KR20190025288A - 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 황숙종 유래의 화합물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 황숙종 유래의 화합물을 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황숙종(黃熟種)에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 황숙종(黃熟種)에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물인 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)은 DPPH 자유라디칼 소거능, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능이 우수하므로, 천연물 유래 신규 항산화, 항염 및 주름개선용 조성물로 활용 가능하다.

Description

항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 황숙종 유래의 화합물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetics Composition Containing Compounds Having Anti-oxidant, Anti-inflammatory and Anti-wrinkle Derived from Hwangsook-jong}
본 발명은 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 황숙종(黃熟種) 유래의 화합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 황숙종에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
나린제닌(Naringenin)은 플라보노이드의 일종인 플라바논(Flavanone) 무배당체로서 벤젠 고리를 2개 가지고 있으며 그레이프프루트, 오렌지, 유자 등의 감귤류에 많이 들어있다. 나린제닌은 알레르기에 의한 히스타민의 생산을 억제하는 작용이 있고, 꽃가루 알레르기 등을 완화시키며, 천식 증상을 개선하는 효과가 있다는 연구가 보고되어 있다. 또한, 암 세포에서 손상된 DNA를 복구하는데 효과가 있으며 발암물질인 아플라톡신 B1의 활성을 저해하는 효능도 있다. 또한, 항산화 효과, 항염증, 지방감소, 탄수화물 대사 증진, 면역시스템 조절 등에 효과가 있다.
나린제닌을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0087662호「나린게닌을 유효성분으로 포함하는 체모 성장 억제용 조성물」, 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0067715호「나린제닌 및 ＴＲＡＩＬ을 포함하는 폐암 치료 및 예방용 조성물」, 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0062528호「나린제닌을 포함하는 항균용 렌즈」, 대한민국 등록특허공보 제10-0375047호「나린진 또는 나린게닌을 유효 성분으로 함유하는 알코올대사 촉진을 위한 건강음료조성물」 등이 개시되어 있다.
캠페롤(Kaempferol)은 노란색 가루로 전형적인 C6-C3-C6의 구조를 가진 중요한 플라보노이드중의 하나이며, 사과, 양파, 부추, 감귤류, 포도, 레드와인, 고추나물에 포함되어 있다. 캠페롤은 지방과 DNA의 산화위험을 막고 강한 항산화 작용을 하며 암세포 형성을 억제하는 화학적 예방 작용제로서 사용되고 있다.
캠페롤을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1634210호「캠페롤을 유효성분으로 함유하는 충치와 치주질환 예방 또는 치료용 조성물」, 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0097275호「캠페롤(Kaempferol(KM))을 포함하는 활성산소에 의한 기관지 질환 예방 및 치료용 조성물」, 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0084010호「캠페롤, 퀘세틴, 또는 클로로제닉산의 베타 엔도르핀분비를 통한 우울증 질환의 예방 또는 치료효과」 등이 개시되어 있다.
한편, 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물이다. 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약으로 질병을 예방하고 수명을 연장시키기 위한 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능은 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암 활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진 효능, 심혈관 장해 개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 작용, 항피로 작용, 항산화 활성, 노화 억제 등이 있다.
인삼속(Panax) 고려인삼종(Ginseng)에는 4가지 변종인 자경종(紫莖種, var. jakeungjong), 황숙종(黃熟種, var. hwangsookjong), 청경종(靑莖種, var. chungkeangjong) 및 등황숙종(橙黃熟種, var. deunghwangsookjong)이 있다. 이 중 황숙종은 열매 생성 시기에 노란색 열매가 생기는 것이 특징이며, 1926년과 1928년 경기도 장단군 인삼포에서 처음 발견된 변이종으로 일부 농가에서 재배하고 있다. 황숙종은 자경종에 비하여 내병성이 강하기 때문에 생존율이 높고, 단위 면적 당 생존 본수가 많기 때문에 생산수량이 많으며, 홍삼 품질에서도 황숙종이 자경종에 비하여 천삼 등급이 높다고 보고되어 있다. 또한, 황숙종은 배수 불량지에서의 생존율 역시 다른 종에 비하여 높으며, 인삼 생장이 적절한 20℃ 이하 온도에서 자경종및 청경종에 비하여 광합성량이 월등히 높아 다른 종에 비하여 우수한 성장력을 나타내고 있다.
