KR102183355B1 - 피노레시놀 및 trail을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피노레시놀(pinoresinol) 및 TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 피노레시놀은 TRAIL과 병행 처리하였을 때, TRAIL 항암제 또는 피노레시놀 단독에 의한 항암효과가 나타나지 않던 교모세포종의 세포사멸을 촉진시키는 효과가 우수하였으므로, 피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 교모세포종의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating glioblastoma comprising pinoresinol and TNF-related apoptosis inducing ligand as effective component}

본 발명은 피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

교모세포종(glioblastoma)은 미국에서 신경교종(glioma)의 대부분을 차지하며, 조직학적으로 두 번째로 빈번하게 발생하고, 5년 생존율이 5%에 불과한 뇌 및 중추신경계에서 가장 빈번한 악성 종양이다. 한국에서, 교모세포종은 전체 뇌 및 CNS 원암종의 15.1%를 차지하며, 전체 신경교종의 34.4%를 차지하는 가장 흔한 뇌상피종이다. 그러나 신경교종에 대한 치료는 치료제에 대한 내성, 비정상적으로 활성화된 신호 전달 경로의 반복적 발생, 치료제의 효율적 전달의 어려움, 그리고 개개인의 종양 간의 현저한 공간적, 시간적 비균일성으로 인해 어려운 실정이다.

세포자살(apoptosis)에 의한 세포사멸 유도는 암 치료에서 훌륭한 전략으로 생각되고 있다. 카스파제(caspase)-의존적 세포자살은 내인성 또는 외인성 세포자살 경로를 통해 전형적으로 활성화된다. 내인성 세포자살 경로는 DNA 손상, 저산소증, 또는 기타 세포적 스트레스와 같은 내인성 스트레스에 의해 유도되고, 외인성 세포자살 경로는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼 패밀리(TNFR superfamily)와 같은 세포사멸 수용체에 의해 매개된다.

인간에서, TNF 슈퍼 패밀리의 일원인 종양 괴사 인자 관련 세포자살 유도 리간드(tumor-necrosis-factor related apoptosis-inducing ligand, 이하 TRAIL)는 말단 절단된 원형질막 사멸 도메인(truncated cytoplasmic death domain)으로 2개의 사멸 수용체(DR4/TRAIL receptor-1 및 DR5/TRAIL receptor-2) 및 2개의 디코이(decoy) 수용체(DcR1/TRAIL receptor-3 및 DcR2/TRAIL receptor-4)와 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 디코이 수용체는 TRAIL과 결합하는 사멸 수용체 (DR4 및 DR5)와 경쟁적 길항효과가 있다. 암세포와 달리 정상세포는 디코이 수용체의 발현이 증가되어 있으며, 이로 인해 TRAIL에 의한 세포자살이 일어나지 않는 것으로 알려져 있다.

따라서 TRAIL은 정상세포에 손상을 주지 않으면서 암세포에만 선택적인 세포자살을 유도할 수 있어 항암 후보 물질로서 주목받고 있다. 그러나 교모세포종을 비롯한 다양한 암세포가 TRAIL에 대해 내성을 나타내어, 실제 임상에서 적용하는 데에는 한계가 있다.

