KR20060020774A

KR20060020774A - 백렴 추출물을 함유 하는 노화방지 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20060020774A
Application number: KR1020040069430A
Authority: KR
Inventors: 조영호; 심관섭; 김진희; 박성민; 이범천; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2004-09-01
Filing date: 2004-09-01
Publication date: 2006-03-07
Also published as: KR100588830B1

Abstract

본 발명은 백렴으로부터 유효 활성성분을 추출·정제하는 방법과 그 추출물 또는 이로부터 분리된 유효 활성성분을 함유하는 피부 화장료에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 백렴으로부터 얻은 에탄올 추출물은 탁월한 자유 라디칼 소거효과 및 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현 저해효과와 콜라겐 합성 촉진효과를 가지고, 특히 이 원료가 함유하는 유효 활성성분은 1,2,4,6-테트라갈로일베타디글루코피라노스(1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-beta-D-glucopyranose)이며, 이 물질을 이용하여 피부 노화 예방 및 주름 개선 효과가 우수한 각종 기능성 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

백렴, MELOTHRIA HETEROPHYLLA, 추출물, 자유 라디칼, 주름개선, 화장료.

Description

백렴 추출물을 함유 하는 노화방지 화장료 조성물{A COSMETIC COMPOSITION FOR ANTI-AGING CONTAINING AN EXTRACT OF MELOTHRIA HETEROPHYLLA}

본 발명은 백렴의 추출물을 함유하는 화장료에 관한 것으로서, 상세하게는 피부 주름 예방 및 개선효과가 우수한 백렴으로부터 유효 활성성분을 추출·정제하는 방법과 그 추출물 또는 이로부터 분리된 유효 활성성분을 함유하는 피부 화장료에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 끊임없이 변화하게 된다. 피부 노화는 크게 자연 노화(혹은 내인성 노화)와 외적 노화로 구분되며(EB Doris, Cosmetics & Toiletories, 1996; 111:31-37), 자연 노화(내인성 노화)는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적인 노화현상이 바로 주름 형성이다(HW Daniell, Ann Intern Med, 1971; 75(6):873-880; GL Grove et al., J Am Acad Dermatol, 1989; 21(3):631-637; CE Griffiths et al., Arch Dermatol, 1992; 128: 347-351).

자외선에 의해 야기되는 광노화 메카니즘 중의 하나는 자유 라디칼 경로를 경유하는 것이다(D Harman, J Gerontol, 1956; 11(3):298-300). 자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합조직형성 파괴, 세포막 기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 세포간 에너지 전이, 신진대사와 관련된 분자들의 변형 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(RM Lavker and AM Kligman, J Invest Dermatol, 1988; 90: 325-330). 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화 시키는 항산화제 또는 여러 가지 화학적 소거제들을 사용하여 노화과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 'MMP'라 칭함), 특히 콜라게나제(collagenase, 이하 'MMP-1'이라 칭함)와 젤라티나제(gelatinase, 이하 'MMP-2'라 칭함)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사와 자유 라디칼에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.

MMP는 그 기질특이성에 따라 3 그룹으로 크게 분류되는데, 그룹 I에는 간질 콜라게나제(interstitial collagenase(MMP-1))와 호중구 콜라게나제(neutrophil collagenase(MMP-8))가 속하며 기질로는 콜라겐 타입 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅶ,Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(gelatinase)의 작용이 용이하게 한다. 그룹 II에는 타입 IV 콜라게네이즈인 72kd 젤라티네이즈(MMP-2)와 92kd 젤라티네이즈(MMP-9)가 속하며 기질로는 젤라틴, 콜라 겐 타입 Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ, 엘라스틴 및 파이브로넥틴 등을 분해한다. 그룹 III에는 스트로멜리신-1(stromelysin-1(MMP-3)), 스트로멜리신-2(stromelysin-2(MMP-10), 마트리리신(matrylysin(MMP-7) 등이 속하며 기질로는 젤라틴, 프로테오글리칸, 파이브로넥틴, 라미닌 및 엘라스틴 등을 분해한다.

