CN113577302A - 多糖多肽偶联物在治疗感染性角膜炎中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了多糖多肽偶联物在治疗感染性角膜炎中的用途，属于生物医药技术领域，多糖多肽偶联物内含多糖、聚乙二醇和多肽，聚乙二醇连接多肽和多糖；在水相环境中，多肽位于核心，聚乙二醇位于表面；当多糖多肽偶联物遇到细菌或者真菌细胞膜时，发生解组装，暴露出多肽。合成的多糖多肽偶联物能通过破膜杀菌机制抑制细菌和真菌，生物相容性高，并且可以实现在离体角膜组织的全层分布，角膜渗透效果优于那他霉素滴眼液；多糖多肽偶联物对细菌或真菌所致的浅层及深层角膜炎模型具有良好的治疗效果，且多糖多肽偶联物生物安全性有很大提高、眼表刺激性小；多糖多肽偶联物在体内药效学研究中显示出优于那他霉素滴眼液的治疗效果。

Description

多糖多肽偶联物在治疗感染性角膜炎中的用途
技术领域
本发明实施例涉及生物医药技术领域，具体涉及多糖多肽偶联物在治疗感染性角膜炎中的用途。
背景技术
角膜炎是由外源或内源性致病因素引起的角膜炎症，症状主要表现为眼睛疼痛、怕光、流泪、眼睑痉挛等不适，可伴有不同程度的视力下降，如果不及时治疗，可导致视力永久性损害。角膜炎是临床上常见的眼科疾病，而感染性角膜炎是世界性的常见致盲眼病，约20%的盲人因角膜感染所致。我国目前约有400万以上因角膜病致盲（角膜盲）患者，其中感染性角膜炎是导致角膜盲的最主要原因。近年来由于植物性眼外伤的增多、广谱抗生素或激素的大量滥用、隐形眼镜的不当使用、眼科手术和角膜移植的广泛开展，以及艾滋病、糖尿病、免疫缺陷等患者不断增多，角膜炎发病率呈逐年上升的趋势。
感染性角膜炎主要包括细菌性角膜炎、真菌性角膜炎和病毒性角膜炎。
真菌性角膜炎（fungal keratitis，FK）属于感染性角膜炎主要病种之一，在我国部分地区有超过60%的严重感染性角膜炎为FK。植物性外伤是FK的主要诱因，近年来随着角膜接触镜的佩戴、广谱抗生素及激素类药物的滥用导致眼部微环境失衡，致FK发病率呈明显上升趋势。该病起病相对缓慢，病程迁延、治疗周期长，近71%患者虽经积极治疗仍遗留严重角膜瘢痕，导致角膜盲，给患者家庭及社会带来沉重负担。FK按感染深度分为浅表感染和深层感染，若早期诊断治疗不及时，真菌极易向角膜深部侵袭，造成深层感染。同时由于胶原溶解酶的释放，导致角膜溃疡穿孔，甚至眼内炎，严重者需摘除眼球，对患者身心健康产生极大威胁。因此，如何有效治疗FK，尤其是角膜深层感染，提高FK治愈率，是近年来眼科基础与临床研究的重要课题。
常见的FK致病菌有镰刀菌、白色念珠菌、曲霉菌等。目前临床上多采用局部或全身抗真菌药物来治疗真菌性角膜炎。但近年来真菌耐药性持续增加，且现有商品化抗真菌眼药种类单一，同时存在较强的眼表毒性及刺激性。例如多烯类抗真菌药物是通过结合真菌细胞膜上麦角固醇来破坏细胞膜，实现杀菌作用，但由于真菌麦角固醇在结构和功能上与哺乳动物胆固醇相似，这就导致该类药物除了具有抗真菌活性外，还显示出较强的细胞毒性。现有抗真菌眼药对角膜的低通透性是影响药物疗效的另一重要原因，尤其是对深层FK。正常角膜由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮细胞层构成。上皮层和内皮层含有丰富的脂质，易转运非极性、脂溶性物质，而占角膜厚度90%的基质层则易转运极性、水溶性物质。分子量大、疏水性强、水溶性差一直是多烯类、唑类抗真菌眼药角膜通透性差的主要原因。临床常用抗真菌滴眼药那特真（成分为5%的那他霉素）是唯一商品化抗真菌滴眼药，但其水溶性差，在角膜基质中渗透性差使其很难治愈深层感染的真菌性角膜炎。因此，理想的通透性眼药应具备双向溶解性。另外，角膜无血管结构，因此全身应用的抗真菌药物经血液循环传递到角膜需通过角膜缘血管网缓慢弥散入角膜组织，导致角膜内难以短时间达到有效药物浓度。同时，全身抗真菌药应用极易引起肝肾及胃肠等系统较严重毒副作用，并可能导致真菌耐药性。
基于药物治疗的局限性，目前对于药物控制不佳的FK，积极的手术治疗已取得一定疗效。如对于病灶相对浅表的FK，行角膜病灶切除术、角膜层间注药术等可有效清除真菌病原体，促进抗真菌药在局部发挥作用。然而，由于真菌性角膜炎起病相对缓慢，发病早期往往症状较轻，且患者多数为农民，积极就医意识薄弱，因此，多数FK患者就诊时已经进展为深层感染。对于深层感染FK，角膜病灶切除联合深板层角膜移植术或穿透性角膜移植术是目前主流术式，但由于面临手术难度大、供体角膜材料稀缺、手术费用昂贵、术后无法避免角膜炎复发等问题，限制其在临床广泛开展。此外，无论选择何种术式，手术前后依然需要依赖抗真菌药物，控制病情进展、防止真菌复发，巩固手术疗效。因此，目前临床上亟需新型的抗菌作用强、不易产生耐药性、眼表生物安全性高、角膜通透性好的眼部抗真菌制剂。
细菌或真菌的感染多以生物膜的形式发生，生物膜是浮游菌聚集在一定的基底上，通过分泌的高分子基质将细菌细胞进行层层包裹的一种菌群形式。在生物膜的保护下，细菌或真菌对抗菌剂的耐受性可以提高100-1000倍。
随着耐药菌株的出现以及生物膜增强的耐药性，传统抗生素逐渐失去了作用，为了发展新型抗菌剂，抗菌性多肽（AMP）的研究引起了很多关注。AMP又称宿主防御肽（hostdefense peptides，HDP），是由阳离子亲水性氨基酸和疏水性氨基酸组成的短肽化合物，广泛存在于动物、植物或微生物中，是先天免疫系统的重要组成部分。截至2014年，已从自然资源中鉴定出2300多个AMP序列，比如蛙皮素、尼生素、蜂毒肽、丙甲菌素和防御素等，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌等微生物都有广谱的抗菌作用。并且更多研究显示AMP也有抗病毒作用。
AMP通常带有正电荷，在生理环境中会折叠成二级结构，包括α-螺旋、β-折叠、环状、无规线状和混合结构，它们在抗菌机制中起着至关重要的作用。不同于传统抗生素的特定靶点抗菌，AMP主要通过与磷脂双分子层作用，物理破坏细菌或真菌的细胞膜从而起到杀菌作用，这种抗菌机制使得微生物很难对AMP产生耐药性，所以AMP是最有望成为下一代新型抗生素的候选化合物。但是，在对抗生物膜方面，带正电荷的AMP倾向于粘附在EPS上，从而导致AMP在生物膜中的渗透受到限制。并且，天然AMP提取困难，蛋白酶稳定性低，溶血毒性高，耐盐能力差，这些缺点限制了天然AMP的进一步应用。
