KR20160031673A

KR20160031673A - 물냉이 추출물을 유효성분으로 하는 골질환 예방 및 치료 또는 골성장 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20160031673A
Application number: KR1020140121358A
Authority: KR
Inventors: 김하형; 박혜진; 정재훈; 현한빛; 오현일; 김지혜; 김해성
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2016-03-23

Abstract

본 발명은 물냉이 추출물을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 물냉이 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 골성장 촉진용 및 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본발명의 조성물은 조골세포 증식, 활성화 및 미네랄화를 촉진하며 생체 내에서 골 생성과 관련 있는 표지를 증가시키고 골밀도를 증가시키므로 골질환 예방 및 치료 및 골성장 촉진에 효과적이다.

Description

물냉이 추출물을 유효성분으로 하는 골질환 예방 및 치료 또는 골성장 촉진용 조성물 {Composition for treatment and preventation of bone disease or stimulation of bone growth comprising extract of Nasturitum officinale R. Br.}

본 발명은 물냉이 추출물을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 물냉이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 골성장 촉진용 및 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

골조직은 골량(bone mass) 및 골격의 항상성(skeletal homeostasis)을 유지하기 위해 흡수와 형성이 끊임없이 일어나는 동적인 조직이다. 뼈를 파괴하고 신생시키는 데에는 조골세포와 파골세포가 작용하며, 조혈모세포에서 유래하는 파골세포는 오래된 뼈를 파괴 또는 흡수(resorption) 과정을 통해 제거하고, 칼슘을 혈류로 방출하여 신체 기능을 유지하는데 관여하고, 뼈세포에서 생기는 조골세포는 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다. 정상 성인에서는 골흡수 양과 골형성 양 사이에는 항상 균형이 유지되고 있으며, 조골세포와 파골세포 활성간의 불균형은 전체적인 뼈의 감소(osteoporosis)나 증가(osteosclerosis)로 인한 골격의 이상으로 나타난다.

골질환 중 고령사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 골강도의 약화로 골절의 위험성이 증가하는 골격계 질환이며, 골강도는 골밀도와 골질에 의해 결정된다. 골밀도는 영역 혹은 볼륨 당 미네랄의 그램 수로 표현되며, 특정 개인의 경우 가장 높은 뼈질량 수치와 뼈손실의 양에 의해 결정되고, 골의 구조, 골 교체율, 미세 손상 축적, 무기질화 등으로 알 수 있다. 골다공증은 1차성(원발성) 골다공증과 2차성(속발성) 골다공증으로 분류되며, 1차성 골다공증은 폐경 후 골다공증과 노인성 골다공증으로 나뉜다. 2차성 골다공증은 특정 질병이나 수술, 약물 치료 등에 의해 골량의 형성장애가 있거나 골소실이 증가되는 경우에 발생한다. 대표적인 원인으로 스테로이드 투여, 성선기능저하증, 셀리악병 등이 있다(NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH: Osteoporosis Prevention, Diagnosis, and Therapy. NIH Consensus Statement . 17, 1, 2000).

골다공증을 예방하고 치료하기 위해 칼슘과 비타민 D의 적절한 섭취는 필수적이며, 이는 골다공증의 예방과 치료에 사용되는 다른 약제와 함께 기본적으로 투여되어야 한다. 이 외에 사용되는 약제요법으로는 호르몬 요법과 비호르몬 요법이 있다. 호르몬 요법으로는 에스트로겐 단독 요법, 에스트로겐-프로게스테론 병합 요법 및 합성 스테로이드 제제인 티볼론(Tibolone) 등이 있다. 비 호르몬 요법으로는 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), 칼시토닌, 비스포스포네이트, 파라토르몬 등이 있다(대한골대사학회 : 골다공증의 진단 및 치료 지침 2011).

