KR101826398B1

KR101826398B1 - 모루신 및 trail을 유효성분으로 포함하는 trail-내성 교모세포종 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101826398B1
Application number: KR1020150158024A
Authority: KR
Inventors: 이석근; 윤미용; 박다인
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2018-02-07
Also published as: KR20170055176A

Abstract

본 발명은 모루신 및 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 TRAIL-내성 교모세포종 치료용 조성물에 관한 것이다. TRAIL은 선택적으로 암세포를 사멸시키는 효과가 매우 우수하여 항암제 후보물질로서 주목받고 있으나, 대부분의 교모세포종이 TRAIL에 대해 내성을 나타내어 실제 임상적 적용에 한계가 있다. 본 발명의 모루신과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 조성물은 모루신이 교모세포종 세포를 TRAIL에 감작시키고 모루신과 TRAIL이 서로 상승작용을 하여 TRAIL-내성 교모세포종에 대해 우수한 항암 효과를 나타낸다.

Description

모루신 및 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 TRAIL-내성 교모세포종 치료용 조성물{A composition for treating TRAIL-resistant glioblastoma comprising morusin and TRAIL as active ingredients}

본 발명은 모루신 및 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 TRAIL-내성 교모세포종 치료용 조성물에 관한 것이다.

교모세포종(glioblastoma)은 미국에서 신경교종(glioma)의 대부분을 차지하며, 조직학적으로 두 번째로 빈번하게 발생하고 5년 생존률이 5%에 불과한 뇌 및 중추신경계에서 가장 빈번한 악성 종양이다. 한국에서, 교모세포종은 전체 뇌 및 CNS 원암종의 15.1%를 차지하며, 전체 신경교종의 34.4%를 차지하는 가장 흔한 뇌상피종이다. 그러나 신경교종에 대한 치료는 치료제에 대한 내성, 비정상적으로 활성화된 신호 전달 경로의 반복적 발생, 치료제의 효율적 전달의 어려움, 그리고 개개인의 종양 간의 현저한 공간적, 시간적 비균일성으로 인해 어려운 실정이다.

교모세포종이 암 치료에 대해 내성을 나타내는 기전에는 EGFR, PDGFR, STAT3 등의 다양한 신호 전달 경로 단백질 및 항-아폽토시스 단백질들이 관여되어 있다. 상피 성장 인자 수용체(EGFR)는 티로신 키나제(RTK)의 하나로서, 환경적 자극에 대한 세포 증식, 대사 및 생존의 중요한 레귤레이터이다. 교모세포종을 비롯한 다양한 암에서 EGFR과 같은 RTK의 증폭 및/또는 돌연변이가 발생한다고 알려져 있다. The Cancer Genome Atlas (TCGA)에 따르면 전체 1차 교모세포종 환자의 66%에서 RTK 과발현 및/또는 돌연변이가 나타났으며, 그 중 EGFR의 변화가 가장 흔하게 나타났다. 즉, 전체 1차 교모세포종 환자의 50%에서 EGFR의 과발현 및/또는 돌연변이가 나타났다. 또한 혈소판-유래 성장 인자 수용체(platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)의 과발현이 전체 1차 교모세포종 환자의 13%에서 나타났다. EGFR 및 PDGFR은 이합체화 후에 그들의 트랜스-인산화를 유도하고 그 다음 AKT, STAT 및 ERK와 같은 중요한 하류 신호전달 분자의 활성화가 일어나 신경교종의 성장 촉진 및 악성을 야기한다. 특히, STAT3은 다양한 사멸 관련 단백질, 항-아폽토시스 및 아폽토시스 촉진 단백질을 조절한다. 따라서, EGFR 및 PDGFR 둘 다를 타겟팅하는 경우 암세포의 증식 및 세포 생존을 둘 다 차단할 수 있기 때문에 효과적인 치료 전략이 될 수 있다.

