KR20220006468A

KR20220006468A - 4',6,7-트리메톡시이소플라본과 카테콜을 이용한 폐섬유화증 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20220006468A
Application number: KR1020210087826A
Authority: KR
Inventors: 조문제; 김영미
Original assignee: 주식회사 에이켐바이오
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2022-01-17
Also published as: KR102292362B1; WO2022010219A1; US20220218655A1

Abstract

본 발명은 본 발명은 세포독성이 없으면서 TGF-β1 신호 전달 경로를 억제하여 EMT 억제하는 활성을 가지는 4',6,7-트리메톡시이소플라본(4',6,7-trimethoxyisoflavone)와 카테콜(Catechol, 1,2-dihydroxybenzene)를 이용한 폐섬유화증 개선용 조성물을 개시한다.

Description

4',6,7-트리메톡시이소플라본과 카테콜을 이용한 폐섬유화증 개선용 조성물{Composition for Improving Pulmonary Fibrosis Using 4',6,7-trimethoxyisoflavone and Catechol}

본 발명은 4',6,7-트리메톡시이소플라본와 카테콜을 이용한 폐섬유화증 개선용 조성물에 관한 것이다.

폐섬유화 (pulmonary fibrosis) 또는 특발성 폐섬유화 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)는 폐포벽에 결합조직, 특히 콜라겐이 과도하게 참착되는 폐 간질의 섬유화를 특징으로 하는 질환이다. 폐섬유화증은 서서히 진행하는 폐 기능 저하로 인해 호흡부전으로 진행하여 진단 이후 평균 생존기간이 2-3년 이내인 치명적인 질환이다. 폐섬유화의 유병률은 보고마다 차이가 있으나, 인구 10만 명 중 2-29명으로 알려져 있으며, 국내에서는 희귀 난치성 질환으로 지정되어 있다.

폐섬유증화증은 고령에서 생기는 질환으로 인구의 고령화가 진행됨에 따라 점차 늘어날 것으로 생각되며, 최근의 연구 결과들은 흡연자 혹은 일반인구의 약 7-8% 정도까지 나타남을 보고하여 현재까지 보고된 폐섬유증화증의 유병률이 과소평가되었을 가능성도 제시하고 있다. 따라서 적지 않은 고령인구(현재도 70세 이상 남성의 경우 450명당 1명)가 이 질환으로 고통 받을 것이 예상되나 아직까지 효과적인 치료방법이 없고, 폐이식의 경우도 이식 받고자 하는 사람에 비해 이식 공여자의 수가 적어 장시간 대기 시간을 필요로 하며(이로 인해 대기 중 악화되어 사망하기도 함) 어렵게 이식을 했다 하더라도 이식 후 합병증으로 사망하는 경우도 많아(5년 생존률이 약 50%) 좀 더 효과적이고 안전한 치료 방법이 시급한 상황이다.

폐섬유화의 원인으로는 폐 손상, 독성 물질 또는 미세먼지나 초미세먼지 등의 독성 환경에의 노출, 항암제, 자가면역질환, 또는 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonia) 등 다양하다(Proc Am Thorac Soc 2006, 3:285-92; Am J Respir Crit Care Med 2002, 165:277-304). 폐섬유화증의 기본적인 조직학적 변화는 폐포 중격에 세포의 침윤, 부종, 삼출 등의 염증성 변화와 콜라겐, 프로테오글라이칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin), 당단백과 같은 세포외 기질(extracellular matrix)의 침윤, 섬유화 등에 의한 폐실질의 파괴이다(Am J Respir Crit Care Med 2002, 165:277-304; N Engl J Med 2001, 345:517-25).

과거에는 폐섬유화의 병인을 염증으로 보고 항염증 치료를 시도하였으나, 실제 그 효과는 미미하였고(Annals of Internal Medicine 2001, 134:136-51; Chest 1996, 110:1058-67), 그래서 최근에는 염증이 아닌 상피세포-중간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition, EMT)이나 EMT를 유도하는 TGF-β1 신호 전달이 새로운 병인 및 치료 목표로 다루어지고 있다(Annals of Internal Medicine 2001, 134:136-51; Chest 2007, 132:1311-21; The Journal of Clinical Investigation 2009, 119:213-24).