천연물 중 골다공증에 효과가 있다고 보고된 식물에는 phytoestrogen이 풍부한 홍화씨, 석류 그리고 칡 등이 있다. 홍화씨에는 lignan과 flavonoid 등의 페놀성 화합물이 많고 석류에는 daidzein, genistein 등이 풍부하며 칡에도 daidzein과 puerarin 등이 있다(Lee et al., Archives of pharmacal research . 25, 313 (2002); Choi et al., Korean J. Food Nutr . 15, 119 (2002); Kim et al., Korean J. Food Sci . Technol . 34, 710 (2002)).

한편, 유럽과 아시아 북부가 원산지인 물냉이(Nasturtium officinale R.Br)는 다년생 수생 초본으로 깨끗한 물에서 자란다. 냉이와 비슷한 생김새로 ‘물에서 자라는 냉이’라는 뜻에서 물냉이로 이름 붙여졌으며, 잎과 씨는 식용이 가능하다. 유럽에서는 예전부터 ‘크레송(Cresson)’이라 하여 약용으로 이용하였고, 강장, 소화, 해열작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 중세시대에는 발모제나 양모제, 19세기에는 괴혈병의 치료약으로 사용되기도 하였고, 주로 샐러드나 나물로 식용되고 있다(이영희: 우리 하천에 자라는 비타민의 제왕 물냉이. 하천과 문화. 6, 63, 2010).

물냉이에 대해 선행된 연구들을 살펴보면, 신선한 물냉이의 잎은 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B 군, 칼슘, 인, 칼륨, 철, 마그네슘, 아연과 셀레늄을 포함한 미네랄들이 풍부하고, 베타 카로틴과 글루코시놀레이트를 함유하고 있다(Zahradnet al., Acta Univ . Agric . et Silvic . Mendel . Brun . 61, 233, 2013). 또한 Quercetin 등의 flavonoid와 phenolic compound가 많이 존재하며, 특히 glucosinolate의 일종인 gluconasturtiin의 가수분해 산물, 항암작용이 알려진 phenethyl isothiocyanate가 다량 존재한다(L.A. Boyd et al., Nutr Cancer . 55, 232, 2006). 잎의 기름 성분에는 myristicin, α-terpinolene 과 limonene이 있고, 서양에서 민간요법으로는 이뇨제, 거담제, 건위제로 쓰일 뿐만 아니라 치통, 저혈당, 고혈압 그리고 심혈관계 질환에도 사용되어 왔다(Amiri et al., Nat . Prod . Res . 26, 109, 2012). 그 외에 물냉이의 연구들로 인해 밝혀진 대표적인 효능은 항산화 작용이며(Ozen et al., Acta Pol Pharm . 66, 187, 2009), 물냉이의 알코올 추출물은 혈중 콜레스테롤, 중성지방, 저밀도지방단백질(LDL)을 감소시키고, 고밀도지방단백질(HDL)을 증가시키는 것으로 보고되고 있다(Bahramikia et al., J. Ethnopharmacol . 115, 116, 2008). 또한, 물냉이 물 추출물은 TGF-β gene의 down regulation에 의한 효과로 간 보호효과를 가지는 것으로 알려져 있다(Ebadollahi et al., Toxicology Letters . 205, S182, 2011).

이상과 같이, 오랫동안 꾸준히 사용되어온 채소인 물냉이에 대한 연구가 많지만, 골성장 촉진에 관해서는 보고된 것이 없는 실정이다.

본 발명자는 골성장 촉진 또는 골질환의 예방 및 치료 효과가 있는 천연성분에 관하여 연구하던 중, 물냉이의 추출물이 조골세포의 분화를 촉진하고 활성을 증가시켜 뼈의 미네랄화를 증가시키며, 생체 내에서 골 생성과 관련 있는 표지를 증가시키고 골밀도를 증가시키는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 물냉이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 물냉이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골성장 촉진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 물냉이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 물냉이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 물냉이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골성장 촉진용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 물냉이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 물냉이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 물냉이(Nasturtium officinale R. Br) 추출물은 십자화과(Cruciferae, Brassicaceae) 식물인 물냉이에서 추출된 것으로, 물냉이의 전체 식물, 잎, 줄기 및 뿌리로부터 추출된 것일 수 있으나, 바람직하게는 상기 물냉이 추출물은 물냉이의 잎에서 추출된 것일 수 있다.