황숙종을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0058718호「황숙종 인삼 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물」이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 황숙종 유래의 항산화, 항염 및 주름개선 활성물질을 찾기 위하여 노력한 결과, 황숙종 열매에서 분리된 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)이 DPPH 자유라디칼 소거능, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능이 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 공개특허공보 제10-2015-0087662호 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0067715호 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0062528호 대한민국 등록특허공보 제10-0375047호 대한민국 등록특허공보 제10-1634210호 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0097275호 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0084010호 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0058718
본 발명의 목적은 천연물인 황숙종(黃熟種)으로부터 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 우수한 화합물 및 이를 포함하는 항산화, 항염 및 주름개선용 조성물을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황숙종(黃熟種)에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 황숙종은 황숙종의 열매 부위를 사용한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 황숙종은 황숙종 열매 추출물로부터 분획하여 얻은 황숙종 열매 분획물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물은 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 나린제닌(Naringenin)은 (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 캠페롤(Kaempferol)은 (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 DPPH 자유라디칼 소거능, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물인 나린제닌(Naringenin)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물인 캠페롤(Kaempferol)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명으로부터 제공되는 황숙종(黃熟種)에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물인 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)은 DPPH 자유라디칼 소거능, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능이 우수하므로, 천연물 유래 신규 항산화, 항염 및 주름개선용 조성물로 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 황숙종 열매 추출물(Y), 황숙종 열매 n-헥세인(n-Hexane) 분획물(1), 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물(2), 황숙종 열매 n-부탄올(n-Butanol) 분획물(3), 황숙종 열매 물(Water) 분획물(4), 자경종 열매 추출물(R), 자경종 열매 n-헥세인(n-Hexane) 분획물(1’), 자경종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물(2’), 자경종 열매 n-부탄올(n-Butanol) 분획물(3’) 및 자경종 열매 물(Water) 분획물(4’)의 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 황숙종 열매 추출물, 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물, 자경종 열매 추출물 및 자경종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물의 세포활성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 황숙종 열매 추출물, 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물, 자경종 열매 추출물 및 자경종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물의 DPPH 자유라디칼 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 황숙종 열매 추출물, 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물, 자경종 열매 추출물 및 자경종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물의 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 황숙종 열매 추출물, 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물, 자경종 열매 추출물 및 자경종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물의 엘라스타아제(Elastase) 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물로부터 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 나린제닌(Naringenin)의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 캠페롤(Kaempferol)의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)의 DPPH 자유라디칼 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)의 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)의 엘라스타아제(Elastase) 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서는 부작용 위험이 낮으면서, 효과가 우수한 천연물 유래의 항산화, 항염 및 주름개선용 활성물질을 개발하고자 하였다.
본 발명에서는 황숙종 열매 추출물에서 분리된 화합물이 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 가지고 있다는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 유기용매로 황숙종 열매를 추출하였고, 황숙종 열매 추출물을 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC) 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 DPPH 자유라디칼 소거능, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능, 즉 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 활성물질을 순차적으로 분리하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 황숙종(黃熟種)에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 “황숙종”이라 함은 황숙종 열매 추출물로부터 분획하여 얻은 황숙종 열매 분획물을 의미한다.
상기 황숙종은 황숙종의 전초(잎, 뿌리, 줄기)를 한 번에 사용하는 것이 아닌 황숙종의 열매 부위를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 황숙종 열매 추출물은 황숙종 열매를 유기용매 또는 물로 추출하여 얻을 수 있다. 상기 유기용매로는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 등의 극성 용매; 헥산, 에테르, 벤젠, 톨루엔 등의 무극성 용매; 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드 등의 중간극성 용매를 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 황숙종 열매 추출물은 에탄올 등의 유기용매 또는 물에 황숙종 열매를 환류, 침지, 중탕, 증류시켜 추출하거나 초임계 추출 또는 마이크로파 추출법으로 추출할 수 있으며, 여과 및 농축과정을 통하여 획득할 수 있다.
한편, 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 가진 것으로 확인된 황숙종 열매 추출물을 분획할 경우, 항산화, 항염 및 주름개선 활성 성분을 함유하는 분획물을 분리할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 황숙종 열매 추출물을 각각 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 순차분획하여 각각의 분획물을 획득하고, 획득한 분획물을 가지고 항산화, 항염 및 주름개선 활성 실험을 수행하였다. 그 결과, 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물이 우수한 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 분획물은 유기용매의 극성에 따라 용해되는 화합물들을 분리하는 통상의 방법으로 획득할 수 있으며, 본 발명에서는 먼저 추출한 황숙종 열매 추출물에 각각 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획하여 n-헥세인 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물을 획득하였다.