호중구 및 다형핵성 백혈구의 MMP는 산화과정에 의하여 일차적으로 활성화되는데 그 과정은 먼저 세포 내에서 과산화수소가 발생되면 염소이온의 존재 하에서 미엘로페록시다제(Myeloperoxidase)에 의하여 차아염소산으로 전환되고 이것이 MMP를 활성화시킨다(S Kondo, J Dermatol Sci, 2000; 23(1):S30-S36).

지금까지는 자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있었으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 거칠음 및 잔주름의 완화에 효과가 있다고 보고된 이래(JS Weiss et al., J Am Acad Dermatol, 1988; 19(1):169-175), 전 세계적으로 피부 노화를 억제 혹은 개선시키는 물질을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C, E 등 비타민류의 유도체 및 AHA(alpha -hydroxy acid)는 현재까지 알려진 대표적인 피부 노화 개선 물질이다(DS Rosenthal et al., J Invest Dermatol, 1990; 95:510-515, CM Ditre et al., J Am Acad Dermatol, 1996; 34(2):187-195). 하지만, 이들은 자연환경에서 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 혹은 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는데 문제가 있다. 따라서 생체에 안전하고 자유 라디칼의 소거능 및 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현 저해능과 콜라겐 합성능이 우수한 새로운 피부 주름 개선 물질의 개발이 절실히 요망되 고 있다.

본 발명은 이상과 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 여러 가지 생약들 중 백렴을 선택하여, 이의 화장품 원료로서의 효능을 확인하고 그 사용방법을 개발함으로써, 다양한 화장품의 원료의 선택범위를 높이고, 또한 이 원료를 사용하여 좀더 자극이 없으면서도 소정의 기능성 효과를 나타내는 화장품을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 항산화효과, 콜라겐 합성 촉진효과, 콜라게나제(MMP-1)에 작용하여 피부 잔주름 방지효과 등 우수한 주름개선 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 백렴 추출물을 제조할 때 특정 추출용매 선택시 목적 효능이 더욱 크게 나타난 점으로부터 화장품 원료로서의 유효 활성성분이 무엇인지를 밝혀내고, 이 성분의 분리방법, 이 성분을 이용하여 화장료를 제조하는 방법 및 그 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 천연에서 자생하는 식물들을 대상으로 우수한 자유 라디칼 소거효과 및 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현 저해효과와 콜라겐 합성 촉진효과가 우수한 소재를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 백렴에 매우 강력한 자유 라디칼 소거효과 및 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현 저해효과와 콜라겐 합성 촉진효과가 있음을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 사용되는 백렴은 박과 식물인 Melothria heterophylla (Lour.) Cogn.의 괴근(塊根)으로 다년생 덩굴성 초본이다. 분지하지 않는 덩굴손이 있으며 뿌리부분은 팽대되어 방추형(紡錘形)의 괴근을 이룬다. 잎은 단엽(單葉)으로 어긋나며 가늘고 긴 잎자루가 있고 변이가 많아서 3갈래로 얕게 갈라지거나 3~5갈래로 깊게 갈라지며 보다 더 갈라지기도 하고 가운데 열편(裂片)은 길고 크며, 엽저는 다극형(多戟形)이다. 꽃은 단성동주로 단생하거나 여러 송이가 엽액에서 모여서 나고, 꽃자루는 가늘고 길며 선상(線狀)이고, 화관(花冠)은 백색으로 삼각(三角)의 종모양이며 5갈래로 깊게 갈라지고, 수꽃에는 3개의 수술이 있고, 암꽃의 자방은 하위자방이다. 열매는 대부분이 긴 원형이고 길이는 2~4㎝이다. 북한의 황해도 이북 및 중국의 여러 지역에서 분포하며, 한방에서는 가을에 뿌리를 캐내어 깨끗이 씻어 신선한 것을 사용하거나 햇볕에 말린 것을 사용하며, 인후종통, 결막염, 임파선결핵, 고환염, 피부습진 등에 처방한다. 백렴의 성분으로는 리그노세릭산(lignoceric acid), 트리코사노익산(tricosanoic acid), 칼레바신 B(calebassine B), 시트룰린(citrulline), 아르기닌(arginine), 글루탐산(glutamic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 옥타코사노익산(octacosanoic acid) 등이 분리된 바 있다(중화본초, 상해과학기술출판사, 1999).

