KR20120067715A - 나린제닌 및 ｔｒａｉｌ을 포함하는 폐암 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나린제닌 및 TRAIL(Tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료 및 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은 TRAIL-내성 폐암세포에서 TRAIL 사멸 수용체인 DR5 발현을 상향조절하고 카스파아제를 활성시키며 Bid 분해를 촉진시킴으로써, TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시키고 현저히 증가된 아폽토시스를 유발하는 효과가 있으므로, 우수한 폐암 치료제로 사용할 수 있다.

Description

나린제닌 및 ＴＲＡＩＬ을 포함하는 폐암 치료 및 예방용 조성물{Composition for treating and preventing lung cancer comprising narigenin and tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand}

본 발명은 나린제닌의 신규한 폐암 치료 용도를 이용한 폐암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 TRAIL(Tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand) 내성 폐암 세포에서 TRAIL 매개 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시키는 작용을 하는 나린제닌과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료 및 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

우리나라 사람들에게 가장 많이 발생하는 암은 위암, 대장암, 폐암, 갑상선암, 간암이다. 국가 암 발생 통계를 기초로 살펴보면 평생 암에 걸릴 확률이 남성은 3명 중 1명, 여성은 4명 중 1명으로 분석되는 등 암 발생에 대한 위험이 높아지고 있다. 특히 폐암의 경우, 산업화에 따른 대기오염의 악화와 함께 흡연자의 증가, 특히 청소년과 여성들의 흡연 증가 추세로 볼 때 폐암 환자는 더욱 많아질 것으로 예상된다. 미국의 경우도 암 관련 사망 가운데 남녀 모두에게 폐암은 가장 흔한 원인이며, 그중에서도 비소세포폐암(NSCLC)이 폐암의 75-80%를 차지한다.

대부분의 폐암은 화학요법과 방사선요법에 의해서는 치료될 수 없다, 소세포암은 그 크기를 축소시킴으로써 화학요법 및 방사선요법이 적용될 수 있으나 이에 의해서는 완전한 치료를 기대할 수 없고, 비소세포폐암은 소세포폐암에 비해 항암제의 효과가 적어 화학요법만으로는 치료가 거의 불가능하므로, 종양을 외과적으로 완전히 제거하는 것이 유일한 효과적인 치료법이다. 그러나 폐암 환자의 30% 이하가 진단시 전부 절제할 수 없는 종양을 가지며, 이들 중의 3분의 1 이하만이 외과적 절제술 이후 5년간 생존할 뿐이다. 따라서 폐암에 대한 보다 효과적인 치료방법이 요망된다.

암은 세포성장(cell proliferation)과 아폽토시스(apoptosis) 기전의 불균형에 의해 발생되는 것으로 알려져 있다. 이러한 아폽토시스 경로는 크게 미토콘드리아 경로(mitochondrial pathway)와 세포사 수용체 경로(death receptor pathway)를 경유한다. 방사선 요법과 화학요법에 의한 항암치료의 대부분은 미토콘드리아 경로를 통해 암세포의 아폽토시스를 유발하여 항암 효과를 나타내나 이 경로는 정상세포에도 손상을 주어 부작용을 나타낸다는 보고가 있다. 따라서 암세포를 죽이기 위해서는 세포사 수용체 경로를 활성화시켜 아폽토시스를 유도하는 것이 유리할 것이다.

일반적인 아폽토시스 기전은 카스파아제라고 불리는 단백질 분해효소에 의해 세포 내 단백질이 분해되는 일련의 과정으로 신호가 전달되어 이루어지고, 이 과정에서 여러 종류의 카스파아제들이 아폽토시스에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 구체적으로, 카스파아제-8은 아폽토시스 유도물질에 의해 활성화되고, 활성화된 카스파아제-8은 다시 다른 카스파아제들을 활성화시키면서 아폽토시스를 유발시킨다. 각 세포의 특징에 따라 카스파아제-8이 활성화되면 직접적 또는 간접적으로 미토콘드리아를 통하여 하위 신호인 카스파아제-3가 다시 활성화되어 아폽토시스 신호가 전달된다. 이러한 아폽토시스의 기작을 이용한 다양한 항암물질이 개발되고 있다

현재까지 알려진 많은 항암제 및 암 저해제들은 비특이성으로 인한 정상조직에의 심한 부작용, 높은 돌연변이율로 인한 암세포의 내성 획득 등의 문제점이 있었으나, 1997년 종양 괴사인자-관련 아폽토시스-유발 리간드(Tumor necrosis factor(TNF)-ralated apoptosis-inducing ligand, 이하 TRAIL이라 함)가 정상세포에는 작용하지 않고 형질전환된 암 세포(transformed cancer cell)에만 작용하여 아폽토시스를 유도한다는 사실이 알려짐에 따라 항암치료제로서 매우 유용한 것으로 여겨지고 있다.

상기 TRAIL은 TNF에 의한 아폽토시스를 유도하는 리간드로서, 사멸 수용체 경로(death receptor pathway)를 활성화시켜 아폽토시스를 유도한다고 알려져 있다. TRAIL과의 세포 감수성은 세포막 TRAIL 수용체 및 카스파아제-8의 발현에 의존하며, 카스파아제-8은 TRAIL에 대응하여 활성화되고, 세포질로 방출되어 프로테아제 캐스케이드를 개시시키고, 이는 카스파아제-3 및 -7을 포함한 작동체 카스파아제들을 활성화시킨다. 또한, 이러한 TRAIL은 정상세포에서는 아폽토시스를 유발하지 않고 형질전환된 암 세포(transformed cancer cell)에서만 아폽토시스를 유도할 수 있는 것으로 알려짐에 따라 항암치료제로 매우 유용한 것으로 여겨지고 있다. 종래 TRAIL을 이용하거나 TRAIL 유전자 이입을 통한 새로운 암치료법의 개발이 시도되어 왔으며, 예를 들어 대한 민국 특허출원 제10-2003-7015417호에 TRAIL 수용체에 면역특이적으로 결합하는 항체가 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2004-0006450호에는 TRAIL을 이용하여 혈관신생을 억제시키는 방법이 개시된 바 있다.