发明内容
为此，本发明实施例针对临床上致盲率极高的FK亟待攻克的难题，即现有眼部抗真菌药物种类单一、耐药性强、生物安全性低、药物角膜通透性差等突出问题，拟通过设计AMP序列及制备多糖多肽偶联物的策略，实现对FK，尤其对深部FK的更有效治疗。并得到一种抗菌作用强、不易产生耐药性、眼表生物安全性高、角膜通透性好的新型眼部抗真菌制剂。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种多糖多肽偶联物，所述多糖多肽偶联物内含多糖、聚乙二醇和多肽，所述聚乙二醇连接所述多肽和所述多糖；
在水相环境中，所述多肽位于核心，所述聚乙二醇位于表面；当所述多糖多肽偶联物遇到细菌或者真菌细胞膜时，发生解组装，暴露出所述多肽。
进一步地，所述多糖为壳聚糖、葡聚糖、藻酸盐、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、果胶、支链淀粉、直链淀粉、环糊精、羧甲基纤维素中的一种或者几种。
进一步地，所述多肽为LKLLKKLLKKLKK，C端被酰胺化，能够自组装成α-螺旋结构。
进一步地，所述多肽为抗菌肽。
进一步地，所述抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为（LKLLKKLLKKLKKLLKKL）4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为（KKLL）n + K；其中，n=1~4；所述抗菌肽的C末端均被酰胺化，所述抗菌肽能够自组装成α-螺旋结构。
进一步地，所述抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为（LKKLLKKLKKLLKKLLKL）4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为K+（LLKK）n；其中，n=1~4；所述抗菌肽的C末端均被酰胺化，所述抗菌肽能够自组装成α-螺旋结构。
进一步地，所述聚乙二醇的平均分子量为100~40000，所述多糖为壳聚糖，所述多肽为抗菌肽。
进一步地，所述聚乙二醇为聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇1450、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3350、聚乙二醇4000、聚乙二醇5000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或者几种。
本发明提供的第二方面，本发明提供的所述多糖多肽偶联物的制备方法，包括两个步骤：
步骤一、多糖的氨基与COOH-PEG-N3的羧基通过EDC/NHS活化反应进行偶联；
步骤二、通过点击化学反应将多肽偶联至多糖-聚乙二醇的叠氮基团上。
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面中所述的一种多糖多肽偶联物以及药学可接受的载体或者辅料。
进一步地，所述药物组合物包括但不限于胃肠道给药剂型、静脉给药剂型、吸入给药剂型、经皮给药剂型和粘膜给药剂型。
进一步地，所述粘膜给药剂型包括但不限于滴眼液、眼膏、眼用凝胶剂、眼用脂质体、眼用乳剂和眼用植入剂。
本发明的第四方面，多糖多肽偶联物在制备治疗真菌性角膜炎药物中的应用。
进一步地，所述角膜炎包括细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、真菌性角膜炎中的一种或者几种。
进一步地，所述细菌角膜炎包括由铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或肺炎链球菌中的一种或几种细菌感染引起的角膜炎。
进一步地，所述病毒性角膜炎包括水痘带状疱疹、腺病毒或HSV-1中的一种或者几种病毒引起的角膜炎。
进一步地，所述真菌性角膜炎包括丝状真菌和/或酵母样真菌引起的角膜炎。
进一步地，所述酵母样真菌包括白色念珠菌和/或隐球菌。
进一步地，所述丝状真菌包括黄曲霉菌、烟曲霉菌、镰刀菌、链格孢菌、淡紫色拟青霉菌中的一种或者几种。
本发明提供的第五方面，多糖多肽偶联物在制备角膜中去除生物膜药物中的应用。
本发明实施例具有如下优点：
一、合成的多糖多肽偶联物能通过破膜杀菌机制抑制细菌和真菌，生物相容性高，并且可以实现在离体角膜组织的全层分布，角膜渗透效果优于那他霉素滴眼液；
二、多糖多肽偶联物对细菌或真菌所致的浅层及深层角膜炎模型具有良好的治疗效果，且多糖多肽偶联物生物安全性有很大提高、眼表刺激性小；
三、多糖多肽偶联物在白色念珠菌浅层和深层真菌性角膜炎感染的动物实验模型中也已显示出优于那他霉素滴眼液的治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为CPL合成的核磁表征；
图2（a）CPL组装体的TEM图像，（b）CPL组装体的DLS谱图，（c）CS-PEG、LK13和CPL组装体的Zeta电位，（d）LK13与CPL组装体在水中的CD谱，（e）LK13与CPL组装体在SDS溶液中的CD谱，（f）CPL在POPG和DOPC中的CD谱；
图3为经CPL组装体、LK13和妥布霉素处理的生物膜中的细菌存活率统计图；
图4 人角膜上皮细胞与LK13、CPL作用后的存活率统计图；
图5 不同样品处理后的白色念珠菌SEM图像（标尺=5.00μm）；
图6 点药前及点药后各组各时间点裂隙灯下观察到的兔眼图；
图7 点药前及点药后各组各时间点角膜荧光素钠染色图；
图8 各组不同时间点病理切片HE染色（x200，标尺=50μm）；
图9 兔眼白色念珠菌性角膜炎浅层模型不同时间点眼前节图像；
图10 兔眼白色念珠菌性角膜炎深层模型不同时间点眼前节图像。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供的第一方面，提供一种多糖多肽偶联物，多糖多肽偶联物内含多糖、聚乙二醇和多肽，聚乙二醇连接多肽和多糖；
在水相环境中，多肽位于核心，聚乙二醇位于表面；当多糖多肽偶联物遇到细菌或者真菌细胞膜时，发生解组装，暴露出多肽。