아폽토시스(apoptosis)에 의한 세포사 유도는 암 치료에서 훌륭한 전략으로 생각되고 있다. 카스파제(caspase)-의존적 아폽토시스는 내인성 또는 외인성 아폽토시스 경로를 통해 전형적으로 활성화된다. 내인성 아폽토시스 경로는 DNA 손상, 저산소증, 또는 기타 세포적 스트레스와 같은 내인성 스트레스에 의해 유도되고, 외인성 아폽토시스 경로는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFR superfamily)와 같은 세포 사멸 수용체에 의해 매개된다.

인간에서, TNF 수퍼패밀리의 일원인 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(tumor-necrosis-factor-related apoptosis-inducing ligand, 이하 TRAIL)은 말단절단된 원형질막 사멸 도메인(truncated cytoplasmic death domain)으로 2개의 사멸 수용체(DR4/TRAIL receptor-1 및 DR5/TRAIL receptor-2) 및 2개의 디코이(decoy) 수용체(DcR1/TRAIL receptor-3 및 DcR2/TRAIL receptor-4)와 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 TRAIL은 암세포의 선택적인 아폽토시스를 유도할 수 있어 항암 후보 물질로서 주목받고 있다. 그러나 교모세포종을 비롯한 다양한 암세포가 TRAIL에 대해 내성을 나타내어, 실제 임상에서 적용하는 데에는 한계가 있다.

종래 보고는 뽕나무(Morus alba L.)(Moraceae)의 뿌리 껍질(root bark), 즉 상백피에서 분리된 모루신(morusin)이 항미생물 활성, 항산화 음이온 라디칼에 대한 스캐빈저 활성, 그리고 항염증성 활성과 같은 다양한 생물학적 활성을 가짐을 입증한 바 있다. 최근에는 모루신이 인간 전립선암, 간암 및 자궁경부암 세포에서 NF-κB 및 STAT3 신호전달 경로의 억제를 통해 아폽토시스를 유도할 수 있다는 것이 보고된 바 있다.

국내 출원번호 제10-2014-0003343호(발명의 명칭: 모루신을 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물)

본 발명은 모루신 및 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 TRAIL-내성 교모세포종(glioblastoma) 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 모루신을 유효성분으로 포함하는, TRAIL-내성 교모세포종에 대한 항암보조용 약학적 조성물로서, 상기 모루신은 TRAIL-내성 교모세포종을 TRAIL에 대해 감작시키는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 모루신(morusin) 및 TRAIL(tumor-necrosis-factor-related apoptosis-inducing ligand)을 유효성분으로 포함하는 TRAIL-내성 교모세포종(glioblastoma) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 모루신을 유효성분으로 포함하는, TRAIL-내성 교모세포종에 대한 항암보조용 약학적 조성물로서, 상기 모루신은 TRAIL-내성 교모세포종을 TRAIL에 대해 감작시키는 조성물을 제공한다.

상기 모루신은 뽕나무의 뿌리껍질(상백피)로부터 분리된 물질이며, 하기 화학식으로 표시된다.

상기 모루신은 모루신의 고유의 성질을 갖는 것이라면 합성하거나 상백피 외의 다른 식물에서 추출된 것이라도 제한 없이 사용될 수 있다.

교모세포종은 신경교종(glioma)의 일종이다. TRAIL은 암세포에 대해 선택적으로 강력한 아폽토시스 유도 효과를 가지나, 교모세포종에서 TRAIL 내성을 나타내는 비율이 매우 높은 것으로 보고된 바 있다. 교모세포종의 종류에 따라 TRAIL에 대해 다양한 정도로 내성을 나타낸다. 본 발명의 조성물에 있어서 모루신은 TRAIL에 대해 매우 강한 내성, 강한 내성, 중등도의 내성 및 약한 내성을 나타내는 교모세포종 세포를 TRAIL에 대해 감작(sensitization)시키는 효과를 가지며 TRAIL과 강한 상승작용을 한다. 따라서 TRAIL 내성 교모세포종을 치료하는 효과가 우수하다.

본 발명의 조성물은 임상 투여 시에 경구 및 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 경구, 정맥내, 종양내, 피내, 또는 피하로 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로는 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위투여형(unit-dosage form)으로 제형화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용한 담체는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 포함한다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다.