그러나, 인간 폐암 세포주를 포함한 많은 종양 세포가 TRAIL의 아폽토시스 효과에 내성(resistance)을 획득하고 있다는 점에서 치료제로서의 많은 제약이 있다 (Kim et. al., Clin Cancer Res, 6, 335-346,1995. Zhang et. al., Cancer Res 59, 2747-2753, 1999). 유방암, 전립선암, 자궁암, 폐암, 간암 및 뇌종양 등의 암에서 TRAIL 내성이 나타나고 있으며, 또한 TRAIL을 암세포에 지속적으로 처리하면 처음에는 TRAIL 감수성을 보이던 암세포주도 TRAIL에 저항성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 폐암 환자의 삶의 질 향상을 위한 차세대 항암요법으로서, TRAIL 내성 폐암 세포에서 TRAIL 매개 아폽토시스를 민감화시켜 TRAIL에 의한 항암효과를 증대시킬 수 있는 새로운 TRAIL sensitizer의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

최근 천연 물질을 이용한 항암 약품의 개발은 과학적 및 산업적으로 매우 중요한 과제가 되고 있다. 실제로 택솔 (taxol) 및 에토포사이드 (etoposide)와 같은 다양한 식물성 화합물들 (phytochemicals)은 임상용 항암제로서 이미 사용되고 있다. 또한, 자연계에 존재하는 천연 식물 추출물인 플라보노이드를 이용하여 치료용 항암 약품을 개발하려는 연구도 활발히 진행되고 있다. 상기와 같은 플라보노이드 화합물로서 항과민 반응, 항산화 작용, 항혈전, 항균 및 항바이러스 효과 그리고 항염증 반응 등의 특성을 포함하여 생물학적으로 유익한 활성을 나타내는 다양한 종류들이 보고되고 있다.

한편, 나린제닌(naringenin)은 자연계에 존재하는 플라보노이드의 일종인 플라바논(flavanone) 무배당체로서, 그레이프프루트, 오렌지, 유자 등의 감귤류에 많이 들어 있으며, 인간 건강에 유익한 다양한 생리활성 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 종래 나린제닌은 암 세포에서 손상된 DNA를 복구하는데 도움을 주며 발암물질인 아플라톡신 B1의 활성을 저해하는 효과가 있다고 알려져 있으며, 국내특허공개 제10-2004-0092968호에서는 유자에서 분리한 나린제닌이 뇌 신경세포에 함유된 AChE를 저해시켜 아세틸콜린의 양을 증가시키고 치매나 기억력 감퇴에 효과가 있음을 개시하고 있다. 뿐만 아니라, 나린제닌에 의한 자극은 C형 간염 바이러스에 감염된 세포에서 바이러스의 방출을 80%까지 감소시킨다는 것이 보고되기도 하였다 (Totta, P., Acconcia, F, Leone, S., Cardillo, I., Marino, M., Mechanisms of naringenin-induced apoptotic cascade in cancer cells: involvement of estrogen receptor a and b signaling. IUBMB Life 2004, 56, 491-499.). 그러나, 아직까지 나린제닌이 TRAIL 내성을 가진 폐암 세포에서 TRAIL-유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시켜 세포사멸을 촉진할 수 있는지에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 적고 안전한 천연 물질 중에서 TRAIL sentitizer로서의 활성을 가지는 것을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 플라보노이드 중에서도 나린제닌이 TRAIL과 공동 처리할 경우 TRAIL-내성 비소세포 폐암세포에서 TRAIL 사멸 수용체인 DR5 발현을 상향조절하고 카스파아제를 활성시키며 Bid 분해를 촉진시킴으로써, 단독 투여시에 비해 TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시키고 현저히 증가된 아폽토시스를 유발함을 밝혔으며, 이러한 나린제닌과 TRAIL을 병용 투여시 우수한 폐암 치료 효과를 가져올 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 나린제닌 및 TRAIL(Tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 나린제닌을 유효성분으로 포함하는, TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성(sensitization)을 증진시키기 위한 TRAIL 병용제제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 나린제닌 및 TRAIL(Tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료 및 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 "나린제닌"은 노란색의 결정형 분말(yellow crystalline powder)로 화학식은 C₁₅H₁₂O₅, 분자량은 272.257, 비점은 247 - 250℃이며 벤젠 고리를 2개 가지고 있으며, 그레이프프루트와 오렌지, 유자 등의 감귤류에 많이 들어 있으며, 자연계에 존재하는 플라보노이드의 일종인 플라바논(flavanone) 무배당체를 말한다.

본 발명에서, 상기 "TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)"은 TNF에 의한 아폽토시스를 유도하는 리간드로서 사멸 수용체 경로를 활성화시켜 아폽토시스를 유도하는 사이토카인을 말한다. TRAIL은 현재 5개의 수용체를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 이 중 DR4 및 DR5 (death receptor 4 및 5)는 암세포에서, DcR1 및 2(decoy receptor 1 및 2)는 정상세포에서 과발현되고, DcR의 경우는 C-말단 꼬리에 사멸 도메인을 가지고 있지 않아 아폽토시스 신호전달이 세포내로 전해지지 않는다고 알려져 있다. 본 발명의 나린제닌과 TRAIL의 공동 처리시 TRAIL 내성을 가진 비소세포폐암 세포에서는 DR5의 발현이 상향조절됨에 따라 세포내 아폽토시스 신호전달을 촉진시키는 것으로 나타났다.