根据本发明提供的一个具体实施例，多糖为壳聚糖、葡聚糖、藻酸盐、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、果胶、支链淀粉、直链淀粉、环糊精、羧甲基纤维素中的一种或者几种。
根据本发明提供的一个具体实施例，多肽为LKLLKKLLKKLKK，C端被酰胺化，能够自组装成α-螺旋结构。
根据本发明提供的一个具体实施例，多肽为抗菌肽。
根据本发明提供的一个具体实施例，抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为（LKLLKKLLKKLKKLLKKL）4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为（KKLL）n + K；其中，n=1 ~ 4；所述抗菌肽的C末端均被酰胺化，抗菌肽能够自组装成α-螺旋结构。
根据本发明提供的一个具体实施例，抗菌肽从 N 端到 C 端的氨基酸序列为（LKKLLKKLKKLLKKLLKL）4中连续的 4-72 个氨基酸序列，或者为 K+（LLKK）n；其中，n=1 ~ 4；抗菌肽的碳末端均被酰胺化，抗菌肽能够自组装成α-螺旋结构。
根据本发明提供的一个具体实施例，所述聚乙二醇的平均分子量为100~40000，所述多糖为壳聚糖，所述多肽为抗菌肽。
根据本发明提供的一个具体实施例，所述聚乙二醇为聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇1450、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3350、聚乙二醇4000、聚乙二醇5000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或者几种。
本发明实施例提供的第二方面，本发明提供的多糖多肽偶联物的制备方法，包括两个步骤：
步骤一、多糖的氨基与COOH-PEG-N3的羧基通过EDC/NHS活化反应进行偶联；
步骤二、通过点击化学反应将多肽偶联至多糖-聚乙二醇的叠氮基团上。
本发明实施例提供的第三方面，提供一种药物组合物，药物组合物包含本发明第一方面中的一种多糖多肽偶联物以及药学可接受的载体或者辅料。
药物组合物可以采用多种方式施用，这取决于是期望局部治疗还是期望全身治疗。施用可以是局部的眼表滴药或全身的，如口服和/或肠胃外。肠胃外施用包括：静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注。施用途径可选自由眼表滴药、全身施用、口服施用、静脉内施用和胃肠外施用组成的组。
药物组合物可作为用于局部给药的组合物提供，如滴眼剂、霜剂、泡沫、凝胶、洗剂和软膏等。
药物组合物的局部施用制剂可包括无菌水溶液，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂，诸如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。
药物组合物包括但不限于溶液、糊剂、软膏、霜剂、水凝胶、乳液、含有脂质体的制剂、泡沫、滴眼剂和涂料。
药物组合物包括但不限于预成型液体、自乳化的固体和自乳化的半固体。
可根据制药行业内熟知的常规技术制备可方便地以单位剂型呈现的所述药物组合物制备的制剂。此类技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常通过如下方式制备所述制剂：将活性成分与液体载体或磨碎的固体载体或二者均匀且紧密地结合，然后（如有必要），使产品成形。
药物组合物包括但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。
药物组合物配制成水性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇/或葡聚糖，所述悬浮液还可含有稳定剂。
药物组合物配制并用作泡沫。药物泡沫包括但不限于乳剂、微乳剂、霜剂、凝胶剂和脂质体的制剂。
药物组合物可另外含有药物组合物中常规发现的其它辅助组分。药物组合物可含有另外的相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可含有用于物理配制本发明的组合物的各种剂型的另外材料，如缓冲剂、染料、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂或其组合，所添加的材料可以适用于滴眼剂的任何浓度添加到溶液中的药理活性剂一起使用。然而，在被添加时，此类材料不应过度干扰药物组合物的中活性成分多糖多肽偶联物的生物活性。
药物组合物可被灭菌，可以添加不影响药物组合物生物活性的润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质。
根据本发明提供的一个具体实施例，药物组合物包括但不限于胃肠道给药剂型、静脉给药剂型、吸入给药剂型、经皮给药剂型和粘膜给药剂型。
根据本发明提供的一个具体实施例，粘膜给药剂型包括但不限于滴眼液、眼膏、眼用凝胶剂、眼用脂质体、眼用乳剂和眼用植入剂。
所需的确切的量根据受试者不同而不同，这取决于诸如治疗的物种、受试者的年龄和总体状况、治疗的病况的严重性、施用的具体试剂、施用方式等因素。因此，不可能规定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定适当的“有效量”。
剂量取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性，治疗过程可持续几天至几个月，或者直到达到治愈或实现疾病状态的减轻。可由患者身体中的药物积累的测量来计算最佳的给药方案。施用医师可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳的剂量可根据组合物的相对效力而变化，并且通常可基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50或基于本文所述的示例进行估算。通常，剂量可每天、每周、每月或每年给予一次或多次。
使用所得到的滴眼剂治疗或减轻眼部角膜炎症状的方案可包括每天6次向受影响的眼中滴滴眼剂，直到症状的严重性降低到可接受的水平。在特别严重的情况下，可能需要更频繁的施加，而在不太严重的情况下，单次日剂量可能是足够的。