이러한 백렴에 관한 특허로는 일본 특개평10-114670과 일본 특개평9-315398에서 Melathria 속 식물(Melothria indica, M. heterophylla, M. japonica)추출물에 시판되는 티로시나제 활성 저해제, 활성산소 소거제, 항산화제, 세포부활제, 항염증제, 보습제로부터 선택되어진 약효제 1종 또는 2종 이상을 첨가하여 나타나는 미 백효과 및 Melothria 속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 화장료에 대하여 보고한 바 있으나, 본 발명의 항산화 작용 및 콜라게나제의 활성 및 발현 저해 작용과 콜라겐 합성 촉진을 통한 피부 주름 개선 및 예방과는 전혀 관계가 없다.

본 발명은 백렴을 에탄올 40~95 중량% 함유 수용액을 추출용매로 추출하여 얻은 것으로서 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-beta-D- glucopyranose를 0.0001~2.0 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 백렴 추출물을 제공한다.

본 발명은 또한, (1) 백렴을 70~85℃에서 에탄올 40~95 중량% 함유 수용액으로 추출하는 단계와, (2) 상기 추출 단계에서 얻어진 여액을 50℃이하에서 감압농축하는 단계와, (3) 감압 농축물을 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 수포화부탄올로 용매 분획하는 단계와, (4) 메탄올(중량% 비율 - 40 내지 100)을 이동상으로 하는 세파덱스 엘에취-20(Sephadex LH-20) 칼럼 크로마토그래피에 의해 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 유효 활성성분인 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-beta- D-glucopyranose를 함유하는 에탄올 추출물을 분리·정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백렴 추출물 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기 추출물을 피막 형성제와 혼합하여 스프레이 드라이어로 파우더화한 것을 특징으로 하는 백렴 추출물 파우더를 제공한다.

또한, 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-beta-D-glucopyranose는 백렴 외에 동일 성분이 많이 포함되어 있는 가회톱 (Ampelopsis japonica), 백하수오(Cynanchum auriculatum Royle), 큰조롱(Cynanchum wilfordi (Max.) Hemsl), 산수유(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.), 석류(Punica granatum L.), 백교(Liquidambar formosana Hance), Melothria indica, Melothria japonica, Ampelopsis serianaefolia Bunge, Ampelopsis aconirifolia Bunge로 이루어진 군으로부터도 추출할 수 있다.

본 발명은 백렴 추출물을 함유하는 항산화 효과 및 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현 저해와 콜라겐 합성 촉진을 통한 피부 주름 개선 및 노화 예방용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 백렴을 40 ~ 95중량% 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-beta-D-glucopyranose를 유효 활성성분으로 하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 함유되는 백렴 추출물의 함량은 0.0001 내지 20 중량%의 양으로 포함되는 것이 바람직하다. 백렴 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 피부주름 개선 효과가 미미하며, 20 중량%를 초과할 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대가 미미하여 경제적이지 못하기 때문이다.

상기 유효 활성성분은 상기의 백렴 추출물의 형태 또는 백렴 추출물 파우더 형태로 함유된다.