본 발명에서, 상기 "유효성분"이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능?효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에서, 상기 "폐암"이란 소세포폐암(SCLC)과 비소세포폐암(NSCLC)을 모두 포함하나 바람직하게 비소세포폐암을 의미하며, 상기 비소세포암은 선암, 편평상피암, 대세포암, 선편평상피암 등의 조직형으로 분류되는데, 이러한 다른 종류의 조직형을 모두 본 발명의 치료대상 질병에 포함한다.

본 발명에서, 용어 "아폽토시스 (apoptosis)"란 세포 내부에 프로그램화된 신호를 따라 여러 유전자의 발현 및 단백질 활성이 조절되면서 일어나는 능동적인 세포사멸을 의미하며, 발생 과정 및 불필요하게 된 세포(잉여세포나 노화세포 등)를 제거하여 항상성을 유지하거나 이상을 초래하여 생체에 해롭게 된 세포(암 세포, 바이러스 감염세포 등)을 제거하는데 중요한 생물학적 의의가 있는 기작이다. 이 과정을 통해 생성된 아폽토시스체 (apoptotic body)들은 주변 세포들 또는 대식세포 등의 식세포 작용에 의해 제거되어 염증을 유발하지 않는다. 이 과정에서 형태학적으로는 염색질의 응축, 핵막의 덩어리 형성, 핵 분절(fragmentation) 및 DNA 분절 등의 변화가 나타나며, 최종적으로 주변 세포 또는 대식세포에 의한 식 작용이 일어나는 것으로 알려져 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 특히 TRAIL에 내성을 갖는 폐암 세포주에 특이적으로 작용하며, 특히 인간 비소세포폐암 세포주에서 아폽토시스 유발 효과를 나타낸다. 본 발명자들은 TRAIL 내성 A549 세포에서 나린제닌의 TRAIL 민감화 효능이 있음을 확인하였고, 나린제닌이 인간 정상 폐 섬유아세포에서 세포 성장을 저해함이 없이, 사멸 수용체인 DR5의 상향조절, 카스파아제 활성, Bid 분해 등을 통해 TRAIL 유도 아폽토시스를 증가시키는 것을 확인하였다.

구체적으로 상기 아폽토시스에 대한 메커니즘에 대해 살펴보면, TRAIL 수용체 DR5는 세포 표면에 위치하며, TRAIL 리간드와 결합 혹은 과다발현에 따라 활성되거나 올리고머 되며, 카스파제-8-매개 활성을 통해 아폽토시스를 신호한다. 이들 사멸 수용체들 (death receptors)의 발현 수준은 사멸 리간드에 대한 반응에서 사멸 수용체-매개 아폽토시스 신호의 강도 및 지속기간을 결정하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다. Bcl-2 집단의 일원인 Bid는, 미토콘드리아에 의해 조절되는 아폽토시스 경로를 지나면서 활성 카스파제-8에 의해 세포를 죽이기 위한 반응을 증가시킨다. 또한 활성 카스파제-8은 미토콘드리아 비의존적 경로를 지나면서 아폽토시스의 유도를 위해 직접적으로 실행자 (executioner) 카스파제를 활성시킬 수 있다. 미토콘드리아 의존적 아폽토시스 경로에서, Bid의 카스파제-8-매개성 분해는 Bid의 절단형(tBid)을 발생시키며, 이것은 미토콘드리아를 전위시키고, proapoptotic Bax와 Bak 단백질의 협력으로 아폽토시스인자의 방출을 증가시킨다. cIAP1,cIAP2와 X염색체-인코딩된 IAP (XIAP)를 포함한 아폽토시스 단백질 저해자(IAPs)는 카스파제의 저해를 통해 TRAIL이 유도하는 아폽토시스를 저해적으로 조절한다(negative regulation). 최근 DR5는 리간드 TRAIL이 변형 혹은 악성 세포에서 아폽토시스를 우선적으로 유발함으로서, 항암치료를 위한 암 선택적 아폽토시스 유도 사이토카인으로서의 잠재력을 증명하며 주목받았다. 따라서, 폐암 치료제는 폐암세포에서 DR5의 발현을 유도시킴으로써, TRAIL이 유도하는 아폽토시스를 증가시키거나 아폽토시스를 개시할 수 있는 것이다.

본 발명의 하나의 구체예에서, TRAIL-내성 A549 세포에서 나린제닌과 TRAIL을 공동 처리한 결과, 나린제닌과 TRAIL을 단독으로 처리한 경우와 비교하여 현저히 증가된 아폽토시스를 확인할 수 있었으며(도 1D 및 도 1F 참조) 이로부터 나린제닌을 TRAIL과 공동 처리하면 TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 하나의 구체예에서, 상기 아폽토시스의 민감성 증진 효과와 카스파아제 활성과의 관계를 조사한 결과, 나린제닌과 TRAIL의 공동처리시 나린제닌과 TRAIL을 단독으로 처리한 경우와 비교하여 프로카스파아제-3과 프로카스파아제-8을 효과적으로 감소시키고 카스파아제-3, 및 카스파아제-8 활성을 유의적으로 증가시키는 것으로 나타나, 이를 통해 TRAIL-내성 A549 세포에서 나린제닌과 TRAIL의 공동 효과에 의해 유도된 아폽토시스는 카스파아제의 활성을 통해 유발되는 것임을 알 수 있었다 (도 2A 및 도 2B 참조).

본 발명의 또 다른 하나의 구체예에서, 나린제닌과 TRAIL의 공동처리가 Bcl-2 패밀리 멤버들의 발현을 조절함으로써 아폽토시스를 유도하는 것이 아닌지 조사한 결과, A549 세포에서 Bcl-2, Bcl-XL와 Bax 단백질의 발현 수준에는 영향이 없었으나, 나린제닌과 TRAIL을 단독으로 처리한 경우와 비교하여 Bid의 분해가 많이 일어남을 확인할 수 있었고, 이를 통해 공동처리시 Bid를 분해하여 아폽토시스를 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 3A 및 도 3B 참조).