本发明实施例提供的第四方面，多糖多肽偶联物在制备治疗真菌性角膜炎药物中的应用。
根据本发明提供的一个具体实施例，角膜炎包括细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、真菌性角膜炎中的一种或者几种。
根据本发明提供的一个具体实施例，细菌角膜炎包括由铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或肺炎链球菌中的一种或几种细菌感染引起的角膜炎。
根据本发明提供的一个具体实施例，病毒性角膜炎包括水痘带状疱疹、腺病毒或HSV-1中的一种或者几种病毒引起的角膜炎。
根据本发明提供的一个具体实施例，真菌性角膜炎包括丝状真菌和/或酵母样真菌引起的角膜炎。
根据本发明提供的一个具体实施例，酵母样真菌包括白色念珠菌和/或隐球菌。
根据本发明提供的一个具体实施例，丝状真菌包括黄曲霉菌、烟曲霉菌、镰刀菌、链格孢菌、淡紫色拟青霉菌中的一种或者几种。
本发明实施例提供的第五方面，多糖多肽偶联物在制备角膜中去除生物膜药物中的应用。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合多糖多肽偶合物的合成、体外抑菌实验、体内动物实验对本发明的各个方面进行详细介绍如下。
首先通过模拟天然AMP（抗菌肽）的结构设计了兼具阳离子、疏水域和α-螺旋二级结构的AMP—LK13（序列 LKLLKKLLKKLKK），然后以PEG（聚乙二醇）作为连接将 LK13与壳聚糖（CS）偶联。在水相环境中，CPL（壳聚糖-聚乙二醇-肽偶联物，即CS-PEG-LK13）可以自组装成外表面带中性电荷的纳米粒子，其中LK13肽位于核心，而 PEG 位于表面。这种组装结构有利于在角膜基质层中运送。当CPL遇到细菌或真菌细胞膜时，组装体可发生解组装，暴露出LK13，破坏菌膜。
1、CPL的合成。
首先，CS的氨基与COOH-PEG-N3的羧基通过EDC/NHS活化反应进行偶联。
具体为：将100 mg CS溶解在MES缓冲液（体积为10 mL ；浓度为25 mM；pH为5.0）中以形成CS溶液。然后加入100μL浓度为1M稀盐酸来促进CS溶解。同时，在另一反应瓶中将0.62 g COOH-PEG-N3（1当量于CS的氨基）溶解于10 mL浓度为25 mM 、pH为5.0 MES缓冲液中。进一步添加0.48 g EDC（4倍当量于CS的每个氨基）和0.29 g NHS（4倍当量于CS的每个氨基）以活化羧基。将活化反应溶液在室温下搅拌30分钟，然后将其加入CS溶液中，室温下搅拌，再反应48小时。获得的CS-PEG用透析袋（MWCO＝3,500 Da）在去离子水中透析来纯化，然后通过冻干获得干燥的所述CS-PEG。
第二步，通过点击化学反应将LK13偶联至CS-PEG的叠氮基团上。将6.9 mg CS-PEG（5.92μmol）和10 mg LK13（5.92μmol）溶解在体积为583μL、浓度为150 mM、pH为6.0的MES缓冲液中以形成溶液1。将体积为118μL 、浓度为0.5 M CuSO4水溶液与体积为118μL、浓度为1M抗坏血酸钠水溶液在冰浴条件下混合，获得黄色沉淀的Cu(I)悬浊液，然后与体积为118μL、浓度为1M氨基胍水溶液混合，得到白色的悬浊液2。将悬浊液2添加到溶液1中，然后将混合物放在在4℃下搅拌24小时。反应完成后，混合物为绿色。再加入EDTA/Na（pH≈8，100 mM，2.96 mL），搅拌1小时。所得的CPL在去离子水中通过透析袋（MWCO＝3,500 Da）在去离子水中透析进行纯化，然后通过冻干获得干燥CPL样品。
1H NMR测试：将3-5 mgCPL样品溶于600μL的D2O中，在室温（25℃）下测试，根据氢谱的积分面积来计算接枝率。
核磁结果见图1，使用1H NMR来确认CPL的化学结构。在图1a中，化学位移δ =3.111 ppm 代表CS的2位氨基特征峰。图1b中化学位移δ = 2.962 ppm 代表CS的2位氨基特征峰基本不变，化学位移δ = 4.087 ppm代表PEG中a位氢的特征峰，化学位移δ = 3.528ppm代表PEG中b位氢的特征峰。CS和PEG的特征峰同时出现，表明COOH-PEG-N3已成功接枝到CS骨架上。在图1c中，出现了肽的甲基的多重峰（即化学位移δ = 1.065-0.585 ppm）和芳香族三唑d位氢的特征峰（即化学位移δ = 8.041 ppm），说明LK13已通过点击化学反应与CS-PEG成功偶联。
2、CPL样品的TEM测试、DLS测试、zeta电位测试和圆二色谱（CD）测试：
2.1 CPL的TEM测试：将CPL样品水溶液滴到铜网上后用醋酸双氧铀负染，然后在TEM下观察其形貌。
结果见图2a，说明CPL可形成直径约为100 nm的纳米球。
2.2 CPL的DLS测试：将CPL样品水溶液放入比色皿中再通过粒度仪测试粒径。
结果见图2b，说明CPL在不同浓度下可形成直径约为100 nm的纳米球。
2.3 CPL的zeta电位测试：将不同浓度的CPL样品水溶液通过马尔文zeta电位分析仪测量其zeta电位。
结果见图2c，应用Zeta电位研究样品表面性质，可以看到LK13肽显示出强正电荷，而CS-PEG表现出中性电荷。CPL组装体的Zeta电势呈电中性，表明中性电荷的CS-PEG在表面，而带正电的LK13肽被保护在内部。
2.4 CPL的圆二色谱（CD）测试：通过圆二色谱仪在室温下测试CPL样品的二级构象。石英比色皿的路径长度为1.0 mm，光谱扫描范围为190-250 nm。每个样品以100 nm/min的扫描速度扫描3次。溶剂背景去除后获得CD谱图。
结果见图2d-f。通常，天然AMP在水溶液中表现出随机构象，在插入细菌膜中时会形成α-螺旋。LK13肽是通过模拟天然AMP的结构设计的。如CD光谱所示（图2d-f），水中的LK13肽和CPL组装体均在198 nm附近显示负峰，表明存在随机构象。在十二烷基硫酸钠（SDS）膜结构中，LK13肽和CPL均在222 nm和208 nm处显示出双重负峰（图2e）。该双重负峰与α-螺旋构象的特征峰一致，证实了CPL在膜结构上的解组装过程和随后的α-螺旋LK13肽的暴露。