한편, 한국등록특허 제1826398호에는 모루신 및 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 TRAIL-내성 교모세포종 치료용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학 조성물에 관해 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하고, 상기 조성물이 TRAIL 항암제 또는 피노레시놀 단독에 의한 항암효과가 나타나지 않던 교모세포종의 세포사멸을 촉진시키는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 피노레시놀(pinoresinol) 및 TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 피노레시놀(pinoresinol) 및 TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 피노레시놀은 TRAIL과 병행 처리하였을 때, TRAIL 항암제 또는 피노레시놀 단독에 의한 항암효과가 나타나지 않던 교모세포종의 세포사멸을 촉진시키는 효과가 우수하였으므로, 피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 교모세포종의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 루비아 필리피넨시스(Rubia philippinensis)로부터 분리된 피노레시놀(pinoresinol, PINO)의 TRAIL 감작 효과에 관한 것이다. (A)는 루비아 필리피넨시스로부터 분리한 33가지 물질 단독 또는 TRAIL과의 병용 처리에 의한 LN428 세포에서의 세포 생존율 변화를 확인한 결과이고, (B) 및 (C)는 농도별 피노레시놀, TRAIL 및 이들의 병용 처리에 의한 세포 독성을 확인한 결과이다. *은 피노레시놀 단독 처리군 대비 TRAIL과 병용처리군의 세포 독성이 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 2는 TRAIL 및 피노레시놀 병용 처리에 의한 세포사멸 효과(A 및 B) 및 TRAIL 및 피노레시놀 병용 처리에 의한 카스파제-8 활성화(C, D 및 E)에 관한 것으로, *은 피노레시놀 단독 처리군 대비 TRAIL과 병용처리군의 세포사멸 효과가 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 3은 TRAIL 및 피노레시놀 병용 처리에 의한 세포 사멸에 대한 민감성 효과가 NF-κB 또는 p53 신호 전달 경로와 관련성이 없다는 것을 확인한 결과로, (A)는 NF-κB에 반응하는 리포터 플라스미드를 이용한 루시퍼라아제 활성 분석 결과이고, *은 피노레시놀 무처리군 대비 피노레시놀 처리군의 루시퍼라아제 활성이 억제되었다는 것을 의미하며, p<0.05이다. (B)는 IκBα 슈퍼 리셉터(SR-IκBα) 플라스미드를 과발현시켜 세포사멸 효과를 확인한 결과로, *은 SR-IκBα 과발현에 의해 세포 독성이 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.05이다. (C)는 IKKα/β의 억제자인 TPCA-1의 전처리에 의한 세포사멸 효과를 확인한 결과이고, (D)는 HCT116 세포에서 p53의 발현 제거(KO, Knock out)에 의한 세포사멸 효과를 확인한 결과이다. CPT(campthothecin)는 토포이소머라아제 Ⅰ 억제제(topoisomerase Ⅰ inhibitor)이다. #은 HCT116 WT군에 비해 HCT116 p53 KO군의 세포 독성이 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 4는 피노레시놀이 프로테아좀 매개 분해를 통해 번역 후 수준에서 cFLIP_L 및 서바이빈의 발현을 하향 조절한다는 것을 확인한 결과로, (A)는 피노레시놀, 피노레시놀 및 TRAIL 병용 처리에 의한 세포사멸 관련 단백질 발현 변화를 확인한 것이고, (B)는 피노레시놀 처리 시간에 따른 cFLIP_L 및 서바이빈의 mRNA 발현 변화를 확인한 것이며, (C)는 프로테아좀 억제자인 MG-132 및 피노레시놀 처리에 따른 cFLIP_L 및 서바이빈의 단백질 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 피노레시놀 매개 cFLIP_L의 하향 조절에 의한 TRAIL DISC 형성 촉진효과를 확인한 결과로, (A)는 서바이빈, 야생형 cFLIP_L 및 cFLIP_L K167/195R(주요 유비퀴틴 수용체 부위가 변형된 cFLIP_L)의 과발현에 의한 세포 독성을 확인한 것이다. *은 mock 형질감염 군에 비해 세포 독성이 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.05이다. #은 야생형 cFLIP_L에 비해 cFLIP_L K167/195R 과발현 군의 세포 독성이 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 6은 cFLIP_L의 피노레시놀 매개 하향 조절이 단백질 신생(de novo) 합성 억제를 통해 매개된다는 것을 확인한 결과이다. (A)는 프로테아좀 억제자인 MG-132 및 피노레시놀 처리에 의한 cFLIP_L의 유비퀴틴 정도를 확인한 결과이고, (B)는 단백질 번역과정 저해제인 사이클로헥시미드(cycloheximide, CHX)와 피노레시놀 처리에 의한 단백질 발현의 변화를 확인한 결과이고, (C)는 단백질 합성 억제효과를 항-GFP 항체를 이용하여 확인한 결과이다.