본 발명의 또 다른 하나의 구체예에서, 나린제닌이 아폽토시스를 유도하는 메카니즘을 조사하기 위해 사멸 수용체의 발현과의 관계를 조사한 결과, 나린제닌은 DR5의 상향조절을 통해 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스를 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, DR5의 발현을 통해 나린제닌과 TRAIL의 공동작용으로 인한 아폽토시스의 미토콘드리아 의존적 증가를 매개하는 것을 알 수 있었다 (도 4 참조). 또한, 나린제닌과 TRAIL를 공동처리하여 A549 세포를 배양한 결과, 나린제닌과 TRAIL을 단독으로 처리한 경우와 비교하여 in vitro 상의 종양 세포 제거는 유지하면서 클론원성 종양(clonogenic tumor)의 생존을 감소시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (도 5B 참조).

상기 본 발명의 결과를 종합적으로 볼 때, 본 발명의 나린제닌이 사멸 수용체를 활성시키고 카스파아제를 포함한 아폽토시스 단백질의 상향조절 및 활성화를 통해 세포를 TRAIL-매개 아폽토시스에 민감화시킴을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 나린제닌 및 TRAIL을 TRAIL 내성 폐암세포에 처리할 경우 나린제닌과 TRAIL을 단독 처리한 경우에 비해 현저하게 증가된 폐암세포의 아폽토시스가 유발되는 시너지 효과를 확인할 수 있으므로, 상기 나린제닌과 TRAIL을 유효성분으로 한 약학적 조성물은 화학요법 또는 TRAIL 단독 처리에 내성을 갖는 인간 폐암의 치료 및 예방을 위해 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

상기 "예방"이란 상기 조성물의 투여로 폐암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 "치료"란 상기 조성물의 투여로 폐암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약학적 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민 B1, B2, B6, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘 및 이들의 혼합물 등의 무기 또는 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존에 사용된 폐암에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물을 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 개체에 투여하여 폐암을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, "개체"는 폐암 또는 이의 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 개 등의 포유동물을 의미하나, 바람직하게는 인간을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있도록 하는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 화합물을 포함하는 조성물의 투여방법은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 폐암 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 나린제닌을 유효성분으로 포함하는, TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성(sensitization)을 증진시키기 위한 TRAIL 병용제제에 관한 것이다.

상기 나린제닌의 TRAIL과 병용하여 사용될 경우, TRAIL 민감화 증진 효과 및 아폽토시스 촉진 효과에 대해서는 상술한 바와 같다. 바람직하게 상기 나린제닌은 TRAIL 내성 폐암 세포에서 TRAIL 수용체인 DR 5(death receptor 5)의 발현을 증가시켜 TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시키는 효과를 갖고, 바람직하게 상기 TRAIL 병용제제는 비소세포폐암의 치료에 유용하다.

상기 상술한 바와 같이, 본 발명의 나린제닌과 TRAIL을 유효성분으로 포함한 약학적 조성물은 TRAIL-내성 폐암세포에서 TRAIL 사멸 수용체인 DR5 발현을 상향조절하고 카스파아제를 활성시키며 Bid 분해를 촉진시킴으로써, TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시키고 현저히 증가된 아폽토시스를 유발하는 효과가 있으므로, 우수한 폐암 치료 및 예방 효과를 갖는다.