为了进一步研究CPL组装体在细胞膜上的二级结构，磷脂1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-（1'-rac-甘油）钠盐（POPG）和1，2-二-（9Z-十八烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）分别模拟带负电的细菌细胞膜和不带电的哺乳动物细胞膜。图2f显示CPL在磷脂POPG中显示α-螺旋构象，但在磷脂DOPC中显示随机构象。与不带电荷的哺乳动物细胞膜相比，带负电荷的细菌或真菌细胞膜更容易驱动CPL组装体的解组装和LK13肽的暴露。CPL组装体在遇到哺乳动物细胞膜时倾向于保持其组装结构，其中LK13肽表现出随机构象。相反，当CPL组装体遇到细菌或真菌细胞膜时，它很可能解组装，并且暴露出LK13，表现出α-螺旋构象。该特征有利于提高样品对细菌或真菌的选择性。
3 CPL样品抑菌浓度的测定：
3.1 CPL样品最小抑菌浓度（MIC）的测定
革兰氏阴性菌——铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌（S. aureus）或真菌——白色念珠菌（C. albicans）的 MIC的测定，采用改良微量肉汤稀释法进行测定。接种环刮取培养基中菌落悬浮于肉汤之中，并将其进一步稀释至105CFU/mL。预先在无菌 96 孔板中加入100μL生理盐水，其中100μL生理盐水加100μL肉汤作阴性对照，100μL 生理盐水加100μL细菌或真菌悬浮液作阳性对照。将CPL和LK13溶液从高浓度至低浓度进行对半稀释，然后将100μL细菌或真菌悬浮液添加到每个孔中。将96孔板置于培养箱中培养 12-16 小时，采用目测法以肉眼能观察到有明显浊度孔的抗菌药物的上一个稀释度对应的浓度即为MIC值。为确定肉眼判定的MIC孔的准确性，用酶标仪测定每个孔在620nm处的OD值，根据以下公式计算出每个浓度对应的抑菌率，当所测抑菌率≥90%时，可认定该MIC值为可靠值：
抑菌率（%）=（阳性对照值OD值-试验OD值）/（阳性对照值OD值-阴性对照OD值）×100%
表1-1 LK13和CPL组装体对两种菌株的HC10值（溶血率为10%所对应的样品浓度）、MIC值（最小抑菌浓度）和选择性 a
Figure 10250DEST_PATH_IMAGE001
a 所有的浓度都转换成LK13的实际浓度。
结果从表1-1可以看出，LK13对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有广谱抗菌特性。通过PEG（聚乙二醇）与CS（壳聚糖）偶联后，LK13肽对革兰氏阴性细菌的抗菌作用没有改变（对P. aeruginosa为8μg/mL）。
表1-2 LK13 与CPL的抗真菌效果与选择性（浓度为换算的实际多肽浓度，HC10值（溶血率为10%所对应的样品浓度）、MIC值（最小抑菌浓度））
Figure 865074DEST_PATH_IMAGE002
表1-2表明，对于白色念珠菌，多肽LK13的MIC为32μg/mL，而CPL的MIC可达16μg/mL，对应的实际多肽浓度为8μg/mL。壳聚糖-聚乙二醇-肽偶联物的抗真菌性能相对于纯多肽有显著的上升。
4 CPL样品红细胞溶血实验:
将5 mL新鲜的兔血以1000 g离心力离心10分钟以获得红细胞。用Tris缓冲液（10mM Tris，150 mM NaCl，pH = 7.2）洗涤红细胞3次，直到上清液澄清。将100 μL不同浓度的溶于Tris缓冲液中的CPL样品和100μL适宜浓度的红细胞悬浮液添加到离心管中，并在37℃下孵育1 h。将混合物以1000 g离心力离心10分钟后，将50μL上清液和50μL Tris缓冲液转移至96孔微孔板中。使用酶标仪测量540 nm处的吸光度。纯水用作阳性对照，Tris缓冲液用作阴性对照。根据以下公式计算溶血率：
溶血率=（H-Hn）/（Hp-Hn）×100%
其中H，Hn和Hp分别代表样品组，阴性对照组和阳性对照组的吸光度。
红细胞溶血实验结果显示（表1-1和表1-2）：多肽LK13的HC10（红细胞溶血率为10%时所对应的样品浓度）为13130μg/mL，CPL的HC10为32000 μg/mL以上。
用HC10与MIC的比值来计算待测样品对红细胞的选择性，比值越大所测样品的生物选择性越高，表1-1和表1-2中数据可见CPL的选择性远大于LK13的选择性。生物安全性有较大提高。
5 CPL样品对生物膜的体外抑菌实验:
将肉汤配制的107 CFU/mL的铜绿假单胞菌悬浮液，每孔100 μL添加到96孔板（Nunc 269787）中。然后，将孔板用装有96个钉的板盖（Nunc 445497）覆盖，并在37℃的恒温箱中孵育48小时以形成生物膜。然后钉盖用PBS洗涤两次，再转移到新的96孔板中，其中每孔中包含200μL用PBS配制的不同浓度的样品，纯PBS作为对照组。在37℃下孵育24小时后，将钉盖用PBS洗涤，然后转移至含有200μL PBS的新96孔板中。将孔板通过超声处理15分钟，使生物膜分散。然后将孔中的悬浮液稀释至一定浓度，并平铺涂在琼脂平板上孵育过夜，然后计算菌落数。
如图3所示，在8倍MIC的浓度下，LK13和妥布霉素对生物膜的抗菌效率都非常低（LK13为15.24%，妥布霉素为33.57%），其抗菌功效的显着下降是由于胞外高分子基质的限制。而由于CPL在水合通道中容易形成大小~100 nm、外表面为电中性的组装结构，遇到菌膜时会解组装并暴露LK13，因此CPL既可以高效穿透生物膜又可以有效破坏菌膜。在8倍MIC浓度时，CPL对生物膜中的抗菌效率为72.7%。当浓度进一步增加到16倍MIC时，其在生物膜中的抗菌效率已达到97.95%，明显高于LK13（41.58%）和妥布霉素（45.5%）。
6 CPL样品对人角膜上皮细胞毒性实验：
人角膜上皮细胞（HCECs）在完全培养基中培养，培养温度为37℃，培养环境为含有5% CO2、饱和湿气的环境。细胞毒性实验中，首先将细胞以5,000-8,000个/孔的密度接种在96孔板中培养过夜。再将旧的培养基吸出弃掉，加入包含不同浓度样品的新培养基。不加样品的纯培养基用作对照。孔板放入培养箱孵育1小时后，再将先前的培养基替换为包含10%（v/v）CCK-8的培养基。将孔板放入培养箱培养1-2小时后，用酶标仪测量450 nm处的吸光度。根据以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率（%）=（As/Ac）×100%