나아가 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어 진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나의 제형임을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 백렴 추출물 제조

세절하여 양건한 백렴 450g을 뜨거운(hot) 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 3시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조한 후 81.5g의 에탄올 추출물을 얻었다. 감압 농축물 및 동결 건조물이 0.0001 ~ 20.0 중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 백렴 추출물을 제조하였다. 또한 상기 감압 농축물 및 동결 건조물이 0.0001 ~ 20.0 중량% 함유되게 에탄올 수용액에 녹인 다음 피막 형성제인 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 결정성 셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스, 락토오스, 글루코스, 갈락토스, HP-β-시클로덱스테린 등과 혼합하여 스프레이 드라이어로 파우더화 하였다.

실시예 2: 백렴 추출물로부터 유효 활성성분 분리 및 구조 확인

감압 건조된 백렴 추출물을 물에 분산시킨 후 n-헥산으로 3회 분배 추출하여 n-헥산 분획을 얻고, 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 탈 수한 후, 감압 농축하여 5.8g의 분획물을 얻었다. 남은 물층에 대하여 디클로로메탄과 에틸아세테이트, 수포화 부탄올 등을 이용하여 n-헥산 분획과 같은 방법으로 탈수, 농축하여 각각 0.8g, 10.7g, 16.3g의 분획물을 얻었다. 각 분획물에 대하여 실시예 3 내지 4의 실험을 통해 항산화 효과가 우수한 에틸아세테이트 분획물을 세파덱스 엘에취-20 칼럼 크로마토그래피에 의해 메탄올(40 중량%)을 이동상으로 하여 용리하였다. 그 후 최종 물질들이 분리 용출될 때까지 메탄올의 비율을 조금씩 증가시켜 가면서 기울기 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 20개의 분획을 얻었다(Fr. 1 ~ Fr. 20). 20개의 분획에 대하여 실시예 3 내지 4의 실험을 통해 항산화 효과가 우수한 6개의 분획을 선별하였다(Fr. 10, 12, 14, 15, 18, 19). 선별된 6개의 분획 중 항산화 효과가 가장 우수한 것으로 나타난 분획 15를 에틸아세테이트를 이용하여 재결정하였다. 재결정 화합물에 대하여 얇은막 크로마토그래피를 통해 정성적인 순도 확인 후, UV-VIS 및 ¹H-NMR, ¹³C, NMR, MS 스펙트럼 분석을 통해 구조를 확인하였다.

분리된 화합물의 물리화학적 성질과 여러 가지 분광법을 이용하여 분석한 백렴 추출물의 유효 활성성분의 구조는 다음과 같다.

분획 15 물질은 갈색의 무정형 분말로 분리되었으며, FeCl₃ 양성 반응을 나타내어 phenol성 OH group의 존재를 예측하였으며, 217 ㎚와 277.1 ㎚에서 UV 흡수를 보여 galloyl glucoside류의 일종으로 추정하였다(BS Min et al., Arch Pharm Res, 2002; 24(4):441-445). ¹³C-NMR(125MHz, Acetone-d ₆ ) 분석결과 65.67 ~ 74.7 ppm 사이에 5개의 aromatic carbon peak가 관측되고 102.93 ppm에서 1개의 peak, ¹H-NMR(500MHz, Acetone-d ₆ ) 분석 결과 나타난 4.47 ~ 4.67 ppm의 splitting pattern으로부터 구성당으로 glucopyranose를 함유하고 있을 것으로 추정할 수 있었다. 7.28 ~ 7.32 ppm 에서 보이는 4개의 singlet은 각각 galloyl기의 대칭성 2'번과 6'번 수소가 중첩되어 나타난 것으로 모두 4개의 peak가 관측되어 4개의 galloyl기가 있음을 추정할 수 있었다. 또한 ¹³C-NMR spectrum의 110.42~167.32 ppm 사이에 나타난 carbon peak들은 전형적인 gallic acid의 peak들로서 유사한 chemical shift 수치를 갖는 signal들이 4쌍씩 존재하는 것으로 볼 때 4개의 galloyl group을 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 데이터 분석과 기 보고된 Tanaka 등(T Tanaka et al., Phytochemistry, 1985; 24(9);2075)의 결과와 비교하여 분획 15를 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-gluco- pyranose(M.W 788.6, 녹는점 211~213℃)로 동정하였다.