본 발명에서는 또한, 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 우수한 것으로 확인된 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 크로마토그래피를 수행하면 항산화, 항염 및 주름개선 활성 본체를 분리 및 동정할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC) 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성 본체를 분리하고, 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 이용하여 구조동정 함으로써, 항산화, 항염 및 주름개선 활성 본체가 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)이라는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 나린제닌(Naringenin)은 (a) 황숙종 열매를 유기용매로 환류추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득할 수 있다.
또한, 상기 캠페롤(Kaempferol)은 (a) 황숙종 열매를 유기용매로 환류추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득할 수 있다.
상기 중압용 크로마토그래피(MPLC) 수행시 이동상은 클로로포름 및 메탄올을 이용하는 것이 바람직하며, 클로로포름 : 메탄올의 비율이 100:0에서 순차적으로 0:100이 되도록 하는 것이 더욱 바람직하다.
전술된 바와 같이, 황숙종에서 분리된 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)을 유효성분으로 함유할 경우, DPPH 자유라디칼 소거능, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성이 우수하므로, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 항산화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물에서, 상기 황숙종에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물인 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 0.0001 내지 0.1 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 항산화, 항염 및 주름개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 황숙종 열매를 유기용매로 환류추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물인 나린제닌(Naringenin)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 황숙종 열매를 유기용매로 환류추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물인 캠페롤(Kaempferol)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 황숙종 열매 추출물 제조
황숙종(놀뫼인삼社, 한국) 열매 1kg에 유기용매 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 환류 추출한 다음, 감압여과시킨 후 여액을 60℃ 이하의 수조에서 감압 농축하여 약 60brix의 농축액을 얻었고, 최종 황숙종 열매 추출물(약 0.2kg)을 수득하였다.
<실시예 2~4> 황숙종 열매 분획물 제조
실시예 1에서 제조된 황숙종 열매 추출물(농축액) 총량(0.2Kg)의 10배의 증류수(2L)를 가하여 균질하게 현탁시킨 후, 분획을 실시하였다. 분획은 분액깔때기를 이용하여 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획하여 각각 n-헥세인층(0.94g), 에틸아세테이트층(2.27g), n-부탄올층(14.08g) 및 물층(4.67g)을 얻었다.
황숙종 열매 분획물
실시예 2 황숙종 열매 n-헥세인(n-Hexane) 분획물
실시예 3 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물
실시예 4 황숙종 열매 n-부탄올(n-Butanol) 분획물
실시예 5 황숙종 열매 물(Water) 분획물
<비교예 1> 자경종 열매 추출물 제조
자경종(놀뫼인삼社, 한국) 열매 1kg에 유기용매 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 환류 추출한 다음, 감압여과시킨 후 여액을 60℃ 이하의 수조에서 감압 농축하여 약 60brix의 농축액을 얻었고, 최종 자경종 열매 추출물(약 0.2kg)을 수득하였다.
<비교예 2~4> 자경종 열매 분획물 제조
비교예 1에서 제조된 자경종 열매 추출물(농축액) 총량(0.2Kg)의 10배의 증류수(2L)를 가하여 균질하게 현탁시킨 후, 분획을 실시하였다. 분획은 분액깔때기를 이용하여 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획하여 각각 n-헥세인층(0.85g), 에틸아세테이트층(2.13g), n-부탄올층(11.91g) 및 물층(4.74g)을 얻었다.
자경종 열매 분획물
비교예 2 자경종 열매 n-헥세인(n-Hexane) 분획물
비교예 3 자경종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물
비교예 4 자경종 열매 n-부탄올(n-Butanol) 분획물
비교예 5 자경종 열매 물(Water) 분획물
<시험예 1> Thin Layer Chromatography (TLC) 분석
실시예 1~5 및 비교예 1~5의 성분적 차이를 정성분석을 통해 알아보고자, TLC 분석을 하였다. Silica gel TLC plate(20×20 cm silica gel 60 F254, Aluminium plate, Merck)에 실시예 1~5 및 비교예 1~5를 각각 20㎕를 점적하였다. 점적한 TLC plate를 클로로포름, 메탄올 및 물(65:35:10(v/v/v)) 조건의 전개용매를 사용하여 전개하였다. 전개한 TLC plate는 10% H2SO4을 분사시킨 후 열을 가해 발색시켜 나타나는 패턴을 확인하였다.