表2 人角膜上皮细胞与LK13 、CPL作用后的存活率（换算为多肽实际浓度）
Figure 644811DEST_PATH_IMAGE003
人角膜上皮细胞毒性实验表明（表2），多肽LK13浓度在64μg/mL时对人角膜上皮细胞增殖有明显抑制作用（细胞存活率为61%），而含有等量多肽浓度的CPL对人角膜上皮细胞表现出促生长作用（细胞存活率为130%）。故本研究后续动物实验选择含有实际多肽浓度为64μg/mL的CPL（128μg/mL）作为实验浓度。
7 扫描电镜观察CPL样品与菌作用实验。
首先，将108 CFU/mL的菌悬浮液分为3份，一份与LK13作用，一份与CPL作用，一份不加任何样品。作用2 h后，离心，洗涤两次后重悬于2.5%戊二醛溶液中，放于4℃冰箱过夜以固定菌体。然后将固定的菌用生理盐水洗涤三次，将固定液洗掉，用梯度浓度乙醇脱水（乙醇浓度为30%，50%，70%，90%脱水1次，100%乙醇脱水3次，10分钟/次）。最后，将菌悬浮液10μL滴于硅片上，自然干燥（过夜）后喷金，于SEM上观察菌的形态。
结果如图5，从SEM图像可见，未经任何处理的白色念珠菌菌体呈现出完整光滑饱满的形态（图5-A）；经LK13处理的白色念珠菌菌体塌陷皱缩（图5-B）；经CPL 处理的白色念珠菌菌体塌陷皱缩伴内容物流出（图5-C，黑色箭头所指），该结果提示，CPL与LK13的抗菌机制均为破膜杀菌，且CPL对真菌菌体的破坏程度比多肽LK13更加严重。
8 CPL的眼表刺激性评估：
采用改良的Draize眼刺激性评分原则来评估CPL的眼表刺激性，健康新西兰白兔9只，雌性，体重2.0-2.5kg，分别于测试前24h裂隙灯下观察眼睑、角膜，结膜等组织，确定无任何眼部病变后将其分为3组，采用兔左右眼自身对照，其中右眼分别给予CPL（128μg/mL）、LK13（64μg/mL）、5%那他霉素组。采用多次给药刺激性实验，具体方法为：每次给药50μL，一日6次，连用7日，左眼给予同频次等量的生理盐水作为对照。每次点药后观察兔眼有无频繁眨眼、畏光、流泪等眼部刺激症状，于末次点药后1h、12h、24h、48h、72h裂隙灯下观察每组兔眼情况，荧光素钠染色钴蓝光下观察有无上皮损伤等情况。于末次点药后1h、24h、72h，耳缘静脉空气栓塞法处死每组实验兔各1只，立即取出兔眼球，生理盐水冲洗，4%甲醛固定过夜，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察角膜组织各层情况。眼刺激性评分遵循Draize眼刺激性评分原则。
Draize眼刺激性评分：
角膜：无混浊 0分；散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1分；半透明区易分辨，虹膜模糊不清2分；出现灰白色半透明区、虹膜细节不清、瞳孔勉强可见 3分；角膜不透明、虹膜无法辨认 4分。
虹膜：正常 0分；褶皱加深、充血肿胀、瞳孔对光仍有反应 1分；出血、肉眼可见坏死或对光反应消失（或其中一种）2分。
结膜充血（指球结膜和睑结膜）：血管正常 0分；血管充血成鲜红色 1分；血管充血成深红色、血管不易分辨 2分；血管弥漫性充血成紫红色 3分。
结膜水肿：无水肿0分；轻微水肿（含眼睑）1分；明显水肿伴部分眼睑外翻2分；水肿至眼睑近半闭合3分；水肿至眼睑过半闭合4分。
分泌物：无分泌物 0分；少量分泌物 1分；分泌物使眼睑或睫毛潮湿或黏着 2分；分泌物使整个眼区潮湿或黏着 3分。
最大总积分 16分。
Draize眼刺激性评分等级：
无刺激性 0-3分；轻度刺激 4-8分；中度刺激 9-12分；重度刺激13-16分。
结果如图6，图7与图8所示采用长期给药法，即每日给药6次，连续给药7天，评价该制剂对兔眼表的刺激作用。观察期间得到的每组动物眼表刺激评分的总分值除以动物数量得到每一组受试药物的刺激性平均分值（表3）。
表3 兔眼表刺激性评分结果
Figure 226971DEST_PATH_IMAGE004
末次点眼后1h、12h、24h、48h、72h裂隙灯下观察，那他霉素组有1只实验兔末次点药后1h出现结膜充血；CPL组有1只实验兔末次点药1h后出现结膜充血，1只实验兔末次点药后12h出现分泌物；LK13组3只实验兔均于末次点药后1h及12h出现角膜缘上方球结膜血管充血，且伴有白色黏液状分泌物，此类体征均于24h后消失，余眼前节未见明显异常（图6）。
荧光素钠染色角膜透明完整，未见明显着染渗染等上皮受损表现（图7）。末次点药后1h、24h、72h各组分别空气栓塞处死实验兔1只，取其角膜组织进行HE染色（图8）示：生理盐水组、CPL组及那他霉素组，角膜上皮细胞排列整齐，连接紧密，细胞核完整清晰可辨；基质层未见明显水肿，基质细胞排列有序，形态规则，无异常炎症细胞浸润；内皮层与基质层连接紧密，细胞连续，未见明显结构异常。LK13组可见上皮粗糙，上皮卷丝形成（图8黑色箭头所示）；基质层细胞间隙增大，结构疏松；内皮层未见明显异常。
眼表刺激性实验结果显示，连续多次给药，生理盐水组、那他霉素组、CPL组的兔眼刺激性评分均少于3，由Draize眼刺激性评分等级可知，刺激性评分分值在 0～3 之间代表无刺激性，LK13眼刺激性评分为4，刺激性评分分值在 4～8 之间代表轻度刺激性，同时结合HE染色结果，综合考虑LK13对于兔眼有轻度刺激性。CPL对兔眼无刺激性，说明多糖多肽偶联物提高了多肽的生物安全性。
9 CPL在角膜中的渗透情况：
为了便于检测CPL在角膜中的渗透情况，将荧光分子罗丹明B接枝于CPL上。选取健康新西兰白兔6只，雌性，体重2.0-3.5kg于裂隙灯下观察兔角膜无角膜炎、角膜白斑、角膜溃疡等病损情况。将白兔处死，沿其角巩膜缘外3mm取下角膜。垂直扩散池（Franz Cell）上方为放置样品的供应池，中央为扩散区域（用于固定角膜），下方为接收样品的接收池（容积5mL）。将新鲜离体兔角膜（离体30min内）固定于扩散池的扩散区域内，上皮层朝上方，内皮层朝下方。上方供应池中加入500 μL接枝有罗丹明B的CPL（浓度1mg/ml）或市售那他霉素滴眼液（5%），下方接收池内加入5 ml预热的生理盐水，将整个装置置于37℃的恒温水浴槽内，持续给药，在固定的时间从接收池中取出100 μL测量吸光度（取完会再补充接收池生理盐水，维持体积不变），换算为样品浓度，再根据接收池接收样品质量与进样池最初加入样品总质量的比值来比较CPL与那他霉素的渗透效果。