추출에 사용되는 물냉이는 수확한 후 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사용할 수 있다. 건조방법으로는 양건, 음건, 열풍건조 및 자연 건조하는 방법을 모두 사용할 수 있으나, 바람직하게는 음건할 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시키기 위해 전처리 과정을 포함할 수 있으며, 예를 들어 물냉이를 절단하고 분쇄하여 사용할 수 있다.

물냉이로부터 추출하는 경우 그 추출방법에는 제한이 없으나, 바람직하게는 당업계에 공지된 용매 추출법에 의해 제조할 수 있으며, 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 반복 추출할 수 있다. 또한 필요한 경우 당업자에게 공지된 방법에 따라 여과 및 농축 단계를 추가적으로 포함하여 제조할 수 있다.

추출용매로는 예를 들어, 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol)과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르(petrolem ether), 디에틸에테르, 벤젠과 같은 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매를 이용하여 추출할 수 있다. 본 발명의 물냉이(Nasturtium officinale R.Br) 추출물은 바람직하게는 물, 에탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 1-부탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올을 용매로 이용하여 추출될 수 있다.

용매 추출법에 의한 추출시 물냉이와 용매의 비율은 특별히 한정되지 아니하며 예를 들어 용매를 중량기준 1 내지 20배로 첨가할 수 있다. 바람직하게는 물냉이에 대하여 용매를 중량기준 5 내지 15배로 첨가할 수 있다. 또한, 상기 용매의 농도는 10 내지 100 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 60 내지 80 부피%일 수 있다.

본 발명의 추출물 추출온도는 용매의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며, 특별히 한정되지 아니한다. 예를 들어 0℃ 내지 150℃일 수 있으며, 바람직하게는 10℃ 내지 120℃일 수 있다. 추출시간은 추출 온도에 따라 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 1시간 내지 10일일 수 있으며, 바람직하게는 1일 내지 4일 일 수 있다. 또한, 추출시 교반기로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.

상기에서 얻은 물냉이 추출물을 분액여두에서 적당한 용매로 용출시켜 물냉이 추출물의 분획물을 제조할 수 있다. 이때, 바람직하게는 용출 용매는 물, 클로로포름, 에틸아세테이트, 1-부탄올로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 물냉이 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하며, 조골세포의 분화 촉진 및 활성 증가, 뼈의 미네랄화 증가 및 생체 내에서 골 생성과 관련 있는 표지를 증가시키고 골밀도를 증가시키므로 골성장 촉진 및 골질환 예방 및 치료의 효능이 있다.

골질환이란 뼈와 관련된 질환을 말하며, 예를 들어 조골세포와 파골세포의 불균형이 원인이 되는 골대사 질환일 수 있으며, 바람직하게는 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 또는 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 구성된 군에서 선택된 질환일 수 있다.

상기 본 발명 물냉이 추출물의 효능은 본 발명자들의 실시예에 의해 확인되었다.

본 발명의 일실시예에서는 조골세포 배양 시 물냉이 잎 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 물냉이 잎 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 물냉이 잎 추출물 또는 이의 분획물을 처리한 군이 대조군에 비하여 유의하게 조골세포의 증식을 촉진되는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 조골세포 분화 시 물냉이 잎 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 물냉이 잎 추출물이 조골세포의 분화에 미치는 영향을 측정하였다. 분화에 미치는 영향 측정은 조골세포 활성 표지인자인 염기성 인산분해효소 활성도(Alkaline phosphatase activity; ALP activity)를 측정하는 방법으로 하였다. 그 결과 물냉이 잎 추출물 및 이의 일부 분획물 처리군이 대조군에 비하여 유의하게 조골세포의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 조골세포의 분화 시 분화배지에 물냉이 잎 추출물을 농도별로 첨가하여 물냉이 잎 추출물이 조골세포의 미네랄화 정도를 Alizarin Red S(ARS) 염색법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 10 ug/ml 이상의 농도범위에서 물냉이 잎 추출물을 처리한 군이 대조군에 비해 유의하게 조골세포의 미네랄화를 증가시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 랫트(rat)에 7주간 물냉이 추출물을 투여한 후, 혈장 속의 오스테오칼신(osteocalcin) 농도를 측정하였다. 그 결과 물냉이 투여군에서 혈장 속 오스테오칼신 농도가 유의성있게 증가된 것을 확인하였고, 이로써 물냉이 추출물이 골형성 및 조골세포 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 랫트에 7주간 물냉이 추출물을 투여한 후, micro-CT를 이용하여, 신체크기나 체중변화 없이 골밀도가 증가하였음을 확인하였다.