상기 단위투여형은 단회 투여되거나 또는 수 회로 나누어 투여될 수 있다. 상기 단위투여형은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 현탁액, 외용제, 및 주사용 용액 등의 형태로 제제화될 수 있다. 본 발명의 단위투여형이 비경구용으로 제형화되는 경우 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 경우에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 조성물 내 상기 모루신은 1일 0.0001 내지 500 mg/kg으로, 상기 TRAIL은 1일 0.000001 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 모루신 및 TRAIL을 0.0001 내지 50 % 중량백분율로 포함할 수 있다.

TRAIL은 선택적으로 암세포를 사멸시키는 효과가 매우 우수하여 항암제 후보물질로서 주목받고 있으나, 대부분의 교모세포종이 TRAIL에 대해 내성을 나타내어 실제 임상적 적용에 한계가 있다. 본 발명의 모루신과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 조성물은 모루신이 교모세포종 세포를 TRAIL에 감작시키고 모루신과 TRAIL이 서로 상승작용을 하여 TRAIL-내성 교모세포종에 대해 우수한 항암 효과를 나타낸다.

도 1은 인간 교모세포종 세포주에 TRAIL을 24시간 동안 처리한 후 세포 생존성을 확인한 도이다.
도 2A는 인간 교모세포종 세포주에 TRAIL을 72시간 동안 처리한 후 세포 생존성을 확인한 도이다. 도 2B는 인간 교모세포종 세포주 및 정상 성상세포에 모루신을 처리한 후 세포 생존성을 확인한 도이다. 도 2C는 인간 교모세포종 세포주에 모루신과 TRAIL을 공동 처리한 경우에 세포 생존성을 확인한 도이다. 도 2D는 인간 교모세포종 세포주에 모루신과 TRAIL을 공동 처리한 경우에 조합 지수(CI)를 계산하여 모루신과 TRAIL을 분석한 도이다.
도 3A는 인간 교모세포종 세포주에 모루신과 TRAIL을 공동 처리한 경우에 아폽토시스에 관련된 단백질인 cleaved PARP, cleaved caspase 3, cleaved caspase 8, cleaved caspase 9의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 3B는 인간 교모세포종 세포주에 모루신과 TRAIL을 공동 처리하고 유동세포분석으로 아폽토시스가 일어난 세포 수를 확인한 도이다.
도 4A는 인간 교모세포종 세포주에 모루신을 0, 12.5, 또는 25 μM으로 처리하고 DR4, DR5, DcR1, DcR2의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 4B는 인간 교모세포종 세포주에 25 μM의 모루신을 처리하고 0, 3, 6, 9 및 18 시간 후에 DR4, DR5, DcR1, DcR2의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 4C는 인간 교모세포종 세포주에 모루신을 처리하고 유동세포분석으로 DR4 및 DR5의 발현을 확인한 도이다. 도 4D는 인간 교모세포종 세포주에 모루신을 처리하고 DR5 mRNA 발현을 RT-qPCR로 확인한 도이다. 도 4E는 인간 교모세포종 세포주에 DR5 mRNA에 대한 siRNA를 일시적 형질감염시키고 TRAIL과 모루신을 공동 처리한 후 세포 생존성을 확인한 도이다.
도 5A는 인간 교모세포종 세포주에 모루신을 0, 12.5, 또는 25 μM으로 처리하고 아폽토시스와 관련된 단백질인 c-IAP1, XIAP, Survivin의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 5B는 인간 교모세포종 세포주에 모루신을 처리하고 0, 3, 6, 9, 18시간 후에 c-IAP1, XIAP, Survivin의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 5C는 인간 교모세포종 세포주에 모루신을 0, 12.5, 또는 25 μM으로 처리하고 RT-qPCR로 XIAP mRNA, Survivin mRNA의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 5D는 인간 교모세포종 세포주에 모루신을 처리하고 0, 6 및 18시간 후에 RT-qPCR로 XIAP mRNA, Survivin mRNA의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다.
도 6A는 인간 교모세포종 세포주에 0 또는 25 μM의 모루신을 처리하고 PDGFR 및 EGFR의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 6B는 인간 교모세포종 세포주에 0, 12.5 또는 25 μM의 모루신을 처리하고 phospho-ERK, ERK, phospho-STAT3, STAT3, phospho-EGFR, EGFR의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다. 도 6C는 인간 교모세포종 세포주에 25 μM의 모루신을 처리하고 3, 6, 9, 18 시간 후에 phospho-ERK, ERK, phospho-STAT3, STAT3, phospho-EGFR, EGFR의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다.
도 7의 상단 그래프는 도 2B에서 발췌한 것이고, 하단의 모식도는 모루신(도면 중앙의 화학식을 갖는 화합물)이 인간 교모세포종 세포를 TRAIL에 감작시키는 과정을 나타낸 것이다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

