KR20110062528A

KR20110062528A - 나린제닌을 포함하는 항균용 렌즈

Info

Publication number: KR20110062528A
Application number: KR1020090119277A
Authority: KR
Inventors: 임순호
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2011-06-10

Abstract

본 발명은 나린제닌(naringenin)을 포함하는 항균용 렌즈에 관한 것이다. 본 발명은 천연 항균물질 나린제닌이 렌즈의 다른 구성 화합물과 구조적으로 결합하여 제조된 렌즈로서, 렌즈로부터 나린제닌이 서방성으로 용출되어 장기간 항균 지속 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명은 안과 질환 균에 매우 효과적인 항균 효능을 나타내므로 안과용 렌즈, 특히 안과용 소프트 콘택트렌즈에 적합하다.

나린제닌, 서방성 방출, 항균, 콘택트렌즈

Description

나린제닌을 포함하는 항균용 렌즈{Antimicrobial Lenses Comprising Naringenin}

본 발명은 나린제닌(naringenin)을 포함하는 항균용 렌즈에 관한 것이다.

현재 첨단산업의 발달과 정보화 사회로 진입, 생활환경 악화 등으로 인한 시력저하 현상은 매년 급증하고 있으며, 이를 교정하기 위한 안경 및 콘택트렌즈의 착용율은 지속적인 증가를 보이고 있다.

최초 콘택트렌즈는 1508년 이탈리아의 레오나르도 다빈치가 물이 가득 찬 둥근 유리그릇을 이용한 실험과정에서 착안하여 개발되었으며, 1888년경 스위스 A. E. Fick이 유리로 만든 렌즈를 개발하였고, 1947년 Kevin Tuohy가 PMMA (polymethyl methacrylate)를 이용해서 하드 콘택트렌즈(hard contact lens)를 개발하였다. 그러나 이 렌즈는 산소부족으로 오는 눈의 문제점들을 해결할 수 없었으며, 이물감과 각막부종의 문제점을 가지고 있었다. 1950년대 후반에는 체코의 Otto Wichterle와 D Lim가 현재의 소프트렌즈의 기본 재질인 HEMA (2-Hydroxyethyl methacrylate)를 개발하였다^[1].

콘택트렌즈 재료로써 요구되는 특성은 굴절률(refraction), 함수율(water content), 생체적합성(biocompatibility), 광학적 투명성(optical transparent), 습윤성(wettability), 팽윤비(swelling rate), 산소투과성(oxygen permeability) 등의 조건들을 충족시켜야 한다^[2].

보통의 소프트 콘택트렌즈의 원료의 중합은 HEAM, NVP (N-vinyl pyrrolidone), MMA (methylemthacrylate), AIBN(azobis-2-methylpropionitrile) 개시제를 사용하여 중합한다. 중합은 전자저울(electronic scale)을 이용하여 배합된 재료를 바이알(vial)에 AIBN을 넣고 라운드 파이렉스 스핀 바(round pyrex spin bar)를 넣어 1시간 동안 교반기(stirrer)에 유지시킨다. 배합된 재료를 몰드(mould)에 넣고 중탕기에 70℃에서 약 1시간 30분을 유지시킨다. 배합된 재료를 몰드에서 꺼내어 상온에서 3시간 정도 건조한 후 오븐에 70℃을 유지하면서 1시간 동안 건조시켜 사용한다^[1].

소프트 콘택트렌즈는 착용자의 전신 건강상태, 안검의 상태, 눈물의 과부족, 렌즈처방의 문제, 착용전과 후의 눈의 변화 등에 따라서 여러 가지 부작용이 발생될 수 있다. 특히 소프트 콘택트렌즈를 오랜 기간 착용함에 따라 나타나는 각막 신생혈관, 연속착용 렌즈의 약 15%에게 나타나는 급성충혈, 렌즈를 끼고 수면 후 나타나는 각막미란, 오랜 기간 렌즈를 착용하면 발생하는 거대유두결막염, 가장 심각한 부작용으로는 렌즈로 인한 각막상처를 통해 세균이 침범하는 감염성 각막염 등이 있다. 이 중 렌즈로 인한 감염은 불결한 위생 상태나 부주의한 렌즈 관리용기의 소독에 의해 발생 할 수 있는데 심할 경우 시력을 잃을 수 있는 심각한 합병증을 유발할 수도 있다^[7-9].

이는 주로 사용자의 직업, 눈의 건강상태, 안질환, 약물사용, 전신질환, 미용, 콘택트렌즈와 눈의 광학적인 관계, 재료의 특성, 눈의 생리적인 상태, 렌즈 디자인 등을 충분히 고려하지 않는데서 부작용이 오는 경우가 많다. 특히 콘택트렌즈 착용 시 렌즈 표면의 이물질 부착은 콘택트렌즈 착용감을 저하시키며, 시력을 저하시키고, 콘택트렌즈를 변형시켜 세균감염에 원인이 되기도 한다^[9-12]. 따라서 콘택트렌즈는 사용방법과 관리에 따라 여러 가지 문제점을 유발시키는데, 콘택트렌즈의 단백질 침착물과 이물질이 미생물에 이상적 환경을 제공하여 각종 미생물의 부착과 증식을 촉진한다. 콘택트렌즈 세척제는 보관과 착용 시 멸균작용, 칼슘 침착방지 및 이물감을 없도록 해주는 역할을 한다. 그러나 이러한 기능의 세척제는 눈에 자극감 또는 화학적 안 외상을 줄 수 있으므로 그 적정 농도를 유지하는 것이 중요하다^[13,14].

미국의 역학조사에 의하면 콘택트렌즈와 관련된 감염성 각막염 환자는 지난 40년간 435% 증가하였다^[16]. 콘택트렌즈 착용자의 눈물에는 비 착용자의 눈물보다 세균이 더 많다고 보고되었으며, 소독방법에 따라 세균감염의 정도가 다르다고 보고되었다^[17]. 소프트콘택트렌즈는 단백질이나 유기물, 무기질, 칼슘염, 인산염, 환경오염물 등이 침착되기도 하며, 무코프로틴-리피드 컴플렉스(mucoprotein-lipid complex) 침착물이 유기-무기물 등과 결합해 혼합 침착물이 생기기도 한다. 또한 미생물의 오염이나 제조 과정상의 기계적 결합, 불순물 소화 및 퇴화로 인해 각막이 손상될 수 있다^[18].

소프트 콘택트렌즈는 착용한 후 렌즈의 35%에서 세균이 오염되었으며, 콘택트렌즈 사용기간이 길수록 오염도가 증가하였다^[19]. 콘택트렌즈 사용자에게 있어서 각막염을 일으키는 주요 원인 중 하나는 세균감염 인데, 콘택트렌즈에 기생하는 박테리아는 두 가지 종류가 있다. 그람 양성 세균(Gram positive bacteria)과 그람 음성 세균(Gram negative bacteria)으로 그람 양성 세균은 두껍고 단단한 세포벽을 가지는데 반해서 그람 음성 세균은 세포벽이 얇고 단백질로 덮여있다. 콘택트렌즈 연속 착용자에게 빈번하게 발생하는 세균은 그람 양성 세균인 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis)와 그람 음성 세균인 슈도모나스 에루지노사균(Pseudomonas aeruginosa)이며, 이들은 각막염을 유발시켜 각막의 모든 조직을 파괴하는 미생물이다^[20].

표피포도상구균은 눈 질환을 일으키는 원인 균으로 현재 가장 많이 보고 되고 있다^[21,22.]. 또한 이 균은 중심성 각막궤양의 원인 균이며, 소프트 콘택트렌즈 착용자에게 잘 감염되어 심한 전방 축농을 동반하고 궤양부의 삼출물과 침윤 부위가 세균의 생산색소에 의해 특징적인 청록색을 띠기 때문에 슈도모나스 에루지노사 균 각막궤양이라 한다. 슈도모나스 에루지노사균 각막염에서 유착을 중개하는 중요한 역할을 하는 인자로 섬모(pili), 세균의 표면의 물리화학적 전하(bacterial physiochemical net surface charge), 탄수화물 접착성(carbohydrate adhesions), 글리코릭스(glycocalyx), 외독소(exotoxins), 내독소(endotoxins) 등이 알려져 있다^[23]. 황색포도상구균 감염은 콘택트렌즈 사용자가 렌즈 소독을 원칙에 따라 하지 않는 요인도 있으나, 황색포도상구균을 살균할 수 있는 용매가 콘택트렌즈 보존액에 전혀 첨가되지 않거나 첨가물의 살균효과가 없기 때문이다.

