KR102220918B1 - 유오디아 파스퇴리아나 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유오디아 파스퇴리아나 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물은 염증억제 효과가 우수하여 다양한 염증성 질환의 개선, 예방, 또는 치료제로서 폭넓게 사용될 수 있다.

Description

유오디아 파스퇴리아나 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition comprising Euodia pasteuriana extract for Preventing or Treating Inflammatory disease as active ingredient}

본 발명은 유오디아 파스퇴리아나 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증(inflammation)이란 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻한다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생되는 백혈구의

사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입 받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다. 염증에 의한 농양의 치료는 소염작용을 통하여 촉진될 수 있는데, 소염작용이란 항균제를 이용하여 침입균의 증식을 억제하거나 농양중에 축적된 이물질들을 탐식하는 대식세포(macrophage)를 활성화하여 상기 이물질들을 소화 및 배설하는 대식세포의 기능을 항진시키는 등의 염증치료 촉진작용이다.

일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 칭한다. 상기 염증질환은 외부자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 상기 염증성 질환은 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전 및 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive puEponary disease)등을 포함한다.

많은 염증관련 질환의 발병에는 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 대표적인 염증관련 인자들로는 IL-1β, TNF-α 등이 있다. 또한, 염증반응의 유도물질들 중에서 LPS(lipopolysaccharide)는 그람음성세균의 세포 표면을 구성하는 물질로서 백혈구와 같은 면역세포와 상호 작용을 하며, 염증관련 사이토카인의 조절에 관여한다.

한편, 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana)가 위염을 포함하는 염증성 질환의 치료에 효과적인지는 거의 알려진 바 없다.

한국등록특허 10-1705460

이에 본 발명자들은 유오디아 파스퇴리아나 추출물이 치료 효과가 높으면서도 부작용이 적어, 염증성 질환의 치료 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 조성물은 식품 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 용매에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 염증성 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 염증성 피부질환, 알레르기성 질환, 크론씨 질환(Crohn's desease), 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게릭 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive puEponary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-puEponary dysplasia)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 조성물은 NF-κB 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 Syk(Spleen tyrosine kinase) 단백질의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 Src 단백질(Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료방법을 제공한다.

또한 본 발명은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 염증성 질환의 예방 및/또는 치료 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물의 염증성 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물은 염증반응으로 생성되는 사이토카인과 그에 따른 반응물의 생성을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 면역활성에 관여하는 신호전달 단백질의 발현을 억제시키는 효과가 있다. 또한, 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물의 염증억제 효과는 동물 모델에서도 우수하며, 천연물로서 세포독성이 없기 때문에, 다양한 염증성 질환의 개선, 예방, 또는 치료제로서 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 Euodia pasteuriana의 메탄올 추출물 (이하 Ep-ME)이 RAW 264.7 cells 에서 염증 유발 물질 lipopolysaccharide (이하 LPS)에 의한 니트릭 옥사이드 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 Ep-ME의 RAW 264.7 cells에 대한 세포 독성효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Ep-ME가 LPS에 의한 염증관련 사이토카인인 iNOS, COX-2, 및 IL-1β의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 Ep-ME가 전사인자인 NF-κB의 활성 감소에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 Ep-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질 AKT, IκBα의 인산화 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 초기 시간에서 Ep-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질 Src, Syk의 인산화 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 Syk 과발현을 통한 염증 발생시 Ep-ME의 신호전달 단백질인 syk의 인산화 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 Ep-ME와 표적 단백질 Syk 사이의 결합 안정성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 동물 급성 위염 모델에서 Ep-ME의 위 염증 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 염증 신호 전달 체계에서 Ep-ME의 표적 단백질 Syk을 통한 염증 억제 효과를 나타내는 기작을 나타낸 것이다.

본 발명은 유오디아 파스퇴리아나 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana)는 Rutaceae과 쉬나무 속(Euodia)에 속하는 식물로서, 베트남에서 주로 서식하며, Melicope accedens로도 명명된다. Melicope accedens는 Rutaceae과의 식물로서, Melicope accedens는 높이 40 미터(130 피트)까지 관목이나 나무로 자란다. 또한, 열매는 둥글거나 타원형, 난(卵)형이 되며, 길이는 최대 0.5cm (0.2 인치)이다.

본 발명의 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana)는 그 원형을 훼손하지 않고 그대로 사용하거나, 당업자가 의도하는 공정 속도 및 공정(제조) 효율을 고려하여 전처리 과정을 수행한 후 사용할 수 있으며, 상기 전처리 과정으로는 예를 들어 통상적인 선별, 수세, 절단, 분말화, 건조 등의 단계를 거칠 수 있다.