하기의 실시예에서 사용된 세포주, 시약 및 항체는 하기와 같이 준비하였다. 인간 교모세포종 세포주인 U251MG 및 LN18는 Cancer Res. 2011, 71, 6514-6523 및 J. Pharmacol. Sci. 2013, 121,192-199에 기술된 바와 같이 준비하였다. U87MG, T98G 및 U373MG 세포주는 한국 세포주은행(KCLB)으로부터 구입하였다. U138MG는 대한민국, 서울에 위치한 가톨릭대 의대 전신수 박사로부터 입수하였다. U251MG 및 U138MG은 10% FBS 및 1% 항생제/항진균제로 보충된 DMEM에서 배양되었다. U87MG 및 T98G은 MEM에서 배양되었고 U373MG는 10% FBS 및 1% 항생제/항진균제로 보충된 RPMI에서 배양되었다. 모든 세포는 5% CO₂, 37℃에서 습식 배양기에서 배양되었고, 배양된 세포의 생존성은 LUNA-FL 자동화 세포 계수기(대한민국, 경기도, 안양, Logos Biosystems)에 의해 모니터링되었다.

1차 정상 성상세포(primary astrocyte)는 P1 및 P4 ICR(Institute of Cancer Research) 마우스(DBL Co., Ltd., 대한민국 충북 음성)의 피질에서 분리되었고 성상세포 배양 배지에서 유지되었다(10% 열-불활화 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 고 포도당 DMEM). 동물에 대해 모든 적용가능한 국제적 및 기관 가이드라인을 준수하였고, 마우스에서 분리한 1차 뇌세포를 사용한 연구는 경희대학교 윤리위원회의 승인을 받았다(KHUASP(SE)-14-056).

재조합 인간 TRAIL/Apo2L은 ATGen(대한민국, 경기도, 성남)에서 구입하였다. 모루신(BP0961, 순도 (HPLC, 270 nm) ≥ 98%)은 Biopurify Phytochemicals Ltd. (중국, 시추안, 청두)에서 구입하였고 DMSO에 용해되었다.

웨스턴 블롯에 사용한 항체들은 하기의 회사들로부터 구입하였다. Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 cleaved-PARP, cleaved caspase 3, cleaved caspase 8, cleaved caspase 9, XIAP, ERK, phospho-ERK, phospho-EGFR, EGFR, PDGFR, STAT3 및 phospho-STAT3에 대한 항체를 구입하였고, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 DR4, DR5, cIAP1 및 Survivin에 대한 항체를 구입하였고, Sigma-Aldrich로부터 β-actin에, DcR1 및 DcR2에 대한 항체를 구입하였다. 그 외 2차 항체 HRP-컨주게이션된 항-마우스 IgG 및 항-토끼 IgG(1:5000; Cell Signaling Biotechnology)가 면역블롯을 위해 사용되었다.

실시예 1. 인간 교모세포종 세포에서 세포 생존성에 대한 TRAIL과 모루신의 조합 치료의 효과

TRAIL에 대한 내성 정도를 확인하기 위하여, 인간 교모세포종 세포주인 LN18, U87MG, U373MG, T98G, U251MG, 및 U138MG에 각각 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/ml의 TRAIL을 24시간 동안 처리하고 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석으로 세포 생존성을 관찰하였다. 구체적으로, 각 세포(3-5×10³cells/well)를 96 웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후 상기 각 농도의 TRAIL로 처리하고 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 1 mg/mL MTT를 포함하는 신선 배지를 각 웰에 첨가하였다. 그 후 세포를 2시간 동안 37 ℃에서 배양하고 동일한 부피의 MTT 용해 완충액을 각 웰에 첨가한 후, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 다음 마이크로플레이트 판독기(Tecan Austria GmbH, Grodig, 오스트리아)를 사용하여 570 nm에서 OD를 측정하여 세포 생존성을 관찰하였다. 그 결과 모든 세포주가 세포 생존성이 50% 이상으로 유지되어 TRAIL에 대해 내성을 나타냄을 확인하였다(도 1).