소프트 콘택트렌즈는 눈에 착용하는 순간부터 누액성분과 세균으로 구성된 바이오필름(biofilm)으로 오염된다. 콘택트렌즈를 눈에서 빼내면 세척과 소독을 반드시 해야만 세균에 의한 부작용을 막을 수 있다. 따라서 현재에는 콘택트렌즈와 관련된 부작용과 불편감을 줄이기 위해 일회용 렌즈나 정기적으로 교체하는 렌즈를 더 선호하고 있다.

이러한 세균을 없애는 방법으로 콘택트렌즈를 소독하는데, 소독방법으로 크게 열소독과 화학 소독이 있다. 열소독은 콘택트렌즈의 파라미터에 영향을 줄 수 있고 변색될 수 있는 단점이 있어 화학 소독을 많이 사용한다. 화학소독의 방법으로는 Isen(1972)에 의해 처음 소개된 3% 과산화수소(H₂O₂)를 이용한 소독방법이 있다^[24]. 3% 과산화수소는 유기물질이 접촉하면 산소가 발생하면서 산화작용으로 살균효과를 나타내며, 매우 반응성이 뛰어난 유리 산소기를 생성하여 세포 구조물들과 빠르게 결합한다. 또한 물과 산소로 분해되며 중화가 필요하고 무방부제 형 태로 이용 가능하다. 백금 촉매용 디스크를 이용하여 소독과 동시에 물과 산소로 분해되는 중화 과정 시간이 많이 소요되지만 세균, 진균 그리고 가시아메바(Acanthaamoeba) 까지 소독하는 효과가 있어 최근 많이 사용되고 있다^[25].

미국의 경우 USP (United State Pharmacopoeia)나 FDA (Federal Food and Drug Administration)는 보존제가 접촉하는 조직에는 독성 효과를 유도하지 않아야 한다고 규정하고 있다. 합성 보존제는 각막과 결막 건조증 환자의 경우 장기간 사용 시에 눈에 독성을 일으키는 것으로 알려져 있다^[26]. 또한 연성 콘택트렌즈를 사용은 안구 건조증 환자의 경우도 합성 보존제에 의한 부작용 때문에 합성 보존제가 들어 있는 인공누액의 사용을 금지하고 있다^[27-30].

이처럼 부작용을 일으키는 합성 보존제를 대체할 수 있는 물질로는 천연항균물질이 효과적이다. 김^[31]등은 천연 보존제로 알려진 나린제닌(naringenin)과 키토산(chitosan)을 이용하여 콘택트렌즈 보존액을 개발하였다. 그 결과 화학보존제보다 천연보존제가 우수한 세포 보호기능이 있으며, 상기 천연보존제 중 키토산보다는 나린제닌이 더 우수한 세포 보호기능이 있음을 증명하였다. 또한 채^[32] 등은 콘택트렌즈 항균 기능을 높이기 위한 기존 보존액에 나린제닌을 첨가하여 합성보존제의 세포 독성에 대해 천연보존제가 더 안전하고, 합성보존제의 기능을 나타내면서 그의 부작용은 최소화 시킬 수 있는 천연항균 물질로 나린제닌이 우수하다 고 하였다^[33].

최근 콘택트렌즈 연구 동향을 살펴보면 콘택트렌즈에 항균물질 또는 약물 등을 첨가하여 눈 안에서 용출시켜 항균기능 또는 약물전달 작용하는 콘택트렌즈에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 근시 진행을 억제시켜줄 수 있는 콘택트렌즈에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다^[75-79].

현재 개발 연구 중인 항균 콘택트렌즈는 셀레늄(selenium)을 콘택트렌즈 표면에 딥핑(dipping)에 의한 코팅 방법으로 항균 콘택트렌즈 개발이 이루어지고 있으며, Anne(2007)는 콘택트렌즈 표면에 항균기능을 갖고 있는 레보플록사신(levofloxacin)이 포함된 리포좀 코팅(liposome coating)하여 눈 안에서 레보플록사신이 용출되도록 하는 항균 콘택트렌즈에 대하여 보고하였다^{[75,76,78,79]}.

천연항균제인 나린제닌은 자몽씨 추출물의 주성분으로서 플라보노이드(flavonoid)라는 색소를 갖는 비타민 P라고 알려진 성분이다. 이 물질은 주로 잘 익은 종자껍질에 많이 존재한다. 나린제닌은 인체에 독성이 없으면서 다양한 미생물에 대해 항균성을 보이는 천연 항균제로 알려져 있다. 자몽은 강한 산미를 가지는 구연산 및 비타민 C가 다량 함유되어 있어, 이들 두 성분이 효력 증진제 역할을 하여, 일산화질소의 생성을 제지하고, 면역기능을 높이는 한편, 비타민 강화 및 산화제 기능에 영향을 미쳐 발암성을 제지하는 작용이 있다. 나린제닌의 주요기능은 정균 및 항균작용, 항산화작용, 금속봉쇄작용 즉 세포막의 효소작용을 방해하여 세균의 생육을 저해하며, 악성세포의 성장을 중지시키는 작용과 발암 물질에 의해 손상되어진 세포를 보호하는 항암작용을 한다^[26,34-36].

항균기능 콘택트렌즈의 개발은 천연물질인 키토산이나 은 이온을 이용하여 최근에 활발한 연구가 진행되고 있다^[37,38]. 조^[39]에 의해 연구된 항균성 콘택트렌즈는 HEMA에 은(silver)을 첨가한 항균 콘택트렌즈가 콘택트렌즈 착용 시 황색포도상구균, 대장균(E. coli), 슈도모나스 에루지노사균에 의한 항균실험에서 높은 항균성을 나타냈다고 보고하였다. 또한 김^[40]은 주로 게나 새우 등 갑각류의 껍질을 이루고 있는 키도산을 첨가한 콘택트렌즈의 항균실험 결과 항균력을 갖는 것으로 보고하였다. Yu^[38]등은 콜라겐과 키토산을 합성하여 콘택트렌즈 재질로서 가능성 연구를 하기도 하였다.

매년 소프트 콘택트착용자의 35%가 세균감염에 의한 부작용으로 소프트 콘택트렌즈의 착용을 포기하거나 중단하는 렌즈 사용자가 증가하고 있다^[41].

따라서 콘택트렌즈를 착용함으로서 눈에서 각종 안과질환을 일으키는 세균들의 증식을 억제시키는 천연 항균물질의 개발이 이루어져야 할 것이며, 이를 이용한 콘택트렌즈 보존제와 항균 콘택트렌즈에 대한 연구가 활발히 이루어져야 할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참 조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 인체에 독성을 나타내지 않으며 세균의 증식을 보다 효과적으로 장시간 억제시킬 수 있는 항균용 렌즈를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 천연 항균물질인 나린제닌을 렌즈의 주요 구성 성분으로 포함시킴으로써 나린제닌이 서방성으로 용출되어 세균 증식을 장시간 억제시키는 효과를 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 나린제닌(naringenin)을 포함하는 항균용 렌즈를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 렌즈의 구성 성분으로 다음 화학식 1로 표시하는 나린제닌(naringenin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈를 제공한다:

화학식 1

본 발명자들은 인체에 독성을 나타내지 않으며 세균의 증식을 보다 효과적으로 장시간 억제시킬 수 있는 항균용 렌즈를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 천연 항균물질인 나린제닌을 렌즈의 표면이 아닌 주요 구성 성분으로 포함시킴으로써, 나린제닌이 서방성(sustained release)으로 용출되어 오랜 기간 동안 세균 증식 억제 효과를 나타내는 항균용 렌즈를 개발하였다.

