)을 사용하여 측정하였다. 분석 말기에, 상기 세포를 탑재하고 현미경하에 관찰하였다. 세포사멸 세포의 염색은 알파-글리아딘 및/또는 게피티니브로 처리된 세포에 대해 관찰하였고, 세포사멸된 세포의 %는 대표적인 샘플 내 염색된 세포의 수를 계수함에 의해 결정하였다. 표 10은 대조군 세포와 비교하여 각각의 처리 후 세포사멸된 세포의 %, 및 글리아딘- 및 게피티니브-처리된 세포의 원-웨이 ANOVA 분석을 사용하여 측정된 p-값을 보여준다.
표 10: 세포사멸의 유도에 대한 단독으로 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43과 병용된 게피티니브의 효과
용량 평균 세포사멸 % S.E . p-값
대조군 3 2 --
글리아딘 19 4 p > 0.05
100 ㎍/mL 글리아딘 37 7 p < 0.01
200 ㎍/mL 글리아딘 36 4 p < 0.01
500 ㎍/mL 글리아딘 38.5 1.5 p < 0.01
100 ㎍/mL 글리아딘 + 게피티니브 28.5 0.5 p < 0.05
200 ㎍/mL 글리아딘 + 게피티니브 37 1 p < 0.01
500 ㎍/mL 글리아딘 + 게피티니브 55 5 p < 0.001
단독의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43으로 처리된 세포의 상당히 높은 %는 단독의 비히클 또는 게피티니브로 처리된 세포와 비교하여 세포사멸되었다. 추가로, 상당히 많은 세포는 단독의 비히클 또는 게피티니브로 처리된 세포와 비교하여 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브를 사용한 병용 치료요법 후 세포사멸되었다. 세포사멸을 유도하기 위해 가장 효과적인 처리물은 500㎍/mL 의 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브의 병용물이었다. 전체적으로, 상기 결과는 단독으로 또는 게피티니브와 병용된 알파-글리아딘 펩타이드가 사람 폐암 세포에서 세포사멸의 강력한 유도제인 것으로 입증되었다.
실시예 11
단독으로 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43과 병용되는 게피티니브의 활성은 A549 사람 폐암 이종이식체 모델을 사용하여 평가하였다. 6주령 암컷 누드 마우스(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)는 3일동안 격리하고, 12시간 명암 주기 및 50%의 상대 습도와 함께 케이지 당 5 마리의 마우스를 수용하였다. 음료수 및 식이물은 자유롭게 동물에게 공급하였다. 모든 동물은 병원체 부재 조건하에서 수용시켰다. 4일째에, 100㎕의 RPMI 1640 배지 중에서 5 x 106 A549 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 접종 후 24시간 부터 개시하여, 동물에게 하기와 같이 14일동안 하루 1회 투여하였다: 그룹 1 - 정맥내 투여된 비히클 (식염수 중 2% DMSO); 그룹 2 - 위관영양법에 의해 투여된 150 mg/kg 게피티니브; 및 그룹 3 - 위관영양법에 의해 투여된 150 mg/kg의 게피티니브 및 정맥내 투여된 200㎍의 알파-글리아딘 p31-43. 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43 및 게피티니브를 사용한 병용 치료요법을 위해, 상기 2개의 화합물은 상기 세포에 동시에 투여하였다. 상기 동물은 14일 처리 기간 후 2주 동안 모니터링하였다. 종양 측정은 종양이 감지할 수 있는 덩어리를 형성하자마자 개시하였고 주마다 2회 측정하였다. 표 11은 연구 과정 동안에 치료 그룹에 대한 평균 체중을 보여준다.