TRAIL 내성 정도를 보다 정확히 확인하기 위하여, 상기 각 교모세포종 세포주에 72시간 동안 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/ml의 TRAIL을 처리하고 상기와 동일한 방법으로 MTT 분석을 수행하여 세포 생존성을 관찰하였다. 그 결과 U251MG, U138MG의 세포 생존성이 가장 높게 유지되어 상기 세포주들이 TRAIL에 대해 매우 강한 내성을 나타내고, U87MG, U373MG 역시 강한 내성을 나타내며, T98G, LN18은 이보다 낮은 중등도의 내성을 나타냄이 확인되었다(도 2A).

또한 모루신을 단독으로 처리한 경우의 효과를 확인하기 위하여, 상기 각 교모세포종 세포주 및 정상 1차 성상세포에 0, 5, 10, 20, 30 μM의 모루신을 24시간 동안 처리하고 상기와 동일한 방법으로 MTT 분석을 수행하여 세포 생존성을 관찰하였다. 도 2B에 나타난 바와 같이, 모루신이 모든 교모세포종 세포주의 세포 생존성을 감소시키기는 하지만, 약 25-40 μM의 IC₅₀값을 나타내어 세포 생존성을 크게 감소시키지는 못하였다. 반면 모루신은 정상 1차 성상세포의 생존성은 전혀 감소시키지 않았다.

모루신과 TRAIL을 공동 처리한 경우의 효과를 확인하기 위하여, U87MG, T98G, U373MG, U251MG 세포주에 0, 5, 10, 또는 20 μM의 모루신을 단독으로 처리하거나(control), 또는 TRAIL(100 ng/mL)과 0, 5, 10, 또는 20 μM의 모루신을 24시간 동안 공동 처리하고, 상기와 동일한 방법으로 MTT 분석을 수행하여 세포 생존성을 분석하였다. 그 결과 상기 4개의 세포주 모두에서 모루신을 단독으로 처리한 경우보다 TRAIL과 모루신을 함께 처리한 경우 세포 생존성이 더욱 감소하였다(도 2C). 또한 CalcuSyn 소프트웨어(Biosoft, MO, USA)를 사용하여 생존 세포의 분획을 조사하여 TRAIL과 모루신 간에 영향을 받은 분획(fraction affected (Fa))을 확인하여 조합 지수(Combination Index, CI)를 계산하여 TRAIL과 모루신의 상승 작용(synergy)을 분석하였다. 그 결과, CI 값은 모든 Fa 지점에서 0.8 미만으로 나타나, TRAIL과 모루신이 강한 상승 작용을 함을 알 수 있었다.

실시예 2. 인간 교모세포종 세포에서 아폽토시스에 대한 TRAIL과 모루신의 조합 치료의 효과

TRAIL은 암세포의 아폽토시스를 유도하는 기전을 통해 암세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 실시예 1에서 나타난 세포 생존성 감소가 아폽토시스 기전으로 발생한 것인지 확인하기 위하여, 하기 실험을 통하여 인간 교모세포종 세포에서 TRAIL과 모루신의 조합 처리가 아폽토시스와 관련된 단백질들의 발현에 미치는 효과를 확인하였다.

