CN102793761B - 一种白头翁提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种白头翁提取物及其制备方法和应用。所述的白头翁提取物包含齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷2-10重量％、常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷10-40重量%、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷5-30重量%和齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷5-30重量%，并且所述提取物的总皂苷大于65%。该白头翁提取物提高了白头翁提取物中活性成分的含量，同时减少了提取物中的杂质，从而增加了白头翁提取物的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域，特别是涉及一种白头翁提取物、其制备方法和应用，以及从白头翁提取的皂苷类化合物，该白头翁提取物可用于治疗癌症。
背景技术
中药白头翁是毛茛科（Ranunculaceae）白头翁属植物白头翁（Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel）的根，具有清热解毒、凉血止痢的功效。白头翁的主要药理活性包括抗菌作用、抗阿米巴原虫作用、抗其它病原体作用、抗癌作用、杀精子作用和镇静镇痛作用。白头翁的主要有效成分包括白头翁素和白头翁皂苷等，其中白头翁皂苷可通过水提或醇提得到。现代药理研究发现，白头翁皂苷具有增强免疫功能、抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用，因此受到广泛的研究和关注。
中国专利ZL03178797.5公开了一种含有常春藤配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]- α-L-吡喃阿糖糖苷的白头翁根浸膏，其制备方法是用乙醇水溶液提取白头翁根，并且通过向其中加入丙酮形成沉淀而获得水溶性级分得到白头翁根浸膏，白头翁浸膏再通过葡聚糖凝胶Sephedex LH20和HPLC制备得到常春藤配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]- α-L-吡喃阿糖糖苷。所得的白头翁根浸膏可用于制备治疗实体瘤的药物。该专利虽然制备得到能治疗实体瘤的白头翁根浸膏，并鉴定出其中的活性成分之一，但是，通过我们的研究已知，该白头翁根浸膏中活性成分含量较低，对实体瘤的治疗效果有限。同时，该工艺使用了丙酮，不适于工业化生产。
文献“王先芳等，白头翁醇提物的抗肿瘤作用，浙江医科大学学报，1998，27(5)：204-206”和文献“钟邱等，白头翁中皂苷成分对肿瘤细胞的抑制作用，中草药，2004，27(8)：604-605”虽然证明白头翁的醇提取物具有一定的抗肿瘤作用，但是从这些文献的抗肿瘤实验数据看，所得白头翁醇提取物的抗肿瘤效果并不明显，并且提取工艺过于简单，没有对有效成分进行精制，从而导致提取物中的活性成分含量低，且杂质较多，不仅影响了疗效，而且增大了毒副作用的风险。
因此，十分需要研究新的白头翁提取方法，以进一步提高白头翁提取物中活性成分的含量，同时减少提取物中的杂质，从而增加白头翁提取物的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种白头翁提取物、其制备方法和应用，以及从白头翁提取的皂苷类化合物。本发明主要是通过以下的技术方案来实现的。
一方面，本发明提供了治疗癌症的白头翁提取物，其包含齐墩果酸 3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β- D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷2-10重量％、常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷10-40重量%、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷5-30重量%和齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷5-30重量%，并且所述提取物的总皂苷大于65%。
优选地，所述白头翁提取物包含齐墩果酸 3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β- D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷3-8重量％、常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷20-35重量%、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷10-25重量%和齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷10-25重量%，并且所述提取物的总皂苷大于75%。
在上述白头翁提取物所包含的活性成分中，齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β- D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷具有式I的化学结构式：
经检索，式I的化合物是目前首次发现并分离得到的新化合物。该化合物为白色粉末，mp为331-333 ℃；[α] -11.4?（c = 0.02, MeOH）；Limbermann- Burchard 反应和 Molish反应呈阳性，提示为三萜皂苷类化合物；1H-NMR和 13C-NMR数据见表1；HR-ESI-MS谱见图1。HR-ESI-MS谱给出该化合物 [M+Na]+ 准分子离子峰 m/z: 1227. 6102（计算值:1227.6138），分子式为 C59H96O25。
表1 式I化合物的1H-NMR和 13C-NMR数据 (C5D5N, δ)
在上述白头翁提取物所包含的活性成分中，常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷为已知化合物，其具有式
的结构式：
在上述白头翁提取物所包含的活性成分中，齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷为已知化合物，其具有式
的结构式：
在上述白头翁提取物所包含的活性成分中，齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷为已知化合物，其具有式