도 1은 나린제닌과 TRAIL이 세포 증식과 아폽토시스에 미치는 영향을 도시한 것이다. (A와 B, *p＜0.05 임) 표시된 세포주를 96-웰 배양접시에 시딩하였다. 이틀째에 MTT 분석을 이용한 세포 생존능력 측정에 앞서 상기 세포들을 각기 다른 농도의 TRAIL로 24시간 동안 처리하였고(A), 상기 세포들을 각기 다른 농도의 나린제닌(이하, NGEN이라고도 함)으로 30분간 선처리한 후 TRAIL (50 또는 100 ng/mL)로 12시간 동안 배양하였다(B). 그룹 간의 유의미한 차이를 unpaired Student’s t-test를 이용하여 측정하였다. (C) A549 세포를 24-웰 배양접시에 시딩하고 NGEN (100 μM), TRAIL (T, 100 ng/ml), 또는 이들의 조합(NGEN + T)으로 12시간 동안 처리하였다. NGEN을 TRAIL보다 30분 전에 첨가하였고; 고정 후에 세포들을 DAPI 용액으로 염색하였다. (D) 상기 세포들을 (C)에서와 같이 처리하였고; 12시간 후에 sub-G1 개체군의 flow cytometry 분석을 위해 상기 세포들을 수집하였다. (E) 인간 정상 폐 섬유아세포 WI-38 세포들을 96-웰 배양접시에 시딩하였다. 이틀째 날, 상기 세포들을 NGEN (100 μM)과 TRAIL(100 ng/ml), 또는 이들의 조합으로 처리하였다. NGEN을 TRAIL보다 30분 전에 첨가하였다. 24시간 후, MTT 분석으로 세포 생존능력을 측정하였다. (F) D와 같은 조건 하에서 자란 세포들을 Annexin V-FITC와 PI로 염색하고 세포 자살과 괴사의 대비를 알아보기 위해 평가하였다. 각 표시점은 3개의 독립적 실험들의 평균±표준편차(mean±SD)를 나타낸 것이며, 유의미성을 Student’s t-test에 의해 결정하였다(대조군과 비교하여 *p＜0.05 임).
도 2는 나린제닌과 TRAIL이 카스파아제, PARP 및 항-아폽토시스 IAP 단백질에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A) A549와 WI-38 세포를 NGEN (100 μM)의 존재 유무하에서 30분간 배양한 후, TRAIL(100 ng/ml)의 유무하에서 지시된 시간 동안 처리하였다. 카스파아제-3, 카스파아제-8 및 PARP의 프로세싱을 웨스턴 블럿 분석법에 의해 측정하였다. (B) 세포들을 (A)와 같이 처리하고, 카스파아제-3과 카스파아제-8 활성을 카스파아제 분석 키트를 사용하여 분석하였다. 유의미성은 Student’s t-test에 의해 결정하였다(대조군과 비교하여 *p＜0.05 임). (C) 세포들을 z-VAD-fmk (50 μM)의 유무하에서 1시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 도 1D에서와 같이 배양하였다. 12시간 후에 sub-G1 개체군의 분석을 위해 세포를 수거하였다. (D) 세포들을 (A)에서와 같이 처리하였고, XIAP, CIAP-1 및 CIAP-2 프로세싱을 웨스턴 블럿 분석법에 의해 측정하였다. 액틴을 내부 대조구로서 사용하였다. 결과 수치는 최소 2, 3번의 다른 실험들에서 액틴과 비교한 농도계측 분석 평균을 나타낸다.
도 3은 A549 세포에서 MMP(mitochondrial membrane potential)의 손실에 나린제닌과 TRAIL이 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A) 세포들을 NGEN의 각기 다른 농도의 존재 유무하에서 30분간 배양한 후, TRAIL(100 ng/ml)의 유무하에서 12시간 동안 처리하였다. 지시된 Bcl-2 멤버 단백질 프로세싱을 웨스턴 블럿 분석법에 의해 측정하였다. 결과 수치는 최소 2, 3번의 다른 실험들에서 액틴과 비교한 농도계측 분석 평균을 나타낸다. (B) 세포들을 (A)에서와 같이 12시간 동안 처리한 후, 미토콘드리아의 기능부전을 유세포 분석법으로 평가하였다. 유의미성을 Student’s t-test에 의해 결정하였다(대조구 및 NEGN 단독과 비교하여 *p＜0.05 임). (C) A549 세포들을 Bid 특이적인 siRNA 구조체 또는 대조군 구조체로 24시간 동안 일시적으로 형질전환시켰다. 그런 다음, 상기 세포들을 도 1D에서와 같이 12시간 동안 배양하였고, 유세포 분석기로 (C) sub-G1 개체군 또는 (D) 미토콘드리아 기능부전을 분석하였다. 유의미성을 Student’s t-test에 의해 결정하였다(대조군 siRNA와 비교하여 *p＜0.05 임).
도 4는 A549 세포-유도 아폽토시스에서 나린제닌에 의한 DR5 발현의 영향을 나타낸 것이다. (A) A549 세포들을 NGEN(100 μM)으로 지시된 길이의 시간 동안 처리하였다. (B와 C) 지시된 세포주를 주어진 농도의 NGEN으로 12시간 동안 처리하였다 (A - C) DR4와 DR5 단백질의 발현을 웨스턴 블럿 분석법으로 측정하였다. (D와 F) A549 세포를 24-웰 세포 배양접시에 시딩하였고 두번째 날 대조군 혹은 DR5 siRNA로 형질전환시켰다. 40시간 후, 세포들을 NGEN(100 μM)으로 처리하였고, 12시간 후, 세포들을 수거하여 웨스턴 블럿으로 검사하였다. 결과 수치는 최소 2, 3번의 다른 실험들에서 액틴과 비교한 농도계측 분석 평균을 나타낸다. (E와 G) 대조군 또는 DR5 siRNA로 형질전환시킨 후, 상기 세포를 NGEN(100 μM)의 존재 유무하에서 30분간 배양하고 이어서 TRAIL(100 ng/ml)의 존재 유무하에서 12시간 동안 처리하였고, 유세포 분석기로 미토콘드리아 기능부전 (E) 또는 카스파아제-3과 카스파아제-8 활성(F)을 분석하였다. 유의미성을 Student’s t-test에 의해 결정하였다(대조군 siRNA와 비교하여 *p＜0.05 임).
도 5는 A549 세포의 클론원성 생존은 나린제닌과 TRAIL의 공동 처리에 의해 감소된다. (A와 B) A549 세포를 NGEN(100 μM)과 TRAIL(100 ng/ml) 단독, 혹은 NGEN과 TRAIL을 함께 넣은 배지로 12시간 동안 처리하였다. NGEN을 TRAIL 보다 30분 전에 첨가하였다. 죽은 세포들을 세척하였고, 새로운 배지를 일주일에 두 번씩 첨가하였다. 초기 처리 후 지시된 시점에서 MTT 분석에 의해 암세포의 재성장을 정량하였다. 3번의 독립적인 실험 중 하나를 나타내었다. (C와 D) A549 세포를 (C) NGEN (100 μM) 혹은 (D) NGEN (100 - 200 μM)과 TRAIL (100 ng/mL)로 12시간 동안 처리하였다. NGEN을 TRAIL 보다 30분 전에 첨가하였다. 죽은 세포들을 세척하였고 생존한 세포들을 두 달 동안 배양하였다. 그리고 나서, (C) DAPI 용액으로 염색하여 아폽토시스체를 분석 또는 (D) 유세포 분석법에 의한 sub-G1 개체군의 분석에 앞서, 12시간 동안 NGEN과 TRAIL로 재처리하였다. 유의미성을 Student’s t-test에 의해 결정하였다(NEGN 또는 TRAIL 단독으로 처리한 것과 비교하여 *p＜0.05 임).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 시약 및 항체

PI(Propidium iodide), MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)와 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindile)는 시그마-알드리치 사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 광범위-카스파아제 억제제, z-VAD-fmk와 특수 미토콘드리아 염료인 5,50,6,60-tetrachloro-1,10,3,30-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1)는 칼바이오캠 (San Diego,CA, USA)에서 구입하였. 나린제닌 (95% purity)은 시그마-알드리치 사에서 구입하고, DMSO에서 용해시켰다. TRAIL은 코마 바이오텍 (Seoul, Korea)에서 구입하고, PBS에서 용해시켰다. 특별히 언급하지 않은 다른 모든 화학 약품은 시그마-알드리치 사에서 구입했다. 항-엑틴 항체는 시그마-알드리치 사에서 구입했다. 과산화효소로 표지된 당나귀 항-토끼와 면양 항-쥐 면역글로불린은 GE 헬스케어( Buckinghamshire, UK)에서 구입했다. 다른 모든 항체들은 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했다.