U87MG 세포주 및 T98G 세포주를 준비하고, 각각 TRAIL(50 ng/mL) 단독으로, 모루신(5 μM) 단독으로, 또는 TRAIL(25 ng/mL)과 모루신(2.5 μM)의 조합으로 24시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 수득하고, cleaved PARP, cleaved caspase 3, cleaved caspase 8, cleaved caspase 9에 대한 항체, 및 2차 항체 HRP-컨주게이션된 항-마우스 IgG 및 항-토끼 IgG(1:5000; Cell Signaling Biotechnology)를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, TRAIL(25 ng/mL)과 모루신(2.5 μM)의 조합을 처리한 경우, 각각을 처리한 농도가 TRAIL 단독 또는 모루신 단독을 처리한 경우의 1/2였음에도 불구하고 cleaved caspase 3, 8 및 9 및 cleaved PARP 농도가 유의하게 증가하였다(도 3A). 상기 결과는 TRAIL과 모루신의 조합이 인간 교모세포종 세포의 아폽토시스를 유도함을 보여준다. 또한 cleaved caspase 8은 외인성 아폽토시스 경로와 관련이 있는 단백질이고 cleaved caspase 9는 내인성 아폽토시스 경로와 관련이 있는 단백질이므로, TRAIL과 모루신의 조합이 외인성과 내인성 아폽토시스 경로를 모두 유도하여 강력한 아폽토시스 유도 효과를 가짐을 암시한다.

또한 U87MG 세포주 및 T98G 세포주를 준비하고, TRAIL(50 ng/mL)과 모루신(20 μM)의 조합으로 24시간 동안 처리하였다. Annexin V-FITC 및 PI(propidium iodide) 키트(Bio Vision Technology Inc., Golden, CO, USA)로 염색되었다. 그 후 FACS Calibur 유동 세포계수기를 사용하여 유동세포분석을 수행하였다. 그 결과 TRAIL 단독 또는 모루신 단독을 처리한 경우보다 TRAIL과 모루신의 조합을 처리한 경우에 아폽토시스가 일어난 세포 수가 증가함을 확인하였다(도 3B).

실시예 3. 인간 교모세포종 세포에서 사멸 수용체 및 디코이 수용체의 발현에 대한 모루신의 효과

사멸 수용체(DR4 및 DR5)의 하향조절 및/또는 디코이 수용체(DcR1 및 DcR2)의 상향 조절은 종양세포가 TRAIL에 대한 내성을 획득하는 중요한 기전으로 알려져 있다. 따라서 모루신 처리가 인간 교모세포종 세포에서 상기 수용체들의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

먼저 모루신의 효과를 용량-의존적으로 확인하기 위하여, U87MG, U373MG, U251MG, 및 LN18 세포주를 준비하고, 0, 12.5, 25 μM의 모루신으로 24시간 동안 처리하였다. 그리고 웨스턴 블롯으로 DR4, DR5, DcR1, DcR2의 발현을 확인하였다. 결과는 도 4A에 나타내었다.

또한 모루신의 효과를 시간-의존적으로 확인하기 위하여, U87MG 세포주 및 U373MG 세포주를 준비하고, 25 μM의 모루신을 처리한 후 0, 3, 6, 9 및 18 시간이 경과한 후에 각각 웨스턴 블롯으로 DR4, DR5, DcR1, DcR2의 발현을 확인하였다. 결과는 도 4B에 나타내었다.

도 4A 및 4B에서 모루신은 교모세포종 세포에서 용량- 및 시간 의존적 방식으로 DR5의 발현을 강력하게 증가시킨 반면, 그 외 사멸 수용체(DR4, DcR1 및 DcR2)에 대해서는 영향이 거의 없는 것으로 나타났다.

모루신이 DR4 및 DR5에 대해 갖는 영향을 분명히 확인하기 위하여, U87MG, U373MG 및 U251MG 세포주를 준비하고, 25 μM의 모루신을 24시간 동안 처리한 후, DR4, DR5, 또는 IgG 대조군에 특이적으로 결합하는 대한 FITC-컨주게이션된 항체로 염색하고, 유동 세포분석을 수행하였다. 그 결과, 모루신이 DR5의 발현은 증가시키지만 DR4의 발현은 증가시키지 않는 것을 확인하였다(도 4C).

