WO2019082909A1 - 酵素活性阻害剤 - Google Patents

酵素活性阻害剤

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WO2019082909A1
WO2019082909A1 PCT/JP2018/039429 JP2018039429W WO2019082909A1 WO 2019082909 A1 WO2019082909 A1 WO 2019082909A1 JP 2018039429 W JP2018039429 W JP 2018039429W WO 2019082909 A1 WO2019082909 A1 WO 2019082909A1
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enzyme activity
activity inhibitor
active ingredient
enzyme
skin
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PCT/JP2018/039429
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みどり 安田
泰人 川瀬
森　隆志
琢磨 紺野
拓也 深田
正樹 池岡
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リファインホールディングス株式会社
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of biochemistry, and in particular to a novel enzyme activity inhibitor extracted from plants.
  • the skin is a portion exposed to the outside, and is a region regarded as the most important in terms of beauty. Furthermore, since the appearance of the skin reveals its health condition, the demand for a healthy and firm skin is very high.
  • the dermis in the inner layer of the skin is maintained in a healthy state.
  • the network formed by collagen and elastin provides tension and elasticity to the dermis, and by its elasticity, a firm restoring force is obtained that bounces even if the skin is pushed and returns to its original state.
  • the collagen, elastin and hyaluronic acid contained in the dermis are degraded and denatured or diminished due to stress and aging, the skin tension and elasticity are lost, causing age skin such as sagging. It becomes. Furthermore, sagging in the dermis causes the skin to sink and cause deep wrinkles in the skin.
  • enzyme activity inhibitors have been proposed that inhibit enzyme activity such as collagenase, elastase, hyaluronidase, tyrosinase and the like.
  • an elastase activity inhibitor which contains an extract of Aceratum (Ageratum)
  • an elastase activity inhibitor which combines an extract of Amla (Phyllanthus emblica) is also known (see Patent Document 2).
  • a collagenase activity inhibitor comprising at least one solvent extract selected from the group consisting of guava leaves, Nishikawayanagi and Ryoshi (see Patent Document 3).
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and by newly using a raw material (unused raw material) having no other application, it is possible to achieve high safety as well as enzyme activity from the viewpoint of resource recycling.
  • An object of the present invention is to provide a low cost new type of enzyme activity inhibitor which is also excellent in terms of inhibitory effect.
  • the present inventors have found that the above-mentioned object can be achieved by utilizing the skin of a scrapped rhomboid plant and derived the present invention. Furthermore, they have identified the active ingredient and found that the above-mentioned purpose can be achieved.
  • Enzyme activity inhibitors are provided which inhibit the enzyme activity of collagenase or elastase.
  • the enzyme activity inhibitor of the present invention it is possible to effectively inhibit the activity of each of collagenase and elastase enzymes, for example, to maintain the health condition of the skin well and to suppress the formation of stains. It is possible to maintain the beauty of the skin.
  • the active ingredient represented by the above general formula is at least one selected from the group consisting of di-GG, tri-GG, CH-di-GG, and DBTG, or analogs thereof
  • hyaluronidase or tyrosinase enzymes for example, it becomes possible to maintain good skin health.
  • melanin synthesis is also suppressed, and it is possible to suppress stains on the skin and improve the appearance of the skin.
  • the antioxidant effect is also exerted, and high preservation can also be obtained.
  • the enzyme activity inhibitor according to the present invention can be manufactured at low cost because it uses as a raw material a material that is disposed of in large amounts, such as the skin of a rhombode plant, and is excellent also from the viewpoint of effective use of waste resources is there.
  • part are shown.
  • the result of the high performance liquid chromatography with respect to the beet peel which becomes a raw material of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the high-performance liquid chromatography result with respect to the crude polyphenol containing the active ingredient derived from Hisi peel which becomes a raw material of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the result of the high performance liquid chromatography with respect to the inner skin and epidermis in Heishi peel which becomes a raw material of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a comparative example is shown.
  • the collagenase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a comparative example is shown.
  • the elastase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the elastase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the elastase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the elastase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the elastase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the elastase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the elastase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the result of elastase inhibitory activity of the enzyme activity inhibitor according to the comparative example is shown.
  • the high-performance liquid chromatography result regarding a mustard fruit concerning a comparative example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the hyaluronidase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a comparative example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a present Example is shown.
  • the tyrosinase inhibitory activity result of the enzyme activity inhibitor which concerns on a comparative example is shown.
  • the result of melanin production suppression of the enzyme activity inhibitor concerning a present example is shown.
  • the result of melanin production suppression of the enzyme activity inhibitor concerning a present example is shown.
  • the result of melanin production suppression of the enzyme activity inhibitor concerning a present example is shown.
  • the result of melanin production suppression of the enzyme activity inhibitor concerning a present example is shown.
  • the result of melanin production suppression of the enzyme activity inhibitor concerning a present example is shown.
  • the result of melanin production suppression of the enzyme activity inhibitor concerning a present example
  • the enzyme activity inhibitor according to the present invention contains an active ingredient represented by the following general formula (I), (However, X 1 to X 5 are each independently a substituent A or a hydrogen atom represented by the following general formula (II), and at least two of the substituents A are included in the above formula And X 1 to X 5 adjacent substituents A may be mutually linked directly or via a crosslinked structure) (However, m is an integer of 1 to 3 and at least a part of hydrogen atoms constituting a hydroxyl group may be substituted with a substituent A) It is characterized by inhibiting the enzyme activity of collagenase or elastase.
  • I an active ingredient represented by the following general formula (I)
  • X 1 to X 5 are each independently a substituent A or a hydrogen atom represented by the following general formula (II), and at least two of the substituents A are included in the above formula And X 1 to X 5 adjacent substituents A may be mutually linked directly or via a cross
  • the molecular weight is not particularly limited, but is preferably 400 to 1000, and more preferably 500 to 1000.
  • the number of hydroxyl groups m of the substituent A is 1 to 3, and examples of the substituent A when m is 1 include salicylic acid derivatives and 3-hydroxybenzoic acid derivatives, but the enzyme inhibitory activity is caused by the action of hydroxyl groups M is more preferably 2, for example, as a substituent A when m is 2, a substituent A is a 2,3-dihydroxybenzoic acid (2-pyrocatechic acid) derivative, 2,4-Dihydroxybenzoic acid ( ⁇ -resorcynic acid) derivative, 2,5-dihydroxybenzoic acid (gentisic acid) derivative, 2,6-dihydroxybenzoic acid ( ⁇ -resorcynic acid) derivative, 3,4-dihydroxybenzoic acid (Protocatechuic acid) derivatives and 3,5-dihydroxybenzoic acid ( ⁇ -resorcynic acid) derivatives are mentioned, m is more preferably 3, and when m is 3, gallic acid derivatives (3 , 4, 5-Tolyde And Roxybenzoic
  • Each of X 1 to X 5 independently of one another is a substituent A or a hydrogen atom represented by the above general formula (II), and at least two of the substituents A are included in the above general formula (II) .
  • the combination of X 1 to X 5 containing the substituent A is a combination of X 1 and X 3 in the case of X 1 and X 2
  • the combination thereof is not particularly limited, for example, as a case where each of X 1 and X 5 includes a substituent A, the following di-GG (1,6-di-O-galoyl- ⁇ -D-glucopyranose: 1,6-di-O-galloyl- ⁇ -D-glucosanrose).
  • the combination of X 1 ⁇ X 5 includes a substituent group A, includes a substituent A among the X 1 ⁇ X 5
  • the combination is not particularly limited, for example, in the case of X 1 , X 2 and X 3 , and in the case of X 3 , X 4 and X 5 , for example, substitution to each of X 1 , X 2 and X 5
  • the following tri-GG (1,2,6-tri-O-galoyl- ⁇ -D-glucopyranose: 1,2,6-tri-O-galloyl- ⁇ -D-glucosanrose
  • examples of the combination of X 1 to X 5 containing the substituent A include, for example, X 1 , X 2 , X 3 and X
  • the combination thereof is not particularly limited as in the case of X 2 , X 3 , X 4 and X 5 , for example, as a case where each of X 1 , X 2 , X 3 and X 5 contains a substituent A
  • tetra-GG (1,2,3,6-tetra-O-galoyl- ⁇ -D-glucopyranose: 1,2,3,6-tetra-O-galloyl- ⁇ -D-glucosanrose) may be mentioned. .
  • Tetra-GG (also called TGG or tetra-GG) is a 1,2,3,6-tetra-O-galoyl- ⁇ -D-glucopyranose (1,2,3,6-tetra-O-galloyl- ⁇ Also called D-glucocopyranose, it is a type of glucopyranose which is a form of glucose (molecular weight 788).
  • adjacent substituents A of X 1 to X 5 may be directly interconnected, and such an interconnection may be constituted by any chemical structure.
  • two adjacent substituents A can be mutually interconnected directly by a biphenyl structure, for example, the following structures can be mentioned.