본 발명은 피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 피노레시놀은 하기 화학식 1로 표시된다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 피노레시놀은 루비아 필리피넨시스(Rubia philippinensis)로부터 분리된 것일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 다른 천연물로부터 추출하거나 합성하는 것이 얼마든지 가능하다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 피노레시놀은 프로테아좀(proteasome)을 통한 분해능을 향상시키고, 단백질 신생 합성을 저해시켜 cFLIP 및 서바이빈(survivin)의 단백질 발현을 감소시킴으로써, TRAIL-내성 교모세포종을 TRAIL에 대해 감작시키는 작용을 하여 신경교종 세포(glioma cell)의 세포사멸을 유도한다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 식물재료

루비아 필리피넨시스(Rubia philippinensis)의 뿌리는 베트남 람동(Lamdong) 지방 비둡 누이 바 국립공원(Bidoup-Nui Ba National Park)에서 수집되었으며, 베트남 하노이 국립 약학 연구소 푸옹 티엔투옹(Phuong ThienThuong) 박사의 약학 분석 및 표준화 부서에서 식물학적으로 확인하였다. 바우처 표본은 베트남 하노이의 베트남 국립 약리 학회(VDL20140801)의 식물 표본 상자와 충남대학교의 약학 대학 실험실(CNU1409)에도 기탁되었다.

2. 피노레시놀의 추출, 분리 및 동정

피노레시놀은 루비아 필리피넨시스의 건조된 뿌리로부터 획득되었다.

루비아 필리피넨시스 에탄올 추출물 150g을 1.5L의 물에 현탁시키고, 2L의 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 3회 분배하여 디클로로메탄 추출물을 수득하였다. 상기 디클로로메탄 가용성 분획 50g을 실리카겔 VLC에 적용하고, n-헥산-에틸아세테이트(EtOAc)(20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, v/v) 및 클로로폼(CHCl₃)-메탄올(8:1, v/v)로 분획하여 6개의 분획(D-1~D-6)을 수득하였다. 그 후 7L의 메탄올-물(10:90→100:0) 구배의 MPLC를 사용하여 10g의 D-6을 11개의 하위 분획(D-6-1~D-6-11)으로 나누었다. 그 후 HPLC(Phenomenex C₁₈ 250×21.2mm)를 통해 메탄올-물(50:50, v/v, 4mM/분, UV 254nm)로 용출시켜 360mg의 D-6-4분획으로부터 머무름 시간 34.0분에서 화합물(피노레시놀) 40mg을 획득하였다.

정제된 화합물은 갈색의 무정형의 가루로, ESIMS m/z 3592[M+H]⁺, 3811[M+Na]⁺, 3571[M-H]^-, 3931[M+Cl]^-; ¹H NMR(300 MHz, methanol-d4): 313(2H, m, H-8, H-8'), 380(2H, Ha-9, Ha-9'), 385(6H, s, OCH3-3, OCH3-3'), 422(2H, Hb-9, Hb-9'), 470 (2H, d, J=27, H-7, H-7'), 677(2H, overlapped, H-5, H-5'), 679(2H, overlapped, H-6, H-6'), 695(2H, H-2, H-2'); ¹³C NMR(75 MHz, methanol-d₄): 1338(C-1, C-1'), 1110(C-2, C-2'), 1491(C-3, C-3'), 1473(C-4, C-4'), 1161(C-5, C-5'), 1200(C-6, C-6'), 875(C-7, C-7'), 553(C-8, C-8'), 726(C-9, C-9'), 564(OCH₃-3, OCH₃-3')을 나타내는 것을 확인하여, NMR 분광학 및 LC-MS 데이터 분석에 기초하여 피노레시놀로 동정하였다.