본 발명의 명세서에서 렌즈에 포함된 나린제닌은 자연계에 존재하는 천연 항균물질이며, 상기 화학식 1로 표시된다. 바람직하게는, 본 발명의 명세서에 렌즈에 포함되어 있는 나린제닌은 자몽(grapefruit)으로부터 추출된 천연 항균물질이다.

상기 화학식 I의 나린제닌은 렌즈 제형 수지조성물에 첨가된다. 상기 화학식 I의 최대중량%는 생성된 렌즈의 물리적 특성, 예를 들면, 생성된 렌즈의 모듈러스에 손상을 주지 않는 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 렌즈는 50-99 중량% 2-하이드로시에틸메타클레이드(2-hydroxyethylmethacrylate), 0.1-10 중량% 메타크릴 산(methacrylic acid), 0.1-10 중량% N-비닐 피롤리돈(N-vinyl pyrrolidone) 및 0.1-20 중량% 나린제닌을 포함하며, 보다 바람직하게는 70-99 중량% 2-하이드로시에틸메타클레이드, 0.2-5 중량% 메타크릴산, 0.2-5 중량% N-비닐 피롤리돈 및 0.2-10 중량% 나린제닌을 포함하고, 가장 바람직하게는 98-99 중량% 2-하이드로시에틸메타클레이드, 0.3-0.7 중량% 메타크릴산, 0.3-0.6 중량% N-비닐 피롤리돈 및 0.4-2 중량% 나린제닌을 포함한다. 이와 같은 렌즈 조성 성분 및 성분들의 함량비는 본 발명의 렌즈에서 나린제닌의 서방성 방출을 가능하게 하여, 장시간 동안 나린제닌이 렌즈로부터 용출되어 계속적으로 항균 활성을 나타내도록 한다. 즉, 소비자가 렌즈를 착용하는 기간 동안 항균 활성을 계속적으로 나타내는 것이 바람직한데, 본 발명에 따르면 이러한 요구를 만족시킬 수 있다.

나린제닌은 렌즈 제작시 렌즈 제형 수지조성물과의 화학적 결합(예컨대, 수고결합과 같은 비공유결합)을 통하여 제작 완성된 렌즈에 균일하게 분포되며, 렌즈 전체에 걸쳐 포집(entrapment)되어 있다.

본 발명의 렌즈는 항균 성분이 없는 종래 렌즈와 거의 동일하게 100% 빛 투과도를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 렌즈는 가시광선 영역인 400-780 nm에서 100% 빛 투과도를 나타낸다.

본 발명의 명세서에서 용어 “서방성(sustained release)”은 렌즈로부터 일정한 나린제닌이 외부로 서서히 용출 또는 분비되는 것을 의미한다. 본 발명은 나린제닌이 렌즈로부터 서방성으로 용출 또는 분비됨으로써, 항균 물질이 딥 핑(dipping)에 의한 또는 리포좀(liposome)의 형태로 표면에 코팅된 렌즈보다 장기간 세균에 대한 항균 지속 효과를 나타낸다(참조: 본 발명의 명세서 참조문헌^[75-79] 및 실시예).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 렌즈로부터 나린제닌이 서방성(sustained release)으로 용출(elution) 또는 분비되어 항균 활성을 나타내며, 보다 바람직하게는 상기 렌즈로부터 용출 또는 분비되는 나린제닌의 용출량 또는 분비량은 3-6 x 10^-7g/일(day)이고, 가장 바람직하게는 4-5 x 10^-7g/일이다.

본 발명의 명세서에서 표현 “항균”은 렌즈를 포함하여 렌즈로부터 확장되는 반경내에서 박테리아 또는 다른 미생물의 렌즈에의 부착 억제, 렌즈위의 박테리아 또는 다른 미생물의 성장 또는 증식 억제 및 박테리아 또는 다른 미생물의 사멸 시키는 것을 의미한다. 본 발명의 렌즈는 미생물 생성을 50% 이상 억제한다(참조: 본 발명의 명세서에서 실시예의 항균 활성 검정).

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 나린제닌이 포함된 렌즈는 매우 우수한 항균 활성을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 슈도모나스 에루지노사(pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 알카리제네스(pseudomonas alcaligenes), 슈도모나스 앙귈리셉티카(pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 아르젠티넨시스(pseudomonas argentinensis), 슈도모나스 보르보리(pseudomonas borbori), 슈도모나스 시트로넬로리스(pseudomonas citronellolis), 슈도모나스 플라베센스(pseudomonas flavescens), 슈도모나스 멘도시나(pseudomonas mendocina), 슈도모나스 니트로레두센스(pseudomonas nitroreducens), 슈도모나스 올레오보란스(pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 슈도알카리제네스(pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스 레시노보란스(pseudomonas resinovorans) 또는 슈도모나스 스트라미네아(pseudomonas straminea)균에 대하여 항균 활성을 나타내며, 보다 바람직하게는 슈도모나스 에루지노사(pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 알카리제네스(pseudomonas alcaligenes), 슈도모나스 앙귈리셉티카(pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 아르젠티넨시스(pseudomonas argentinensis), 슈도모나스 보르보리(pseudomonas borbori) 또는 슈도모나스 시트로넬로리스(pseudomonas citronellolis)균, 보다 더 바람직하게는 슈도모나스 에루지노사(pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 알카리제네스(pseudomonas alcaligenes) 또는 슈도모나스 앙귈리셉티카(pseudomonas anguilliseptica)균, 가장 바람직하게는 슈도모나스 에루지노사(pseudomonas aeruginosa)균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리키아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리키아 퍼구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리아 불너리스(Escherichia vulneris)균에 대하여 항균 활성을 나타내며, 보다 더 바람직하게는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii) 또는 에스케리키아 블라태(Escherichia blattae)균, 가장 바람직하게는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타낸다.

본 발명의 명세서에서의 용어 “렌즈”는 눈에 또는 눈 위에 위치하는 안과용 장치를 의미한다. 상기 렌즈는 시력 교정이나 미용상 제공될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 명세서에서의 렌즈는 안과용 렌즈, 망원경용 렌즈, 카메라용 렌즈 또는 현미경용 렌즈를 포함하며, 보다 바람직하게는 소프트 콘택트렌즈, 하드 콘택트렌즈, 안내렌즈(intraocular lenses), 오버레이(overlay) 렌즈, 접안 인서트(ocular inserts) 또는 광학 인서트(opticalinserts)를 포함하고, 가장 바람직하게는 소프트 콘택트렌즈를 포함한다.

상기 나린제닌이 구성 물질로 포함된 콘택트렌즈를 눈(eye)에 착용하는 경우, 착용시부터 렌즈의 주요 구성으로 포함된 나린제닌이 서방성으로 용출 또는 분비가 되어 눈에 존재하는 세균을 효과적으로 억제시킨다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 나린제닌을 포함하는 항균용 렌즈를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 천연 항균물질 나린제닌이 렌즈의 다른 구성 화합물과 구조적으로 결합하여 제조된 렌즈로서, 렌즈로부터 나린제닌이 서방성으로 용출되어 장기간 항균 지속 효과를 나타낸다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 안과 질환 균 중 슈도모나스 에루지노사균에 매우 효 과적인 항균 효능을 나타내므로 안과용 렌즈, 특히 안과용 소프트 콘택트렌즈에 적합하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.