  • eugenin is a hydrolyzable tannin having a hexahydroxydiphenol group, also called ellagitannin (molecular weight 938.7).
  • substituent A at least a part of the hydrogen atoms constituting the hydroxyl group may be substituted with the substituent A, and examples of such substituted substituent A include the following: The structure is mentioned.
  • each of X 1 , X 2 , X 3 and X 5 includes the substituent A as described above.
  • the following DBTG ⁇ -D-Glucopyranose, 6- [3,5-dihydroxy-4-[(3,4,5-trihydroxybenzoyl) oxy] benzoate] 1,2,3-tris (3,4 , 5-trihydroxybenzoate) and ⁇ -D-Glucopyranose, 6- [3,4-dihydroxy-5-[(3,4,5-trihydroxybenzoyl) oxy] benzoate] 1,2,3-tris (3,4,5 -trihydroxybenzoate)).
  • adjacent substituents A of X 1 to X 5 may be mutually connected via a cross-linked structure, and the type of cross-linked structure is not particularly limited. It may be an -O- structure by atoms, and an example of such two interconnected substituents A includes the following structures.
  • Trapain is a kind of tannin and is represented by the following chemical formula (molecular weight 954.7).
  • an extract and / or a ground product of a skin of a rhomboid plant is also contained as an active ingredient.
  • the rhomboid plant is not particularly limited as long as it is a plant (commonly known as “Hishi”) belonging to the rhomboid family (Trapaceae).
  • Hishi a plant belonging to the rhomboid family
  • Preferable examples include, but are not limited to, Wabishi (Trapa japonica), Tobi-shi (Trapa natans), Tobi-shi (Trapa bicornis), and Hime-Bishi (Trapa incisa).
  • Hisashi is an annual aquatic plant that grows naturally in ponds, marshes, and creeks, and thorny fruits stick to the bottom of the water to overwinter, and sprout in spring and produce fruits in the fall.
  • the beard is distinguished from the fruit 1, the hide 2, the inner coat 3, and the epidermis 4 in order from the inside to the outside.
  • the peel of shiitake used in the present invention uses the inner skin 3 and the epidermis 4 and more preferably uses only the inner skin 3 from the viewpoint of exhibiting higher inhibition of the enzyme activity.
  • the skins of Hisi fruits are discarded in large quantities as they have no utility value, making them unutilized plants.
  • Hisi fruits refer mainly to the seeds of the radish (seed 1), and may also include the thin skin (seed 2).
  • Hishi is rich in starchy properties and is boiled and eaten, consumed as a folk medicine and sencha, and also used as a raw material for shochu.
  • the enzyme inhibitor according to the present invention is unconventional in that it is not used as a raw material, and it is expensive compared to various enzymes such as collagenase, elastase, hyaluronidase, or tyrosinase.
  • various enzymes such as collagenase, elastase, hyaluronidase, or tyrosinase.
  • the excellent effect of exerting the enzyme activity inhibitory property has been confirmed (see Examples described later).
  • the peel of the waste wood is used, it is useful not only from the viewpoint of cost but also from the viewpoint of resource recycling that resource recycling can be performed using unused plants.
  • the method for producing the enzyme inhibitor according to the present invention is not particularly limited.
  • the solvent can be mixed with to obtain an extract.
  • the residue of the obtained extract is removed to obtain a filtrate.
  • the filtrate (concentrated solution) is passed through a polyphenol adsorbent, and then desorbed with a solvent to obtain a purified crude polyphenol (Hishi peel polyphenol) extract.
  • hot water is not particularly limited, but is preferably water heated to 60 ° C. to 100 ° C., and can be, for example, 90 ° C. Also, when stirring, ultrasonic vibration can be applied, whereby the extraction is efficiently performed.
  • the enzyme activity inhibitor according to the present invention preferably comprises all of the above di-GG, tri-GG, tetra-GG, CH-di-GG, DBTG, eugeniin and trapain as active ingredients simultaneously, in that case While being easily obtained as an extract (crude polyphenol solution) from the skin of a rhomboid plant, the enzyme activity inhibitory effect by these active ingredients is simultaneously exhibited.
  • di-GG, tri-GG, tetra-GG, CH-di-GG, DBTG, eugeniin and The isolation of each of the TRAPINEs has also been successful (see the examples below). Therefore, as one form of the enzyme activity inhibitor according to the present invention, di-GG, tri-GG, tetra-GG, CH-di-GG, DBTG, eugeniin, and trapain isolated from the skin of a rhomboid plant It is also possible to construct with at least one active ingredient selected from the group consisting of
  • Examples of the above-mentioned substituent constituting the substance equivalent to the active ingredient include alkyl groups such as methyl group and ethyl group, carboxy group, phosphoric acid group, cyano group, alkoxycarbonyl group, acyl group, nitro group, hydroxy group, etc. Can be mentioned.
  • the enzyme activity inhibitor according to the present invention has, as a component corresponding to the active ingredient, the same di-GG, tri-GG, tetra-GG, and CH-di-GG as those extracted from the skin of a rhomboid plant. And at least one member selected from the group consisting of DBTG, eugeniin and trapain, even those extracted from the skins of rhomboid plants (for example, those purified by a chemical synthesis process) Also, it may be extracted (or further isolated) from the skin of a rhomboid plant, or may be a mixture of these.
  • di-GG, tri-GG, tetra-GG, CH-di-GG, DBTG, eugeniin, extracted from the skin of a rhomboid plant Or at least one active ingredient selected from the group consisting of and rapein, and / or contains an ingredient corresponding to the active ingredient, and / or contains an equivalent substance to the active ingredient .
  • the enzyme inhibitor according to the present invention thus obtained has been confirmed to inhibit the activity of collagenase, elastase, hyaluronidase or tyrosinase, and the use thereof is not particularly limited, but preferably the skin It is used as an external preparation, cosmetic raw material (cosmetic composition), or health food, and acting on the dermis of the skin effectively suppresses the degradation of collagen, elastin, and hyaluronic acid contained in the dermis, and is healthy It will give you a tough skin. Furthermore, it has been confirmed that melanin synthesis can be additionally suppressed, and it is possible to suppress the stains on the skin and to further improve the appearance of the skin. Furthermore, it is also confirmed that an antioxidant effect is exhibited concomitantly, and it is a high value-added product that can exhibit high preservation property.
  • the form of utilization of the enzyme inhibitor according to the present invention is not particularly limited, and cosmetic compositions, pharmaceutical compositions, food additives and the like can be mentioned, and can be provided as extracts or powders.
  • the enzyme inhibitor according to the present invention may be used as a drug selected from the group consisting of oral preparations, skin preparations, subcutaneous injections, nasal drops, and eye drops, or functional foods and cosmetics.
  • health care products can be used as a form selected from the group consisting of:
  • the enzyme inhibitor according to the present invention may be used as a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, active agent, excipient, filler, penetration enhancer, thickener, flavor, emulsifier, dispersion aid or binder, etc. It can also be used as a pharmaceutical composition in combination with Furthermore, the enzyme inhibitor according to the present invention is not limited to the use as a drug, and can also be used, for example, as a raw material or additive for functional foods, in which case it is easy to take functional foods. Health improvement effect can be obtained.
  • Example 1 Preparation of Hisi Extract As a raw material, we obtained Onibishi, a native of Inba in Chiba Prefecture, Wabishi native to a creek in Saga, and a commercially available Taiwan radish. We prepared samples for frozen frozen stored analysis of Onibishi, which is borne naturally in Inbanuma, Chiba Prefecture, as a representative of these raw materials, and at the Japan Food Research Laboratories, we established environmental harmful substances, heavy metals and radioactive substances. It was used for the analysis of the content (collection date 2015. 9. 18., storage temperature-21 ° C, test period 2015 12.3-2016. 1.7). As a result, none of the target items exceeded the standard value. From this, it was confirmed that it has high safety as a raw material.
  • each beet was washed with tap water, dried in the sun for 2 to 3 days, and then divided into beet fruits and beet peels (peel). As shown in FIG. 1 (b), it was divided into a real 1, a real 2, an inner 3 and an epidermis 4. Among these, Hisi peel (inner layer peel 3 and epidermis 4) was used as a raw material.
  • the persimmon peel was dried with a microwave room temperature dryer and made into a fine powder with a grinder. The mixture is immersed overnight in a mixed extract of 1: 9 to 2: 8 with acetone as a solvent, and the supernatant is filtered using filter paper (No.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • FIG. 2 three peaks were detected after the large peak by the retention time. The first large peak was observed immediately after the chromatogram from the 60% acetone extract from Hisi peel, which was due to impurities such as proteins, amino acids and the like.
  • the vertical axis unit of the HPLC chart indicates the peak intensity (or the output intensity (mV)), but in FIG. Although vertical axis units are omitted, it is confirmed that the retention times of the components contained in the mash are in agreement with the respective known components.