상기 실시예 2는 백렴 추출물의 분획 중 본 발명자들이 요구하는 소정의 효과, 즉 자유 라디칼 소거효과, 콜라겐 합성 촉진효과, 콜라게나제 (MMP-1)의 활성 및 발현 억제 효과 등의 피부 주름 개선효과와 피부자극 완화효과가 우수한 분획만을 골라내는 방법으로 그 유효 활성물질을 추적한 것으로, 이 연구 결과 상기 효과를 나타내는 유효 활성물질이 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose임을 밝 힌 점에 의의가 있다.

실시예 3: DPPH 라디칼을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 물질의 항산화 효과를 측정하기 위하여 Yoshida 등(1989)이 사용한 방법을 약간 변형하여 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 소거 효과를 측정하였다. DPPH는 안정한 자유 라디칼로서 보라색을 나타내므로, 시료가 라디칼을 소거함에 따라 보라색이 제거되는 정도를 측정하는 것이다.

먼저, DPPH를 1×10^-4M 농도로 메탄올에 녹여, 이 용액 0.15㎖를 시험관에 넣었다. 여기에 각 농도의 시료 0.15㎖을 넣고, 상온에서 20분간 반응 후 565㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차 추출물, 비타민 C 를 사용하였다. 각 시료의 자유 라디칼 소거효과는 수학식 1을 이용하여 라디칼을 50% 소거하는 농도를 구하여 SC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 액의 반응 흡광도로 하였다.

자유 라디칼 소거율(%) = [(대조군의 흡광도-각 시료의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100

백렴 추출물의 자유 라디칼 소거효과

실험물질	SC₅₀(㎍/㎖)
실시예 1	13
실시예 2	3.1
녹차 추출물	400
비타민 C	10.6

표 1에서 나타난 바와 같이 본 발명의 백렴 추출물과 유효 활성성분인 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose는 강력한 항산화제인 비타민 C 및 녹차 추출물과 비교할 때, 백렴 추출물은 같은 추출물 형태인 녹차 추출물에 비해 30배, 유효 활성성분은 단일 성분인 비타민 C에 비해 3배 정도의 매우 강력한 활성을 나타내었다.

실시예 4: 활성산소 라디칼을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 물질의 항산화 효과를 측정하기 위하여 Furuno 등(2002)이 사용한 방법을 약간 변형하여 크산틴-크산틴옥시다제 시스템(xanthine-xanthine oxidase system)에 의해 생성된 활성산소 라디칼(superoxide radical)에 대한 소거 효과를 측정하였다. 크산틴과 크산틴옥시다제 반응에 의해 생성되는 활성산소는 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 청색을 나타내므로, 시료가 활성산소를 소거함에 따라 줄어든 청색의 진하기 정도를 측정하는 것이다.

먼저, 각 농도별 시료에 3×10^-3M xanthine, 3×10^-4M EDTA, 7.5×10^-4M nitroblue tetrazolium(NBT), 0.15㎎/㎖의 BSA(bovine serum albumin) 용액을 각각 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 10분간 반응하였다. 그 후 각 시험관에 크산틴옥 시다제(0.25U/㎖) 용액을 첨가하여 상온에서 20분간 반응한 다음, 565㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차 추출물, BHA를 사용하였다. 각 시료의 활성산소 라디칼 소거효과는 수학식 2를 이용하여 라디칼을 50% 소거하는 농도를 구하여 SC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 액의 반응 흡광도로 하였다.