结果如表格4所示，在22小时时间点CPL的通透性为7.50%，在下方接收池检测测到CPL就说明CPL已经穿透了角膜全层。而那他霉素在检测的24小时之内均未检测到那他霉素的紫外吸收，通透性为0，说明那他霉素在检测时间内未能穿透角膜全层。由此对比出CPL对角膜的穿透性优于市售那他霉素滴眼液。
表4 CPL与那他霉素在角膜中的通透性
Figure 41343DEST_PATH_IMAGE005
10 CPL体内药效学实验。
新西兰白兔28只，雌性，体重2.0-2.5kg，购买于天津裕达实验动物养殖有限公司，均饲养于天津医科大学眼科研究所，自由饮水及进食，饲养环境符合医学实验动物饲养的环境要求。
（1）浅层感染模型的建立
改良角膜浅基质划痕法建立新西兰大白兔浅表真菌性角膜炎模型。
（2）深层感染模型的建立
改良角膜深基质划痕法建立新西兰大白兔深层真菌性角膜炎模型。
（3）实验动物分组
浅层感染模型分为4组，CPL组（n=4）、LK13组（n=4）、5%那他霉素组（n=4），将生理盐水组（n=4）作为对照组。深层感染模型分为3组，CPL组（n=4）、5%那他霉素组（n=4），将生理盐水组（n=4）作为对照组。
每次药物用量为50μL（滴于兔右眼下睑结膜囊内，手动将其上下睑闭合数次使药物均匀涂布于角膜后，再使其闭眼10s），6次/日，连用7日后改为4次/日，以该频率治疗直到角膜溃疡愈合。于点眼治疗第1、3、7、14、21、28天进行荧光素染色评分及眼表感染程度临床评分，对角膜溃疡面积（0-4）、角膜混浊程度（0-4），角膜水肿（0-3），角膜新生血管（0-3），前房反应（0-4）以及结膜充血（0-3）程度进行分级并记录，同时每组随机选出1只实验兔刮取角膜溃疡边缘组织做真菌及细菌培养，若造模后出现混合感染（如细菌性角膜炎等）会影响真菌性角膜炎模型结果及药物疗效评判，故将此类实验兔剔除出组。
兔眼感染程度的临床评分标准如下：
溃疡面积：角膜透明，无浸润及溃疡 0分； 病灶累及中央7mm区域的1%-25% 1分；
病灶累及中央7mm区域的26%-50% 2分；病灶累及中央7mm区域的51%-75% 3分；病灶累及全角膜 4分；
混浊度：角膜透明、虹膜纹理清晰 0分； 角膜雾状或毛玻璃样混浊，虹膜纹理可辨1分；角膜灰白色混浊累及浅层基质，透过病灶模糊可见虹膜纹理 2分；角膜灰白色混浊累及深层基质，透过病灶仅见前房，虹膜纹理不清 3分；角膜灰白色致密混浊，视不清前房 4分。
前房反应：前房水清，房水闪辉、细胞阴性 0分；前房可见细胞、房水闪辉或纤维素性渗出 1分；前房可见线状或片状灰白色脓性渗出，未形成液平面 2分；前房积脓形成液平面，但不与角膜病灶相连 3分；前房多量积脓，与角膜病灶相连 4分；
结膜充血：无充血 0分；角膜缘血管环轻度充血 1分；角膜缘血管环中度充血 2分；角膜缘血管环重度充血，血管怒张 3分；
角膜水肿：无水肿 0分；轻度水肿（少于1/2角膜） 1分；中度水肿（大于1/2角膜） 2分；整个角膜水肿 3分；
新生血管：无新生血管 0分；周边角膜血管化（角膜缘2mm） 1分；中周部角膜血管化（大于角膜缘2mm） 2分；角膜中央血管化 3分。
（4）统计学方法
采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析。MIC、人角膜上皮细胞毒性试验、红细胞溶血等实验数据采用Mean±SD表示，两组数据间对比采用独立样本t检验。治疗作用评价中，生理盐水组，CPL组、LK13组及那他霉素组的眼表感染评分及溃疡愈合时间以Mean±SD表示，并行正态分布及方差齐性检验，各组不同时间点眼表感染评分比较采用重复测量两因素方差分析，四组同一时间点结果差异及角膜愈合时间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义（*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001）。
结果：
将浅层模型（n=16）分为生理盐水组、CPL组、LK13组、那他霉素组。造模后第1、3、7、14、21、28天裂隙灯下观察角膜感染情况并进行评分（图9）。
造模后第1天，兔眼白色念珠菌性角膜炎（浅层）模型建立，4组兔子均可见角膜缘血管环扩张充血，角膜呈灰白色浅层溃疡累及角膜中央约7*7mm范围；造模后第3天，4组角膜灰白色溃疡呈逐渐扩大加重趋势，LK13组有1只出现前房积脓；造模后第7天，生理盐水组，LK13组及那他霉素组角膜溃疡情况较前未见明显好转，灰白色浸润灶较前致密，均可见新生血管呈树枝状长入角膜缘，角膜组织水肿；CPL组角膜溃疡病灶较前明显缩小，仅累及中央区1*1mm范围，未见新生血管长入角膜。造模第14天至21天，生理盐水组水肿逐渐消退，溃疡愈合，伴新生血管长入角膜病灶区，最终遗留灰白色角膜斑云翳。LK13组与那他霉素组溃疡愈合，伴萎缩变细的新生血管长入角膜组织，角膜中央遗留片状斑云翳；CPL组溃疡愈合，未见明显新生血管长入角膜组织，中央区遗小片状角膜云翳。造模后第28天，四组角膜情况稳定，未见炎症复发。
不同时间点浅层各组间眼表感染性评分统计学分析结果显示：造模后第1天各组兔眼表感染评分差异无统计学差异（F1=0.268，P>0.05）,造模后第7、14、21、28天，各组兔眼表感染评分均有统计学差异（F7=16.574，F14=27.818，F21=34.400，F28=6.077，均P<0.05）；生理盐水组眼表感染评分明显高于其他三组（P<0.05），LK13组与那他霉素组评分高于CPL组（P<0.05），LK13与那他霉素组眼表评分无明显差异（P>0.05）（见表5）。
表5 兔眼白色念珠菌性角膜炎浅层模型不同时间点眼表评分（Mean±SD）
Figure 801489DEST_PATH_IMAGE006
注：a代表此组数据与对应生理盐水组数据这两组数据比较时aP<0.05，b代表此组数据与对应那他霉素组数据这两组数据比较时bP<0.05。
四组角膜愈合时间比较（F时间=29.170，P<0.05），生理盐水组愈合时间为20.50±1.73天，LK13组为15.00±0.82天，CPL为11.75±0.96天，那他霉素组为19.25±2.06天，CPL组溃疡愈合所需时间短于LK13组（P<0.05），LK13组愈合时间短于那他霉素组与生理盐水组（P<0.05），那他霉素组愈合时间与生理盐水组无明显差异（P>0.05）。