  • HPLC conditions are column: CAPCELL PAK C18 UG120 (250 mm ⁇ 10 mm, 5 ⁇ m: Shiseido Co., Ltd.), guard column: C18 UG120 (20 mm ⁇ 10 mm, 5 ⁇ m: Shiseido Co., Ltd.), eluent: 0.1%
  • Formic acid: acetonitrile 95: 5% (v / v) after 30 minutes 70: 30% (v / v) (linear gradient), column temperature: 40 ° C, flow rate: 5 mL / min, detection: UV-Vis detection (280 nm).
  • the solvent was removed by a rotary evaporator (N-1200B: Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) to obtain an isolated component.
  • the collagenase inhibitory activity was measured for each of the above-obtained trapain, eugeniin, tetra-GG, and crude polyphenol extract containing these.
  • EDTA disodium ethylenediaminetetraacetate
  • EGCG ((-)-epigallocatechin gallate)
  • tea catechin which is the same polyphenol compound
  • Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH as a substrate, trifluoroacetate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and collagenase (Historiticus-derived, Type IV, Sigma-Aldrich) were used as enzymes.
  • the substrate solution was dissolved in 0.1 M Tris-HCl buffer solution (pH 7.1) containing 20 mM CaCl 2 so as to be 0.39 mg / ml (0.5 mM).
  • the collagenase enzyme solution was prepared by dissolving collagenase in 0.1 M Tris-HCl buffer solution (pH 7.1) containing CaCl 2 (20 mM) to 0.1 mg / ml.
  • A absorbance of sample
  • B absorbance of sample blank (no enzyme)
  • C absorbance of control (buffer)
  • D absorbance of control blank (no enzyme).
  • results obtained by calculating 50% inhibitory concentrations (IC 50 values) showing concentrations that can inhibit the action of half (50%) of the target enzyme for each sample are summarized in Table 3 below.
  • IC 50 values 50% inhibitory concentrations showing concentrations that can inhibit the action of half (50%) of the target enzyme for each sample are summarized in Table 3 below.
  • the IC 50 value in ⁇ M is omitted because the molecular weight can not be specified for the crude polyphenol extract of Onibishi because it is a mixture.
  • N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (S4760, Sigma-Aldrich) was used as a substrate, and elastase (from pig pancreas, Type III, Sigma-Aldrich) was used as an enzyme.
  • the substrate solution used was one dissolved in 0.2 M Tris-HCl buffer solution (pH 7.5) to a concentration of 0.451 mg / ml (1 mM).
  • the enzyme solution was prepared by dissolving elastase in 0.2 M Tris-HCl buffer solution (pH 7.5) to 10 mg / ml.
  • A absorbance of sample
  • B absorbance of sample blank (no enzyme)
  • C absorbance of control (buffer)
  • D absorbance of control blank (no enzyme).
  • FIGS. 7a-7f The results of elastase inhibition activity are shown in FIGS. 7a-7f for each sample. Moreover, the result of EGCG which is a comparative example is shown in FIG. In addition, the results of calculation of 50% inhibitory concentrations (IC 50 values) showing concentrations that can inhibit the action of half (50%) of the target enzyme for each sample are summarized in Table 4 below.
  • hyaluronidase Type IV-S from Brovine Testes, Sigma Aldrich
  • the substrate solution was dissolved in 0.1 M acetic acid-sodium acetate buffer solution (pH 4.0) to a concentration of 0.8 mg / ml.
  • the hyaluronidase enzyme solution was prepared by dissolving hyaluronidase in 0.1 M acetic acid-sodium acetate buffer solution (pH 4.0) to 4 mg / ml.
  • Compound 48/80 is used as an enzyme activation solution, and it becomes 0.5 mg / ml in 0.1 M acetic acid-sodium acetate buffer solution (pH 4.0) containing calcium chloride dihydrate (3.75 mg / ml) I melted it.
  • the potassium borate solution was dissolved by adding 2.24 g of potassium hydroxide to 100 ml of 0.8 M boric acid.
  • the p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DABA) solution was prepared by dissolving 5 g of p-dimethylaminobenzaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 44 ml of glacial acetic acid and 6 ml of 10 M hydrochloric acid. At the time of use, it was diluted 10-fold with glacial acetic acid.
  • Hyaluronidase inhibitory activity (%) ⁇ 1-(A-B) / (C-D) ⁇ x 100
  • A absorbance of sample
  • B absorbance of sample blank (no enzyme)
  • C absorbance of control (buffer)
  • D absorbance of control blank (no enzyme).
  • FIGS. 10a-10f The results of hyaluronidase inhibitory activity are shown in FIGS. 10a-10f for each sample. Moreover, the result of the sodium cromoglycate which is a comparative example is shown in FIG. In addition, Table 5 below summarizes the results of calculating 50% inhibitory concentrations (IC 50 values) indicating concentrations that can inhibit the action of half (50%) of the target enzyme for each sample. In the following table, the IC 50 value in ⁇ M is omitted because the molecular weight can not be specified for the crude polyphenol extract of Onibishi because it is a mixture.
  • L-tyrosine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a substrate, and tyrosinase (mushroom-derived, Sigma-Aldrich) was used as an enzyme.
  • the substrate solution was dissolved in water so as to be 2 mM, and the solution filtered through a membrane filter was used.
  • the tyrosinase enzyme solution used tyrosinase at 0.125 mg / ml with phosphate buffer solution (adjusted to pH 6.8 with 0.1 M Na 2 HPO 4 and 0.1 M NaH 2 PO 4 ) .
  • A absorbance of sample
  • B absorbance of sample blank (no enzyme)
  • C absorbance of control (buffer)
  • D absorbance of control blank (no enzyme).
  • the results of tyrosinase inhibitory activity are shown in FIGS. 12a-12f for each sample.
  • the result of arbutin which is a comparative example is shown in FIG.
  • the results of calculating the 50% inhibitory concentration (IC 50 value) showing the concentration capable of inhibiting the action of half (50%) of the target enzyme for each sample are summarized in Table 6 below.
  • the IC 50 value in ⁇ M is omitted because the molecular weight can not be specified for the crude polyphenol extract of Onibishi because it is a mixture.
  • mouse-derived B16 4A5 melanoma cells (RIKEN BioResource Center) were used.
  • the medium was FBS (fetal calf serum, Funakoshi), 10% immobilized in D-MEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1% Penicillin-Streptomycin ( ⁇ 100, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1% L-alanyl-L-glutamine solution (200 mM, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • HBSS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% FBS was used.
  • ⁇ -MSH Peptide Institute
  • 1 M sodium hydroxide solution was used as a cell growth stop solution.
  • Each sample was first dissolved in ethanol and appropriately diluted in culture medium. The final concentration of ethanol was 1% or less so as not to affect the proliferation of cells.
  • the melanin standard solution is commercially available melanin (Sigma Aldrich) dissolved in 1 M sodium hydroxide to make a 0.2 mg / mL solution, then 0, 0.00625, 0.0125 with 1 M sodium hydroxide. , 0.025, 0.05, 0.1 mg / mL solutions for calibration curve were prepared.
  • the DCTM protein assay kit (Bio Rad) was used for protein measurement. That is, the reagent A (alkaline copper tartrate), the reagent B (forin reagent), and the reagent S were used, and the A ′ reagent was obtained by adding 30 ⁇ L of the S reagent to 1.5 mL of the A reagent.
  • the serum albumin solution was dissolved in 20 mL of serum albumin (protein standard standard II) water (1.41 mg / mL) to prepare a solution for calibration curve.
  • 500 ⁇ L of cells (1 ⁇ 10 5 cells / mL) were seeded in a 24-well plate and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 concentration for 24 hours.
  • the well plate was sealed with an aluminum plate seal and heated at 80 ° C. for 1 hour.
  • a and B indicate the sample melanin concentration (mg / mL) and protein concentration (mg / mL), and C and D indicate the control melanin concentration (mg / mL) and protein concentration (mg / mL) .
  • the results of the melanin production inhibitory action are shown in FIGS. 14 a to 14 f for each sample.
  • the results of calculating the 50% inhibitory concentration (IC 50 value) showing the concentration at which half (50%) of the target enzyme can be inhibited for each sample are summarized in Table 7 below.
  • the IC 50 value in ⁇ M is omitted because the molecular weight can not be specified for the crude polyphenol extract of Onibishi because it is a mixture.
  • the DPPH solution used was made by making DPPH (Sigma Aldrich) 400 ⁇ M with ethanol.
  • the Trolox standard solution was prepared by dissolving Trolox (Calbiochem) in 80% ethanol and adjusting to 200 ⁇ M. Using this Trolox standard solution, those prepared at 0, 50, 100, 150, and 200 ⁇ M in 80% ethanol were used as a Trolox standard solution for calibration curve.
  • DPPH unit ( ⁇ mol TE / g) x ⁇ A / 1000 ⁇ 1 / w ⁇ 1000 ⁇ dilution ratio
  • x molar concentration from the calibration curve ( ⁇ M)
  • w collected amount of sample (mg)
  • A volume when sample is extracted (ml).