활성산소 라디칼 소거율(%) = [(대조군의 흡광도-각 시료의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100

백렴 추출물의 활성산소 라디칼 소거효과

실험물질	SC₅₀(㎍/㎖)
실시예 1	20
실시예 2	3.4
녹차 추출물	340
BHA	32.4

표 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 백렴 추출물과 유효 활성성분인 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose는 강력한 항산화제인 BHA 및 녹차 추출물과 비교할 때, 백렴 추출물은 같은 추출물 형태인 녹차 추출물에 비해 17배, 유효 활성성분은 단일 성분인 BHA에 비해 9배 정도의 매우 강력한 활성을 나타내었다.

실시예 5: 콜라겐 합성 촉진효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 시료들의 콜라겐 합성 촉진효과를 관찰하기 위해 인간으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 처리하여 실험을 실시하였다.

96공 평판배양기(96-well plate)에 2.5% 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지와 인간의 섬유아세포(5000세포/well)를 넣고, 70-80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음 시료를 각각 농도별로 1일 처리 후 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Catalog N. : MK 101, Takara Shuzo Co. Ltd, 일본)를 이용하여 콜라겐 합성량을 측정하였다.

측정 방법은 우선 1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포된 96공 평판배양기에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96공 평판배양기에 넣고 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색 유발물질을 넣어 실온에서 발색시키고, 1M 황산을 넣어 발색을 중지시켰다. 반응색의 색깔은 노란색을 띠며, 반응의 정도에 따라 진하기가 달라진다. 노란색을 띤 96공 평판배양기를 흡광광도계를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하고, 아래 수학식 3에 의해 콜라겐 합성 정도를 계산하였다. 이때 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

콜라겐 합성효과(%) = [(대조군의 반응 흡광도-시료의 세포 배양액의 반응 흡광도)/대조군의 반응 흡광도]×100

백렴 추출물의 콜라겐 합성 촉진효과

실험물질(㎍/㎖)		콜라겐 합성효과(%)
실시예 1	100	80
실시예 1	10	52
실시예 2	10	60
실시예 2	1	40

표 3에서 나타난 바와 같이 본 발명의 백렴 추출물과 유효 활성성분인 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose는 우수한 콜라겐 합성 촉진효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 측정 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 시료들의 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 효과를 관찰하기 위해 시험관내에서 스크리닝 타입의 생화학적 모델에서 측정하였는데 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접합된 콜라겐의 이용을 기초로 한다(EnzChek, 콜라게나제 키트, 몰큘라프루브, 미국).

먼저, 반응 완충액(0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.02mM NaN₃, pH7.3) 100㎕에 0.25㎎/㎖의 DQ 콜라겐 용해액 20㎕와 농도별 시료를 40㎕씩 첨가한 다음, 0.5 Unit의 콜라게나제 40㎕와 잘 혼합하여 암소, 상온에서 20분간 반응하였다. 그 후 형광 분광광도계를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚에서 형광값을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차 추출물을 사용하였다. 각 시료의 콜라게나제의 활성 저해효과는 수학식 4를 이용하여 효소활성 을 50% 소거하는 농도를 구하여 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 액의 형광값으로 하였다.

콜라게나제(MMP-1) 활성 저해효과(%) = [(대조군의 반응 형광값-시료의 반응 형광값)/대조군의 반응 형광값]×100

백렴 추출물의 콜라게나제의 활성 저해효과

실험물질	IC₅₀(㎍/㎖)
실시예 1	100
실시예 2	10
녹차 추출물	200

표 4에서 나타난 바와 같이 본 발명의 백렴 추출물과 유효 활성성분인 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose는 강력한 콜라게나제 활성 저해제인 녹차 추출물과 비교할 때 매우 강력한 저해활성을 나타내었다.

실시예 7: 콜라게나제(MMP-1)의 발현 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 시료의 UVA 조사에 의해 발현이 증가되는 콜라게나제의 발현 억제효과를 Petersen 등(1992)이 사용한 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)를 약간 변형하여 실시하였다.