재료 및 방법

배양세포의 증식저해시험

세포 배양

배양세포는 마우스 각막세포주인 Clone 1-5C-4 세포주(한국세포주 은행, 서울)를 이용하였으며, Clone 1-5C-4 세포는 α-최소배지(α-MEM, GIBCO Co., 미국) 에 10%의 FBS (fetal bovine serum), 페니실린 G(25 unit/㎖), 스트렙토마이신(25 ㎍/㎖), 펀지존(fungizone; 3 ㎕/㎖, GIBCO Co., 미국) 및 항생제(10 ㎕/㎖, GIBCO Co., 미국)를 첨가해 배양하였다. 세포배양은 25 ㎠의 배양용 플라스크(Nunc Co., 미국)에 일정량의 배양액을 넣어 37℃로 조정된 5% CO₂ 항온기(Forma Co., 미국)에서 배양하였고, 배양액은 3일 마다 교환하였다. 세포 증식 저해를 조사하기 위해 배양한 세포를 0.25% 트립신-EDTA (ethylenediaminetetracetate)를 처리하여 세포를 부유 시킨 다음 혈구계산기로 세포를 계수 한 후, 4 x 10³ 세포/㎖ 세포를 96 웰-플레이트(Nunc Co., 미국)에 200 ㎕/웰로 분주하여 실험에 사용하였다^[48,49].

세포 카운팅(Cell counting)

세포의 밀도는 혈구 계산기(hemacytometer, Sigma Co., 미국)를 이용하여 현미경으로 직접 세포수를 측정하였다. 세포 부유액 0.5 ㎖을 0.4% 트립판-블루(Sigma Co., 미국) 및 0.85% NaCl 용액 0.5 ㎖과 잘 혼합하여 5-15분 사이에 혈구계산기를 사용하여 염색된 세포와 염색되지 않은 세포의 수를 측정한다. 15분이 지날 경우 살아있는 세포도 염색될 수 있기 때문에 정해진 시간 안에 세포수를 산정하였다^[54,55]. Clone 1-5C-4 세포를 1-5 x 10⁵ 세포/㎖로 계수한 다음 24 웰 플레이트에 나린제닌 콘택트렌즈와 대조군 콘택트렌즈 위에 각각 30 ㎕의 세포 부 유액을 넣어 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 혼합액을 시그마코트(Sigmacote)가 처리된 튜브에 옮기고, 골고루 섞이게 하여 세포 수를 계산하였다.

나린제닌 농도

나린제닌에 대한 세포독성 검증을 위하여 나린제닌 100% 원액(Sigma Co., 미국)을 pH 7.2-7.3으로 유지시켜 세포성장에 영향을 미치지 않는 DMSO 0.5% 이하의 농도에서 용해하여 세포 배양액에 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1% 및 2%의 농도별 처리 후 24시간 배양하여 대조군과 처리군의 세포독성 정도를 비교하였다.

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석

MTT (Sigma Co., 미국) 분석은 Mosmann(1983)방법에 따랐다. MTT 분석은 세포소기관 중 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)의 활성도를 측정하여 세포 생존을 측정하는 방법이다. 용해성 노란색 MTT 졸리움(tetrazolium)이 숙신산 탈수소효소에 의해 불용성의 보라색 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원되는 정도를 흡광도로 측정하는 방법으로 트립판 블루(trypan blue)에 의한 다이-익스클루젼(dye-exclusion) 방법보다 민감하여 세포사 진행과정의 초기시점에서 세포의 생존율을 보다 정확히 측정할 수 있는 장점이 있다^[48,49]. MTT는 수용액 속에서는 무색이지만 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 효소인 숙신산 탈수소효소에 의해서 물에 녹지 않는 보라색 색소로 전환되므로, 색소의 농도를 ELISA 비색계로 측정하여 살아있는 세포의 증식과 독성을 측정할 수 있다. 세포독성 검정을 위해 Clone 1-5C-4 세포는 D-MEM (GIBCO Co, USA)에 10% FBS, 페니실린 G(25 unit/㎖), 스트렙토마신 (25 ㎍/㎖), 펀지존(3 ㎕/㎖) 및 항생제(10 ㎕/㎖)를 첨가해 배양하여 4 x 10³ 세포/㎖를 96 웰-플레이트에 각각 200 ㎕/웰 씩 분주하여 세포가 웰 당 70% 정도 채워졌을 때 나린제닌을 농도 별로 처리하였다. 24시간 경과 후 MTT가 포함된 배양액으로 교환하여 3시간 더 배양한 후 DMSO (dimetylsulfoxide, Sigma Co., 미국)로 포르마잔(Sigma Co., 미국)을 용해시켜 ELISA 플레이트 리더(Bio-Tech, 미국)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.

광학현미경에 의한 세포형태 조사

광학 현미경적 관찰을 이용하여 배양된 마우스 각막 세포주 (Clone 1-5C-4) 5 x 10³ 세포/㎖를 96 웰-플레이트에 200 ㎕/웰 분주하여 세포가 웰 당 80% 정도 채워졌을 때 나린제닌을 농도 별로 처리한 후 24시간 동안 배양하여 도립위상차 현미경(Nikon TS-100, 일본)으로 세포형태를 관찰(x 200)하고 사진 촬영하였다.

나린제닌 용출액

나린제닌을 함유한 소프트 콘택트렌즈의 수지조성물을 제조하기 위하여 원자재 2-하이드로시에틸메타클레이드(2-hydroxyethylmethacrylate, Sigma Co., 미국) 100% 원액을 전체 중합액의 99% 함량이 되게 정제하여, 메타크릴산(methacrylic acid, Sigma Co., 미국), 0.5%, N-비닐 피롤리돈(N-vinyl pyrrolidone ,Sigma Co., 미국) 0.4%, 그리고 나린제닌(naringenin) 2%를 순차적으로 넣고, 40℃에서 혼합하면 소프트 콘택트렌즈의 수지조성물을 조성하였다. 벌크 중합방식을 이용하여 콘텍트렌즈 몰드에 조성물들을 75℃의 오븐에 넣은 후 12시간동안 중합을 거친다. 중합과정을 거친 후 몰드판에서 렌즈를 분리하여 선반절삭 과정을 통하여 중앙부 두께 0.02 mm로 잘라 콘텍트렌즈를 제조하였다.

나린제닌이 1% 함유된 콘택트 렌즈를 제조한 후, 상기 콘택트렌즈 5개를 식염수 2 ㎖에 담아 밀봉하여 12시간 동안 55℃에서 1차 멸균 처리한 후 다시 이 렌즈를 110℃에서 15분간 2차 멸균처리 하였다. 병에 남아있는 용출물을 각막의 온도에 맞게 37℃에서 24시간 동안 방치하였다.

항균실험

사용균주 및 생균수 측정

본 연구에 사용된 균주는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, 한국생명공학연구원 생물자원센터, 대전) 과 E. coli (한국생명공학연구원 생물자원센터, 대전)를 사용하였다. 슈도모나스 에루지노사의 배양은 LB(luria-bertani) 배지(트립톤 10 g, NaCl 10 g, 효모 추출물 5 g 및 박토 아가(bacto agar, Sigma Co., 미국) 15 g/증류수 1,000 ㎖)에 보관되어 있는 균주를 액체배지 37.5℃에서 18-24시간 동안 배양하여 3일간 3회 계대배양으로 계수하기에 적합할 정도의 균체가 생장하였을 때 균을 계수하여 사용하였다.

나린제닌 콘택트렌즈 용출액의 항균성 검증실험

본 실험에는 배양된 슈도모나스 에루지노사, 7 x 10⁸ CFU/㎖ 균액과 E. coli, 5 x 10⁹ CFU/㎖, 식염수 및 나린제닌 용출액 등을 사용하였다. 실험군에는 증류수 10 ㎖에 균체 100 ㎕와 나린제닌 용출액 100 ㎕를 넣고, 대조군에는 증류수 10 ㎖에 균체 100㎕와 증류수 100 ㎕를 넣어서 37℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 생균수 측정은 배양한 균체 1 ㎖를 취해서 증류수 9 ㎖가 들어있는 시험관에 혼합하였다. 이와 같은 방법으로 3-5회 정도 시험관을 옮겨서 균체 희석배수를 증가시켰다. 생균수 측정은 실험군과 대조군을 각각 100 ㎕ 취해서 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 12시간 동안 배양한 후 생성된 생균수를 측정하였다.