  • the inhibitory activity against collagenase, elastase, hyaluronidase, or tyrosinase was confirmed with respect to the seeds known conventionally as a part of enzyme activity inhibitors.
  • the content of the above-mentioned active ingredients Trapain, Eugeniin, and tetra-GG in Heishi seeds was measured, and collagenase inhibitory activity and elastase inhibitory activity were confirmed depending on how much these active ingredients are contained.
  • the results obtained are shown in the following table, and the results of high performance liquid chromatography for the extract from the seed of Onibishi, which is a comparative example, are shown in FIG.
  • the pericarp skin extract according to this example exhibited higher collagenase inhibitory activity and elastase inhibitory activity as compared to the conventional comparative example. From these results, it is possible to suppress decomposition and degeneration of collagen and elastin according to the present example, for example, functional foods (eg, health supplements, nutritive functional foods, etc.), cosmetics, Health care products (including products for promoting the maintenance and promotion of health, such as nutritional drinks and packs that moisturize the skin, etc.), etc.
  • functional foods eg, health supplements, nutritive functional foods, etc.
  • Cosmetics e.g., cosmetics, Health care products (including products for promoting the maintenance and promotion of health, such as nutritional drinks and packs that moisturize the skin, etc.), etc.
  • Health care products including products for promoting the maintenance and promotion of health, such as nutritional drinks and packs that moisturize the skin, etc.

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Abstract

未利用原料を新たに用いることによって、高い安全性とともに、資源再利用の観点からも酵素活性阻害効果の観点からも優れた低コストな新しいタイプの酵素活性阻害剤を提供する。　酵素活性阻害剤は、以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、 （I）（但し、Ｘ１～Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１～Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）（II）（但し、ｍは、１～３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）　 コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害する。

Description

[規則26に基づく補充 09.11.2018]　酵素活性阻害剤
　本発明は、生化学の技術分野に属し、特に、植物から抽出された新規な酵素活性阻害剤に関する。
　現代社会では、美容と健康の維持や増進に高い関心が寄せられている。特に、肌（皮膚）は外部に露出される箇所であり、美容上、最も重要視されている領域である。さらに、肌の外観はその健康状態を如実に顕すことから、健康で張りのある肌を得たいという需要は非常に高い。
　健康で張りのある肌では、肌（皮膚）の表皮の内層にある真皮が健康な状態に維持されている。真皮では、コラーゲンとエラスチンにより形成されるネットワークによって、真皮に張りや弾力性が与えられ、その弾力性によって、肌を押しても弾かれて元の状態に戻る強固な復元力が得られる。
　しかし、ストレスや加齢によって、真皮に含まれるコラーゲン、エラスチン、さらにはヒアルロン酸が分解されて変性したり減少したりすると、肌の張りや弾力性が失われて、たるみなどの年齢肌の原因となる。さらに、真皮にたるみが生じることによって、皮膚が沈み、皮膚に深い皺ができる原因ともなる。
　このようなことから、健康で張りのある肌を得るには、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸の変性や減少を抑制することが重要となっている。コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸を分解する物質としては、各々、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼといった酵素が特定されている。さらに、肌の美観の点でシミの原因となるメラニンの合成に関わる酵素としてチロシナーゼが特定されている。すなわち、このような酵素の作用（活性）を阻害することができれば、健康で張りのある肌が得られると考えられる。
　従来から、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、チロシナーゼなどの酵素活性を阻害する酵素活性阻害剤が提案されている。
　例えば、従来の酵素活性阻害剤としては、カッコウアザミ属（Ageratum）の抽出物を配合するエラスターゼ活性阻害剤が知られている（特許文献１参照）。また、例えば、アムラ（Phyllanthus emblica）の抽出物を配合するエラスターゼ活性阻害剤も知られている（特許文献２参照）。また、グアバの葉、西河柳および菱実よりなる群より選んだ少なくとも一種の溶媒抽出物を含むコラゲナーゼ活性阻害剤も知られている（特許文献３参照）。
特開２００６－０６２９８８号公報 特開２００６－０６２９８９号公報 特開平７－２９１８７３号公報
　しかし、従来の酵素活性阻害剤では、原料として、カッコウアザミ属や西河柳のように園芸用として市場に流通しているものや、アムラや菱実のように食用として流通しているものを用いるものである。すなわち、既に他の用途がある材料を酵素活性阻害剤の原料として用いることから、コストが嵩むという課題がある。
　このようなことから、廃材のような現時点では用途の無い材料を原料として、安全性の高い酵素活性阻害剤を得ることができれば、コスト抑制の観点のみならず、資源再利用の観点からも、特に有益と考えられる。しかし、現状ではそのようなものは見当たらない。
　さらに、本発明者らが確認したところに拠れば、従来の酵素活性阻害剤として、例えば、上述した特許文献３の菱実の溶媒抽出物を含むコラゲナーゼ活性阻害剤を例にとると、実用上、十分に酵素活性を阻害するものではなく（後述の実施例参照）、すなわち、従来の酵素活性阻害剤では、その酵素活性阻害効果も、実際のところ、総じて十分なものであるとは言い切れないのが実情である。
　本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、他の用途が無い原料（未利用原料）を新たに用いることによって、高い安全性とともに、資源再利用の観点からも酵素活性阻害効果の観点からも優れた低コストな新しいタイプの酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、廃材の菱科植物の果皮を利用することによって、上記の目的を達成できることを見出し、本発明を導き出した。さらに、その有効成分を特定し、上記の目的を達成できることを見出した。
　かくして、本発明に従えば、以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （但し、Ｘ１～Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１～Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （但し、ｍは、１～３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）
　コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害する酵素活性阻害剤が提供される。本発明の酵素活性阻害剤に拠れば、コラゲナーゼ、エラスターゼの各酵素に対して、効果的に活性阻害することができ、例えば、肌の健康状態を良好に維持することやシミの生成を抑制して肌の美観を保つことが可能となる。また、上記一般式で表される前記有効成分が、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、およびＤＢＴＧ、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つである場合には、ヒアルロニダーゼまたはチロシナーゼの各酵素に対しても、効果的に活性阻害することができ、例えば、肌の健康状態を良好に維持することが可能となる。さらに付随する効果として、メラニン合成も抑制され、肌のシミを抑制して肌の美観を向上させることができる。さらに付随する効果として、抗酸化作用も発揮され、高い保存性も得ることができる。
　本発明に係る酵素活性阻害剤は、菱科植物の果皮という大量に廃棄されている材料を原料に用いることから、低コストで製造できるとともに、廃棄資源の有効利用という観点からも優れたものである。
本発明に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮の部位を説明する断面図（ａ）およびヒシを部位ごとに取り出した写真（ｂ）を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮に対する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮由来の有効成分を含有する粗ポリフェノールに対する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮における内層皮と表皮に対する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 比較例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 比較例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。 比較例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。 比較例に係るヒシ実に関する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。 比較例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。 比較例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。 本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。
　本発明に係る酵素活性阻害剤は、以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （但し、Ｘ１～Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１～Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （但し、ｍは、１～３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）
　コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害することを特徴としている。
　その分子量は、特に限定されないが、好ましくは、４００～１０００であり、より好ましくは、５００～１０００である。
　置換基Ａの水酸基数ｍは１～３であり、例えば、ｍが１の場合の置換基Ａとしては、サリチル酸誘導体や、3-ヒドロキシ安息香酸誘導体が挙げられるが、水酸基の作用によって酵素阻害活性をより高めるという点からは、ｍはより好ましくは２であり、例えば、ｍが２の場合の置換基Ａとして、置換基Ａは、2,3-ジヒドロキシ安息香酸（2-ピロカテク酸）誘導体、2,4-ジヒドロキシ安息香酸（β-レゾルシン酸）誘導体、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）誘導体、2,6-ジヒドロキシ安息香酸（γ-レゾルシン酸）誘導体、3,4-ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸）誘導体、3,5-ジヒドロキシ安息香酸（α-レゾルシン酸）誘導体が挙げられ、ｍはさらに好ましくは３であり、ｍが３の場合の置換基Ａとしては、没食子酸誘導体（3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸）が挙げられる。
　Ｘ１～Ｘ５は、各々互いに独立して、上記一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記一般式（II）中に少なくとも２つ含まれる。
　例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に２つ含まれる場合として、置換基Ａを含むＸ１～Ｘ５の組み合わせとしては、Ｘ１およびＸ２の場合、Ｘ１およびＸ３の場合、Ｘ２およびＸ３の場合、Ｘ４およびＸ５の場合、などその組み合わせは特に限定されないが、例えば、Ｘ１およびＸ５の各々に置換基Ａを含む場合として、以下のジ-ＧＧ（1,6-ジ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース：1,6-di-O-galloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　また、例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に３つ含まれる場合として、置換基Ａを含むＸ１～Ｘ５の組み合わせとしては、Ｘ１～Ｘ５のうち置換基Ａを含む組み合わせとしては、例えば、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の場合、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の場合などその組み合わせは特に限定されないが、例えば、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５の各々に置換基Ａを含む場合として、以下のトリ-ＧＧ（1,2,6-トリ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース：1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　また、例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に４つ含まれる場合として、置換基Ａを含むＸ１～Ｘ５の組み合わせとしては、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の場合、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の場合などその組み合わせは特に限定されないが、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５の各々に置換基Ａを含む場合として、以下のテトラ-ＧＧ（1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース：1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　テトラ-ＧＧ(ＴＧＧまたはｔｅｔｒａ－ＧＧとも呼ばれる）は、1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース（1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose）とも呼ばれ、グルコースの一形態であるグルコピラノースの一種である（分子量７８８）。
　また、上述したように、Ｘ１～Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が、直接、相互連結されていてもよく、このような相互連結はどのような化学構造によって構成されていてもよく、例えば、ビフェニル構造によって直接、隣接する２つの置換基Ａが相互連結されることができ、例えば、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に４つ含まれる場合として、上記同様にＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５の各々に置換基Ａが含まれる場合に、このように隣接する２つの置換基ＡがＸ２およびＸ３に存在する場合に、ビフェニル構造によって相互連結された場合の一例として、以下のＣＨ－ｄｉ－ＧＧ（β-D-グルコピラノース, サイクリック2,3-[(1S)-4,4’,5,5’,6,6’-ヘキサヒドロキシ[1,1’- ビフェニル]-2,2’-ジカルボキシレート] 1,6-ビス(3,4,5-トリヒドロキシベンゾエート)：β-D-glucopyranose, cyclic2,3-[(1S)-4,4’,5,5’,6,6’-hexahydroxy[1,1’- biphenyl]-2,2’-dicarboxylate] 1,6-bis(3,4,5-trihydroxybenzoate)）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　このような隣接する置換基Ａがビフェニル構造によって相互連結された場合の一例としては、Ｘ４およびＸ５の各々に存在する置換基Ａがビフェニル構造によって相互連結された一例として、以下のオイゲニン（β-D-glucopyranose, cyclic 4,6-((1S)-4,4',5,5',6,6'-hexahydroxy(1,1'-biphenyl)-2,2'-dicarboxylate) 1,2,3-tris(3,4,5-trihydroxybenzoate)）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　オイゲニイン（オイゲニンとも呼ばれる）は、ヘキサヒドロキジフェノール基を持つ加水分解型のタンニンで、エラジタンニンとも呼ばれるものである（分子量９３８．７）。
　また、上述したように、置換基Ａは、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよく、このような置換された置換基Ａの一例としては、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　このような置換された置換基Ａを含む一例としては、例えば、置換基Ａが４つ含まれる場合として、上記同様にＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５の各々に置換基Ａが含まれる一例として、以下のＤＢＴＧ（β-D-Glucopyranose, 6-[3,5-dihydroxy-4-[(3,4,5-trihydroxybenzoyl)oxy]benzoate] 1,2,3-tris(3,4,5-trihydroxybenzoate)およびβ-D-Glucopyranose, 6-[3,4-dihydroxy-5-[(3,4,5-trihydroxybenzoyl)oxy]benzoate] 1,2,3-tris(3,4,5-trihydroxybenzoate)）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　また、上述したように、Ｘ１～Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が、架橋構造を介して相互連結されていてもよく、架橋構造の種類は、特に限定されないが、例えば、酸素原子による-O-構造とすることができ、このような相互連結された２つの置換基Ａの一例としては、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　例えば、置換基Ａが４つ含まれる場合として、上記同様にＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５に置換基Ａが含まれる場合に、このような隣接する２つの置換基Ａが架橋構造を介して相互連結された場合の一例として、以下のトラパイン（6-O,4-O-[2,9,10,11,11-Pentahydroxy-3-oxo-3,6-dihydro-2,6-methano-2H-1-benzoxocin-5,7-diylbis(carbonyl)]-1-O,2-O,3-O-trigalloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。
　トラパインは、タンニンの一種であり、以下の化学式で表される（分子量９５４．７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　上記の主要な有効成分の例示をまとめて以下の表に示す。勿論、以下は主要な有効成分の例示であって、当該有効成分が各種置換基で置換されたような類縁体であっても、同等な有効成分を奏するものとして、本有効成分として含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　本発明者らが解明したところに拠れば、上記有効成分のうち、特に、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパイン、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つが、コラゲナーゼまたはエラスターゼに対して優れた酵素活性阻害作用を発揮するものであり、また、上記有効成分のうち、特に、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、およびＤＢＴＧ、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つが、ヒアルロニダーゼまたはチロシナーゼの酵素活性を阻害するものであることが確認されている。さらに、上記の有効成分ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインが、菱科植物の果皮から得られることが確認されている（後述の実施例参照）。
　すなわち、本発明の酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮の抽出物および／または粉砕物を有効成分として含有するものでもある。
　菱科植物とは、菱科（Ｔｒａｐａｃｅａｅ）に属する植物（通称ヒシ）であれば特に制限されない。好適には、ワビシ（Ｔｒａｐａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、ヒメビシ（Ｔｒａｐａ ｉｎｃｉｓａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　ヒシは、池、沼、およびクリークに自生する一年生水草であり、とげのある実が水底に固着して越冬し、春になると芽を出し、秋に果実をつける。
　図１（ａ）に示すように、ヒシは、内部から外部に向かって順に、実１、実皮２、内層皮３、表皮４と区別される。このうち、本発明で用いるヒシの果皮は、内層皮３および表皮４を用いるものであり、より高い酵素活性阻害を呈するという点から、より好ましくは、内層皮３のみを用いるものである。ヒシの果皮は、ヒシの果実（通称ヒシ実）とは異なり、利用価値が無いという扱いで大量に廃棄されており、未利用植物となっている。
　ヒシ実は、主としてヒシの実（実１）を指し、薄皮である実皮（実皮２）も含める場合もある。ヒシ実は、デンプン質が多く、茹でて食用とすることや、民間薬や煎茶として飲用され、さらには焼酎の原料としても利用されている。
　ヒシ実を利用した酵素活性阻害剤は一部で提案されてはいるものの（例えば、上記の特許文献３参照）、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼに対する十分な酵素活性阻害は得られていない（後述の比較例参照）。また、ヒシ実は、既にデンプン源や焼酎の原料などの食用としても使われていることからも、購入コストが嵩むものとなる。
　本発明に係る酵素阻害剤では、ヒシ実を原料に使わないという点で従来には無いものであり、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼといった各種の酵素に対して、従来では得られなかった高い酵素活性阻害性を奏するという優れた効果が確認されている（後述の実施例参照）。さらに、廃材であるヒシの果皮を用いることから、コストの観点のみならず、未利用植物を活用して資源循環を行えるという資源再利用の観点からも有益である。