3. 화학 물질 및 시약

항-PARP, 항-XIAP 및 항-FADD 항체는 BD Biosciences로부터 구입하였고, 항-카스파제-3 항체, 항-카스파제-8 항체 및 항-카스파제-9 항체는 Cell signaling technology로부터 구입하였고, 항-Bcl-X_S/L, 항-서바이빈 및 항-RIP1 항체는 Santa Cruz로부터 구입하였고, 항-c-FLIP 항체는 Enzo Life Sciences로부터 구입하였고, 항-cIAP1/2 항체는 Upstate Biotech로부터 구매하였고, 항-DR5 항체는 Abcam으로부터 구매하였고, 항-TurboGFP 항체는 Thermo scientific으로부터 구매하였고, 항-액틴 항체 및 사이클로헥시미드(CHX)는 Sigma-Aldrich로부터 구매하였고, 팬 카스파제 억제제 Z-VAD-FMK, MG-132, TPCA-1은 Calbiochem으로부터 구매하였고, 재조합 TNF는 R&D Systems으로부터 구매하였으며, 재조합 인간 TRAIL/Apo2 리간드는 Peprotech로부터 구매하였다.

4. 세포 배양

인간 교모세포종 세포인 LN428, LNZ308, U87MG 및 U251MG는 김용완 박사(동성 암 센터, 대구, 한국)로부터 제공받았다. 인간 대장암 세포인 HCT116 및 p-53 결여 유도체는 신득용 교수(단국대학교, 천안, 한국)로부터 제공받았다.

세포는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum), 2mmol/L의 글루타민, 100unit/mL의 페니실린, 100g/mL의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.

랫트 신생아로부터 분리된 정상 일차배양 성상세포(normal primary astrocyte)는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum), 2mmol/L의 글루타민, 100unit/mL의 페니실린, 100g/mL의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다.

5. 플라스미드, 형질감염(transfection) 및 루시퍼라아제 분석

서바이빈(pCA-flagsurvivn) 및 cFLIP_L(pCA-flag-cFLIP_L) 발현 플라스미드는 권택규 교수(계명대학교, 대구, 한국)로부터 제공받았다. 리신 167/195(cFLIP_L-K167/195R)가 점 돌연변이된 cFLIP_L은 제조사의 프로토콜에 따라 Quickchange^TM Site-Directed Mutagenesis kit를 이용하여 제작하였다. 일시적 형질 감염은 제조사의 프로토콜에 따라 Fugeme-6 시약(Promega Corporation, Wisconsin, USA)을 사용하여 수행하였다.

루시퍼라아제 분석을 위해, 리포펙타민(lipofectamine, Invitrogen) 시약을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 LN428 세포에 p2xNF-κB-Luc 및 pRSV-β갈락토시다아제를 일시적으로 형질감염시겼다. 24시간 후, 세포는 TNF(30ng/mL) 또는 TRAIL(50ng/mL)로 6시간 동안 처리하였고, 루시퍼라아제 활성을 루시퍼라아제 분석 키트(Promega, Madison, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 각 샘플의 β-갈락토시다아제 활성으로 표준화하였다.

6. 세포 생존률 분석

세포 생존율 분석은 살아있는 세포에 존재하는 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate, ATP)의 수준에 기초한 세포 생존력을 측정하는 Cell Titer-glo Luminescent 세포 생존율 분석 키트(프로메가)를 이용하여 수행하였다.

발광의 측정은 Tecan Infinite 플레이트 리더기로 측정하였고, 모든 실험은 독립적으로 3번 반복 수행하였다.

7. 면역 블랏(immunoblot) 분석 및 면역침강(immunoprecipitation)

각 조건으로 처리된 세포는 M2 완충액(20mM Tris(pH 7.6), 0.5%(v/v) NP-40, 250mM NaCl, 3mM EDTA, 3mM EGTA, 2mM DTT, 0.5mM PMSF, 20mM β-글리세롤 인산염, 1mM 바나듐산나트륨, 1㎍/mL 류펩틴)을 이용하여 회수하고 용해하였다.

면역 블랏을 위해, 50㎍의 단백질을 10%(v/v) SDS-폴리 아크릴 아미드 겔에서 분획하고, 향상된 화학 발광(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)으로 시각화하였다.