기호 황숙종 및 자경종 열매 분획물
실시예 1 Y 황숙종 열매 추출물
실시예 2 1 황숙종 열매 n-헥세인(n-Hexane) 분획물
실시예 3 2 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물
실시예 4 3 황숙종 열매 n-부탄올(n-Butanol) 분획물
실시예 5 4 황숙종 열매 물(Water) 분획물
비교예 1 R 자경종 열매 추출물
비교예 2 1’ 자경종 열매 n-헥세인(n-Hexane) 분획물
비교예 3 2’ 자경종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물
비교예 4 3’ 자경종 열매 n-부탄올(n-Butanol) 분획물
비교예 5 4’ 자경종 열매 물(Water) 분획물
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이 실시예 1~5와 비교예 1~5는 서로 다른 뚜렷한 양상의 패턴을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 3의 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물에서 뚜렷한 노란색의 화합물을 확인하였다. 그 중에서도 서로 뚜렷한 양상의 패턴을 나타내는 실시예 1, 3 및 비교예 1, 3으로 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 확인하였다.
<시험예 2> 세포독성 시험 : WST-1 assay
실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 이용하여 세포에 대한 자극성을 갖는지 확인하기 위해 각질형성세포(Keratinocyte)를 대상으로 세포독성 실험을 진행하였다. 인간 각질형성 세포 HaCat(ACTT, CLS 300493, USA)을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 96well plate에 1.5 x 104 cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 각각 다양한 농도로 희석하여 시료들을 준비하였다. 농도별로 1㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합하고 각 well 농도별로 처리한 뒤, 이를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 배지는 제거하고, well당 10% WST-1(high sensitive Water Soluble Tetrazolium salt) 시약과 DMEM 배지와 혼합한 뒤 각 well에 처리하고 동일한 조건에서 2시간 동안 더 배양하였다. 2시간 뒤, Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로는 시료 대신 증류수(Distilled water)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 세포 활성도는 아래 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
세포 활성도(%) = (실험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) X 100
Cell viability(%)
농도(㎍/㎖) 0 3.125 6.25 12.5 25 50 100
실시예 1 100 96.91 99.52 99.30 99.09 96.78 92.71
실시예 3 100 100 99.75 99.25 97.66 96.95 96.30
비교예 1 100 99.28 97.53 95.76 96.69 96.04 93.90
비교예 3 100 95.95 93.86 94.26 93.54 94.86 93.49
그 결과, 표 4 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1, 3 및 비교예 1, 3의 최고 농도인 100㎍/㎖에서도 모두 세포독성이 없는 것으로 나타난 것으로 보아, 독성이 없는 안전한 원료로 사용이 가능함을 확인하였다.
<시험예 3> 항산화 시험 : DPPH assay를 통한 Free radical 소거 활성
실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 이용하여 항산화 효능을 확인하기 위해 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 자유라디칼 소거 활성 시험을 진행하였다. 먼저, 실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 각각 다양한 농도로 희석하여 시료를 준비한 후, 이들 시료와 100μM DPPH(1,1-diphenyl 2-picrylhydrazyl) 용액을 혼합하고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96well plate에 담아 DPPH 양을 520nm에서 측정하였다. 그리고 시료를 넣지 않은 경우를 음성대조군으로 하여 아래의 수학식 2에 의해 시료의 자유라디칼 소거량(Free radical scavenging activity, %)을 계산하였다. 이때, 비타민 C인 아스코빅산(Ascorbic Acid) 2.5㎍/㎖를 양성 대조군으로 이용하여 실험을 진행하였다.
[수학식 2]
자유라디칼 소거능(%)=100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)]
Free radical scavenging(%)
농도(㎍/㎖) 0 1.56 3.125 6.25 12.5 25 50 100
실시예 1 0 0.24 1.18 1.88 4.24 6.12 17.65 34.59
실시예 3 0 6.64 11.85 22.04 35.55 50.24 68.25 82.70
비교예 1 0 0 0 0.02 0.12 0.08 1.77 3.15
비교예 3 0 0.16 0.67 9.12 19.67 38.79 61.43 71.98
그 결과, 상기 표 5 및 도 3에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1 및 실시예 1의 경우 미약한 DPPH 자유라디칼 저해능을 나타냈으나, 비교예 3 및 실시예 3은 유의성 있는 라디칼 소거 효과를 보여 항산화 활성이 우수함을 확인하였다.