　本発明に係る酵素阻害剤の製造方法は、特に限定されないが、例えば、水や有機溶媒（例えばアセトン）を溶媒として、ヒシの果皮の粗粉砕に対して例えば重量比１：９～２：８で溶媒を混合し、抽出物を得ることができる。得られた抽出液の残渣物を取り除き、濾過液を得る。濾過液（濃縮液）をポリフェノール吸着剤に通液させ、その後溶媒にて脱着させ、純化した粗ポリフェノール（ヒシ果皮ポリフェノール）抽出物を得ることができる。
　この他にも、菱科植物の果皮を熱水中で攪拌することによって熱水抽出して製造することも可能である。熱水とは、特に限定されないが、好適には６０℃～１００℃に加熱された水であり、例えば９０℃とすることができる。また、攪拌する際には、超音波振動を適用することもでき、これによって、抽出が効率的に行なわれる。
　この他にも、菱科植物の果皮を粉砕したものも、本発明に係る酵素阻害剤として用いることができる。
　本発明に係る酵素活性阻害剤は、上記のジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの全てを有効成分として同時に含むことが好ましく、その場合には、菱科植物の果皮からの抽出物（粗ポリフェノール溶液）として簡易に得られると共に、これらの有効成分による酵素活性阻害効果が同時に発揮されるものとなる。
　さらに、本発明者らが解明したところに拠れば、菱科植物の果皮から抽出される有効成分として、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの各々の単離にも成功している（後述の実施例参照）。そのため、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から単離されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分を用いて構成することも可能である。
　また、菱科植物の果皮から抽出される有効成分であるジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの各々の一部を置換基で置換したこれらの類縁体も、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの構造に近いことから、菱科植物の果皮から抽出される有効成分に相当し、すなわち、当該有効成分と同等の物質である。
　当該有効成分と同等の物質を構成する上記の置換基としては、メチル基、エチル基などのアルキル基、カルボキシ基、リン酸基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、ニトロ基、ヒドロキシ基などが挙げられる。
　このようなことから、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から抽出されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分と同等の物質を含有するものである。
　また、当該有効成分としては、菱科植物の果皮から抽出されたもの以外であってもよい。すなわち、本発明に係る酵素活性阻害剤は、当該有効成分に相当する成分として、菱科植物の果皮から抽出されたものと同じジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つを含むものであれば、菱科植物の果皮から抽出されたもの以外（例えば化学合成プロセスで精製されたもの）であってもよく、また、菱科植物の果皮から抽出されたもの（もしくはさらに単離されたもの）であってもよく、また、これらを混合したものでもよい。
　このようなことから、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から抽出されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、さらに／または、当該有効成分に相当する成分を含有するものである。
　さらに、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、上記の有効成分と同等の物質を含有することも可能である。
　以上のことから、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から抽出されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、さらに／または、当該有効成分に相当する成分を含有し、さらに／または、当該有効成分と同等の物質を含有するものである。
　このようにして得られた本発明に係る酵素阻害剤は、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼの活性を阻害することが確認されており、その用途としては、特に限定されないが、好適には皮膚外用剤、化粧品原料（化粧品組成物）、または健康食品として用いることであり、肌の真皮に作用することによって、真皮に含まれるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸の分解が効果的に抑制され、健康で張りのある肌が得られるものとなる。さらに付随的にメラニン合成も抑制できることが確認されており、肌のシミを抑制して肌の美観をさらに向上させることができる。さらに付随的に抗酸化作用を呈することも確認されており、高い保存性も発揮できるという付加価値の高いものとなる。
　本発明に係る酵素阻害剤の利用形態は、特に限定されず、化粧品組成物、医薬品組成物、食品添加物等が挙げられ、エキスまたはパウダーとして提供することができる。特に限定されないが、本発明に係る酵素阻害剤は、経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、および点眼剤からなる群から選択される薬剤として、または、機能性食品、化粧品、およびヘルスケア商品からなる群から選択される形態として用いることが可能である。
　さらに、本発明に係る酵素阻害剤は、製薬上許容され得る担体、希釈剤、活性剤、賦形剤、充填剤、浸透促進剤、増粘剤、香料、乳化剤、分散助剤または結合剤等と組み合わされた医薬組成物として使用することもできる。さらに、本発明に係る酵素阻害剤は、薬剤という用途に限定されず、例えば、機能性食品の原料または添加物として利用することもでき、この場合には、機能性食品を摂取することによって手軽に健康改善効果を得ることができる。
　以下に、本発明の特徴をさらに具体的に示すために実施例を記すが、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
（実施例１）
（１）ヒシ抽出物の調製
　原料となるヒシとして、千葉県の印旛沼に自生するオニビシ、佐賀県のクリークに自生するワビシ、および市販の台湾ヒシを入手した。これらの原料を代表して千葉県の印旛沼に自生するオニビシについて、冷凍保存した分析用サンプルを作成し、一般財団法人日本食品分析センターにて、環境由来の有害物質、重金属類、放射性物質の含有量の分析に使用した（採取日2015.9.18、保管温度-21℃、試験期間2015.12.3～2016.1.7）。結果として、すべての対象項目において基準値を超えるものは無かった。このことから、原料として高い安全性を有することが確認された。
　それぞれのヒシは水道水にて洗浄後、天日で２～３日間乾燥させ、ヒシ実とヒシ果皮（果皮）とに分けた。図１（ｂ）に示すように、実１、実皮２、内層皮３、表皮４に分別した。このうち、ヒシ果皮（内層皮３および表皮４）を原料に用いた。マイクロ波常温乾燥機にてヒシ果皮を乾燥させ、粉砕機にて微粉末とした。溶媒であるアセトンを用いて１：９～２：８の混合抽出液に一昼夜漬込み、これを上清をろ紙（Ｎｏ．６、アドバンテック）を用いて濾過後、ロータリーエバポレーター（N-1200B：東京理化器械株式会社）にて濃縮させた。吸着剤（三菱ケミカル株式会社「ダイアイオンHP20」）に濃縮液を通液させ、溶媒（80%エタノール）で粗ポリフェノールを脱着させ、純化した粗ポリフェノール抽出物エキスを得たあと、上記ロータリーエバポレーターで乾固した。
　さらに、これらの成分について高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で調べた。HPLC条件は、カラム：CAPCELL PAK C18 UG120（250 mm × 4.6 mm、5 μm：株式会社資生堂）、溶離液：0.1% ギ酸：アセトニトリル＝95：5% (v/v) から30分後に70：30% (v/v)（リニアグラジエント）、カラム温度：40℃、流速：1 mL/分、検出：UV-Vis検出器（280 nm）であった。その結果、図２に示すように、リテンションタイムによって、大きいピークの後に、３つのピークを検出した。最初の大きいピークは、ヒシ果皮からの６０％のアセトン抽出物からクロマトグラム直後に観察されたが、これはタンパク質、アミノ酸などの不純物に起因するものであった。
　なお、HPLCチャートの縦軸単位は、ピーク強度（もしくは出力強度（mV））を示すものであるが、図２では、グラフを統合して表示する目的で、表記上の見易さを優先して縦軸単位を省略しているが、確かに、ヒシに含まれる成分のリテンションタイムが、各既知成分と一致することが確認された。
　これら３つの成分の分取を以下のように行った。オニビシ粗ポリフェノール1gを秤り取り、エタノールを10ml入れることで、100 mg/mlの濃度とした。超音波洗浄器（MCD-2、アズワン株式会社）にて充分溶かした後、メンブレンフィルター（13HP045AN、アドバンテック）にてろ過を行った。3つの成分の分取は、HPLCにて行った。HPLC条件は、カラム：CAPCELL PAK C18 UG120（250 mm × 10 mm、5 μm：株式会社資生堂）、ガードカラム： C18 UG120（20 mm × 10 mm、5 μm：株式会社資生堂）、溶離液：0.1% ギ酸：アセトニトリル＝95：5% (v/v) から30分後に70：30% (v/v)（リニアグラジエント）、カラム温度：40℃、流速：5 mL/分、検出：UV-Vis検出器（280 nm）であった。さらに、ロータリーエバポレーター（N-1200B：東京理化器械株式会社）にて溶媒を除去し、単離成分を得た。
　液体クロマトグラフ質量分析計(ＬＣ／ＭＳ)（ＬＣＭＳ－２０２０：島津製作所製）を用いて測定した。ＬＣ／ＭＳ測定条件は、カラム：CAPCELL PAK C18 UG120（150 mm × 2 mm、3 μm：株式会社資生堂）、溶離液：0.1% ギ酸：アセトニトリル＝95：5% (v/v) から30分後に70：30% (v/v)（リニアグラジエント）、カラム温度：40℃、流速：0.2 mL/分、イオンモード：ネガティブであった。その結果、各々の単離成分のｍ／ｚ値は、各々９３７、７８７、および４７６であった。
　高速液体クロマトグラフィーのリテンションタイム値と、上記ＬＣ／ＭＳ測定から、単離成分のサンプルのうち、１番目のリテンションタイム値でピークを有するものは、オイゲニイン（分子量９３８）と同定された。同じく、３番目のリテンションタイム値でピークを有するものは、トラパイン（分子量９５４）と同定された。また、２番目のリテンションタイム値でピークを有するものについては、さらに、核磁気共鳴装置(NMR)（JNM-AL400（1H-NMR：400 MHz 、13C-NMR：100 MHz）：日本電子株式会社製）を用いて、1H NMRスペクトルを測定したところ、次の結果が得られた。δ4.13 (m, 2 H, H-4 and H-5), 4.59 (m, 2 H, H-6), 5.46 (t, 1 H,J = 8 Hz, H-2), 5.66 (t, 1 H, J = 9 Hz, H-3), 6.16 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-1), 6.99, 7.07, 7.08, 7.17 (s, each 2 H, galloyl H). この結果から、テトラガロイルグルコース類であることが確認され、上述のｍ／ｚ値７８７と、１３Ｃ ＮＭＲ測定結果[glucose moiety: 93.4, 76.0, 75.9, 71.8, 69.3, 63.6; ester carbons:166.6, 166.2, 165.8, 165.0]から、グルコピラノース骨格におけるガロイル基の位置がＣ－１、２、３および６であることが特定され、この単離成分がテトラ-ＧＧ(1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース:1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose)であることが同定された。
　上記と同様に、オニビシおよびワビシの果皮を原料とする抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーの結果を、各々、図３に示す。得られた結果から、この抽出物は、有効成分としてジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインをすべて含有する粗ポリフェノール溶液であることが確認された。