면역침강 분석을 위해, 용해물은 관련 항체 및 단백질 A-아가로즈 또는 단백질 G-세파로즈 비드와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 표적 단백질을 침강시켰다. 침강시킨 비드는 M2 완충액을 이용하여 3회 세척하고, 결합된 단백질을 면역 블랏 분석을 통해 확인하였다.

8. RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 분석

ReliaPrep RNA 미니프렙 시스템(Promega)을 이용하여 전체 RNA를 추출한 이후에, RT-PCR 키트(Agilent Technologies) 및 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR은 각 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 수행되었다.

9. 시험관 번역 분석(translation analysis)

시험관 결합형 전사 및 번역 분석은 1-Step Human Coupled IVT Kit±DNA(Thermo Scientific)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.

상세하게는, 번역(translation) 반응은 1㎍의 원형 DNA(pCFE-GFP)를 주형으로하여 HeLa 세포 용해물을 예비 배양하여 조립하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 12시간 동안 배양하고, SDS-PAGE 용 로딩 완충액으로 정지시켰다. GFP 단백질의 발현 수준은 면역 블랏 분석으로 검사하고, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 농도계로 정량화했다.

10. 통계 분석

실험 결과는 최소한 3번의 개별적 실험 결과를 평균±표준편차(standard deviation)로 표기하였고, 다중 실험군 사이의 통계학적 비교는 ANOVA를 통해 분석하였으며, 두 그룹간의 평균값을 비교하게 위해 Student's t-test를 사용하였다. p<0.05는 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

실시예 1. 루비아 필리피넨시스( Rubia philippinensis )로부터 TARIL 민감도 향상 물질인 피노레시놀의 동정

루비아 필리피넨시스에 포함된 TRAIL 민감도 향상 물질을 확인하기 위해, 루비아 필리피넨시스로부터 총 33개의 물질을 분리하였고, 인간 교모세포종 세포인 LN428 세포에 분리 물질 5μM을 30분 동안 전처리한 후, 50ng/mL의 TRAIL과 24시간 동안 병용처리하여 세포사멸효과가 현저히 증진되는 31번째 물질을 동정하여 피노레시놀을 확인하였다(도 1A).

피노레시놀의 농도별 효과를 검증하기 위해, LN428 세포에 피노레시놀을 농도별로 전처리하고, 50ng/mL의 TRAIL을 처리한 다음 24시간 동안 반응시켰다. 그 결과, 피노레시놀은 단독으로는 세포사멸 효과가 거의 일어나지 않았고, TRAIL과 병용처리 한 경우, 0.2μM의 저농도에서도 피노레시놀 단독 및 TRAIL 단독 처리군 대비 현저한 세포사멸 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 1B 및 1C).

실시예 2. 카스파제-8 의존적인 피노레시놀의 TRAIL 민감도 향상

상기 실시예 1의 결과를 검증하기 위해 피노레시놀의 비독성 농도(0.5μM)를 사용하여 TRAIL과 병용 처리시 세포사멸의 시너지 유도 효과를 확인하였다.

LN428 세포에서, TRAIL을 매개로 하는 세포 독성은 피노레시놀 동시 투여 후, 9시간이 경과한 다음 나타났으며, 24시간 까지 급격히 증가하였다(도 2A).

또한, 피노레시놀은 LN428 세포 이외에 다른 인간 교모종 세포인 U87MG, LNZ308 및 U251에서도 TRAIL-매개 세포 독성과 유사한 상승 효과를 나타냈고, 대조적으로 정상 성상세포(astrocyte)에서는 피노레시놀, TRAIL 및 이들의 병용 처리에 의한 세포 독성이 나타나지 않았다(도 2B).