이와 같이 본 발명의 조성물은 조골세포의 증식, 분화 및 무기질화의 촉진을 통하여 골성장을 촉진시키고, 골질환을 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 물냉이 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 추출물의 양을 말한다.

본 발명에 따른 물냉이 추출물의 약학적으로 유효한 양으로는 1∼600 mg/day/체중kg, 바람직하게는 1∼500 mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 임상적으로 투여하는 경우에 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여에 적합한 단위투여형의 약제학적 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 골질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다. 상기 화합물의 예로는, 천연 비타민 D3, 에스트로겐, 알렌드로네이트(alendronate) 및 랄록시펜(raloxifene) 등이 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 골성장 촉진 또는 골질환 예방 및 치료 목적으로 식품에 첨가될 수 있다.

따라서, 본 발명은 물냉이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골성장 촉진용 또는 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다.

상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 건강식품으로는 상기 물냉이 추출물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용할 수 있도록 액상화하거나 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있도록 제조할 수 있다.

캡슐화 하는 경우 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 물냉이 추출물을 단독 또는 부형제 등의 첨가제와 함께 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 물냉이 추출물을 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

과립형태의 건강기능식품은 상기 물냉이 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등과의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다(대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

본 발명의 식품 조성물은 상기 물냉이 추출물과 골성장 촉진 또는 골질환 예방 및 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 물냉이 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 물냉이 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 본 발명은 물냉이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 골성장 촉진용 및 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 조골세포 증식, 활성화 및 미네랄화를 촉진하며 생체 내에서 골 생성과 관련 있는 표지를 증가시키고 골밀도를 증가시키므로 골질환 예방 및 치료 및 골성장 촉진에 효과적이다.

도 1은 물냉이 잎 에탄올 추출물 또는 이의 분획 처리 시, 농도별 조골세포의 증식 정도를 나타낸다. (A: 에탄올 추출물, B: chloroform 분획, C: ethyl acetate 분획, D: butanol 분획, E: 물 분획)
도 2는 양성 대조군(daidzein)과 물냉이 잎 에탄올 추출물 처리 농도별 조골세포에서 ALP의 활성 정도를 나타낸다. (왼쪽: daidzein, 오른쪽: 에탄올 추출물)
도 3은 물냉이 잎 에탄올 추출물의 분획 처리 농도별, 조골세포에서의 ALP의 활성 정도를 나타낸다. (A: chloroform 분획, B: ethyl acetate 분획, C: butanol 분획, D: 물 분획)
도 4는 물냉이 잎 에탄올 추출물 처리시, 처리기간 및 농도별 조골세포에서 석회화 결절을 형성한 정도를 나타낸다.
도 5는 물냉이 잎 에탄올 추출물 섭취시, 랫트의 체중 변화를 나타낸다.
도 6은 물냉이 잎 에탄올 추출물 섭취시, 랫트의 혈청 오스테오칼신 농도 변화를 나타낸다.
도 7은 물냉이 잎 에탄올 추출물 섭취시, 랫트의 경골의 micro-CT 촬영 결과를 나타낸다.
도 8은 물냉이 잎 에탄올 추출물 섭취시, 랫트의 경골 피질골의 골밀도 변화를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