먼저, 자외선 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/cm²의 에너지로 조사한 후 시료가 첨가된 배지로 교환하여 24시간 배양한 다음 배지를 회수하 여 96공 평판배양기에 코팅하였다. 일차 항체 (MMP-1 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 90분 반응시킨 다음, 3% BSA를 1시간 처리하여 결합되지 않은 부위를 블로킹하였다. 이차 항체인 항마우스 이뮤노글로불린 지(anti-mouse IgG, Whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 90분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 ㎎/㎖ p-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 첨가하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 흡광광도계를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아래 수학식 5에 의해 MMP-1 활성 저해 정도를 계산하였다. 이때 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

MMP-1 발현 억제율(%) = [(대조군의 반응 흡광도-시료의 세포 배양액의 반응 흡광도)/대조군의 반응 흡광도]×100

백렴 추출물의 콜라게나제 발현 억제 효과

실험물질(㎍/㎖)		발현 억제율(%)
실시예 1	100	78.3
실시예 2	5	45
녹차 추출물	100	75

표 5에서 나타난 바와 같이 본 발명의 백렴 추출물과 유효 활성성분인 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose는 녹차 추출물과 비슷하거나 매우 강력하게 콜라게나제의 발현을 저해하는 것으로 나타났다.

실시예 8: 세포 배양기술을 이용한 자극완화 효과 평가

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 시료의 자극완화 효과를 평가하기 위하여 세포 배양 기술을 이용하여 피부 자극을 유발하는 물질인 소듐라우릴썰페이트(Sodium Lauryl Sulfate:SLS)에 의한 세포 사멸을 저해시키는 정도로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

SLS는 화장품 기재의 피부 자극 평가의 기준이 되는 물질로 세포막에 결합되어 세포대사 억제와 세포막을 파괴하여 피부자극을 유발하는 물질이다. 본 실시예는 사람 섬유아세포에 SLS와 시료를 동시에 첨가하였을 때 SLS에 의한 세포 사멸을 감소시키는 효과를 평가한 것이다. 본 실시예에 사용된 Hs68 섬유아세포는 사람의 피부 진피세포로 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 1635)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양기술을 이용한 자극완화 평가 실험은 다음과 같이 행하였다.

먼저, 사람 유래의 섬유아세포를 96공 평판배양기에 각 웰당 1×10⁵농도로 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 0.01% SLS 단독, 0.01% SLS와 시료(0.01%)을 동시에 처리하고 24시간 동안 추가배양 하였다. 배양 후 MTT(Sigma 사) 시약을 첨가하고 4시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 1 N NaOH/이소프로판올 용액을 첨가하여 20분간 교반한 후 흡광광도계로 565㎚에서 흡광도를 측정하여 시료의 SLS에 의한 세포사멸을 저해하는 효과를 측정하였다.

세포배양기술을 이용한 자극완화 효과

실험물질(㎍/㎖)	섬유아세포 생존율(%)
실시예 1(100) + SLS(100)	65
실시예 2(100) + SLS(100)	60
SLS(100)	23

표 6에 나타난 바와 같이 백렴 추출물은 SLS에 의해서 유발되는 세포사멸을 억제시킴으로써 화장료 기재와 함께 처방하였을 때 화장료 기재로 일어날 수 있는 피부 자극을 감소시키는 자극완화 물질임이 밝혀졌다.

실시예 9 내지 11 및 비교예 : 피부 주름 개선 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 백렴 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 잔주름 개선효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 7에 나타낸 바와 같다. 우선 표 7에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 9 내지 11, 비교예 1)을 제조한다.

원료		실시예			비교예 1
원료		9	10	11	비교예 1
가	스테아릴알콜	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2
	스테아린산콜레스테롤	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가) 알콜에스테르	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2	2	2
나	백렴 추출물	10	1	0.1	-
	프로필렌글리콜	5	5	5	5
	정제수	적량	적량	적량	적량

주) 단위 : 중량%

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 9 내지 11에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 잔주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치(SV600, C+K, 독일)와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교하였다.