将真菌性角膜炎深层模型（n=12）分为生理盐水组、CPL组及那他霉素组。图10为真菌性角膜炎深层模型造模后第1、3、7、14、21、28天裂隙灯显微镜图像。
造模后第1天兔眼白色念珠菌性角膜炎深层模型建立，3组角膜缘血管环充血明显，角膜均呈灰白色浅层溃疡累及中央区角膜7mm范围，病灶周边角膜水肿，CPL组前房可见脓性渗出；造模后第3天，3组角膜灰白色溃疡及浸润深度较前扩大，且生理盐水组与那他霉素组角膜水肿较前加重，CPL组前房脓性渗出消失，角膜轻度水肿。造模后第7天CPL组角膜溃疡灶较前明显缩小，约累及中央区3mm范围，灰白色浸润较前减轻，上方可见新生血管长入角膜缘约2mm；生理盐水组及那他霉素组溃疡面积较前未见明显缩小，上方可见新生血管长入病灶周边区域。造模后第14天至21天，生理盐水组溃疡范围及浸润程度稍较前减轻，角膜全周新生血管长入中央病灶区，周边角膜水肿明显; CPL组角膜溃疡范围进一步缩小直至愈合，角膜水肿消退，病灶上方可见新生血管长入；那他霉素组溃疡进一步缩小，病灶上方新生血管长入，周边角膜轻水肿。造模后第28天，生理盐水组和那他霉素组角膜溃疡愈合，水肿消退、新生血管变细，中央区遗留片状斑翳；CPL组角膜新生血管变细萎缩，中央区遗留片状斑翳，未肉汤配制的见角膜炎复发。
不同时间点深层各组间眼表感染性评分统计学分析结果显示：造模后第1天各组兔眼表感染评分差异无统计学差异（F1=0.115，P>0.05）,造模后第3、7、14、21、28天，各组兔眼表感染评分均有统计学差异（F3=15.8，F7=18.618，F14=26.373，F21=95.00，F28=14.226，均P<0.05），造模后第3、7天生理盐水组及那他霉素组眼表感染评分明显高于CPL组（P<0.05），造模后第14、21天，那他霉素组眼表评分较生理盐水组有明显下降（P<0.05），但仍较CPL组评分高（P<0.05）。造模后第28天，三组角膜均处于瘢痕期，此时生理盐水组及那他霉素组角膜评分无明显差异（P>0.05），但二者均高于CPL组（P<0.05）（见表6）。
表6 兔眼白色念珠菌性角膜炎深层模型不同时间点眼表评分（Mean±SD）
Figure 68522DEST_PATH_IMAGE007
注：a代表此组数据与对应生理盐水组数据这两组数据比较时aP<0.05；b代表此组数据与对应那他霉素组数据这两组数据比较时bP<0.05。
三组角膜愈合时间比较（F时间=41.895，P<0.05），生理盐水组愈合时间为27.25±0.96天，CPL为19.75±1.50天，那他霉素组为26.25±1.25天，CPL组愈合时间较生理盐水组和那他组明显缩短（P<0.05），但那他霉素组愈合时间与生理盐水无明显统计学差异（P<0.05）。
对兔眼真菌角膜炎浅层和深层模型的治疗结果都说明，CPL的治疗效果要优于市售那他霉素组，CPL对真菌性角膜炎有更好的治疗效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (15)

1.一种多糖多肽偶联物，其特征在于，所述多糖多肽偶联物内含多糖、聚乙二醇和多肽，所述聚乙二醇连接所述多肽和所述多糖；
在水相环境中，所述多肽位于核心，所述聚乙二醇位于表面；当所述多糖多肽偶联物遇到真菌细胞膜时，发生解组装，暴露出所述多肽。
2.如权利要求1所述的一种多糖多肽偶联物，其特征在于，所述多糖为壳聚糖、葡聚糖、藻酸盐、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、果胶、支链淀粉、直链淀粉、环糊精、羧甲基纤维素中的一种或者几种。
3.如权利要求1所述的一种多糖多肽偶联物，其特征在于，所述多肽为LKLLKKLLKKLKK，C端被酰胺化，能够自组装成α-螺旋结构。
4.如权利要求1所述的一种多糖多肽偶联物，其特征在于，所述多肽为抗菌肽。
5.如权利要求1所述的一种多糖多肽偶联物，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为100~40000，所述多糖为壳聚糖，所述多肽为抗菌肽。
6.如权利要求1所述的一种多糖多肽偶联物，其特征在于，所述聚乙二醇为聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇1450、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3350、聚乙二醇4000、聚乙二醇5000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或者几种。
7.一种制备如权利要求1-6任意一项所述多糖多肽偶联物的方法，包括两个步骤：
步骤一、多糖的氨基与COOH-PEG-N3的羧基通过EDC/NHS活化反应进行偶联；
步骤二、通过点击化学反应将多肽偶联至多糖-聚乙二醇的叠氮基团上。
8.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-6任意一项所述多糖多肽偶联物以及药学可接受的载体或者辅料。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是胃肠道给药剂型、静脉给药剂型、吸入给药剂型、经皮给药剂型或粘膜给药剂型。
10.如权利要求9所述药物组合物，其特征在于，所述粘膜给药剂型是滴眼液、眼膏、眼用凝胶剂、眼用脂质体、眼用乳剂或眼用植入剂。
11.如权利要求1所述的多糖多肽偶联物在制备治疗真菌性角膜炎药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述真菌性角膜炎包括丝状真菌和/或酵母样真菌引起的角膜炎。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述酵母样真菌包括白色念珠菌和/或隐球菌。
14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述丝状真菌包括黄曲霉菌、烟曲霉菌、镰刀菌、链格孢菌、淡紫色拟青霉菌中的一种或者几种。
15.如权利要求1所述的多糖多肽偶联物在制备角膜中去除生物膜药物中的应用。
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