모루신이 DR5의 발현에 미치는 영향을 mRNA 수준에서 관찰하기 위하여, U87MG 세포주를 준비하고, 25 μM의 모루신을 처리한 후, 총 RNA를 TRI Reagent® 용액(Ambion, Waltham, MA, USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 총 RNA(1 μg)를 PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara Korea Biomedical Inc., 대한민국, 서울)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA로 역전사시키고 RT-qPCR로 증폭시켰다. cDNA의 증폭은 LightCycler instrument (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN, USA)에서 Sensi FAST SYBR No-ROX kit (Bioline, Taunton, MA, USA)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 모니터링되었다. RT-qPCR 은 하기 표 1의 특이적인 프라이머를 사용하여 수행되었다. 한편 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.

[표 1]

평균±SD를 도 4D의 그래프에 나타내었다(음성 대조군(mock control)에 대하여, *, p < 0.05; **, p < 0.01; 및 ***, p < 0.001). 도 4D에서 시간이 경과할수록 DR5의 mRNA 수준이 크게 증가하는 것을 알 수 있다.

상기 결과로부터 모루신이 DR5의 발현을 mRNA 수준에서 증가시킴으로써 TRAIL에 대한 인간 교모세포종 세포의 내성을 증가시키는 것으로 파악하였다. 따라서 DR5 mRNA에 대한 siRNA를 이용하여 DR5를 녹다운시키면 모루신의 효과가 억제되는지 여부를 하기의 실험으로 확인하였다.

6-웰 플레이트에 U87MG 세포를 준비하고, DR5에 특이적인 siRNA(Mbiotech, 대한민국, 경기도, 하남) 또는 검증된 scrambled control siRNA(대조군)을 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 일시적 형질감염(transient transfection)시켰다. DR5 siRNA의 서열은 하기 표 2와 같다.

[표 2]

형질감염 48시간 후, 상기 세포를 TRAIL(50 ng/mL)과 모루신(20 μM)으로 24시간 동안 공동-처리하였다. 그 후 MTT 분석을 통해 세포 생존성을 확인하였다. 평균±SD를 도 4E의 그래프에 나타내었다(음성 대조군(mock control)에 대하여, *, p < 0.05; **, p < 0.01; 및 ***, p < 0.001). 도 4E의 그래프에서 가장 왼쪽 막대는 아무것도 처리하지 않은 대조군(mock control)이고, 가운데 막대는 scrambled control을 처리한 후 TRAIL과 모루신(T+M)을 처리한 세포에서의 결과이고, 가장 오른쪽 막대는 DR5 siRNA를 처리한 후 TRAIL과 모루신을 처리한 세포에서의 결과이다. DR5 siRNA를 처리한 경우 scrambled control을 처리한 경우보다 TRAIL과 모루신 공동 처리에 의한 세포사가 약 66% 감소함을 확인하였다.

상기 결과를 종합하여, 모루신은 DR5의 발현을 증가시킴으로써 인간 교모세포종 세포를 TRAIL에 대해 감작시키는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 인간 교모세포종 세포에서 항- 아폽토시스 단백질의 발현에 대한 모루신의 효과

항-아폽토시스 단백질의 상향 조절은 종앙세포가 TRAIL에 대한 내성을 획득하는 또 다른 중요한 기전으로 알려져 있다. 따라서 모루신 처리가 인간 교모세포종 세포에서 항-아폽토시스 단백질들의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

모루신이 용량-의존적으로 아폽토시스와 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, U87MG 및 U373MG 세포를 0, 12.5, 25 μM의 모루신으로 24시간 동안 처리하고 아폽토시스와 관련된 단백질인 c-IAP1, XIAP, Survivin에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 결과는 도 5A에 나타내었다.

또한 모루신이 시간-의존적으로 아폽토시스와 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, U87MG 및 U373MG 세포를 25 μM의 모루신으로 처리하고 0, 3, 6, 9, 18시간 후에 c-IAP1, XIAP, Survivin에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 결과는 도 5B에 나타내었다.

도 5A 및 5B에서 모루신이 인간 교모세포종 세포에서 용량-의존적 및 시간-의존적으로 XIAP 및 Survivin의 발현을 감소시키나, c-IAP1의 발현을 감소시키지 않는 것을 알 수 있다.