백렴 추출물의 피부 주름 개선 효과

평가 항목	실시예 10		비교예 1
	사용전	2개월후	사용전	2개월후
평균 잔주름 깊이	0.201	0.150	0.200	0.196
사용전 대비 주름 감소율(%)	25.4%		2.0%

표 8은 실시예 9 내지 11에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름 감소율을 비교예 1의 크림을 사용한 실험자와 비교한 것이다. 표 8에서 나타난 바와 같이 백렴 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 눈주위 피부에서 피부 잔주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

실시예 12: 백렴 추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 백렴 추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가한 것이다. 본 평가는 실시예 8에서 얻어진 결과를 인체에 직접 적용하여 얻어진 평가의 결과이다. 일반적 화장품 처방 (크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate)와 실시예 9 내지 11에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박부위에 FINN CHAMBER (FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.2㎎씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 백렴 추출물을 함유하는 제품을 첩포하고 24시간, 48시간, 72 시간 경과 후에도 아무런 피부 발적을 일으키지 않았다.

이 평가의 결과는 백렴 추출물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유익한 효과가 있음을 나타낸다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 본 발명의 백렴 추출물 및 이를 함유하는 조성물은 앞에서와 같이 자극완화효과, 주름 개선효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 13: 백렴 추출물을 함유한 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 폴리올알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지 제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 백렴 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부 개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 14: 백렴 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸 알콜(setyl alcohol) 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아리에트 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합 용해하고, 실시예 1에서 수득한 백렴 추출물 0.05g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열하여 가열용해 시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수/유중계형의 피부 개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 15: 백렴 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에스텔에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 백렴 추출물 각 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부 개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 백렴 추출물은 자유 라디칼 소거효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 콜라게나제 (MMP-1)의 활성 및 발현 억제 등의 피부 주름 개선 효과가 우수하고, 화장품 기재에 의해 야기되는 피부 자극을 감소시키는 피부세포사멸 억제효과와 피부자극 완화효과가 우수하다.

또한 본 발명에 따른 백렴 추출물 또는 이로부터 분리된 유효 활성성분을 함유한 화장료 조성물은 사람에게 사용하였을 경우, 효과뿐만 아니라 안전성 면에서도 우수한 피부 화장료의 성분으로서 적용이 가능하다.

따라서, 본 발명은 상기의 효능을 갖는 백렴 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩 등의 화장료 조성물을 제조하여 피부 주름 개선효과와 자극 완화효과가 있는 기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

Claims

에탄올 40 ~ 95 중량% 함유 수용액을 추출용매로 추출하여 얻은 것으로서 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose를 0.0001 - 2.0 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 백렴 추출물.
(1) 백렴을 70 - 85℃에서 에탄올 40 ~ 95 중량% 함유 수용액으로 추출하는 단계와;

(2) 상기 추출단계에서 얻어진 여액을 50℃이하에서 감압농축하는 단계와;

(3) 감압 농축물을 n-헥산, 디클로메탄, 에틸아세테이트 및 수포화부탄올로 용매 분획하는 단계; 및

(4) 중량% 비율이 40 내지 100인 메탄올을 이동상으로 하는 세파덱스 엘에취-20(Sephadex LH-20) 칼럼 크로마토그래피에 의해 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 유효 활성성분인 1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose를 함유하는 에탄올 추출물을 분리?정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백렴 추출물 제조방법.
제 1항의 백렴 추출물을 피막 형성제와 혼합하여 스프레이 드라이어로 파우더화한 것을 특징으로 하는 백렴 추출물 파우더.
1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose를 유효 활성성분으로 하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,

피부 노화 방지용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,

피부 자극완화용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,

상기 유효 활성성분은 상기 제 1항의 백렴 추출물의 형태로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,

상기 유효 활성성분은 상기 제 3항의 백렴 추출물 파우더 형태로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 4항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유 중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.