<시험예 4> 항염 효능 시험 : 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 활성
실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 이용하여 항염 효능을 확인하기 위해 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 시험을 진행하였다. 니트릭 옥사이드(Nitric oxide)는 체내에서 L-아르기닌이 시트룰린을 생성할 때 생성되는 것으로, 과잉 생성 시 우리 몸의 산화를 촉진시키는 자유라디칼(Free radial)로 알려져 있다. 염증 유발인자인 LPS(Lipopoly- saccharide)를 RAW 264.7 cell에 처리하여 NO의 생성량을 활성화 시킨 후, Griess 분석 방법을 통해 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 발현양을 측정하였다. LPS는 그람음성균 표층의 펩타이드글리칸을 둘러싸는 외막의 중요한 구성성분으로, '염증 유발 인자'라고 알려져 있다. 이 LPS가 Macrophage의 표면에 있는 Receptor를 통해 Macrophage에 Activating signal을 주고, iNOs의 발현에 영향을 주어 NO를 많이 합성할 수 있게 한다고 알려져 있다. 이 반응을 통해 Monocyte 형태인 RAW 264.7 cell이 Macrophge 형태로 변하게 된다. 이러한 실험 원리에 따라 항염증 효과를 알아보기 위하여, RAW 264.7 cell을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 24well plate에 2.0 x 104 cell/well 씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 각각 다양한 농도로 희석하여 준비한 시료들을 농도별로 40㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합한 뒤, 각 well농도별로 처리하였다. 이를 다시 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide)를 발현시키기 위해, LPS를 1㎍/㎖도 같이 처리하였다. 그 후 배양액 중 100㎖를 96 well plate에 취하고 Griess reagent A 50㎕와 Griess reagent B 50㎕를 각각 넣어준 다음 각각 10min간 반응시킨 후, Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, NO2- (Nitrite)를 표준 용액으로 하여 측정하였으며, 이때 항염 효과가 있는 것으로 알려진 덱사메타손(Dexamethasone)을 양성 대조군으로 설정하여 처리하였다. 그리고 LPS를 처리하지 않은 군을 음성대조군으로 하여, LPS와 실시예 1, 3 과 비교예 1, 3을 각각 농도별로 처리한 실험군의 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해율은 아래의 수학식 3에 나타내었다.
[수학식 3]
니트릭 옥사이드 생성 저해율(%)= 100-(각 시료의 흡광도/대조군 흡광도)X100
Nitric Oxide inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 3.125 6.25 12.5 25 50 100
실시예 1 0 1.7 2.46 6.25 11.36 30.39 53.38
실시예 3 0 3.41 8.24 10.51 13.26 28.4 77.73
비교예 1 0 0 0 0 0 0.28 1.29
비교예 3 0 2.95 5.81 2.76 5.99 9.95 25.34
그 결과, 상기 표 6 및 도 4에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1, 3은 비교예 1, 3 대비 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능이 현저하게 높았으며, 특히, 실시예 중에서도 실시예 1의 황숙종 열매 추출물 대비 실시예 3의 황숙종 열매 에틸아세테이트 분획물이 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능이 현저하게 우수하여 항염 활성이 우수함을 확인하였다.