나린제닌이 함유된 콘택트렌즈의 노출에 의한 항균성 검증실험

본 실험에는 배양된 슈도모나스 에루지노사, 7 x 10⁸ CFU/㎖ 균액과 E. coli, 5 x 10⁹ CFU/㎖, 대조군 콘택트렌즈 및 나린제닌이 함유된 콘택트렌즈 등을 사용하였다. 증류수 10 ㎖에 균체 100 ㎕의 슈도모나스 에루지노사, 7 x 10⁸ CFU/㎖ 균액과 E. coli 5 x 10⁹ CFU/㎖을 각각 접종하고 여기에 나린제닌이 함유된 콘택 트렌즈와 대조군 콘택트렌즈를 5개씩 각각 넣고 37℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 생균수 측정은 배양한 균체 1 ㎖를 취해서 증류수 9 ㎖가 들어있는 시험관에 혼합하였다. 이와 같은 방법으로 3-5회 정도 시험관을 옮겨서 균체 희석배수를 증가시켰다. 생균수 측정은 실험군과 대조군을 각각 100 ㎕ 취해서 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 12시간 동안 배양한 후 생성된 생균수를 측정하였다.

나린제닌의 항균성 검증실험

나린제닌에 대한 항균성 검증을 위하여 슈도모나스 에루지노사, 7 x 10⁸ CFU/㎖ 균액과 나린제닌 100% 원액을 pH 7.2-7.3으로 유지시켜 세포 배양액에 0.001%, 0.01% 및 0.1%의 농도로 실험군에는 증류수 10 ㎖에 균체 100 ㎕와 나린제닌 100 ㎕를 각각 넣고, 대조군에는 증류수 10 ㎖에 균체 100 ㎕와 증류수 100 ㎕를 넣어서 37℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 생균수 측정은 배양한 균체 1 ㎖를 취해서 증류수 9 ㎖가 들어있는 시험관에 혼합하였다. 이와 같은 방법으로 3-5회 정도 시험관을 옮겨서 균체 희석배수를 증가시켰다. 생균수 측정은 실험군과 대조군을 각각 100 ㎕ 취해서 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 12시간 동안 배양한 후 생성된 생균수를 측정하였다.

가토의 임상 실험

실험동물

실험동물인 가토의 눈은 각막과 외안부에 이상이 없는 약 2.5-3.0 ㎏의 흰색 가토 8마리를 암수구별 없이 다물 사이언스(대물과학, 대전, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 사육 환경은 18±2℃, 습도 60±10%, 12 시간을 기준으로 명암의 상태를 유지한 본 대학 동물 사육실에서 사료(대물과학, 대전, 한국)와 음용수를 자유로이 섭취하도록 하였다.

안(眼)점막 자극실험

나린제닌 용출액을 가토안내로 점안하여 눈에 자극을 주는지 확인하기 위해 실험용 가토 8마리, 총 16안에 안점막 자극 실험을 하였다. 가토의 안점막 자극실험은 pH 7.2-7.3로 유지된 나린제닌 용출액을 1일 3회 (AM. 9:00, AM. 12:00, PM 3:00), 500 ㎕/1회, 1주일 간 점안하였다. 대조군으로 0.9% NaCl 생리식염수(중외제약, 한국)을 동일한 방법으로 점안한 후 로즈 벤갈(Rose bengal) 염색 방법을 이용하여 확인하였다^[31,32].

로즈 벤갈 염색을 이용한 가토 안(眼)의 관찰

가토안의 육안 관찰은 각막과 결막의 괴사된 상피 세포 또는 손상을 입은 세포에 선택적으로 염색되는 로즈 벤갈 염색 방법을 사용하였다^[31,32]. 로즈 벤갈 염색은 대조군으로 0.9% NaCl 생리식염수(중외제약, 한국)와 실험군으로 나린제닌을 가토 안에 점안한 후 0.25% 로즈 벤갈(Sigma Co, 미국)용액을 가토안의 상부 결막 에 점적하여 염색액이 골고루 퍼지도록 염색한 후 가토안의 각막과 결막의 상태를 육안 관찰하고 디지털 카메라(Sony P-100, 일본)를 이용하여 촬영하였다.

통계학적 분석

통계학적 유의성 검정은 원-웨이 ANOVA (analysis of variance) 방법을 사용하였으며, 유의수준 p＜0.05의 범위 내에서 그 결과들은 평균에 대한 표준편차로 나타내었다.

실험 결과

나린제닌 용출액의 흡광도

서방형(slow release) 분사형태로 나린제닌의 용출을 확인하기 위해 항균 콘택트렌즈 5개를 식염수 2 ㎖에 담아 밀봉하여 12시간 동안 55℃에서 멸균처리한 후 37℃에서 나린제닌 용출액의 고유 흡광도를 측정하였다. 흡광 결과 나린제닌의 고유 흡광도 280 ㎚에서 피크를 나타낸 것으로 보아 용출액내에 나린제닌이 존재하는 것으로 확인되었다(도 1).

나린제닌 용출액의 투과도

나린제닌 용출액의 투과되는 가시광선의 양을 측정하기 위해 나린제닌 용출액을 가시광선 상에 노출시켰다. 가시광선 영역인 400-780 nm에서 전체 광 투과도를 측정한 결과 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈가 가시광선 영역에서 100% 투과도 를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 결과는 나린제닌이 광학적으로 콘택트렌즈 조성물로써 사용이 가능함을 확인하였다(도 2).

1% 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈 용출액 내에서 나린제닌의 용출량

일반적으로 1% 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈 용출액내에서 나린제닌의 용출량을 확인하는 방법으로 흡광도를 통해서 몰농도로 계산하였다. 몰 농도는 용질몰수/용매 1,000 ㎖을 의미하고 몰수는 질량/분자량으로 계산하였다. 따라서 도 3의 스펙트럼은 1.15 x 10^-5 mol/ℓ의 농도를 가진 샘플로 흡광도가 0.18이 나왔다. 30일 후의 나린제닌 용출액의 흡광도는 0.13이 나왔으므로 비례식을 이용하면 1.15 x 10^-5 : 0.18 = X : 0.13이며 x = 7.94 x 10^-6 mol/ℓ로 나타났다(도 3). 이 실험의 경우 3 ㎖ 의 용매를 사용했으므로 2.38 × 10^-8mol이 용출된 것이고, 이를 질량으로 나타내면 나린제닌이 1.38 x 10^-5g이 용출된 것이다.

고성능액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 항균 콘택트렌즈의 나린제닌 존재 확인

항균 콘택트렌즈 용출액의 나린제닌 존재를 확인하기 위하여 2% 나린제닌이 함유된 콘택트렌즈 5개를 2 ㎖ 식염수가 담긴 유리병 37 ℃에서 5일간 나린제닌을 용출한 시료를 고성능 액체 크로마토그래피(Waters, 600E, PDA)를 이용하여 확인하였다. HPLC측정 결과 280 ㎚에서 대조군은 55분에서 높은 피크를 보였고, 항균렌 즈 용출액은 49분에서 높은 피크를 나타냈으며, 용출 기간이 증가할수록 피크의 높이가 감소하였다(도 4). 이는 대조군과 나린제닌 용출액이 시간적인 차이는 보였으나 유사한 피크를 보여주는 것으로 나린제닌의 존재를 확인할 수 있었다.

세포독성 검정

나린제닌의 세포독성

나린제닌의 세포독성 검증을 위해 나린제닌을 Clone 1-5C-4 세포주에 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1% 및 2% 농도로 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포독성 검사를 하였다. 그 결과 1%이하의 나린제닌 농도에서 세포증식 저해가 30%를 넘지 않은 것으로 나타났으며, 2%에서는 50%의 세포증식 저해가 나타나 농도 의존적으로 세포독성이 더 강해지는 것을 관찰하였다(도 5).

나린제닌 용출액의 세포독성

나린제닌 용출액의 세포독성 검증을 위하여 Clone 1-5C-4 세포주에 나린제닌이 1% 함유된 콘택트렌즈의 용출액을 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포독성 검사를 실시하였다. 그 결과 1% 농도의 나린제닌 용출액에서 세포증식 저해가 20%를 넘지 않은 것으로 나타났다(도 6).