물냉이 추출물의 제조

<1-1> 물냉이 잎 추출물 제조

서울시 가락시장에서 구입한 물냉이 잎을 3차 증류수로 수세하고 얇게 절단하여 3일간 음건 후 분쇄하였다. 에탄올 추출은 물냉이 잎 분쇄물 3.0 g에 70(v/v) % 에탄올 30 ml을 가하고 실온에서 교반하며 72시간씩 3회 반복 추출하였다. 이 추출액을 2000 rpm에서 60분 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 0.45 ㎛ syringe filter(SmartPor GHP syringe filter with 25 mm, 0.45 ㎛, Woongki science) 로 여과하였다. 여과된 추출액을 회전식 증발농축기(N-1200A, EYELA) 로 감압, 농축하여 추출농축액을 얻은 다음 동결건조기(FD-1000, EYELA)로 동결건조하여 314.0 mg(수득률 10.5%) 의 에탄올 추출 분말을 얻었다.

<1-2> 물냉이 잎 추출물의 분획물 제조

상기 에탄올을 이용하여 제조한 물냉이 잎 추출 분말 105.8 mg을 20 ml의 3차 증류수에 현탁 시킨 후 chloroform, ethylacetate, 1-butanol, 3차 증류수 순으로 분액여두에서 진탕 추출 후 분획하였고, 분획물을 회전식 증발농축기로 감압 농축하여 추출 농축액을 얻은 다음 동결건조기로 동결건조하여 chloroform, ethylacetate, 1-butanol, 3차 증류수 분획물을 각 4.3 mg, 4.9 mg, 24.0 mg, 41.3 mg을 얻었다. 상기 추출물과 분획은 4℃에서 냉장보관 하였다.

<실시예 2>

물냉이 추출물의 조골세포 증식 및 활성 증가 효과

<2-1> 조골 세포 배양

사람의 골육종에서 유래한 세포주인 Human osteoblast-like MG-63 세포는 한국세포주은행에서 구입하였다. MG-63 세포는 10%의 FBS와 1%의 penicillin 및 streptomycin가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지로 37℃, 5% CO₂의 환경을 유지시켜주며 배양하였으며, 세포가 배양 flask에 70-80% 정도 증식되었을 때 계대 하였다.

<2-2> 조골세포 증식 측정

물냉이 잎 추출물이 조골세포의 생존율 및 증식에 미치는 영향을 알아보고자 WST-8 assay를 실시하였다(Tominaga et al., Anal Commun. 36, 47 ,1999). 조골세포를 96-well plate에 2 × 10³ cells/well의 농도로 분주하고 물냉이 잎 추출물을 농도별로 희석하여 첨가한 DMEM 배지를 각 well에 투여하였으며, 아무것도 처리하지 않은 DMEM 배지에 배양한 세포군을 대조군으로 하여 72시간 동안 배양하였다. 배양된 세포 배양액에 WST-8 용액(10 μl/well)을 첨가하고 3시간 동안 배양한 후 WST-8가 WST-8 formazan으로 환원된 정도를 450nm에서 microplate reader를 이용하여 측정하였다. MG-63 세포의 생존율은 배양액만 처리한 대조군에 대한 백분율로 나타냈다.

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 물냉이 잎 에탄올 추출물 처리군의 경우 0.01 μg/ml ~ 50 μg/ml 범위에서 cell viability가 모두 100%를 넘어 세포독성이 전혀 없음을 확인하였고, Chloroform, ethyl acetate, butanol 분획 및 물층 처리군에서도 세포독성이 거의 없음을 확인하였다.

또한, 10 μg/ml ~ 50 μg/ml 농도 범위에서는 에탄올 추출물과 이의 분획물 처리군 모두 cell viability가 100%를 넘어 조골세포 증식 효과가 있음을 확인하였다. 특히, ethanol 추출물과 butanol, 최종 물층 분획 처리군에서 50 μg/ml 농도로 처리했을 경우 각각 125.0%, 115.2%, 120.9% 의 조골세포 증식 효과를 나타냈다.