　また、オニビシの内層皮と表皮を原料とする抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーの結果を、各々、図４（ａ）および（ｂ）に示す。得られた結果から、この抽出物は、上記有効成分をすべて含有する粗ポリフェノール溶液であることが確認された。
　得られたトラパイン、オイゲニイン、およびテトラ-ＧＧの各ポリフェノール含量を３回測定し、以下表の結果を得た。なお、ヒシは天然物であるため、そのポリフェノール含量は、採取時期や保存状態に依存して多少変動する。そのため、以下表の各サンプルでは、同時期に採取されたヒシを用いて、同じ保存状態（凍結乾燥）のもとで測定を行った。得られた比較結果から、ヒシのうち、特にオニビシが、高いポリフェノール含量を有することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（２）コラゲナーゼ阻害活性の測定
　上記得られたトラパイン、オイゲニイン、テトラ-ＧＧ、およびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、コラゲナーゼ阻害活性を測定した。比較例として、既にコラゲナーゼ阻害活性があるとして知られているエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、および同じポリフェノール化合物である茶カテキンであるＥＧＣＧ（（－）－エピガロカテキンガレート）を用いた。
　基質としてＰｚ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ａｒｇ－ＯＨ、トリフルオロ酢酸塩（和光純薬株式会社）、酵素としてコラゲナーゼ（ヒストリチクス菌由来、Type IV、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、20 mMCaCl2を含む0.1 M Tris-HCl緩衝溶液（pH7.1）にて0.39 mg/ml（0.5mM）となるよう溶かしたものを用いた。コラゲナーゼ酵素溶液は、コラゲナーゼをCaCl2（20mM）を含んだ0.1M Tris-HCl緩衝溶液（pH7.1）に溶解し、0.1mg/mlとしたものを用いた。
　先ず、マイクロチューブ（２ｍＬ）にサンプル溶液１５μＬを入れた。次に、コラゲナーゼ酵素溶液１５μＬを入れた。さらに、基質溶液１２０μＬを入れた。３７℃で３０分間インキュベートした。２５ｍＭクエン酸（反応停止液）３００μＬを入れた。酢酸エチルを１．５ｍＬ入れ、激しく振とうし、抽出させた。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）を行った。上清の酢酸エチル層を石英セルに入れ、分光光度計（V－560、日本分光株式会社）にて３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのコラゲナーゼ阻害活性を求めた。
[数１］
コラゲナーゼ阻害活性（％）＝｛1－（A－B）／（C－D）｝×100
　上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
　それぞれのサンプルについて、コラゲナーゼ阻害活性の結果を図５ａ～５ｇに示す。また、比較例であるＥＤＴＡおよびＥＧＣＧの結果を図６ａおよび図６ｂに示す。また、それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結ｓ果をまとめて以下の表３に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　得られた結果から、比較例に対して、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインのほうが、極めて低い濃度でコラゲナーゼを阻害することが確認された。オニビジ粗ポリフェノールも極めて低い濃度でコラゲナーゼを阻害することが確認された。特に、トラパインにおけるコラゲナーゼ阻害活性は極めて高いことが確認された。
（３）エラスターゼ阻害活性の測定
　上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパイン、およびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物について、エラスターゼ阻害活性を測定した。比較例として、同じポリフェノール化合物である緑茶のポリフェノール（カテキン）の一種である（－）-エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を用いた。
　基質としてＮ－Ｓｕｃｃｉｎｙｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（S4760、シグマアルドリッチ）、酵素としてエラスターゼ（豚の膵臓由来、Type III、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、0.2 M Tris-HCl緩衝溶液（pH7.5）にて0.451 mg/ml（1mM）となるよう溶かしたものを用いた。酵素溶液は、エラスターゼを0.2 MのTris-HCl緩衝溶液（pH7.5）に溶解して10 mg/mlとしたものを用いた。
　先ず、マイクロプレートにサンプル溶液５０μＬを入れた。次に、エラスターゼ酵素溶液５０μＬを入れた。基質溶液１００μＬを入れた。２５℃で５０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）で４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのエラスターゼ阻害活性を求めた。
[数２]
　エラスターゼ阻害活性（％）＝｛1－（A－B）／（C－D）｝×100
　なお、上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
　それぞれのサンプルについて、エラスターゼ阻害活性の結果を図７ａ～７ｆに示す。また、比較例であるＥＧＣＧの結果を図８に示す。また、それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　得られた結果から、比較例に対して、トラパイン、オイゲニイン、テトラ-ＧＧ、ＤＢＴＧのほうが、極めて低い濃度でエラスターゼを阻害することが確認された。特に、オイゲニインにおけるエラスターゼ阻害活性は極めて高いことが確認された。
（４）ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定
上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。比較例として、既にコラゲナーゼ阻害活性があるとして知られているクロモグリク酸ナトリウムを用いた。
　基質として鶏冠由来のヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬株式会社）、酵素としてヒアルロニダーゼ（Type IV-S from Brovine Testes、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、0.1 M 酢酸－酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH4.0）にて0.8 mg/mlとなるよう溶かしたものを用いた。ヒアルロニダーゼ酵素溶液は、ヒアルロニダーゼを0.1 M 酢酸－酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH4.0）に溶解し、4 mg/mlとしたものを用いた。酵素活性化液として、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０を用い、塩化カルシウム・二水和物（3.75 ｍｇ/ｍｌ）を含んだ0.1 M 酢酸－酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH4.0）にて0.5 mg/mlとなるよう溶かした。ホウ酸カリウム溶液は、0.8M ホウ酸100mlに水酸化カリウム2.24gを加えて溶解した。p-ジメチルアミノベンズアルデヒド（p-DABA）溶液は、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド（和光純薬株式会社）5gを氷酢酸44ml、10M塩酸6mlに溶解した。使用時に、氷酢酸で10倍希釈した。
　先ず、マイクロチューブ（２ｍＬ）にサンプル溶液５０μＬを入れた。次に、ヒアルロニダーゼ酵素溶液２５μＬを入れ、３７℃で２０分間インキュベートした。さらに、酵素活性化液５０μＬを入れ、３７℃で２０分間インキュベートした。基質であるヒアルロン酸溶液１２５μＬを加え、３７℃で４０分間インキュベートした。０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液５０μＬを加え、反応を停止させた。さらに、ホウ酸カリウム溶液５０μＬを加え、沸騰水で３分間加熱し、すぐに冷水にて冷却を行った。ｐ－ＤＡＢＡ溶液１．５ｍｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。９６穴のマイクロプレートにそれぞれのサンプルを２００μＬずつ入れ、マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのヒアルロニダーゼ阻害活性を求めた。
　　[数３]
ヒアルロニダーゼ阻害活性（％）＝｛1－（A－B）／（C－D）｝×100
　上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
　それぞれのサンプルについて、ヒアルロニダーゼ阻害活性の結果を図１０ａ～１０ｆに示す。また、比較例であるクロモグリク酸ナトリウムの結果を図１１に示す。また、それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表５に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度でヒアルロニダーゼを阻害することが確認された。
（５）チロシナーゼ阻害活性の測定
上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、チロシナーゼ阻害活性を測定した。比較例として、既にチロシナーゼ阻害活性があるとして知られているアルブチンを用いた。
　基質としてL-チロシン（和光純薬株式会社）、酵素としてチロシナーゼ（マッシュルーム由来、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、水にて２ ｍＭとなるよう溶かし、メンブランフィルターにてろ過したものを用いた。チロシナーゼ酵素溶液は、チロシナーゼをリン酸緩衝溶液（0.1M Na2HPO4と0.1M NaH2PO4を用いてｐＨ６．８に調整したもの）にて０．１２５ ｍｇ／ｍｌとしたものを用いた。
　先ず、96穴のマイクロプレートに基質溶液５０μＬ、リン酸緩衝溶液９０μＬ、サンプル溶液１０μＬを入れ、３７℃で５分間プレインキュベーションを行った。次に、チロシナーゼ酵素溶液５０μＬを入れ、３７℃で１５分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのチロシナーゼ阻害活性を求めた。
　　[数３]
チロシナーゼ阻害活性（％）＝｛1－（A－B）／（C－D）｝×100
　上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
　それぞれのサンプルについて、チロシナーゼ阻害活性の結果を図１２ａ～１２ｆに示す。また、比較例であるアルブチンの結果を図１３に示す。それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表６に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度でチロシナーゼを阻害することが確認された。
（６）メラニン産生抑制作用の測定
上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、メラニン産生抑制作用について調べた。比較例として、既にメラニン産生抑制作用があるとして知られているアルブチンを用いた。
　細胞は、マウス由来のＢ１６の４Ａ５メラノーマ細胞（理化学研究所バイオリソースセンター）を用いた。培地は、Ｄ－ＭＥＭ（和光純薬株式会社）に１０％の不動化処理を行ったＦＢＳ（ウシ胎児血清、フナコシ）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（×１００、和光純薬株式会社）、１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン溶液（２００ｍＭ、和光純薬株式会社）を加えたものを用いた。洗浄液として１０％ＦＢＳを含んだＨＢＳＳ（和光純薬株式会社）を用いた。メラノーマ細胞の成長ホルモン剤として、α－ＭＳＨ（ペプチド研究所）を培地にて２０μＭとなるように溶かしたものを用いた。細胞増殖停止液として、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いた。各々のサンプルは、まずエタノールにて溶解し、培地にて適宜希釈を行った。なお、エタノールの最終濃度は、細胞の増殖に影響を与えないよう１％以下とした。