EMT를 유도하는 주된 인자가 TGF-β1인데, TGF-β1은 EMT 과정에서 α-SMA(α-Smooth muscle actin)의 신생 합성을 유도하고, α-SMA의 신생 합성은 폐 섬유아세포(lung fibroblast)를 근 섬유아세포(myofibroblast) 표현형으로 변화시키고, 이 근 섬유아세포의 표현은 폐 섬유화가 진행되는 부위에서 상향조절되고 지속적으로 표현되기 때문에 폐섬유화의 발생과 진행에 주 역할을 할 것으로 추정되고 있다(Chest 2002,122:286S-9S).

특히 TGF-β 경로와 연관되어 α-Sma, 바이멘틴(Vimentin), 피브로넥틴(Fibronectin), SMA2/3 등의 발현이 증가하고 E-cadherin이 N-cadherin으로 전환되면서 EMT를 촉진시키고 폐섬유화증을 일으키는 것으로 알려져 있으며(The Journal of Clinical Investigation 2009,119:213-24; Nat Rev Mol Cell Biol 2006,7:131-42; Cell Biol Int 2002,26:463-76), 또 TGF-β1에 의한 세포 활성화에는 Smad 의존성 경로와 Smad 비의존성인 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 경로가 관여함이 알려져 있다(J Am Soc Nephrol 2002,13:1464-72; Proc Natl Acad Sci U S A 2001,98:6686-91;Cancer Res 2001;61:4222-8).

폐섬유화증의 치료에는 스테로이드(glucocorticoids), 면역 억제제 (immunosuppressive agents) 및 사이토카인제제(anti-viral cytokines)가 대표적으로 사용되고 있으나, 2011년 특발성 폐섬유화증에 대한 ATS/ERS 가이드라인에 의하면 스테로이드와 면역 억제제인 아자티오프린(azathioprine)의 병용요법이 오히려 사망률을 증가시키는 결과를 보였다.

본 발명은 TGF-β1 신호 전달 경로를 억제하여 EMT 억제하는 활성을 가지는 4',6,7-트리메톡시이소플라본(4',6,7-trimethoxyisoflavone)와 카테콜(Catechol, 1,2-dihydroxybenzene)의 폐섬유화증 개선 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 EMT 억제 활성, TGF-β1 신호 전달 경로 억제 활성을 가지는 4',6,7-트리메톡시이소플라본와 카테콜을 이용한 폐섬유화증 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 4',6,7-트리메톡시이소플라본 및/또는 카테콜이 특별한 세포독성을 보이지 않으면서 TGF-β1 신호 전달 경로를 억제하여 EMT 억제하고 폐섬유화증 동물모델에 있어서도 폐섬유화 억제 효과를 보임을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명은 일 측면에 있어서 4',6,7-트리메톡시이소플라본 및/또는 카테콜을 유효성분으로 포함하는 폐섬유화증 개선용 조성물로 파악할 수 있다.

상기 4',6,7-트리메톡시이소플라본는 콩류 등에서 존재하는 존재하는 화합물이며, 카테콜은 과일, 채소 등에 존재하는 화합물로 그 화학 구조식은 아래에서 확인할 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 폐섬유화증 개선 효과 등을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 폐섬유화증 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조?유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코오스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 점안제, 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제, 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 점안제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 식염수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있으며 필요에 따라 염화벤잘코늄, 메필파라벤, 에틸파라벤 등을 방부 목적으로 첨가할 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 TGF-β1 신호 전달 경로를 억제하여 EMT 억제하고 폐섬유화증 동물모델에 있어서도 폐섬유화 억제 효과를 가지는 4',6,7-트리메톡시이소플라본와 카테콜을 이용한 폐섬유화증 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 건강기능식품 등의 식품이나 의약품 등의 약품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 세포독성 평가 결과이다.
도 2는 세포 이동 억제 평가 결과이다.
도 3은 세포 침투 억제 평가 결과이다.
도 4 및 도 5는 EMT 관련 기전 인자의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 평가한 결과이다.
도 6은 세포 형태 변화 평가 결과이다.
도 7은 폐섬유화증 동물모델 실험의 구성도이다.
도 8은 폐섬유화증 동물모델 실험에서 조직 병리학적 검사 결과이다.
도 9은 폐섬유화증 동물모델 실험에서 EMT 관련 기전 인자의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 평가한 결과이다.
도 10은 BALF액 내 총 세포수와 호중구의 변화를 평가한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> TMF와 카테콜의 폐섬화증 개선 활성 실험

1. 시약 및 항체

카테콜(1,2-dihydroxybenzene, "BCC")은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입 후 DMSO를 이용하여 100mM Stock으로 만들어 사용하였다. TMF (6,7,4'-TRIMETHOXYISOFLAVONE, "BCT")는 Indofine Chemical (Hillsborough, NJ, USA))에서 구입 후 DMSO를 이용하여 100mM Stock으로 만들어 사용하였다. 재조합 인간 TGF-β1은 Invitrogen (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA)으로부터 구입하였다. E-cadherin, Vimentin, TGF-β과 pSmad2/3에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)에서 구입하였다.