한편, 일반적으로 TRAIL에 의해 유발되는 암세포 사멸은 주로 세포자살(apoptosis)이지만, 세포 성질에 따라 비-세포자살(non-apoptosis)에 의한 세포사멸을 유도하기도 한다. 따라서 피노레시놀에 의한 TRAIL 매개 세포사멸의 형태를 확인하기 위해, LN428 세포에 팬카스파제(pancaspase) 및 비가역 카스파제-8 억제제인 z-VAD-FMK 및 z-IETD-fmk를 전처리하였다. 그 결과, 이들의 전처리는 피노레시놀 및 TRAIL 병용 투여에 의한 세포사멸을 억제하는 효과가 있었다. 반면, 프로그램된 괴사(necrosis)의 억제제인 Necrostain-1은 피노레시놀 및 TRAIL과 병용 처리시 세포사멸을 억제하는 효과가 나타나지 않았다(도 2C 및 2D). 이를 통해 피노레시놀이 주로 괴사성 세포사멸보다는 세포자살을 유발한다는 것을 확인하였다.

또한, 피노레시놀 및 TRAIL 병용 처리는 TRAIL 처리 후 외인성 세포사멸 경로의 실행자인 카스파제-9 및 카스파제-3 뿐만 아니라 개시자인 카스파제-8의 활성을 야기했다(도 2E).

상기 결과는 교모세포종 세포에서 카스파제-8 활성화가 피노레시놀 및 TRAIL 병용 처리에 의해 유발된 세포사멸의 민감화에 필수적인 역할을 한다는 것을 명확히 하였다.

실시예 3. 피노레시놀의 TRAIL 민감도 향상에 있어서 NF-κB 및 p53 무연관성

피노레시놀은 다양한 면역계에서 NF-κB 경로를 차단하여 항염증성을 나타낸다고 알려져 있다. NF-κB가 항-세포사멸 유전자(anti-apoptosic gene)의 유도를 통해 TRAIL 내성을 조절하는 능력이 있다는 것을 고려할 때, 피노레시놀의 항-NF-κB 효과가 TRAIL 유도성 세포사멸에 대한 감작에 기여할 수 있다는 가설을 세운 후, 실험을 진행하였다.

NF-κB에 반응하는 리포터 플라스미드인 p2xNF-B-Luc와 pRSV-β-gal을 형질감염시킨 LN428 세포는 형질감염 24시간 후, 피노레시놀(0.5μM) 미포함 또는 포함 조건에서 TNF(30ng/mL) 또는 TRAIL(50ng/mL)을 처리하여 6시간 동안 반응시켰다. 그 결과, LN428 세포에 피노레시놀을 전처리한 경우, TNF 및 TRAIL에 의한 NF-κB의 활성을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 3A).

한편, 알라닌에 의한 세린 32 및 세린 36의 치환으로 인해 인산화가 방지된 IκBα 슈퍼 리셉터 억제자(SR-IκBα)의 과발현에 의한 NF-κB 활성화가 예방된 LN428세포는 TNF에 의해 유도되는 세포사멸은 급격히 증가하였으나, TRAIL 단독 또는 피노레시놀과 TRAIL 병용 처리 후, SR-IκBα이 과발현 되지 않은 세포와 비교하였을 때, 세포사멸 효과가 유사한 정도로 확인되었다(도 3B).

게다가 NF-κB 저해제인 TPCA를 전처리하였을 경우, TRAIL 또는 피노레시놀 및 TRAIL 병용 처리에 의한 세포사멸에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 3C).

상기 결과는 피노레시놀에 의해 부여된 TRAIL 감수성 효과가 NF-κB 저해의 결과가 아닐 가능성을 시사한다.

비록 p53 활성이 TRAIL 감작에 중요한 역할을 하지만, 피노레시놀에 의해 유도된 TRAIL 감작에서 p53의 관여는 LN428 세포가 p53 돌연변이를 유지하고 있으므로, 배제되었다. 이러한 가능성과 일치하여, 피노레시놀 처리가 p53이 존재하지 않는 HCT116 세포(HCT116 p53 KO)에서 야생형 세포(HCT116 WT)와 유사한 정도로 TRAIL에 의해 유도된 세포사멸을 민감하게 했다는 것을 확인하였고, 두 세포에 캄토테신(camptothecin, CPT) 처리시 세포 독성의 차이가 현저하다는 것을 확인하였다(도 3D).