<2-3> 조골세포 활성 측정

조골세포의 세포막에 존재하는 Alkaline phosphatase(ALP)는 조골세포 활성의 표지인자로 알려져 있으며 석회화 과정 동안 무기인산의 운반, 세포 분열이나 분화의 조절자 역할을 한다(Stein et al., FASEB J. 4, 3111, 1990). 그러므로 물냉이 잎 추출물이 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 ALP 활성을 측정하였다. ALP 활성도는 p-nitrophenyl phosphate(pNPP, Sigma, St.Louis, MO, USA)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하여 생성되는 p-nitrophenol의 양을 405nm 파장에서 microplate reader를 이용하여 측정함으로써 간접적으로 산출해내었다(Hawkins et al, J Photo chem Photobiol B. 88, 147, 2007). 조골세포를 24-well plate에 2 × 10⁴cells/well의 농도로 분주하고, 시료를 희석하여 첨가한 DMEM 배지로 교환하고 72시간 배양하였다. 대조군은 아무것도 처리하지 않은 DMEM 배지와 대두에 풍부하게 함유된 isoflavone으로서 조골세포의 단백질양과 ALP 활성을 증가시키고, 골다공증의 발병률을 감소시키는 것으로 알려진 daidzein을 사용하였다. 72시간 후, 각각의 well에서 배양액을 제거하고 0.1% Triton X-100를 처리한 후 -70℃에서 얼리고 37℃에서 녹이는 방법으로 세포막을 파괴하였다. 그 후, 4℃, 14,000g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 모아 ALP 활성도를 측정하였다. 세포수 차이에 따른 ALP 활성도 변화를 고려하기 위해, 총단백질 양은 bovine serum albumin을 표준 단백질로 bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit를 사용하여 측정하였으며 효소 활성은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과, 물냉이 잎 ethanol 추출물은 0.01 μg/ml 이상의 범위에서 조골세포의 ALP 활성을 증가시켰고, 10 μg/ml 이상의 범위에서 ALP 활성의 큰 증가를 나타냈다. 특히, 10 μg/ml 의 농도에서 daidzein은 196.4%의 ALP 활성 증가를 보인데 비해 물냉이 잎 에탄올 추출물은 222.3%의 ALP 활성 증가를 보여, 10 μg/ml 농도 이상의 물냉이 잎 에탄올 추출물 처리 시, daidzein보다 더 큰 ALP 활성 증가효과가 있음을 알 수 있었다. 한편 0.01 μg/ml ~ 1 μg/ml 의 농도범위에서는 ALP 활성이 대조군 100%보다는 높았다(도 2 참조). 또한, 각각의 분획물을 이용하여 0.01 μg/ml ~ 1 μg/ml 범위의 저농도로 처리를 한 경우, chloroform과 ethyl acetate 분획물을 처리한 군에서는 ALP 활성이 유의적으로 증가하였고, butanol과 물층 분획물의 경우, 유의한 변화가 나타나지 않았다(도 3 참조).

<2-4> 석회화 결절 형성 측정( Mineralization assay )

석회화 결절 형성은 조골세포의 후기 분화 단계의 biomarker로서 Alizarin red S(ARS) 염색법을 이용하여 확인할 수 있으며, ARS는 무기질화된 세포 기질의 칼슘과 결합하므로 석회화 결절을 형성한 정도와 염색 정도가 비례한다. 조골세포를 24-well plate에 2 × 10⁴cell/well이 되도록 분주하고 물냉이 잎 추출물을 농도별로 희석하여 첨가한 조골세포 분화 유도용 배지(50 ㎍/ml ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate, 10^-7M dexamethasone)를 각 well에 투여하였다. 3-4일마다 물냉이 잎 추출물을 포함한 새 배지로 교환하면서 배양하였다(Chiu et al., 2006; Gregory et al., 2004). 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 가볍게 세척한 후 70% ethanol을 가하고 4℃에서 1시간 동안 고정하였다. 세포를 증류수로 세척하고 40 mM ARS(pH 4.2)으로 실온에서 10분간 염색하였다. 비특이적인 염색을 줄이기 위해 증류수로 5번 세척한 후 PBS를 가하고 15분 방치하였다. PBS를 제거한 후 10%(w/v) cetylpyridinium chloride를 첨가한 10 mM sodium phosphate(pH 7.0) 용액을 well에 첨가하고 실온에서 15분간 반응시켜서 얻은 Alizarin red 추출액을 96 well plate로 옮기고 562 nm에서 흡광도를 측정하였다(Stanford et al., 1995).