<시험예 5> 주름개선 효능 시험 : 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성
실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 이용하여 주름개선 효능을 확인하기 위해 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성 시험을 진행하였다. 엘라스아타제(Elastase)는 진피 내 피부탄력을 유지시키는 데 중요한 기질인 엘라스틴(Elastin)을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질단백질인 콜라겐(Collagen)을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서, 엘라스아타제(Elastase) 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, Ursolic acid 등이 엘라스아타제(Elastase) 저해제로서 이용되고 있다. 엘라스아타제(Elastase)는 동물 결합조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 엘라스틴(Elastin)을 분해시켜 피부의 진피조기의 그물망 구조 결합을 끊어줌으로서 주름생성의 주원인인 효소로 알려져 있다. 피부의 진피 조직 속에는 콜라겐(Collagen)과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴(Elastin)이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨어지면서 즉 엘라스틴(Elastin)이 엘라스아타제(Elastase)에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 그러므로 피부노화의 주원인 중의 하나인 엘라스틴(Elastin) 분해효소인 엘라스아타제(Elastase)의 활성을 저하시킴으로서 피부노화를 억제할 수 있다. 먼저, 실시예 1, 3 및 비교예 1, 3을 각각 다양한 농도로 희석한 시료 40㎕를 E-tube에 취하였다. 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 N-succinyl-(Ala)3-p- nitroanilide(S4760, Sigma) 1.6 mM 농도의 기질 200㎕를 가한 후, 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ(E0258, Sigma) 0.4U/mL의 효소를 40㎕ 첨가하여 25℃에서 5분 동안 반응시킨 후 분광분석기 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 올레아놀릭 산(Oleanolic Acid) 6.25㎍/㎖를 양성 대조군으로 이용하여 실험을 진행하였으며, 엘라스타아제 저해 활성은 아래의 수학식 4에 나타내었다.
[수학식 4]
엘라스타아제 저해 활성(%)= 100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)
Elastase inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 1.56 3.125 6.25 12.5 25 50 100
실시예 1 0 4.41 5.62 5.09 6.76 7.50 16.49 34.39
실시예 3 0 6.88 12.04 16.91 21.22 26.74 35.66 53.34
비교예 1 0 3.78 5.07 6.18 6.19 8.86 10.40 11.01
비교예 3 0 2.91 2.64 4.09 6.91 14.19 23.91 32.82
그 결과, 상기 표 7 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1, 3은 비교예 1, 3 대비 엘라스아타제(Elastase) 저해 활성능이 현저하게 높았으며, 특히, 실시예 중에서도 실시예 1의 황숙종 열매 추출물 대비 실시예 3의 황숙종 열매 에틸아세테이트 분획물이 엘라스아타제(Elastase) 저해 활성능이 현저하게 우수하여 주름 개선 효과가 우수함을 확인하였다.
<시험예 6> 황숙종 열매로부터 활성물질 분리
시험예 3~5에서 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 우수한 것으로 확인된 실시예 3의 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물의 활성물질을 실리카겔(Silica gel) 컬럼 크로마토그래피(Column Chromatography)를 MPLC(Medium pressure liquid chromatography, Biotage) 기기를 이용하여 11개(YE-1~YE-11)의 소분획으로 나누었다. 소분획 YE-1~11 중 시험예 3~5과 동일한 방법으로 DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 확인하였다. 그 결과, 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 우수한 소분획물 YE-3(900.8 mg)을 MeOH : D2O(2:1)의 혼합용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 시험예 3~5과 동일한 방법으로 DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물(YE-3-2 및 YE-3-5)을 분리 및 정제하였다.(도 6)
<시험예 7> 항산화, 항염 및 주름개선 활성물질 동정
시험예 6에서 분리된 화합물(YE-3-2)을 TLC 및 HPLC 분석을 통해 단일 화합물임을 1차적으로 확인한 뒤, 이를 구조 동정하기 위해 NMR을 이용하여 분석하였다. NMR은 Varian Inova AS 400(400 MHz, Varian, California, USA)을 사용하였고 시료를 pyridine-d 5 에 녹여 측정하였으며 TMS를 내부 표준물질로 사용하여 분석을 실시하였다.
그 결과, 1 H-NMR(400 MHz, Varian, California, USA), 13 C-NMR(100 MHz, Varian, California, USA) Spectrum을 통해 화합물(YE-3-2)은 화학식 1로 표시되는 나린제닌(Naringenin)이라는 것을 확인할 수 있었다.(도 7)
Figure pat00001
또한, 시험예 6에서 분리된 화합물(YE-3-5)을 TLC 및 HPLC 분석을 통해 단일화합물임을 1차적으로 확인한 뒤, 이를 구조 동정하기 위해 NMR을 이용하여 분석하였다. NMR은 VVarian Inova AS 400(400 MHz, Varian, California, USA)을 사용하였고 시료를 pyridine-d 5 에 녹여 측정하였으며 TMS를 내부 표준물질로 사용하여 분석을 실시하였다.