실시예 4. 피노레시놀의 cFLIP _L 발현 하향 조절을 통한 DISC(death-inducing signaling complex) 생성 촉진

TRAIL 매개 세포사멸에 대한 신경교종 세포(glioma cell)의 피노레시놀 유도 감작과 관련된 기본 메커니즘을 규명하기 위해, 다양한 시간 동안 피노레시놀에 노출시킨 후, 사멸 수용체 신호 경로(death receptor signaling pathway)에서 여러 세포사멸 관련 단백질의 발현 수준을 확인하였다.

특히 LN428 세포에서, 개시자(initiator) 카스파제-8 및 실행자(executioner) 카스파제-9를 저해하는 두 카스파제 억제자(inhibitor)인 cFLIP_L 및 서바이빈의 단백질 발현 수준은 피노레시놀 처리 약 3~6시간 후 시간 의존적으로 현저히 감소하였다. 또한, cFLIP_L 및 서바이빈의 감소는 피노레시놀 및 TRAIL 병용 투여시 쪼개진 RIP1(cleaved-RIP1) 및 잘려진 bid(truncated-bid)의 증가를 동반했다(도 4A). 이를 통해 피노레시놀에 의한 TRAIL 감작 작용이 외인성 및 내인성 세포사멸 경로의 활성화를 통해 일어났다는 것을 확인하였다.

피노레시놀 처리시 단백질 발현의 감소를 확인하였으므로, mRNA 수준의 변화도 확인하였다. 그 결과, 피노레시놀은 cFLIP_L 및 서바이빈의 mRNA 수준의 변화는 야기하지 않으면서, 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 4B). 또한, 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 경우, 피노레시놀에 의한 cFLIP_L 및 서바이빈의 단백질 발현 감소가 억제되는 것을 확인함으로써(도 4C), 피노레시놀은 cFLIP_L 및 서바이빈의 단백질 수준의 전사조절보다는 프로테아좀 매개 분해를 통해 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 확인하였다.

상기 결과를 토대로, 피노레시놀에 의해 cFLIP_L 및 서바이빈의 발현이 하향 조절되므로, LN428 세포에서 이들 유전자를 과발현시킴으로써, 촉진된 TRAIL-매개 세포 독성을 억제할 수 있는지 확인하였다.

야생형 cFLIP_L의 과발현 및 주요 유비퀴틴 수용체 부위가 변형된 cFLIP_L-K167/195R은 피노레시놀 및 TRAIL 처리에 의해 유도된 세포사멸 및 카스파제 케스케이드 활성화를 현저하게 감소시켰고, 특히 cFLIP_L-K167/195R의 과발현시 피노레시놀 및 TRAIL 처리에 의한 세포사멸효과가 더욱더 현저하였다(도 5A 및 5B). 그러나 피노레시놀 및 TRAIL에 의해 유도된 세포사멸은 서바이빈의 과발현에는 영향을 받지 않았으므로(도 5A 및 5B), 서바이빈보다는 상류 항-세포사멸 단백질인 항-cFLIP_L의 하향 조절이 TRAIL-유도된 세포사멸의 피노레시놀 감작과 관련된 중요한 기전에 기여한다는 것을 확인하였다.

cFLIP은 TRAIL 의존적 방식으로 FADD에 결합하기 위해 프로카스파제-8과 직접적으로 경쟁하기 때문에 프로카스파제-8 및 -10 모집을 금지하여 DISC(death-inducing signaling complex)를 형성한다. 따라서 피노레시놀에 의한 cFLIP_L의 하향조절이 TRAIL에 의한 세포사멸에서의 초기 신호 사건인 DISC의 형성에 직접적으로 영향을 줄 가능성이 있으므로, 항-카스파제-8 항체를 이용하여 면역침전분석을 통해 확인한 결과, LN428 세포에서 TRAIL 단독 처리에 의해 분리된 DISC에 대한 절단된 cFLIP_L의 효율적인 모집을 유도한 반면, DISC-결합된 FADD 및 카스파제-8 및 -10은 약하게 검출되었고, 피노레시놀을 함께 처리한 군에서는 DISC-결합 cFLIP_L의 감소와 함께 TRAIL-매개된 DISC 형성 및 프로 카스파제-8 및 -10 처리의 증가를 촉진시켰다(도 5C).