세포 카운팅

나린제닌 용출액의 세포독성을 검증하기 위하여 Clone 1-5C-4 세포를 1-5 x 10⁵ 세포/㎖로 계수한 다음 24 웰 플레이트에 나린제닌 콘택트렌즈와 대조군 콘택트렌즈 위에 각각 30 ㎕의 세포 부유액을 넣어 6시간 동안 배양하였다.

배양 후 혼합액을 시그마코트가 처리된 튜브에 옮기고, 골고루 섞이게 하여 세포 수를 계산 한 결과 용출액에 의한 세포독성이 항균 콘택트렌즈가 대조군보다 20% 세포 증식 저해가 있었다(도 7).

항균 활성 검정

나린제닌 용출액의 슈도모나스 에루지노사균에 대한 오염 측정

나린제닌 용출액 100 ㎕에 슈도모나스 에루지노사균을 접종시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과, 균 체수는 5 x 10⁷ CFU/㎖로 나타났다. 대조군으로 증류수에 슈도모나스 에루지노사균을 오염시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과 균체수는 5 x 10⁸ CFU/㎖로 나타났다. 이러한 결과로 볼 때 나린제닌 용출액의 슈도모나스 에루지노사균에 대한 항균력이 10배 향상되었음을 확인하였다(도 8).

나린제닌 용출액의 장내세균(E. coli)에 대한 오염 측정

나린제닌 용출액 100 ㎕에 E. coli을 접종시키고 24시간 후 균의 오염 정도 를 측정한 결과 균체수는 5 x 10⁵ CFU/㎖로 나타났다. 대조군으로 증류수에 E. coli를 오염시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과, 균체수는 2.5 x 10⁶ CFU/㎖로 나타났다. 이러한 결과로 볼 때 나린제닌 용출액의 장내세균의 증식 억제능력이 5배 향상되었음을 알 수 있었다(도 9).

나린제닌의 항균성 검증실험

나린제닌에 대한 항균성 검증을 위하여 나린제닌 원액 0.001%, 0.01% 및 0.1%를 농도별로 슈도모나스 에루지노사균을 접종시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과, 균체수는 1 x 10⁸ CFU/㎖로 나타났다. 대조군으로 증류수에 슈도모나스 에루지노사균을 오염시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과 균체수는 0.1% 나린제닌은 2 x 10⁵ CFU/㎖으로 조사되었고, 대조군과 비교하여 178배의 항균력이 있었다. 0.01% 나린제닌은 4 x 10⁵ CFU/㎖였으며, 대조군과 비교하여 100배 항균력의 항균력이 있었다. 0.001% 나린제닌의 경우 8 x 10⁵ CFU/㎖으로 조사되었고, 대조군과 비교하여 항균력이 40배의 항균력을 나타냈다. 이상의 결과로 볼 때 나린제닌은 농도 의존적으로 항균력이 증가하는 것으로 사료된다(도 10a-10c).

가토안의 안점막 자극실험

눈에 대한 자극 정도를 확인하기 위해 1% 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈의 용출액을 가토 안내로 점안 후 0.25% 로즈 벤갈 염색 방법을 이용하여 가토안의 각막과 결막의 상태를 세극 등 현미경으로 관찰한 결과 대조군과 같이 세포 손상이나 부작용이 없는 것으로 관찰되었다(도 11).

광학현미경적 관찰

나린제닌의 광학현미경에 의한 세포형태 조사

Clone 1-5C-4 세포주에 나린제닌 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1% 및 2%를 각각 농도별로 24시간 처리한 후 도립위상차현미경을 이용하여 200 배율로 관찰한 결과 0.01%이하의 나린제닌 농도에서는 대조군과 별다른 차이를 보이지 않았다. 그러나 0.1% 나린제닌 이상의 농도에서는 농도에 의존하여 96-웰 플레이트에 고착되어 있는 세포의 밀도가 감소하였다.

현대인은 시력교정용 또는 미용 목적으로 안경을 대신하여 콘택트렌즈를 많이 사용하고 있다. 소프트 콘택트렌즈는 유연성과 착용감이 우수하여 널리 공급되었으며, 최근에는 고함수성, 고산소 투과성을 지닌 연속착용 콘택트렌즈뿐만 아니라 일회용 콘택트렌즈까지 개발되어 시판되고 있다. 그러나 콘택트렌즈를 장시간 착용 시 눈물의 구성 성분들이 콘택트렌즈의 표면에 부착하여 착용감을 저하시키고, 시력을 방해하며 콘택트렌즈 변색을 일으키고 세균감염의 원인이 되기도 한 다.

콘택트렌즈 사용자에게 있어서 각막염을 일으키는 주요 원인 중 하나는 세균 감염이며, 슈도모나스 에루지노사균은 눈의 부작용 유발을 일으키는 대표적인 원인 균으로, 현재 가장 많이 보고되고 있다^[45,91-95]. 최근 콘택트렌즈를 착용함으로서 눈에 번식하게 되는 세균들의 증식을 억제시키는 항균 콘택트렌즈의 관심이 높아지고 있으며 각종 안질환을 막기 위해서 종래의 여러 기술들이 연구되고 있다^[75,76].

콘택트렌즈는 인체 중에서도 신경들이 많이 밀집 되어 있는 각막과 결막에 착용하므로 그 무엇보다 안전성이 중요하다. 눈에 민감한 자극을 나타내거나 콘택트렌즈 재료의 독성으로 인해 신경이나 세포조직이 파괴되어서는 안 된다. 따라서 살균효과 못지않게 중요한 것이 인체 내에 무독성과 무자극성이므로 천연 재료를 이용하고자 하는 노력이 끊임없이 이루어지고 있다^[67-69].

천연항균제인 나린제닌은 자몽씨 추출물의 주성분으로서 플라보노이드(flavonoid)라는 색소를 갖는 비타민 P라고 알려진 성분이다. 이 물질은 주로 잘 익은 종자껍질에 많이 존재한다. 나린제닌은 인체에 독성이 없으면서 다양한 미생물에 대해 항균성을 보이는 천연 항균제로 알려져 있다. 자몽은 강한 산미를 가지는 구연산 및 비타민 C가 다량 함유되어 있어, 이들 두 성분이 효력 증진제 역할을 하여, 일산화질소의 생성을 제지하고, 면역기능을 높이는 한편, 비타민 강화 및 산화제 기능에 영향을 미쳐 발암성을 제지하는 작용이 있다. 나린제닌의 주요기능은 정균 및 항균작용, 항산화작용, 금속봉쇄작용 즉 세포막의 효소작용을 방해 하여 세균의 생육을 저해하며, 악성세포의 성장을 중지시키는 작용과 발암 물질에 의해 손상되어진 세포를 보호하는 항암작용을 한다^[46].

콘택트렌즈에 병원균이 부착되는 기전은 여러 가지 병리적 인자가 관여하는데, 이는 섬모같은 세균인자, 세균성 물리화학적 표면전하, 탄수화물 부착, 글리코칼릭스(glycocalyx), 외독소 및 내독소 등이다^{[71,74,96,97]}. Asward^[72]는 토끼를 사용한 동물실험에서 사용되지 않은 콘택트렌즈를 슈도모나스 에루지노사균에 오염시킨 실험군보다 이전 사용했던 렌즈를 슈도모나스 에루지노사균 오염시킨 실험군에서 더 높은 각막염 빈도를 보고하였다.

따라서 본 연구는 콘택트렌즈 제조과정 중에 콘택트렌즈 제조용 수지용액에 나린제닌을 첨가하여 콘택트렌즈 착용 시 렌즈 자체에서 나린제닌이 용출되어 콘택트렌즈를 착용하는 동안 안내 세균의 증식을 억제하는 효과와 항균콘택트렌즈 제조방법을 개발하였다. 나린제닌을 함유한 항균성 콘택트렌즈는 렌즈의 원료가 되는 수지조성물의 제조과정 중 어느 한 과정이나 마지막 처리 과정에서 나린제닌을 첨가한 후 이를 중합하고, 성형 또는 사출하여 제조할 수 있다.