모루신이 XIAP 및 Survivin의 발현에 미치는 영향을 mRNA 수준에서 관찰하였다. 먼저 용량-의존적 효과를 확인하기 위하여, U87MG 세포주를 0, 12.5, 25 μM의 모루신으로 24시간 동안 처리하고 RT-qPCR로 XIAP 및 Survivin의 mRNA 발현을 관찰하였다. RT-qPCR 은 하기 표 3의 특이적인 프라이머를 사용하여 수행되었다. 한편 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다(도 5C).

[표 3]

또한 시간-의존적 효과를 확인하기 위하여 U87MG 세포주를 25 μM의 모루신으로 처리하고 0, 6 및 18시간 후에 RT-qPCR로 XIAP 및 Survivin의 mRNA 발현을 관찰하였다(도 5D).

평균±SD를 도 5C 및 5D의 그래프에 나타내었다(음성 대조군(mock control)에 대하여, *, p < 0.05; **, p < 0.01; 및 ***, p < 0.001). 도 5C 및 5D로부터 모루신이 용량-의존적 및 시간-의존적으로 XIAP 및 Survivin의 mRNA 발현을 감소시킴을 알 수 있다.

상기 결과로부터 모루신이 부분적으로 항-아폽토시스 단백질 발현을 mRNA 수준에서 감소시킴으로써 인간 교모세포종 세포를 TRAIL에 대해 감작시켰음을 알 수 있다.

실시예 5. 인간 교모세포종 세포에서 EGFR / PDGFR - STAT3 신호전달 경로에 대한 모루신의 효과

EGFR/PDGFR-STAT3 신호전달 경로는 신경교종 진행에서 중요한 역할을 수행한다. 따라서 EGFR/PDGFR-STAT3 신호전달 경로에 대한 모루신의 효과를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

LN18, U87MG, T98G, U251MG 및 U373MG 세포를 0 또는 25 μM의 모루신으로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음 PDGFR 및 EGFR에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, 모루신은 PDGFR 및 EGFR의 발현을 유의하게 억제하였다(도 6A).

또한 phospho-ERK, ERK, phospho-STAT3, STAT3, phospho-EGFR, EGFR의 발현에 대한 모루신의 효과를 용량-의존적 및 시간-의존적 방식으로 확인하였다.

먼저, U87MG 및 U373MG 세포를 0, 12.5 또는 25 μM의 모루신으로 24시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 수득하고, phospho-ERK, ERK, phospho-STAT3, STAT3, phospho-EGFR, EGFR 에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 결과는 도 6B에 나타내었다.

또한 U87MG 및 U373MG 세포를 25 μM의 모루신으로 처리하고 0, 3, 6, 9, 18 시간 후에 세포 용해물을 수득하고 웨스턴 블롯으로 phospho-ERK, ERK, phospho-STAT3, STAT3, phospho-EGFR, EGFR의 발현을 확인하였다. 결과는 도 6C에 나타내었다.

도 6B 및 6C에서 phospho-EGFR, phospho-STAT3의 농도가 크게 낮아진 것으로 보아 모루신이 용량-의존적 및 시간-의존적으로 EGFR과 그 하류 표적 단백질인 STAT3의 인산화를 감소시킴을 알 수 있었다. 반면 phospho-ERK의 농도에는 큰 변화가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 모루신이 EGFR의 인산화를 억제하고 PDGFR의 발현을 하향 조절함으로써 EGFR/PDGFR-STAT3 경로를 억제함을 알 수 있었다.

Claims

모루신(morusin) 및 TRAIL(tumor-necrosis-factor-related apoptosis-inducing ligand)을 유효성분으로 포함하는 TRAIL-내성 교모세포종(glioblastoma) 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여되는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위투여형(unit-dosage form)으로 제형화된 조성물.
제3항에 있어서, 상기 단위투여형은 캡슐, 과립, 산제, 정제, 용액 및 현탁액을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나로 제형화된 조성물.
모루신을 유효성분으로 포함하는, TRAIL-내성 교모세포종에 대한 항암보조용 약학적 조성물로서, 상기 모루신은 TRAIL-내성 교모세포종을 TRAIL에 대해 감작시키는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여되는 조성물.