표 11: 체중에 대한 단독으로 또는 알파 -글리아딘 펩타이드 p31-43과 병용되는 게 피티니브의 효과
평균 체중 (그람)
투여 기간 회복 기간
연구일: 4 7 11 14 18 21 25 28
그룹 1
(대조군)		 18.52 ±
0.49		 19.02 ±
0.90		 19.40 ±
1.22		 20.40 ±
1.18		 20.92 ±
0.98		 21.26 ±
0.89		 22.34 ± 0.94 22.80 ± 0.88
그룹 2
(게피티니브)		 17.16 ±
0.42		 17.28 ±
0.56		 18.12 ±
0.78		 18.78 ±
0.64		 19.56 ±
0.58		 21.12 ± 0.60 22.00 ± 0.52 22.50 ± 0.44
그룹 3 (게피티니브 및 글리아딘) 17.22 ±
0.40		 17.88 ±
0.59		 18.52 ±
0.45		 19.00 ±
0.36		 20.36 ±
0.42		 21.70 ± 0.46 22.48 ± 0.42 22.92 ± 0.44
모든 처리물은 잘 허용되었고 어떠한 약물 관련 사망과는 관련이 없었다. 어떠한 상당한 체중 손실이 임의의 처리 그룹에서 주지되지 않았다. 종료시에 평균 체중 그램(± S.E.)은 다음과 같았다: 그룹 1 = 22.80 ± 0.88, 그룹 2 = 22.50 ± 0.44, 및 그룹 3 = 22.92 ± 0.44. 표 12는 연구 과정 동안에 처리 그룹에 대한 평균 종양 용적을 보여준다.
표 12: 종양 용적에 대한 단독으로 또는 알파 -글리아딘 펩타이드 p31-43과 병용되는 게피티니브의 효과
평균 종양 용적 ( mm 3 )
투여 기간 회복 기간
연구일: 4 7 11 14 18 21 25 28
그룹 1
(대조군)		 44.78 ± 6.48 60.44 ± 13.00 86.58 ± 15.44 118.60 ± 29.24 169.34 ± 40.87 227.86 ± 67.54 326.78 ± 91.72 402.86 ± 95.41
그룹 2
(게피티니브)		 47.74 ± 2.87 51.67 ± 5.69 49.30 ± 3.77 60.43 ± 5.35 75.40 ± 9.05 95.22 ± 11.15 157.69 ± 14.76 239.25 ± 32.78
그룹 3 (게피티니브 및 글리아딘) 27.24 ± 7.12 31.06 ± 8.13 40.89 ± 1.11 44.87 ± 3.13 50.12 ± 4.01 82.16 ± 8.72 112.79 ± 13.65 145.46 ± 19.74
연구 종료 일(28일)에 평균 종양 용적 세제곱 밀리미터(± S.E.)는 다음과 같았다: 그룹 1 = 402.86 ± 95.4, 그룹 2 = 239.25 ± 32.78, 및 그룹 3 = 145.46 ± 19374. 표 13은 연구 과정 동안에 처리 그룹에 대한 평균 종양 용적을 보여준다.
표 13: 종양 용적에 대한 단독으로 또는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-43과 병용되는 게피티니브의 효과
평균 종양 성장 억제 %
투여 기간 회복 기간
연구일: 4 7 11 14 18 21 25 28
그룹 2
(게피티니브)		 -6.61% 14.51% 43.06% 49.05% 55.48% 58.21% 51.74% 40.61%
그룹 3 (게피티니브 및 글리아딘) 39.18% 48.61% 52.77% 62.16% 70.40% 63.94% 65.48% 63.89%
평균 종양 성장 억제 % 값은 그룹 2에 대해 40.6%이었고 그룹 3에 대해서는 63.9%이었다. 상기 종양 배가 시간은 그룹 1에 대해 17.21일이었고, 그룹 2에 대해서는 24.48일이었고, 그룹 3에 대해서는 22.89일이었다. 상기 종양 성장 억제 T/C 비율은 그룹 2에 대해서 57.16 이었고 그룹 3에 대해서는 44.06이었다.
총체적으로, 상기 결과들은 게피티니브 및 글리아딘 펩타이드가 단독의 게피티니브와 비교하여 우수한 항암 효과를 발생했음을 입증하였다. 상기 병용 치료요법은 잘 허용되었고 동물에게 독성이 없었지만 종양 크기를 감소시키는데 여전히 효과적이었다. 병용 치료요법 후 평균 종양 용적은 대조군 동물과 비교하여 60% 초과 까지 감소하였다. 상기 평균 종양 용적은 또한 단독의 게피티니브로의 처리 후 평균 종양 용적과 비교하여 병용 치료요법 후 상당히 작아졌다(약 40%). 추가로, 상기 병용 치료요법은 단독의 게피티니브 보다 상당히 신속하게 치료학적 효능을 나타냈고 이는 1주 이내에 50%에 가까운 종양 성장 억제를 달성했고 처리 중단 후에 2주 동안 60% 초과의 성장 억제를 유지했다.