2. 세포배양과 생존능력 분석

A549, H460 및 인간 정상 폐섬유아세포 WI-38 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 모든 세포는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입한 RPMI1640 배지 또는 10 μM의 비-필수 아미노산을 포함한 최소영양배지에서 배양하였다. 세포 생존능력 분석을 위해, 세포들을 지시된 조건에 따라 나린제닌과 TRAIL로 처리하였다. 세포 생존능력을 지시된 시간에 MTT 분석법으로 정량화하였다.

3. DAPI 로 핵 염색

DAPI 염색을 위해 세포를 PBS로 세척하고 PBS에 3.7% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich)를 포함시켜 실온에서 10분간 고정시켰다. 고정된 세포들을 PBS로 세척하였고, 실온에서 10분간 2.5 mg/mL DAPI 용액으로 염색하였다. 그런 다음 세포들을 PBS로 2번 세척하였고, 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 분석하였다.

4. 유세포 분석( flow cytometry )을 통한 미토콘드리아막 단백질( MMP )과 아폽토시스의 검출

아폽토시스 분석을 위해, 세포들을 수거하여 차가운 PBS로 세척한 후, 제조사의 지시에 따라 10mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl와 2.5mM CaCl₂를 함유한 annexin-V-결합 버퍼에서 재현탁되었다. 적당량으로 나누어진 세포들을 annexin-V FITC에서 배양하였고, 혼합한 후 실온의 암실에서 15분 동안 배양하였다. 괴사된 세포를 확인하기 위해 0.5 ug/mL의 PI를 첨가하였다. 아폽토시스된 세포들을 유세포분석기 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에서 형광-활성 세포 선별 분석을 통해 측정하였다. MMP 측정을 위해, 이중-발산 형광 염료 JC-1을 사용하였다. JC-1은 호흡하는 미토콘드리아에 의해 내재화, 농축되었고, 살아있는 세포에서의 MMP의 변화를 반영할 수 있다. monomer 형에 대하여 527nm (초록)를, JC-1 집합체 형에 대하여는 590nm(빨강)인 두 가지 자극 주파수가 있다. 간단하게, 세포들을 수거하여 37℃에서 30분간 10 μM JC-1로 배양하였다. 세포들을 차가운 PBS로 한번 더 세척한 후, DNA 유세포분석기를 사용하여 분석하였다.

5. 웨스턴 블럿 분석과 카스파아제 활성

웨스턴 블럿 분석을 위해, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 겔에서 전기영동시켰고, 분리된 단백질을 electroblotting으로 nitrocellulose 막 (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA)에 옮겼다. 카스파아제 활성은 카스파아제-3과 카스파아제-8 활성 키트(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 colorimetric 분석에 의해 측정하였다.

6. siRNA 처리

세포를 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라, Bid 및 DR5 siRNA (Dharmacon, Chicago, IL, USA) 혹은 대조군으로서 동량의 비특이적 대조군 RNA (Dharmacon)로 형질전환시켰다. siRNA의 형질전환 후, 세포를 지시된 조건하에서 배양한 후 24-40 시간 동안 배양하였다.

7. 통계 분석

모든 데이터는 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었다. 그룹 간 유의미한 차이는 unpaired Student’s t-test를 이용해 측정하였다. ＊p＜0.05 값을 통계학적으로 유의미한 값을 지시하는 것으로 간주하였다. 본 발명에서 나타낸 모든 수치는 적어도 세 번의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다.

결과

1. 나린제닌은 TRAIL -내성 A549 세포에서 TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시킨다.

도 1A에서 보듯이, 10-10,000ng/mL의 TRAIL로 처리한 경우 H460 세포에서 동일 제제로 처리한 것과 비교하여 A549 세포에서 24시간에 걸쳐 제한적인 세포 사멸을 유도하였다 (도 1A). 이는 A549 세포가 TRAIL에 내성이 있음을 시사한다. 다음으로 A549 세포에서 나린제닌 단독 혹은 TRAIL과의 공동 처리시의 항증식 효과를 조사했다. 비록 가장 높은 농도에서는 MTT의 감소에서 세포활성이 미약하게 감소하였지만, 나린제닌 농도가 500μM에 이르기까지 세포증식을 저해했다. 그러나, 세포 생존능력은 지시된 조건에 의해 현격히 감소하였다(도 1B). 게다가, A549 세포에 100μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL을 12시간 동안 공동으로 처리한 경우 아폽토시스체를 증가시켰으나, 이에 반해 나린제닌이나 TRAIL를 단독 처리한 경우는 그렇지 못했다 (도 1C). 유세포 분석 결과, 12시간 동안 100μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL의 공동 처리한 경우 A549 세포의 괴사가 아니라, 증가된 아폽토시스를 확인할 수 있었다(도 1D 및 도 1F). 또한, 인간 정상 폐 섬유아세포 WI-38 세포에서 나린제닌에 TRAIL을 추가한 경우 항증식 효과를 나타내는지의 여부에 대한 조사결과, 비처리된 세포에 비해서, TRAIL 단독, 나린제닌 단독 혹은 나린제닌에 TRAIL을 추가하여 처리된 정상 폐 WI-38 세포에서는 감소된 세포증식은 관찰되지 않았다(도 1E). 이러한 결과로부터 나린제닌과 TRAIL의 공동처리를 한 경우 TRAIL-내성 A549 세포에서 선택적 아폽토시스 유도를 할 수 있음을 알 수 있다.

2. 나린제닌에 의한 TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성은 카스파아제에 의존적이다.