식품의약안전청의“시력보정용 콘택트렌즈 기준 및 시험방법”에 의한 나린제닌 항균 콘택트렌즈의 외형 및 외관, 지름, 두께, 곡률반경, 정점굴절력, 콘택트렌즈 용출물 시험, 배양세포의 증식저해시험, 무균시험, 안자극시험 등 각 검사항목에서 나린제닌을 함유한 항균 콘택트렌즈가 식품의약안전청 기준에 적합한 렌즈로 확인되었다.

제조된 항균성 콘택트렌즈를 식염수에 담가 24시간 실온에서 보관 한 후, 항균 콘택트렌즈에서 용출된 나린제닌의 고유 흡광도를 측정한 결과 나린제닌 용출액의 고유 흡광도가 280 nm로 나타났다^[53,82-86]. 이는 항균 콘택트렌즈 내에 나린제닌이 함유(entrap)되어 있음을 알 수 있다. 나린제닌 용출액의 투과되는 가시광선의 양을 측정하기 위해 나린제닌 용출액을 가시광선에 노출시켰다. 가시광선 영역인 400-780 ㎚에서 전체 광 투과도를 측정한 결과 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈가 가시광선 영역에서 100% 투과도를 나타내었음을 확인하였다. 이는 나린제닌 중합물이 광학적으로 콘택트렌즈 조성물로써 사용이 가능함을 입증해 준다고 할 수 있다.

일반 콘택트렌즈의 수지용액과 나린제닌을 함유한 항균 콘택트렌즈로부터 용출된 용출액의 중합상태를 적외선 스펙트럼의 비교 측정결과 나린제닌은 방향족 화합물에 함유되어 있는 6개의 탄소원자로 이루어진 벤젠고리 모양의 아로마틱 그룹(aromatic group)으로 1,650-1,450 ㎚, 1,045-1,078 ㎚, 878-748 ㎚에서 나린제닌이 각각 존재하고 있음을 확인하였다.

또한 항균 콘택트렌즈의 나린제닌의 용출은 37℃에서 29일간 확인한 결과 용액이 분사되는 경향을 나린제닌의 흡광도인 280 ㎚에서 처음 9일 동안에는 상당량의 나린제닌의 용출을 확인하였고, 이후 20일간은 비교적 적은 량의 나린제닌이 서서히 분사형태로 용출되는 것을 확인하였다. 또한 1% 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈 용출액내에서 나린제닌의 용출량을 확인한 결과 나린제닌이 1.38 x 10^-5g 용출 된 것을 확인하였다. 또한 항균콘택트렌즈 용출액의 나린제닌 존재를 확인하기 위하여 HPLC 측정 결과 280 ㎚에서 대조군은 55분에서 높은 피크를 보였고, 항균렌즈 용출액은 49분에서 높은 피크를 나타냈으며, 용출 기간이 증가할수록 피크의 높이가 감소하였다. 따라서 나린제닌이 30일간 지속적인 용출로 안내(眼內) 항균기능을 유지할 수 있는 항균성 콘택트렌즈 중합물로써 적합한 물질로 확인된 것이다^[82-86]. 또한 Anne의 레보플록사신이 포함된 리포좀이 코팅된 콘텍트 렌즈(liposome coated contact lens)는 레보플록사신의 용출이 6일안에 모두 이루어진다고 보고하였다^[75]. 이는 리포좀이 코팅된 콘택트렌즈보다 나린제닌을 중합한 항균 렌즈가 더 서서히 오랜 기간 동안 항균물질을 용출하는 것이다.

다양한 미생물에 대해 항균성을 보이는 천연 항균제 나린제닌의 MTT 분석 결과 1% 이하의 나린제닌 농도에서 세포증식 저해가 30%를 넘지 않았으며, 2%에서는 50%의 세포증식 저해를 보였다. 이는 채^[32]의 보고에서 나린제닌에 대한 세포독성 결과와 같았다.

나린제닌 1%가 함유된 콘택트렌즈의 용출액의 MTT 분석에 의한 세포증식 저해 효과를 실험한 결과 20%를 넘지 않은 것으로 나타났다. 또한 소프트 콘택트렌즈에 직접 접촉시켜 세포를 배양하여 세포를 계수하는 방법으로 세포독성을 검정한 결과 대조군과 항균 콘택트렌즈의 세포 증식 저해정도가 30% 이하로 나타났다. 따라서 1% 나린제닌이 함유된 항균렌즈와 렌즈 용출물에 대한 세포독성이 없는 것 으로 판단되었다. 이는 서^[56]가 보고한 콘택트렌즈 용출액에 의한 세포독성이 관리용액(MPS)의 경우 세포증식 저해정도 20%를 넘지 않았는데 이는 본 연구의 항균렌즈와 유사한 결과였다. 따라서 항균렌즈의 나린제닌 용출액이 콘택트렌즈 착용자의 눈 안에서 관리용액과 같이 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

나린제닌의 세포독성 실험에 대한 광학현미경적 세포형태를 관찰에서도 나린제닌의 처리농도가 0.1% 나린제닌 이상의 농도에서 노동에 의존하여 96 웰 플레이트에 고착되어 있는 세포의 밀도가 감소하였으나, 2% 나린제닌이 함유된 콘택트렌즈의 용출액에 대한 세포 활성은 대조군과 차이를 보이지 않았다. 이는 채^[32]의 나린제닌의 세포독성에 대한 세포형태의 관찰결과와 유사한 결과를 나타냈다.

세포 카운팅(Cell counting)을 이용한 나린제닌 용출액의 세포독성을 위하여 세포 수를 계산 한 결과 나린제닌 용출액에 의한 세포독성이 없는 것으로 조사되었다. 또한 항균 콘택트렌즈를 세포 위에 올려놓은 후 6시간 동안 배양하여 관찰한 결과 대조군과 별다른 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과는 항균렌즈의 나린제닌 용출액이 콘택트렌즈 착용자의 눈 안에서 세포독성을 나타내지 않을 것으로 판단되었다.

나린제닌의 콘택트렌즈 수지액으로서 적합성을 확인하기 위해 각 2%, 1% 및 0.5%로 처리하여 조제한 후 항균성과 콘택트렌즈용 수지액의 적합성을 확인한 결과 바람직한 수지용액의 나린제닌의 함량은 수지용액 100 g에 대한 2 g 함유한 것이 이상적인 나린제닌 함량이었다. 1 g 미만을 사용하는 경우 항균 효과가 미미하 고, 1 g을 초과하는 경우 콘택트렌즈의 함수율이 낮아지고, 접촉각 실험에서 친수성이 감소하여 콘택트렌즈로 적합하지 않았다. 따라서 2%의 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈가 식품의약품안정청 고시 “시력보정용 콘택트렌즈 기준 및 시험방법” 기준에 최적의 함량이라 사료되었다^[41].

항균성 콘택트렌즈의 나린제닌 용출액에 대한 가토의 안점막 자극실험은 0.25% 로즈뱅갈 염색법을 이용하여 염색 관찰결과 대조군과 차이가 없었으며, 세포 손상이나 부작용이 없는 무자극 상태로 나타났다. 이는 나린제닌 용출액이 가토의 각막 및 결막세포에 독성을 나타내지 않음을 보여주는 것이다. 대조군 콘택트렌즈와 나린제닌 함유 항균 콘택트렌즈를 3주 동안 연속 착용시킨 후 가토안의 각막을 주사현미경으로 관찰한 결과 대조군 콘택트렌즈에서는 세균(슈도모나스 에루지노사균)의 오염 정도가 심하여 렌즈 표면을 덮고 증식하고 있음을 확인하였다. 그러나 수지용액에 나린제닌을 함유한 항균 콘택트렌즈의 경우 대조군 콘택트렌즈와 비교하여 세균의 오염 정도가 감소되었음 확인할 수 있었다. 또한 대조군 콘택트렌즈는 렌즈 표면이 균질하지 않는 것이 특징이나 나린제닌을 함유한 항균렌즈는 표면이 균일하며, 매끄럽고 조직의 밀도가 일반 콘택트렌즈보다 조밀한 구조를 갖고 있었다. 이는 나린제닌을 함유한 항균 콘택트렌즈가 눈 안에서 자연스럽게 용출되어 세균의 증식을 억제시킬 뿐만 아니라 렌즈 표면에 바이오필름(biofilm)의 형성을 막아 세균의 증식이 억제된 것으로 사료된다.