상기 실시예는 제한 없이 발명을 추가로 설명하기 위해 제공된다. 상기 데이타는 글리아딘 펩타이드가 단독으로 사용되는 경우 효과적인 항암제이고 다양한 상이한 암 유형으로부터 유래된 약물 내성 암 세포에서 성장을 억제하고 세포사멸을 유도할 수 있음을 입증하였다. 단독으로 투여된 글리아딘 펩타이드는 강력한 화학요법제로 연장된 처리로부터 생존한 가장 내성있는 암 세포도 사멸시키는데 예상치 않게 효과적이었다. 글리아딘 펩타이드와 화학요법제의 동시 투여는 다수의 화학요법제에 대해 암 세포의 성장을 상당히 억제하는 것으로 나타났다. RTKI와 글리아딘 펩타이드의 동시 투여는 단독의 글리아딘 또는 RTKI 보다 큰 치료학적 효능을 유도하였고 놀랍게도 상승작용 효과를 달성하였다. 생체내 강력한 항종양 효과 및 종양 용적 및 성장을 급격하게 감소시키는 능력을 나타내는데도 불구하고, 글리아딘 펩타이드의 투여는 전체 독성을 유발하지 않았다.
상기 실시예에 기재된 증거 관점에서, 단독으로 또는 화학요법제와 병용한 글리아딘 펩타이드의 사용은 예상치 않고 놀라울 정도로 효과적인 항암 치료요법을 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태가 설명되고 기재되었지만, 다양한 다른 변화 및 변형이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 만들어질 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위내에 있는 모든 상기 변화 및 변형이 특허청구범위에서 보호되는 것으로 의도된다.
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Claims (54)

  1. 치료학적 유효량의 글리아딘 펩타이드를 포함하는 암 치료용 조성물로서, 상기 글리아딘 펩타이드는 서열번호 1을 포함하고 상기 암은 비-소세포 폐암 및 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 암 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 글리아딘 펩타이드는 하나 이상의 화학요법제와 동시 투여되는, 암 치료용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 화학요법제는 아자시티딘, 악사티오프린, 베바시주맙, 블레오마이신, 카페시타빈, 카보플라틴, 클로라부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 플루오로우라실, 겜시타빈, 헤르셉틴, 이다루비신, 메클로레타민, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 타플루포시드, 테니포시드, 티오구아닌, 레티노산, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 수용체 티로신 키나제 억제제 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 암 치료용 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 하나 이상의 화학요법제는 수용체 티로신 키나제 억제제인, 암 치료용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 수용체 티로신 키나제 억제제는 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제인, 암 치료용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 EGFR 억제제는 게피티니브인, 암 치료용 조성물.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 EGFR 억제제는 에를로티니브인, 암 치료용 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리아딘 펩타이드는 알파-글리아딘 펩타이드 또는 이의 유도체 또는 단편인, 암 치료용 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리아딘 펩타이드는 알파-글리아딘 펩타이드 p31-55, 알파-글리아딘 펩타이드 p31-49 및 이의 유도체 및 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 알파-글리아딘 펩타이드인, 암 치료용 조성물.
  10. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 및 하나 이상의 화학요법제는 동시 투여가 상기 화학요법제에 대한 상기 암의 저항력을 감소시키거나 예방하는데 효과적인 양으로 동시 투여되는, 암 치료용 조성물.
  11. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 및 하나 이상의 화학요법제는 동시 투여가 상기 화학요법제의 효능을 증가시키는데 효과적인 양으로 동시 투여되는, 암 치료용 조성물.
  12. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학요법제는 상기 글리아딘 펩타이드를 포함하는 상기 조성물 전에 투여되는, 암 치료용 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 인간 환자에게 투여되는 것인, 암 치료용 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 환자는 EGFR 억제제에 대한 민감성을 증가시키는 것으로 알려진 EGFR 유전자에서 돌연변이를 갖지 않는, 암 치료용 조성물.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 환자는 셀리악 병을 갖지 않는, 암 치료용 조성물.
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