2. 세포독성 평가

TMF(BCT)와 카테골(BCC)이 cell의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) assay의 방법을 응용하였다. 96 well plate에 5 × 10³ cells/well을 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양 하였다. 이후 각각의 시료를 농도에 맞게 각 well에 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 이후, PBS로 세척한 후 PBS에 녹인 MTT 20 ㎕와 FBS free DMEM 200 ㎕을 각 well에 처리한 후 빛을 차단 후 동일한 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 배양액을 제거하고, DMSO (dimethyl sulfoxide)를 200 μl 처리한 후 37℃에서 2 시간 방치 후 microplate reader를 이용 하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

24시간 및 48시간 후의 세포생존율을 시료 무처리군인 대조군 대비 백분율로 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하여 보면, BCT 및/또는 BCC는 근육세포(C₂C₁₂), 사람 섬유아세포(HDF, Human Dermal Fibroblast), 사람 폐태아세포(MRC-5) 모두에 대해서 특별한 세포독성을 보이지 않았다.

3. 폐포상피세포 A549세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 EMT 억제 활성 평가

EMT가 진행되면 상피세포의 증식 및 이동이 증가하고 세포 침투가 증가하며 세포 형태가 변화기 때문에 이를 통해 EMT 억제 효능을 확인하는 한편 그 기전 관련 인자의 발현 정도를 평가하였다.

3.1 세포 이동 억제 활성 평가

A549 세포를 6-웰 플레이트에 1×10⁵/mL 분주하여 24시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 24시간 후 1mL 팁(tip)으로 단일 세포층을 스크래치(scratch)를 내고, TGF-β1, TGF-β1와 시료 BCT(10 uM) 또는 TGF-β1와 시료 BCC(0.5uM)을 포함하는 배지를 각 웰에 첨가하였다. 72시간 동안 배양한 후 세포의 이동 정도를 현미경으로 확인하고, 이미지로 촬영하였다.

결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조하여 보면, TGF-β1을 처리한 세포에서 대조군에 비해 세포 이동이 증가한 것을 알 수 있으며, BCT 및/또는 BCC를 처리한 경우 세포 이동이 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히 BCT 및 BCC를 함께 처리한 경우 세포 이동이 현저히 감소하였다.

3.2 세포 침투 억제 효과 평가

트랜스-웰 인서트(Trans-well insert; Corning, USA)에 매트리겔(matrigel; Corning)을 2 ㎎/L로 코팅하였다. 무혈청 배지(serum free media) 200 ㎕에 A549 세포를 약 5×10⁵/mL가 되도록 희석하고, 여기에 TGF-β1, TGF-β1와 시료 BCT(10 uM) 또는 TGF-β1와 시료 BCC(0.5uM)를 첨가하여 트랜스-웰 인서트에 분주하였다. 리시브 챔버(Receive chambers)에는 10% 혈청을 포함하는 배지를 분주하여 세포를 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 인서트에 남아 있는 세포는 제거하고, 리시브 챔버로 침투한 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 현미경으로 촬영하였다.

결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있듯이, 대조군(control)과 비교하여 TGF-β1을 처리한 세포의 경우 리시브 챔버로 침투한 세포의 수가 증가한 것을 확인할 수 있으며, 이와 반대로 BCT 및/또는 BCC를 처리한 세포의 경우 리시브 챔버로 침투한 세포의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