본 연구 결과, 천연 보존제, 항균 및 항산화제로서 식품과 의약품으로 사용 되고 있는 나린제닌이 항균성 콘택트렌즈 중합물로서 우수한 천연물질로 사용될 수 있다고 판단되었다. 또한 나린제닌을 수지조성물에 첨가하여 콘택트렌즈용 수지용액을 개발하였으며, 1%의 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈가 최적의 함량이라고 사료되며, 완성된 1% 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈는 in vivo 및 in vitro 상태에서 세포주 및 가토안의 안점막 자극 등 다양한 실험 결과 안내 세균에 대한 항균성을 가지며 인체에 무해한 항균 기능성 콘택트렌즈로써 사용될 수 있는 것으로 본다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 서방형(sustained release) 분사형태로 나린제닌의 용출을 확인하기 위해 항균 콘택트렌즈 5개를 식염수 2 ㎖에 담아 밀봉하여 6시간 동안 60℃에서 멸균처리한 후 37℃에서 나린제닌 용출액의 고유 흡광도를 측정한 결과이다. Abs는 흡광도(optical density: OD)를 의미하며, wave length는 파장 길이를 의미한다.

도 2는 나린제닌 용출액의 투과되는 가시광선의 양을 측정하기 위해 나린제닌 용출액을 가시광선 상에 노출시킨 결과이다. 가시광선 영역인 400-780 nm에서 전체 광 투과도를 측정한 결과 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈가 가시광선 영역에서 100% 투과도를 나타내었음을 확인하였다. transmission은 광 투과도를 의미하다.

도 3은 1% 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈 용출액내에서 나린제닌의 용출량을 확인한 결과이다. 30일 후의 나린제닌 용출액의 흡광도는 0.13가 나왔으므로 비례식을 이용하면 1.15 x 10^-5 : 0.18 = X : 0.13이며 x=7.94 x 10^-6 mol/ℓ가 된다.

도 4는 항균 콘택트렌즈 용출액의 나린제닌 존재를 확인하기 위하여 1% 나린제닌이 함유된 콘택트렌즈 4개를 2 ㎖ 식염수가 담긴 유리병 37 ℃에서 5일간 나린제닌을 용출한 시료를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 확인한 결과이다. 대조군 (Control)은 1% 나린제닌이 함유된 콘택트렌즈 4개를 2 ㎖ 식염수가 담긴 유리병 37 ℃에서 1시간 동안 나린제닌이 용출된 시료를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 확인한 결과로서 280 ㎚에서 1시간 후에 가장 높은 피크를 보였고, 용출 기간이 증가할수록 피크의 높이가 감소하였다.

도 5는 나린제닌의 세포독성 검증을 위해 나린제닌을 Clone 1-5C-4 세포주에 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1% 및 2% 농도로 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포독성을 한 검사 결과이다. concentration of treated with naringin은 나린진 처리 농도이며, cell visible은 세포 생존률을 의미한다.

도 6은 나린제닌 용출액의 세포 독성 검증을 위하여 Clone 1-5C-4 세포주에 나린제닌이 2% 함유된 콘택트렌즈의 용출액을 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포독성을 한 검사 결과이다. nariginin gushed-solution은 나린진 용출액을 의미하며, cell visible은 세포 생존률을 의미한다.

도 7은 나린제닌 용출액의 세포 독성을 검증하기 위하여 Clone 1-5C-4 세포를 배양한 후 혼합액을 시그마코트가 처리된 튜브에 옮기고, 골고루 섞이게 하여 세포 수를 계산(counting) 한 결과이다. 용출액에 의한 세포독성이 항균 콘택트렌즈가 대조군보다 20% 세포 증식 저해가 있었다. cell visible은 세포 생존률을 의미한다.

도 8은 나린제닌 용출액 100 ㎕에 슈도모나스 에루지노사균을 접종시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과이다. 그 결과, 나린제닌 용출액의 슈도모나스 에루지노사균에 대한 항균력이 2배 향상되었음을 확인하였다.

도 9는 나린제닌 용출액 100 ㎕에 E. coli을 접종시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과이다. 그 결과, 나린제닌 용출액의 장내세균의 증식 억제능력이 8배 향상되었음을 알 수 있었다.

도 10a-10c는 나린제닌에 대한 항균성 검증을 위하여 나린제닌 원액 0.001%, 0.01% 및 0.1%를 농도별로 슈도모나스 에루지노사균을 접종시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과이다. 그 결과, 균체수는 1 x 10⁸ CFU/㎖로 나타났다. 대조군으로 증류수에 슈도모나스 에루지노사균을 오염시키고 24시간 후 균의 오염 정도를 측정한 결과 균체수는 0.1% 나린제닌에서 1.9 x 10⁵ CFU/㎖으로 조사되었고, 대조군과 비교하여 178배의 항균력이 있었다. 0.01% 나린제닌은 3.4 x 10⁵ CFU/㎖였으며, 대조군과 비교하여 100배의 항균력이 있었다. 0.001% 나린제닌의 경우 8.4 x 10⁵ CFU/㎖으로 조사되었고, 대조군과 비교하여 항균력이 40배의 항균력을 나타냈다.

도 11은 눈에 대한 자극 정도를 확인하기 위해 1% 나린제닌을 함유한 콘택트렌즈의 용출액을 가토 안내로 점안 후 0.25% 로즈 벤갈 염색 방법을 이용하여 가토안의 각막과 결막의 상태를 세극 등 현미경(x 10)으로 관찰한 결과이다. 그 결과, 대조군과 같이 세포 손상이나 부작용이 없는 것으로 관찰되었다.

Claims

렌즈의 구성 성분으로 다음 화학식 1로 표시하는 나린제닌(naringenin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈:

화학식 1
제 1 항에 있어서, 상기 나린제닌은 자몽(grapefruit)으로부터 추출된 물질인 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 1 항에 있어서, 상기 렌즈는 50-99 중량% 2-하이드로시에틸메타클레이드(2-hydroxyethylmethacrylate), 0.1-10 중량% 메타크릴산(methacrylic acid), 0.1-10 중량% N-비닐 피롤리돈(N-vinyl pyrrolidone) 및 0.1-20 중량% 나린제닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 1 항에 있어서, 상기 나린제닌을 포함하는 항균용 렌즈는 가시광선 영역인 400-780 nm에서 100% 광 투과도를 나타내는 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 1 항에 있어서, 상기 렌즈는 렌즈로부터 나린제닌이 서방형(sustained release)으로 용출(elution) 또는 분비되어 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 5 항에 있어서, 상기 나린제닌의 용출량 또는 분비량은 3-6 x 10^-7g/일(day)인 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 1 항에 있어서, 상기 균은 슈도모나스 에루지노사(pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 알카리제네스(pseudomonas alcaligenes), 슈도모나스 앙귈리셉티카(pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 아르젠티넨시스(pseudomonas argentinensis), 슈도모나스 보르보리(pseudomonas borbori), 슈도모나스 시트로넬로리스(pseudomonas citronellolis), 슈도모나스 플라베센 스(pseudomonas flavescens), 슈도모나스 멘도시나(pseudomonas mendocina), 슈도모나스 니트로레두센스(pseudomonas nitroreducens), 슈도모나스 올레오보란스(pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 슈도알카리제네스(pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스 레시노보란스(pseudomonas resinovorans) 또는 슈도모나스 스트라미네아(pseudomonas straminea)균인 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 1 항에 있어서, 상기 균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리키아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리키아 퍼구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리아 불너리스(Escherichia vulneris)균인 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 1 항에 있어서, 상기 렌즈는 안과용 콘택트렌즈인 것을 특징으로 하는 항균용 렌즈.
제 9 항에 있어서, 상기 렌즈는 소프트 콘택트렌즈인 것을 특징으로 하는 항 균용 렌즈.