본 발명의 유오디아 파스퇴리아나 추출물은 공지의 천연물 추출방법에 의하여 추출될 수 있다. 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출될 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6개의 유기용매는 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 유오디아 파스퇴리아나 추출물은 바람직하게는 메탄올로 추출될 수 있다. 추출방법은 상기 용매를 사용하여 냉침, 온침, 가열 등 통상의 추출방법이 사용 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서는 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물의 활성을 검증한 결과, 상기 추출물이 세포독성 없이 대식세포 유래 세포독성물질인 NO의 생성을 억제할 뿐만 아니라(실시예 3 및 실시예 4 참조),

NF-κB 활성화를 억제하여 iNOS, COX-2, 및 IL-1β유전자 발현을 억제하고(실시예 5 및 6참조),

NF-κB에 직접적으로 결합하는 IκBα를 강하게 억제시킬 뿐만 아니라, 결정적으로 NF-κB 신호전달 단백질 중 가장 상위인자로 알려진 Syk의 단백질의 활성을 억제시켰으며 Syk을 과발현 시킨 조건에서 그 억제효과를 뚜렷하게 나타내며(실시예 7 및 8 참조),

NF-κB 경로와 관련된 표적 단백질들(Akt, IκBα, 및 src)의 인산화를 감소시키며(실시예 7 참조),

급성 위염 동물 모델에서, 우수한 위염 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 9 참조).

이에, 유오디아 파스퇴리아나 추출물은 다양한 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 상기 염증성 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 염증성 피부질환, 알레르기성 질환, 크론씨 질환(Crohn's desease), 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게릭 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive puEponary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-puEponary dysplasia)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 염증성 질환은 위염, 위궤양, 위궤양 장염, 십이지장궤양, 위암, 장폐색증, 급성 위장관 출혈, 크론씨병, 궤양성 대장염 및 기능성 소화불량으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 위장질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 유오디아 파스퇴리아나 추출물은 염증성 질환의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 조성물에 1 pg 내지 30g w/v%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “개체”란 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 염증성 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 체액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명은 유오디아 파스퇴리아나 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 유오디아 파스퇴리아나 추출물은 염증성 질환의 개선을 목적으로 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다.

본 발명의 유오디아 파스퇴리아나 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 유오디아 파스퇴리아나 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 유오디아 파스퇴리아나 추출물은 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 20 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 유오디아 파스퇴리아나 추출물은 화장료 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5% 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01-3% 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 제형이 로션, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 준비

Euodia pasteuriana 메탄올 추출물(이하, Ep-ME 추출물)을 해외생물소재센터(www.ibmrc.re.kr, FBM098-017)에서 구입하였다.

실시예 2. 세포배양법

Murine 유래 대식세포주 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다. Human 세포주인 HEK293 세포를 페니실린(100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 100 mm 세포배양 디쉬에 70-80%의 밀도로 배양하였다.

실시예 3. 대식세포 유래 세포독성물질 NO 생성능 측정

마우스 대식세포주인 RAW264.7를 페니실린(100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 1×10⁶ cell/ml의 농도로, 96 well plate에 100μl씩 옮겼다. 그 후 5% CO₂ 및 37℃에서 18시간 동안 전배양하였다. 이후 4배 농도로 조제된 Ep-ME 추출물 50 μl와 50 μl의 LPS (최종농도 1 μg/ml) 함유 배지를 동시에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 상층액을 100 μl씩 다른 96 well plate에 옮기고 NO 정량은 Griess 용액 (0.5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H₃PO₄)을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다. 표준물질로 sodium nitrite (0 에서 100μM) 를 사용하여 검량선을 작성하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, Ep-ME 추출물은 농도의존적으로 염증반응의 생성물인 니트릭 옥사이드(Nitric oxide, NO)의 발생을 억제시킴을 확인하였다.