그 결과, 1 H-NMR(400 MHz, Varian, California, USA), 13 C-NMR(100 MHz, Varian, California, USA) spectrum을 통해 화합물(YE-3-5)은 화학식 2로 표시되는 캠페롤(Kaempferol)이라는 것을 확인할 수 있었다.(도 8)
Figure pat00002
<시험예 8> 분리 화합물의 항산화 효능 확인
시험예 6에서 분리되고, 시험예 7에서 각각 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)로 확인된 물질의 항산화 효능을 시험예 3에 기재한 DPPH assay를 통한 Free radical 소거 활성법으로 평가하였다.
Free radical scavenging(%)
농도(㎍/㎖) 0 1.56 3.125 6.25 12.5 25 50 100
나린제닌
(Naringenin)		 0 1.07 5.64 10.77 16.18 26.44 47.38 57.31
캠페롤
(Kaempferol)		 0 17.65 38.45 77.94 82.14 82.14 82.35 82.56
그 결과, 상기 표 8 및 도 9에서 확인할 수 있듯이, 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)은 유의성 있는 DPPH 자유라디칼 소거 효과를 보였으며, 특히, 캠페롤(Kaempferol)의 경우 양성 대조군인 아스코빅산(Ascorbic acid)과 거의 유사한 활성을 나타내었다. 따라서, 황숙종 열매 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물에서 분리된 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)은 DPPH 자유라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 우수함을 확인하였다.
<시험예 9> 분리 화합물의 항염 효능 확인
시험예 6에서 분리되고, 시험예 7에서 각각 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)로 확인된 물질의 항염 효능을 시험예 4에 기재한 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 활성법으로 평가하였다.
Nitric Oxide inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 3.125 6.25 12.5 25 50 100
나린제닌
(Naringenin)		 0 -3.08 0.97 4.86 15.55 52.82 91.22
캠페롤
(Kaempferol)		 0 20.58 57.68 80.85 92.03 99.32 98.35
그 결과, 상기 표 9 및 도 10에서 확인할 수 있듯이, 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)은 유의성 있는 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능을 나타내었으며, 특히, 캠페롤(Kaempferol)의 경우 저농도에서도 높은 활성을 나타내었으며, 양성 대조군인 덱사메타손(Dexamethasone) 보다 더 낮은 농도에서 현저하게 높은 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능을 갖고 있음을 확인하였다.
<시험예 10> 분리 화합물의 주름개선 효능 확인
시험예 6에서 분리되고, 시험예 7에서 각각 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)로 확인된 물질의 주름개선 효능을 시험예 5에 기재한 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성법으로 평가하였다.
Elastase inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 1.56 3.125 6.25 12.5 25 50 100
나린제닌
(Naringenin)		 0 2.35 3.05 8.54 15.87 23.57 29.99 35.37
캠페롤
(Kaempferol)		 0 4.71 6.97 19.53 27.20 31.88 40.57 54.10
그 결과, 상기 표 10 및 도 11에서 확인할 수 있듯이, 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)은 유의성 있는 엘라스아타제(Elastase) 저해 활성능을 나타내었으며, 두 화합물 모두 유의성 있는 엘라스아타제(Elastase) 저해 활성능이 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 황숙종(黃熟種)에서 분리된 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 황숙종은 황숙종의 열매 부위를 사용한 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 황숙종은 황숙종 열매 추출물로부터 분획하여 얻은 황숙종 열매 분획물인 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항산화, 항염 및 주름개선 활성을 갖는 화합물은 나린제닌(Naringenin) 및 캠페롤(Kaempferol)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 나린제닌(Naringenin)은
    (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
    (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계;
    (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 캠페롤(Kaempferol)은
    (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
    (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계;
    (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 DPPH 자유라디칼 소거능, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능을 갖는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
  9. (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
    (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계;
    (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물인 나린제닌(Naringenin)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법.
  10. (a) 황숙종 열매를 유기용매로 추출하고, 여과한 후, 여과된 여액을 농축시켜 추출물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 추출물에 순차적으로 n-헥세인(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), n-부탄올(n-Butanol) 및 물(Water)로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
    (c) 수득된 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계;
    (d) 상기 실리카겔 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 중수가 2 : 1로 혼합된 용매를 이동상으로 하여 분취용 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 자유라디칼 소거, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 저해 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 확인을 통하여 항산화, 항염 및 주름개선 활성이 가장 높은 화합물인 캠페롤(Kaempferol)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법.
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