아폽토시스 신호의 활성화를 확인하기 위해서, 세포를 100ng/mL TRAIL과 100μM 나린제닌 단독 혹은 공동으로 정해진 시간 동안 처리한 결과, 나린제닌과 TRAIL의 공동처리는 시간-의존적으로 프로카스파아제-3과 프로카스파아제-8을 효과적으로 감소시켰다. 그러나, 100 μM 나린제닌을 단독 처리한 경우는 카스파아제의 단백질 분해 프로세싱을 유도하지 못했다. TRAIL를 단독으로 처리한 경우는 프로카스파아제-3과 프로카스파아제-8은 분해되지 않거나 12시간째에 겨우 일부만 분해되었다. PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)는 TRAIL 혹은 나린제닌의 단독처리시에는 저하되지 않았던 것에 반해, 공동처리 후 6-12 시간부터 점진적으로 저하되었다(도 2A). 대조적으로, WI-38 세포는 같은 제제의 처리에서 단백질 분해 진행을 유도하지 못했다(도 2A). 이와 유사한 카스파아제 활성화 패턴은 나린제닌에 TRAIL을 추가한 것에 대한 반응에서도 관찰되었다(도 2B). 이렇게 상승적으로 증가된 카스파아제 활성이 아폽토시스의 결과인지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 광범위-카스파아제 억제제인 z-VAD-fmk를 50μM 추가하여 카스파아제를 억제하였다. 이 처리로 인해 A549 세포에서 100μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL의 공동처리에 의한 sub-G1 개체군을 효과적으로 감소시켰다(도 2C). 이러한 결과들은 TRAIL-내성 A549 세포에서, 나린제닌과 TRAIL의 공동 효과에 의해 유도된 아폽토시스가 카스파아제의 활성화와 연관되어 있음을 가리킨다.

아폽토시스 단백질 억제자(IAP)를 포함한 몇몇의 세포내 단백질은 카스파아제-3과 카스파아제-7-매개성 아폽토시스를 억제할 수 있는 능력이 있다. 따라서, TRAIL-내성 A549 세포에서 나린제닌이 TRAIL 유도 아폽토시스를 증가시키는 메카니즘을 알아보기 위해, 나린제닌이 이들 항-아폽토시스 단백질의 발현 수준을 하향조절할 수 있는지에 대해 조사하였다. 그러나, 나린제닌과 TRAIL의 단독, 혹은 공동처리에 대하여 테스트된 IAP 단백질 (XIAP, c-IAP1 및 c-IAP2)의 수준에서 유의적인 차이는 발견할 수 없었다(도 2D).

3. 나린제닌의 민감성 증진을 위해 Bid 분해( cleavage )를 필요로 하므로, 미토콘드리아에서의 amplification 이 필요하다.

세포의 운명을 결정하기 위해, Bcl-2 단백질 패밀리의 프로-아폽토시스과 항-아폽토시스 멤버들은 다양한 업스트림 생존 및 위험 신호들을 해석하는 것이 필요하다. 따라서, 본 발명자들은 공동처리가 Bcl-2 패밀리 멤버들의 발현을 조절함으로써 아폽토시스를 유도하는 것이 아닌지 조사한 결과, 100μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL의 단독 혹은 공동처리는 A549 세포에서 Bcl-2, Bcl-XL와 Bax 단백질의 발현 수준에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었고(도 3A), 이와 대조적으로, 프로-아폽토시스적인 Bim_EL, BH3-단독 Bcl2 단백질의 발현은 나린제닌과 TRAIL의 공동처리에 의해 약간 상향조절되었으나, 나린제닌과 TRAIL의 단독처리에서는 그렇지 않았다(도 3A). 다음으로, A549 세포에서 나린제닌과 TRAIL이 Bid 분해에 미치는 영향을 조사하였다. Bid 분해는 완전체 Bid 당백질의 감소로서 측정하였는데, 이유는 항체가 오직 완전체 Bid 단백질만을 인식하고 분해 산물은 인식하지 못하기 때문이다(도 3A). A549 세포에 대한 100ng/mL TRAIL 처리는 전체 Bid의 미약한 감소 결과를 보였고 이는 제한적인 Bid 분해를 의미하며, 50-200 μM 나린제닌 처리는 Bid 분해를 유도하지 않았다. 그러나, 나린제닌과 TRAIL의 공동 처리시 완전체 Bid가 확연히 감소하였음을 알 수 있었다 (도 3A). 다음으로, 세포의 나린제닌과 TRAIL 유도 아폽토시스에서 미토콘드리아의 역할을 MMP에 대한 나린제닌과 TRAIL의 영향을 조사하여 알아보았다. 그 결과, 50-200 μM 나린제닌으로 12시간 처리한 세포는 MMP 손실에 아무런 영향도 미치지 않았고, 100ng/mL TRAIL의 존재하에서도 거의 영향이 없었다. 대조적으로, 나린제닌과 TRAIL의 공동처리는 A549 세포에서 MMP의 손실에 현저한 농도의존적 증가를 야기하였다(도 3B). 이러한 결과는 TRAIL-내성 A549 세포에서 나린제닌/TRAIL-유도 아폽토시스에 미치는 미토콘드리아의 직접적인 역할을 시사한다. 나린제닌과 TRAIL에 의해 유도된 아폽토시스에서의 Bid의 역할을 확인하기 위해, siRNA-매개로 제거된 Bid 발현이 세포 사멸에 대한 방어를 할 수 있는지 조사한 결과, 도 3C에 나타나 있듯이, Bid 녹다운은 100ng/mL TRAIL 단독 혹은 100μM 나린제닌과의 공동작용 하에서 아폽토시스의 유도(도 3C)와 MMP 손실(도 3D)를 현저히 감소시켰으며, 이는 나린제닌이 TRAIL-유도 tBid 분해가 미토콘드리아 아폽토시스 프로그램을 유발하는 역치를 낮추는데 효과적인 역할을 한다는 것을 보여주었다.