그 결과, 물냉이 잎 추출물은 7일에서 14일간, 0.001 μg/ml ~ 50 μg/ml 농도범위 처리군에서 석회화 형성능을 증가시켰으며, 특히 ALP 활성 증가 효과와 유사하게 10 μg/ml 이상의 농도에서 유의하게 농도 의존적으로 석회화 형성능을 크게 상승시켰다(도 4 참조).

< 실시예 3>

동물모델을 이용한 물냉이 추출물의 골 성장 촉진 효과

<3-1> 물냉이 추출물의 투여

3주령의 Female Sprague-Dawley 랫트를 구입하여 일주일간 안정화시켰다. 사육 환경은 24±2℃, 상대습도는 55%, 명암주기는 12시간 간격을 유지하고 사료는 일반 고형사료를 사용하였다. Control 군에는 saline을 경구투여하며, 실험군에는 물냉이 추출물을 500mg/kg로 경구투여로써 일일 1회 7주간 경구투여하였다. 명세서에 포함된 모든 동물 실험은 중앙대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 실시하였다.

<3-2> 실험 동물의 체중 변화

상기 실험예의 각 그룹의 식이 투여 전 체중과 7주간 식이 투여 후 체중을 측정하였다. 측정은 전자저울을 이용하여 매일 실시되었다. 측정된 값은 통계처리하여 평균값과 표준편차를 계산하였다.

7주간 관찰한 결과 control군, 물냉이 투여군 모두에서 몸무게의 차이가 거의 없는 것으로 나타났다(도 5 참조). 이는 랫트의 몸무게가 물냉이 투약의 효과와 상관관계가 크게 없다는 것을 나타낸다.

<3-3> 조골세포 활성인자 혈장 오스테오칼신 측정

7주간의 투여가 끝난 후, 랫트의 혈액을 미정맥에서 채취하여 응고시킨후 serum을 분리하여 샘플을 만들었고, 랫트 Gla-Osteocalcin High Sensitive EIA Kit(MK126, Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 serum내 오스테오칼신 농도를 측정하였다.

그 결과 도 6에서 보는 바와 같이, 물냉이 추출물 투여군에서 혈장 내 오스테오칼신 농도가 control 군에 비하여 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 대조군의 오스테오칼신 농도는 377.9 ng/ml, 물냉이 추출물 투여군의 오스테오칼신 농도는 429.0 ng/ml로 측정되었다. 물냉이 추출물 투여는 혈장내 오스테오칼신 농도를 113.5%로 증가 시켰으며, 따라서, 물냉이 에탄올 추출물이 골 형성을 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있다.

오스테오칼신은 조골세포에 의해서만 생성되기에, 조골세포 표지자로 사용된다. 오스테오칼신은 대부분 골 기질내에 존재하고, 소량이 혈액으로 분비된다. 따라서 혈중 오스테오칼신 농도를 측정함으로써 골 형성 촉진 정도를 가늠 할 수 있다. 조골세포는 일반적으로 carboxylated 형태의 3개의 glutamate 잔기를 가지는 Gla-오스테오칼신을 생성하는데, 이들은 오스테오칼신이 골기질에 더 잘 부착할 수 있게 해주는 중요한 요소이다. 골 대사과정에서 파골세포가 생성하는 효소를 포함하는 여러 효소들에 의해 오스테오칼신은 골 기질에서 떨어져 나가는데, 이때 3개의 glutamate 잔기들은 decarboxylated 형태로 분비가 된다(Glu-osteocalcin). 특히 Gla 형태의 오스테오칼신은 골형성의 지표로 알려져 있다.