3.3 웨스턴 블럿을 통한 EMT 기전 관련 인자의 발현 변화 확인

A549 cell을 100 mm 배양용기에 2×10⁶ 개의 세포를 24시간 부착시키고 TGF-β1, TGF-β1와 시료 BCT(10 uM) 및/또는 TGF-β1와 시료 BCC(0.5uM))를 처리한 후 배양하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 세포침전물을 세포용해액 RIPA lysis buffer(LPS solution, Korea, Seoul)에 용해시킨 후 13,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 취하였다. 총 단백질량은 BCA Protein assay kit (Thermo. Scientific, Wilmington, DE, USA) 용액을 이용하여 정량하였고, 단백질과 6×sample buffer(1 mL of glycerol, 0.5 mL of β-mercaptoethanol, 3 mL of 10% SDS, 1.25 mL of 1 M Tris-HCl, 1~2 ㎍ of bromophenol blue)를 혼합한 후 SDS polyacrylamidegel에서 전기영동 하였다. Nitrocellulose Membrane (Millipore,. Billerica, MA, USA)에 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 시킨 후, 관련 인자들의 단백질 발현 수준을 다양한 항체들을 이용하여 측정하였으며, 단백질 양이 같은지는 actin을 이용하여 확인하였다. 일차 항체를 각각 희석하여 실온에서 4시간 반응시키고, TBST로 3회 세척한 후, 2차 항체를 1:5,000으로 희석하여 실온에서 30분 반응시켰다. TBST로 세척한 후, ECL solution (LPS solution, Korea, Seoul)으로 발광 후 band를 얻었다.

결과를 Smad 의존성 인자에 대해서는 도 4에, Smad 비의존성 인자에 대해서는 도 5에 나타내었다.

도 4를 참조하여 보면, TGF-β1 처리에 의하여 증가된 α-Sma, Vimentin, Fibronectin, SMA2/3, Integrin β3 및 Cyr61의 발현이 BCT 및/또는 BCC 처리에 의하여 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있으며, TGF-β1 처리에 의하여 감소된 E-cadherin 발현은 BCT 및/또는 BCC 처리에 의하여 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

또 도 5을 참조하여 보면, TGF-β1 처리에 의하여 증가된 pAKT 또는 pERK의 발현이 BCT 및 BCC 처리에 의해 발현이 감소하는 것을 확인 할 수 있다.

3.4 세포 형태 변화 확인

A549 세포를 60 mm 플레이트에 1×10⁵/mL로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 TGF-β1, TGF-β1와 시료 BCT (10 μM) 및/또는 TGF-β1와 시료 BCC (0.5 μM)을 포함하는 배지를 각 웰에 5 mL씩 첨가하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 현미경으로 확인하고, 이미지를 촬영하였다.

결과를 도 6에 나타내었다. 도 ~를 참조하여 보면, TGF-β1 처리에 의해 세포 형태가 변화하지만, BCT 및/또는 BCC 처리에 의해 그 세포 형태가 대조군과 유사하게 회복됨을 알 수 있다.

4. 폐섬유화증 동물모델 실험

4.1 폐섬유화증 동물모델 제작

마우스의 기도를 절개하고, 블레오마이신(bleomycin; 3 ㎎/㎏, BLM)을 기도 내에 주입하였다. 주입 후 절개 부위는 나일론으로 봉입(suture)하였으며, 블레오마이신을 주입한 후 24시간이 지난 시점에 시료인 BCT 및/또는 BCC를 매일 투여하였으며, 마우스는 실험 시작일로부터 28일까지 사육하고 29일차 희생시켜 BALF (broncho-alveolar lavage fluid) 및 폐 조직을 분리하여 추가 실험에 이용하였다.

폐섬유화증 동물모델 실험의 구성도를 도 7에 나타내었다.

4.2 조직병리학적 검사

폐섬유화를 평가하기 위해 각 대조군과 실험군의 동물모델을 희생시키고, 이들 동물모델로부터 폐를 적출하여 10% 중성 포르말린 (neutral buffered formalin, NBF)에 고정 후 파라핀으로 포매하여 2-4 um 두께의 조직절편을 제작한 후 조직학적 소견의 비교를 위해 Hematoxilin-Eosin 염색 및 Masson's trichrome 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.

H&E 염색을 실시하여 폐섬유화에 의한 염증과 및 상피세포의 비대를 평가하고, Masson's trichrome 염색을 통해 아래의 조직점수평가법(scoring system, Ashcroft score)을 이용하여 섬유화의 평가에 사용하였다.