실시예 4. 세포 생존률(cell viability) 확인

MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphinyltetrazolium bromide) assay법을 이용하여 분석하였다. 96-well plate에 1 × 10⁶ cell/ml (RAW264.7 cells) 의 세포를 plating하고 37℃에서 각 면역실험 조건에 상응하는 배양시간 동안 CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 10 ㎕ MTT 용액 (stock concentration : 5 mg/ml)을 첨가하고 3시간 동안 추가반응을 유도하였다. 반응 종료 및 formazan crystal 용해를 위해 각 well에 100 ㎕ MTT stopping solution (10% Sodium dodecyl sulfate in 0.01M HCl)을 추가적으로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 formazan으로 환원된 양을 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Ep-ME의 대식세포에 대한 세포 독성효과가 유의하지 않음을 확인하였다. 즉, Ep-ME 추출물이 세포독성 없이 염증반응을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

실시예 5. RT-PCR을 이용한 mRNA 발현량 조사

전사수준에서의 조절을 측정하기 위해 각 시료를 일정시간 동안 처리하고 Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 sense 및 antisense primer 염기서열은 기존문헌을 참조하여 제조하고, 대조군 유전자로는 GAPDH을 사용하였다. PCR amplication은 Hipi PCR kit (Elpis biotech)을 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적단백질들의 sense 및 antisense primers(표 1), 대조군 GAPDH primers를 dNTP 250 uM, Tris-HCL(pH 8.3) 10 mM, KCl 50 mM, NgCl₂ 1.5 mM를 포함한 Hipi PCR kit 20ul에서 시행하였다. PCR은 95 ℃에서 45초 간 denaturing, 55 ℃에서 45초 간 annealing 그리고 72 ℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 30 cycles을 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA는 1.5 % agarose gel에서 전기영동 하였고 분획된 DNA band의 intensity를 측정하였다.

[표 1]

도 3에 나타난 바와 같이, Ep-ME 추출물은 LPS에 의한 염증관련 사이토카인인을 감소시키는 효과가 있다. 구체적으로, Ep-ME 추출물은 NO를 생성하는 니트릭 옥사이드 합성효소(Nitric Oxide Synthase; iNOS), 통증 유발 프로스타글란딘 생성과 관련된 COX-2(Cyclooxygenase-2], 염증 매개 인자인 Interleukin 1 beta를 전사수준(mRNA level) 에서 억제시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 6. NF-κB 매개 Luciferase 활성 확인

HEK 293 세포주를 Opti-MEM을 이용하여 24 well plate에 분주한 후 37 ℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 전배양한 후 세포가 50% 밀도가 되었을 때 실험을 진행하였다. PEI 법을 이용하여 NF-kappaB Luciferase DNA와 beta-galactosidase DNA를 co-transfection 하였다. PEI법은 DNA 1 μg과 PEI 3 μg을 Opti-MEM에 각각 희석해 준 후 상온에서 20분 동안 배양 한 후 DNA 희석액과 PEI 희석액을 혼합하여 다시 상온에서 20분 배양하는 방법으로 진행하였다. 배양 후 혼합액을 세포가 분주된 24 well plate에 넣어준 후 6시간 후 세포배양 배지[10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin in DMEM]로 교체해주고, 24시간 배양 후 시험물질을 농도별로 처리한 후 30분 배양한 후, lysis buffer를 이용하여 세포를 용해시키고 substrate와 1:1로 반응 시켰다. 반응 후 바로 Luminometer로 흡광도를 측정하였다. beta-galactosidase의 경우 X-gal과 1:1로 반응시킨 후 37 ℃ 배양기에서 5분 배양한 후 405 nm로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Ep-ME가 전사인자인 NF-κB 활성이 유의하게 감소시킴을 확인하였다.

실시예 7. 항염증 표적 단백질 및 신호 전달 과정 확인

Murine 대식 세포주인 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 7X10⁶ cell/ml 농도로 60mm의 dish에서 전 배양시켰다. 이후 각 분획들을 처리하고 일정시간 후 stimuli (Lipopolysaccharide)로 자극하고 약물에 따른 일정시간 후 cell 들을 모아서 lysis buffer를 사용해 세포를 깨어 western 표본을 얻어냈다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로 잡고 측정하였다. 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 SDS-PAGE를 실행하고, wet blotting 방법을 사용해 PVDF membrane으로 단백질을 blotting시킨 후 membrane을 3 % BSA를 사용해 blocking시키고, 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (p-IκBα, IκBα, p-AKT, AKT, p-Syk, Syk, p-src, src, β-actin) 용액을 사용해 1차 처리하고, 다시 washing 단계 후 2차 항체 용액을 처리하고 washing하였다. 그리고 암실에서 membrane에 ECL 용액 (Amersham, England)을 골고루 분주하여 X-ray fiEp으로 감광하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, Ep-ME 추출물에 의하여 초기 시간에서 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질 IκBα 및 Akt의 인산화가 감소함을 확인하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, Ep-ME 추출물에 의하여 초기 시간에서 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질 src 및 Syk의 인산화가 감소함을 확인하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, Ep-ME 추출물에 의하여 Syk 과발현을 통한 염증 발생시 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질 Syk의 인산화가 감소함을 확인하였다.