<3-4> 뼈의 이상 증식 및 골다공증 독성 평가

7주간의 투여가 완료된 후 본 발명에 따른 물냉이 추출물을 섭취시킨 실험군 및 대조군 랫트에서, 뼈의 과잉성장 또는 골다공증 이상 유무를 micro-CT 방법으로 평가하였다.

실험동물의 왼쪽 경골의 골밀도와 관련된 경골 소주골(tibial trabecular bone)의 골소주 두께(trabecular thickness)를 micro-CT 검사로 확인하였으며, 골소주 두께는 주로 골다공증 유무 및 골 이상을 평가하는 지표로 사용된다. 측정은 urethane으로 마취하에서 이루어졌으며, Micro-CT시스템은 SKYSCAN 1076 micro-CT(Skyscan Co., Antwerp, Belgium) 기기를 사용하였고 X-ray source는 59 kV, 159 mA로 하였다. pixel 사이즈는 18 μm이며, 1.0 mm의 알루미늄 필터를 사용하였다. 소스와 디텍터가 고정되어 있고 그 사이에 물체가 회전함으로 투영데이터를 얻는다. 사용된 분석프로그램으로는 reconstruction에는 NRecon(Skyscan)이 사용되었다.

하기 표 1 과 도 7에서 보는 바와 같이, 각 군 간 골소주의 차이가 거의 없음을 보아, 실험기간인 7주간 물냉이가 뼈의 이상증식 또는 골다공증 독성 등에는 영향이 없음을 확인하였다.

	Control	물냉이 투여군
골소주 두께(mm)	0.10 ± 0.01	0.10 ± 0.00

<3-5> 실험동물의 골밀도 측정

골밀도에 대한 물냉이 추출물의 효과를 관찰하기 위해, 7주간의 투약이 끝난 후 실험군 및 대조군으로 나누어 골밀도를 측정하였다. 경골 피질골(tibial cortical bone)의 골밀도(bone mineral density) 측정은 SKYSCAN 1076 micro-CT 기기를 사용하였다. X-ray source는 59 kV, 159 mA로 하였으며 pixel 사이즈는 18 μm이며, 1.0 mm의 알루미늄 필터를 사용하였다. 골밀도 분석에는 CTAn(Skyscan)이 사용되었다(표2 참조). 하기 표 2에서 *는 대조군에 대하여 p<0.05 이다.

분석 결과, 하기 표2와 도 8에서 보는 바와 같이, 물냉이 추출물 투여군에서는 정상 랫트와 유사한 신체 크기로 정상이었고 체중의 변화도 없었던데 반해, 경골 피질골 골밀도는 saline을 투여한 대조군에 비하여 유의성 있게 증가되었다. 대조군의 피질골 골밀도는 1.56 mg/cm³이고, 물냉이 추출물 투여군의 골밀도는 118.16% 증가된 1.84 mg/cm³로 측정되었다.

	Control	물냉이 투여군
골밀도(mg/cm³)	1.56 ± 0.13	1.84 ± 0.29^*

< 실시예 4>

통계분석

실험의 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student’s t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

따라서, 본 발명은 본 발명은 물냉이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 골성장 촉진용 및 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 조골세포 증식, 활성화 및 미네랄화를 촉진하며 생체 내에서 골 생성과 관련 있는 표지를 증가시키고 골밀도를 증가시키므로 골질환 예방 및 치료 및 골성장 촉진에 효과적이어서 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

물냉이(Nasturitum officinale R. Br .) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 또는 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 물냉이 추출물은 물냉이 잎으로부터 추출한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
물냉이 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골성장 촉진용 식품 조성물.
물냉이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 개선용 식품 조성물.
제1항, 제3항 내지 제5항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 에탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 1-부탄올, 3차 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매를 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.