メラニン標準溶液は、市販のメラニン（シグマアルドリッチ）を１Ｍの水酸化ナトリウムに溶解して０．２ｍｇ／ｍＬの溶液を作成し、それから、１Ｍ水酸化ナトリウムにて０、０．００６２５、０．０１２５、０．０２５、０．０５、０．１ｍｇ／ｍＬの検量線用溶液を調製した。
タンパク質の測定には、ＤＣＴＭプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）を用いた。すなわち、Ａ試薬（アルカリ性酒石酸銅）、Ｂ試薬（フォーリン試薬）、Ｓ試薬を用い、Ａ’試薬は、１．５ｍＬのＡ試薬に対し、３０μＬのＳ試薬を加えたものとした。血清アルブミン溶液は、血清アルブミン（プロテインスタンダードｓｔａｎｄａｒｄII）２０ｍＬの水に溶解し（１．４１　ｍｇ／ｍＬ）、検量線用溶液を作成した。
　先ず、２４穴のウェルプレートに細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を５００μＬ播種し、３７℃、ＣＯ2濃度５％で２４時間培養を行った。２０μＭのα-ＭＳＨ２５０μＬ、サンプル溶液、比較例としてアルブチン溶液（最終濃度１ｍＭ）、培地（コントロール）をそれぞれ２５０μＬ入れ、さらに３日間培養を行った。その後、培地を捨て、ＨＢＳＳにて２回洗浄した後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液２００μＬを加えた。アルミ製プレートシールにてウェルプレートをシールし、８０℃で１時間加熱を行った。冷却後、１８０μＬずつを９６穴のマイクロプレートに入れ、マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、メラニンの検量線用溶液を９６穴のマイクロプレートに２００μＬずつ入れ、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。メラニン標準溶液の検量線から、サンプル中のメラニン濃度を算出した。
また、次のようにサンプル中のタンパク質濃度を調べた。血清アルブミン標準溶液またはサンプル溶液（必要に応じて水にて希釈）３０μＬを９６穴のマイクロプレートに入れ、Ａ’試薬１５μＬを入れてよく混ぜた。Ｂ試薬１２０μＬを加えて、直ちによく混ぜ、１５分放置した。マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。血清アルブミン標準溶液の検量線から、サンプル中のタンパク質濃度を算出した。さらに、以下の式にそれぞれのメラニン濃度、タンパク質濃度を入れ、サンプルに含まれるタンパク質１ｍｇあたりのメラニン含量比を求めた。
　　[数３]
メラニン含量比（％）＝｛（Ａ／Ｂ）／（Ｃ／Ｄ）｝×１００
　上記の式において、ＡおよびＢはサンプルのメラニン濃度（ｍｇ／ｍＬ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＣおよびＤはコントロールのメラニン濃度（ｍｇ／ｍＬ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。
　それぞれのサンプルについて、メラニン産生抑制作用の結果を図１４ａ～１４ｆに示す。それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表７に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度でメラニンを阻害することが確認された。
（７）抗酸化活性の測定
上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いた抗酸化活性を評価した。比較例として、既に抗酸化活性があるとして知られているアスコルビン酸を用いた。
　ＤＰＰＨ溶液は、ＤＰＰＨ（シグマアルドリッチ）をエタノールにて４００μＭとしたものを用いた。ＤＰＰＨ混液は、ＤＰＰＨ溶液：０．１ＭのＭＥＳ-ＮａＯＨ緩衝溶液（ｐＨ６）：エタノール＝１０：５：１０の割合で混ぜたものを用いた。トロロックス標準溶液は、80％エタノールにてトロロックス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を溶解し、２００μＭとしたものを用いた。このトロロックス標準溶液を用いて、８０％エタノールにて０、５０、１００、１５０、２００μＭに調製したものを検量線用のトロロックス標準溶液とした。
　先ず、サンプル溶液またはトロロックス標準溶液５０μＬを各々９６穴のマイクロプレートに入れ、ＤＰＰＨ混液１５０μＬを加え、静かに振とうした。室温（２５℃）、暗所にて２０分間放置後、マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの値を入れ、１μmolのトロロックス（ＴＥ）に相当するＤＰＰＨラジカル捕捉能を「ＤＰＰＨ単位（μmolＴＥ／g）」として表した。また、サンプル１μmolあたりのＤＰＰＨ単位（μmol ＴＥ／μmol）も求めた。
ＤＰＰＨ単位（μmol ＴＥ／g）＝ｘ×Ａ／１０００×１／ｗ×１０００×希釈倍率
　上記の式においてx：検量線からのモル濃度（μM）、w：サンプルの採取量（mg）、A：サンプルを抽出した時の容量(ml)を示す。
　それぞれのサンプルおよび比較例であるアスコルビン酸について、抗酸化活性の結果を表８に示す。なお、以下の表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μmol TE/μmol単位での値は省略されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度で高い抗酸化活性を発揮することが確認された。
（８）ヒシ実とヒシ果皮との比較
　上述したように、ヒシ果皮を抽出して得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインを有効成分とする粗ポリフェノール抽出物は、優れたコラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼに対する阻害活性、さらに付随してメラニン産生抑制作用および抗酸化作用が確認された。これは、ヒシ果皮に、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインが豊富に含まれていることが要因と考えられる。これらのうちヒシ果皮中のトラパイン、オイゲニイン、テトラ-ＧＧの含有量を測定した。
　さらに、比較例として、従来から一部の酵素活性阻害剤として知られているヒシ実に対して、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼに対する阻害活性を確認した。確認手法としては、ヒシ実における上記有効成分トラパイン、オイゲニイン、およびテトラ-ＧＧの含有量を測定し、これらの有効成分がどの程度含有されているかによって、コラゲナーゼ阻害活性およびエラスターゼ阻害活性を確認した。得られた結果を、以下の表に示すと共に、比較例であるオニビシの実を原料とする抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーの結果を図９に示す。
　なお、ヒシは天然物であるため、そのポリフェノール含量は、採取時期や保存状態に依存して多少変動する。そのため、以下表の各サンプルでは、同時期に採取されたワビシを用いて、同じ保存状態のもとで測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　得られた結果から、図９では、図３や図４で現れたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインのピークが、現れていないことからも、比較例のヒシ実に係る抽出物は、上記３つの有効成分を含有しない溶液であることが確認された。また、ヒシ実を覆う薄皮である実皮をヒシ実に含めて使ったとしても、非常に薄皮であることから、量的にはヒシ実に対して無視できる程度の微量であり、実用上は、ヒシ実における実皮の寄与分は無視されるものとなる。従って、比較例に係る抽出物では、コラゲナーゼ阻害活性およびエラスターゼ阻害活性は得られないことが確認された。
　以上の結果から、本実施例に係るヒシの果皮抽出物は、従来の比較例に比べて高いコラゲナーゼ阻害活性およびエラスターゼ阻害活性を示した。このような結果から、本実施例に係るヒシの果皮抽出物は、コラーゲンおよびエラスチンの分解や変性を抑制できることから、例えば、機能性食品（例えば、健康補助食品、栄養機能食品など）、化粧品、ヘルスケア商品（健康の維持や増進を促進するための商品を指し、例えば、栄養ドリンク剤や肌に潤いを与えるパックなどが挙げられる）などに含有させることによって、さらには、薬剤の形態として、経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、または点眼剤として用いられることによって、健康で張りのある肌を得ることや維持することが可能となる。
１　実
２　実皮
３　内層皮
４　表皮

Claims (9)

  1. 　以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （但し、Ｘ１～Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１～Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （但し、ｍは、１～３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）
    　コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害することを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  2. 　請求項１に記載の酵素活性阻害剤において、
    　前記有効成分が、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパイン、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  3. 　請求項１に記載の酵素活性阻害剤において、
    　前記有効成分が、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、ＣＨ－ｄｉ－ＧＧ、およびＤＢＴＧ、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つであり、
    　ヒアルロニダーゼまたはチロシナーゼの酵素活性を阻害することを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、
    　前記有効成分が、菱科植物の果皮を抽出および／または粉砕して得られたものであることを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  5. 　請求項４に記載の酵素活性阻害剤において、
    　少なくとも１つの前記有効成分を含有し、さらに／または、前記有効成分に相当する成分を含有し、さらに／または、前記有効成分と同等の物質を含有することを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  6. 　菱科植物の果皮の抽出物および／または粉砕物を有効成分として含有する酵素活性阻害剤であって、当該酵素が、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼであることを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  7. 　請求項６に記載の酵素活性阻害剤において、
    　前記酵素が、コラゲナーゼまたはエラスターゼであることを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  8. 　請求項１～請求項７のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、
    　菱科植物が、ワビシ（Ｔｒａｐａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ　ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ　ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、およびヒメビシ（Ｔｒａｐａ　ｉｎｃｉｓａ）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
  9. 　請求項１～請求項８のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、
    　経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、および点眼剤からなる群から選択される薬剤として、または、機能性食品、化粧品、およびヘルスケア商品からなる群から選択される形態として用いられることを特徴とする
    　酵素活性阻害剤。
     
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