상기 결과들로부터 Ep-ME 추출물이 NF-κB에 직접적으로 결합하는 IκBα를 강하게 억제시킬 뿐만 아니라, 결정적으로 NF-κB 신호전달 단백질 중 가장 상위인자로 알려진 Syk의 단백질의 활성을 억제시켰으며 Syk을 과발현 시킨 조건에서 그 억제효과를 뚜렷하게 보여줌을 확인하였다. 상기 결과는 Ep-ME 추출물이 Src 및 Syk 단백질을 표적으로 작용함을 나타내는 것이다.

실시예 8. 표적 단백질 Syk 와 Ep-ME의 결합 안정성 평가

HEK 293 세포주를 Opti-MEM을 이용하여 6 well plate에 분주한 후 37 ℃ 5% CO₂ 세포배양기에서 전배양한 후, 세포가 50% 밀도가 되었을 때 실험을 진행하였다. PEI 법을 이용하여 syk DNA를 transfection 하였다. PEI법은 DNA 1 μg과 PEI 3 μg을 Opti-MEM에 각각 희석해 준 후 상온에서 20분 동안 배양 한 후 DNA 희석액과 PEI 희석액을 혼합하여 다시 상온에서 20분 배양하는 방법으로 진행되었다. 배양 후 혼합액을 세포가 분주된 6 well plate에 넣어준 후 24시간 후 세포배양 배지[10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin in DMEM]로 교체해주고 시험물질을 농도별로 처리한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 cell 들을 모은 후, 얼리고 녹이는 과정을 반복해 세포를 깨어 표본을 얻은 후 후, Western blotting을 통해 확인하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, Ep-ME와 표적단백질 Syk 사이의 결합이 안정적으로 이루어짐을 확인하였는 바, 이는 Ep-ME가 Syk를 표적으로 하여 염증을 완화시킴을 나타낸다.

실시예 9. 급성위염(acute gastritis) 약물과의 효과 비교

에탄올(Ethanol)과 염산(HCl)을 사용하여 급성위염을 유발시켰다. 먼저 ICR mouse를 다섯 군으로 분류한 뒤 두 군은 Ep-ME의 vehicle인 0.5% CMC를 주입하였고 다른 세 군은 각각 Ep-ME 50mg/kg, 100mg/kg 와 positive control인 Ranitidine을 이틀간 경구 투여하였다. 이로서 동물군이 급성위염에 대한 감소효과를 갖도록 하였다. vehicle을 주입한 두 군 중 한 군은 위염을 유발시키지 않았고 나머지 세 군은 에탄올과 염산으로 위염을 유발한 뒤 희생(sacrifice)시켜서 위를 절개, 위벽 상태를 관찰, 위염 유발 정도를 정량화하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 위염(gastritis)을 유도한 마우스의 위벽을 분석한 결과, 대조군과 비교하여 Ep-ME를 미리 주입한 마우스의 위벽이 급성 위염에 의한 출혈의 정도가 유의하게 낮음을 확인하였다. Ep-ME의 위염 완화효과는 50 mg/kg 처리군과 100 mg/kg 처리군을 비교했을 때, 농도의존적으로 증가하였으며, 특히, 100mg/kg Ep-ME 처리군의 경우, Ranitidine처리군보다 더 높은 위염 완화효과를 보여 효과적인 의약품 소재로의 가능성을 나타냄을 확인하였다.

이상의 실시예를 종합하여, 본 발명자들은 Euodia pasteuriana 메탄올 추출물이 염증반응으로 생성되는 사이토카인과 그에 따른 반응물의 생성을 효과적으로 감소시켰으며, 면역활성에 관여하는 신호전달 단백질의 발현을 억제시킴을 확인하였다. 뿐만 아니라, Ep-ME 추출물의 염증억제 효과는 위염을 유발한 동물실험에서도 확인되었기 때문에 Euodia pasteuriana 메탄올 추출물을 염증성 질환의의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 약제 및 건강기능식품과 이들의 개발을 위한 물질에 이용될 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

1. 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 염증성 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 크론씨 질환(Crohn's desease), 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 및 췌장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 NF-κB 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 Syk 단백질의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 Src 단백질의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 유오디아 파스퇴리아나(Euodia pasteuriana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 조성물로서,
   상기 염증성 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 크론씨 질환(Crohn's desease), 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 및 췌장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물 또는 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
    
11. 삭제

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