결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되듯이, 정상소견을 보이는 대조군(control)에 존재하는 섬유화 조직의 수준과 비교하여, BLM을 처리한 폐조직에서는 H&E 염색법에 의해 짙은 적색으로 표시되는 손상된 섬유화 영역이 증가되었으나, BCT 및 BCC를 단독 혹은 병용으로 투여한 경우에는 증가된 섬유화 영역의 크기가 감소함을 확인할 수 있다. 또 조직점수평가법 (scoring system)에 따른 결과인 도 8의 하단 그래프를 참조하여 보면, BCT 및 BCC 단독 투여 실험군과 병용투여 실험군 모두에서 섬유화 영역의 크기가 모두 감소하였음을 확인할 수 있다. 특히 병용 투여군에서의 효과가 우수하였다.

4.3 폐조직을 이용한 단백질 발현 수준확인

28일 동안 사육한 각 대조군과 실험군의 동물모델을 희생시키고, 이들 동물모델로부터 폐조직 시료와 혈청시료를 각각 얻은 다음, -70℃ 딥프리저에 보관한 후 폐섬유화증의 주요 마커로 알려진 단백질인 a-SMA, TGF-β1, 피브로넥틴(Fibronectin 그리고 E-cadherin에 대한 웨스턴 블럿을 시행하였다.

폐조직을 T-PER buffer(lysis buffer, Thermo. Scientific, Wilmington, DE, USA )조직 50mg당 500μL 기준으로 넣고 homogenize 기계를 이용해 조직을 균질화 하였다. 균질화 시킨 조직을 13,000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 웨스턴 블롯을 위한 시료로 사용하였다. 조직의 균질액의 농도는 BCA Protein assay kit (Thermo. Scientific, Wilmington, DE, USA) 용액을 이용하여 정량하였고, 단백질과 6×sample buffer(1 mL of glycerol, 0.5 mL of β-mercaptoethanol, 3 mL of 10% SDS, 1.25 mL of 1 M Tris-HCl, 1~2 ㎍ of bromophenol blue)를 혼합한 후 SDS polyacrylamidegel에서 전기영동 하였다. Nitrocellulose Membrane (Millipore,. Billerica, MA, USA)에 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 시킨 후, 관련 인자들의 단백질 발현 수준을 다양한 항체들을 이용하여 측정하였으며, 단백질 양이 같은지는 actin을 이용하여 확인하였다. 일차 항체를 각각 희석하여 실온에서 4시간 반응시키고, TBST로 3회 세척한 후, 2차 항체를 1:5,000으로 희석하여 실온에서 30분 반응시켰다. TBST로 세척한 후, ECL solution (LPS solution, Korea, Seoul)으로 발광 후 band를 얻었다.

웨스턴 블럿 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9를 참조하여 보면, BLM에 의해 폐섬유화증이 유도되고 BCC 및 BCT를 단독 혹은 병용 투여된 경우 BLM에 의해 폐섬유화증이 유도된 실험군에 비하여 a-SMA, TGF-β1 그리고 피브로넥틴의 발현 정도가 감소하고 E-cadherin은 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 특히 병용 투여군에서의 효과가 우수하였다.

4.4 폐포세척액(BALF, bronchoalveolar lavage fluid) 내의 총 세포수의 변화에 미치는 영향 확인

폐섬유증은 BALF액 내 총 세포수와 호중구의 백분율이 증가하는 것이 특징이다.

각각의 실험동물군에서 BALF로 부터 수집 후 총세포를 포함한 호중구 및 폐포 대식세포 등을 측정하였다. BALF 내 총 세포 수, 호중구 및 폐포 대식세포 등 비율의 측정 방법은 다음과 같다. BALF를 1:1의 비율로 trypan blue와 혼합한 다음 hemocytometer (Fisher Scientific, PA, USA)를 이용하여 총 세포 수를 ×10⁴/BALF 1 mL로 계산하였고, 준비된 BALF를 slide glass 에 도말한 다음 Diff quik (sysmex, USA) 염색 후 현미경 하 에서 총 200개의 세포 중 호중구 및 폐포 대식세포 등의 수를 센 후에 비율을 측정하여 기록하였다.

결과를 도 10에 나타내었다. BLM 투여군에서는 총세균수, 림프구 및 호중구의 증가를 나타냈으며, BCC 및 BCT 단독 또는 병용 투여군의 경우 이들 세포수가 유의성 있게 감소하였다. 여기서도 특히 병용 투여군에서의 효과가 우수하였다.

Claims

4',6,7-트리메톡시이소플라본을 유효성분으로 포함하는 폐섬유화증 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.