이러한 결과는 LN428 세포에서 TRAIL에 의한 cFLIP_L의 DISC로의 동원 및 카스파제-8의 활성화가 TRAIL 세포 독성에 대한 저항성을 나타내는 중요한 단계임을 시사한다. 또한, 피노레시놀 전처리된 세포에서, TRAIL 처리 후에 DISC 내에서 프로 카스파제-8 프로세싱의 활성화는 성숙한 카스파제-8의 활성 p18 서브 유닛의 출현에 의해 나타나듯이 완료까지 진행되었다.

종합하면, 상기의 결과는 DISC-결합 cFLIP_L의 감소된 양이 피노레시놀에 의한 TRAIL 감작에 중요한 역할을 한다는 것을 확인한 것이다.

실시예 5. 피노레시놀의 cFLIP _L 발현 하향 조절을 통한 단백질 신생 합성 억제

피노레시놀이 cFLIP_L의 유비퀴틴 매개 저하(ubiquitin-mediated degradation)를 직접적으로 조절하는 기본 메커니즘을 확인하였다.

그 결과, MG132로 세포를 단독 처리하면 단백질 수준이 증가하면서 폴리 유비퀴틴화된 cFLIP_L이 증가하게 되었으나, 피노레시놀을 함께 처리하여도 낮은 수준의 cFLIP_L이 형성되지 않았으므로, 피노레시놀 및 MG132를 처리한 세포에서 피노레시놀에 의한 cFLIP_L의 촉진된 프로테아좀에 의한 분해가 유비퀴틴 과정의 직접 활성화를 통해 달성되는 것은 아니라는 것을 확인하였다(도 6A).

cFLIP_L 및 서바이빈은 불안정한 단백질이므로, 피노레시놀에 의한 단백질 수준 감소가 cFLIP_L 및 서바이빈의 신생 단백질 합성(de novo protein synthesis)과 관련이 있는지 확인하였다.

피노레시놀 또는 사이클로헥시미드(CHX)의 처리는 DR4/5, FADD, RIP1 및 TRAF2를 포함하는 DR 및 어댑터 단백질의 세포내 양에 영향을 주지 않았다. 대조적으로 피노레시놀은 cFLIP_L 및 서바이빈의 발현 수준을 CHX와 유사한 동역학으로 조절할 수 있었다. 또한, 피노레시놀과 CHX의 병용 요법으로 피노레시놀이나 CHX에 의한 하향 조절효과가 촉진되지 않았다(도 6B). 이러한 결과는 CHX와 유사한 방식으로 피노레시놀이 cFLIP_L 및 서바이빈의 빠른 전환으로 단백질의 신생 합성을 저해함을 시사한다.

피노레시놀에 의한 단백질의 하향 조절이 번역 기계 장치의 손상에 의한 것인지 여부를 직접 확인하기위해, 무 세포 생체외 번역 분석(cell-free in vitro translation assay)을 수행하였다.

양성 대조군으로 동등한 양의 세포외 GFP(in vitro transcribed green fluorescent protein) mRNA가 디메틸설폭사이드의 존재 하에서 항-GFP 항체를 사용하여 검출되었다. 그러나 1μM 피노레시놀과의 항온 처리는 10μM CHX와 비교하여 총 신생(de Novo) 단백질 합성을 획기적으로 저해하여 피노레시놀에 의한 cFLIP 및 서바이빈 발현의 감소가 번역 기계 장치의 손상으로 인한 것임을 확인했다(도 6C).

Claims (5)

1. 피노레시놀 및 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 피노레시놀은 루비아 필리피넨시스(Rubia philippinensis)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 피노레시놀은 cFLIP 및 서바이빈(survivin)의 단백질 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 피노레시놀은 TRAIL-내성 교모세포종을 TRAIL에 대해 감작시키는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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