4. 나린제닌은 DR5 의 상향조절을 통해 TRAIL 에 의해 유도되는 아폽토시스를 증가시킨다.

나린제닌이 아폽토시스를 유도하는 메카니즘을 이해하기 위해, A549 세포와 WI-38 세포에서 DR4와 DR5 발현의 나린제닌의 효과를 연구했다. 나린제닌은 시간-의존적 그리고 농도-의존적 방식으로 DR5 단백질 수준을 증가시켰고, A549 세포에서 나린제닌 노출 후에 DR4 수준에서 미약한 증가가 관찰되었다(도 4A와 도 4B). 대조적으로, 50-200 μM 나린제닌 처리한 WI-38 세포에서 DR4와 DR5 단백질 수준은 바뀌지 않았다(도 4C). 나린제닌이 DR5 상향조절을 통해 TRAIL이 유도하는 아폽토시스를 증가시키는지를 알아보기 위해서, DR5 siRNA와 함께 DR5 발현이 없는 세포에서 MMP의 결여와 아폽토시스 유도에 나린제닌과 TRAIL의 공동작용이 미치는 영향을 조사했다. 나린제닌은 대조군 siRNA이 주입된 세포에서 DR5 수준을 증가시켰다(도 4D, 2번줄). DR5 siRNA가 주입된 세포에서 DR5의 기초 수준은 감소되었고(도 4D, 3번줄), 100 μM 나린제닌으로 12시간 처리해도 더 이상 증가하지 않았다(도 4D, 4번줄). 이러한 결과들은 DR5 발현의 성공적인 부재를 나타낸다. MMP 분석의 형광-활성세포 선별 분석기는 대조군 siRNA가 주입된 세포에서는 MMP의 손실을 70%까지 감지했지만, 100 μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL로 공동처리된 DR5 siRNA가 주입된 세포에서는 MMP의 손실을 35%만 감지했다(도 4E). 게다가, 대조군 siRNA를 주입한 세포에서 100 μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL로 공동처리함으로써 DR5 발현을 사일런싱한 경우 PARP의 분해가 억제되고 프로카스파아제-3를 감소시켰다. 이러한 결과들은 나린제닌 유도 DR5 발현의 차별적인 조절이 A549 세포에 대항하는 공동 처리의 선택적 아폽토시스 유도의 원인이 될 수 있음을 시사한다. 종합적으로, 상기 결과들은 DR5의 상향조절이 나린제닌과 TRAIL의 공동작용으로 인한 아폽토시스의 미토콘드리아 의존적 증가를 매개하는 중대한 사건임을 보여준다.

5. 나린제닌 / TRAIL 공동처리는 클론원성 생존 ( clonogenic survival )을 감소시킨다.

나린제닌과 TRAIL의 공동처리 후 TRAIL-내성 NSCLC 세포의 클론원성 능력을 조사하기 위해서, A549 세포를 100 μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL로 단독 처리 또는 공동처리하여 배양하였다. 24시간 후, 죽은 세포를 제거하고, 처리 후 1, 2, 3, 5, 10, 15일째에 재성장 종양 세포 콜로니의 세포 생존능력 분석을 수행하였다(도 5A와 도 5B). 100μM 나린제닌을 단독처리한 배양은 48시간 후에 생존 세포의 뚜렷한 감소를 야기하였다. 그러나, 5일째에는 종양 세포의 재성장이 이미 초기 세포 손실을 보상한 것보다 더 많아졌다 (도 5A). 100μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL를 공동처리한 배양은 결과적으로 in vitro 상의 종양 세포 제거를 유지하면서 클론원성 종양(clonogenic tumor)의 생존을 감소시키는 것으로 나타났다 (도 5B).

나린제닌과 TRAIL의 공동처리가 민감성-내성 표현형을 가진 종양을 재-확립할 수 있는 내성 종양 세포를 선택할 수 있는지 여부는 임상적 영역이다. 따라서, 본 발명자들은 A549 세포를 100 μM 나린제닌과 100ng/mL TRAIL로 밤새 처리하고, 산발적으로 생존하는 세포를 추가적으로 2개월 동안 성장시켰다. 그러나, 이들 pulse-selected 세포를 여전히 100 혹은 100-200 μM 나린제닌 처리에 의해 100ng/mL TRAIL 유도 아폽토시스에 대해 재-민감화시킬 수 있었다 (도 5C와 도 5D). 따라서, pulse-selection은 나린제닌과 TRAIL의 공동 처리에 내성이 있는 종양 세포 변형체들을 선발할 수 없다.

Claims (9)

1. 나린제닌 및 TRAIL(Tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 TRAIL에 내성을 갖는 폐암 세포에 특이적으로 작용하여 내성 저해 활성을 갖는 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 나린제닌 및 TRAIL은 TRAIL 내성 폐암 세포에서 TRAIL 수용체인 DR 5(death receptor 5)의 발현을 증가시켜 TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성(sensitization)을 증가시키는 것인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 나린제닌 및 TRAIL은 TRAIL 내성 폐암 세포에서 프로카스파아제-3(procaspase-3)및 프로카스파아제-8(procaspase-8)을 감소시키는 활성을 갖는 것인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 나린제닌 및 TRAIL은 TRAIL 내성 폐암 세포에서 Bid의 분해(cleavage)를 촉진시키는 활성을 갖는 것인 조성물.
7. 나린제닌을 유효성분으로 포함하는, TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성(sensitization)을 증진시키기 위한 TRAIL 병용제제.
8. 제7항에 있어서, 상기 나린제닌은 TRAIL 내성 폐암 세포에서 TRAIL 수용체인 DR 5(death receptor 5)의 발현을 증가시킴으로써 TRAIL 유도 아폽토시스에 대한 민감성을 증진시키는 것인 TRAIL 병용제제.
9. 제8항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)인 TRAIL 병용제제.

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