的结构式：
式
至式化合物的13C-NMR数据见表2。
表2 式II、III、IV的13C-NMR数据 (C5D5N, δ)
| No. | 化合物II | 化合物III | 化合物IV | No. | 化合物II | 化合物III | 化合物IV |
| 1 | 39.13 | 39.02 | 39.4 | C3-O- | |||
| 2 | 26.44 | 26.75 | 27.09 | Ara-1 | 104.54 | 105.09 | 105.45 |
| 3 | 81.18 | 88.85 | 89.23 | 2 | 76.42 | 76.53 | 76.27 |
| 4 | 43.64 | 39.64 | 39.72 | 3 | 75.15 | 74.20 | 74.63 |
| 5 | 47.93 | 56.14 | 56.14 | 4 | 80.56 | 79.74 | 69.52 |
| 6 | 18.27 | 18.65 | 18.91 | 5 | 65.53 | 64.64 | 65.82 |
| 7 | 33.01 | 33.44 | 33.70 | Rha-1 | 101.82 | 101.93 | 102.10 |
| 8 | 39.89 | 39.88 | 40.27 | 2 | 72.41 | 72.44 | 72.21 |
| 9 | 48.30 | 48.19 | 48.57 | 3 | 72.59 | 72.63 | 84.07 |
| 10 | 37.03 | 37.18 | 37.56 | 4 | 74.27 | 74.20 | 73.45 |
| 11 | 23.92 | 23.93 | 24.26 | 5 | 69.78 | 69.96 | 70.20 |
| 12 | 122.72 | 122.69 | 123.00 | 6 | 18.76 | 18.78 | 19.02 |
| 13 | 145.03 | 145.00 | 145.31 | Glc-1 | 106.89 | 106.52 | 106.97 |
| 14 | 42.29 | 42.31 | 42.50 | 2 | 75.62 | 75.61 | 75.97 |
| 15 | 28.50 | 28.48 | 28.82 | 3 | 78.93 | 78.67 | 77.11 |
| 16 | 23.92 | 23.93 | 24.26 | 4 | 71.37 | 71.43 | 81.63 |
| 17 | 46.80 | 46.82 | 47.16 | 5 | 78.69 | 78.91 | 77.11 |
| 18 | 42.10 | 42.14 | 42.68 | 6 | 62.64 | 62.70 | 62.45 |
| 19 | 46.57 | 46.64 | 46.99 | Glc-1′ | 105.59 | ||
| 20 | 31.08 | 31.11 | 31.43 | 2′ | 75.20 | ||
| 21 | 34.36 | 34.40 | 34.76 | 3′ | 78.72 | ||
| 22 | 33.29 | 33.44 | 33.75 | 4′ | 72.00 | ||
| 23 | 64.04 | 28.21 | 28.69 | 5′ | 78.90 | ||
| 24 | 14.17 | 17.17 | 17.60 | 6′ | 62.92 | ||
| 25 | 16.21 | 15.69 | 16.01 | ||||
| 26 | 17.59 | 17.53 | 17.87 | ||||
| 27 | 26.30 | 26.32 | 26.66 | ||||
| 28 | 180.64 | 180.42 | 180.61 | ||||
| 29 | 33.39 | 33.44 | 33.75 | ||||
| 30 | 23.92 | 23.93 | 24.26 |
上述白头翁提取物可通过包括下列步骤的方法制备：将白头翁药材，打碎成粗粉，用20-95%乙醇6-12倍量回流提取2-3次，每次1-3h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用碱调节维持pH至10-13，煮沸保温，碱水解反应2-8小时后，放冷过夜；用酸调节pH至4-7，加水稀释2-4倍，上大孔树脂柱，依次用水、10-50%乙醇、60-95%乙醇洗脱；收集60-95%乙醇洗脱液，浓缩，干燥即得。
本申请的发明人通过MTT试验研究了单体皂苷的化学结构和其对应的抗肿瘤活性之间的关系，结果意外地发现白头翁皂苷的C-28位的羧基游离对于皂苷的抗肿瘤活性至关重要。在MTT实验中，凡是C-28位与糖成苷键的化合物其对两种肿瘤细胞的IC50值均大于200μg/ml，而有游离羧基的化合物则对两种肿瘤细胞都显示了很好的抗肿瘤活性，例如SGC-7901肿瘤细胞，同样的情况也能在A549肿瘤细胞的抑制实验中观察得到。
同时，发明人还发现C-3位所连糖链的糖基个数以及连接顺序对皂苷的抗肿瘤活性有一定的影响。从实验的结果中可以看到，以齐墩果酸为苷元的皂苷，对于SGC-7901肿瘤细胞，即糖链顺序为rha(1→2)[glc(1→4)]ara的三糖苷活性最强，接下来依次是带支链的四糖苷(glc(1→3)rha(1→2)[glc(1→4)]ara)>直链四糖苷(glc(1→4)glc(1→3)rha(1→2)ara)>直链三糖苷(glc(1→3)rha(1→2)ara) >直链五糖苷(glc(1→4)glc(1→3)rha(1→2)ara)≈二糖苷(rha(1→2)ara)；而对于A549细胞，糖链顺序为rha(1→2)[glc(1→4)]ara的三糖苷活性也为最强，接下来依次是直链三糖苷(glc(1→3)rha(1→2)ara) >直链四糖苷(glc(1→4)glc(1→3)rha(1→2)ara)>支链四糖苷(glc(1→3)rha(1→2)[glc(1→4)]ara)> 直链五糖苷(glc(1→4)glc(1→3)rha(1→2)ara)≈二糖苷(rha(1→2)ara)。以常春藤为苷元的皂苷，对于SGC-7901和A549肿瘤细胞，糖链顺序为rha(1→2)[glc(1→4)]ara的三糖苷活性最强，接下来依次是二糖苷(rha(1→2)ara)>直链四糖苷(glc(1→4)glc(1→3)rha(1→2)ara)>二糖苷(glc(1→4)ara)>直链三糖苷(glc(1→3)rha(1→2)ara)，单糖苷活性最弱。因此我们可以看到，在体外的MTT实验中，糖基个数及糖链顺序为rha(1→2)[glc(1→4)]ara的皂苷显示了最好的活性。
根据构效关系的研究结果，为了进一步提高白头翁皂苷的抗肿瘤活性，通过碱水解反应，使白头翁皂苷的C-28位酯苷键发生水解，产生C-28位羧酸游离。同时，尽可能富集白头翁皂苷的C-3位为四糖、三糖、五糖及二糖皂苷。
另一方面，本发明提供了一种治疗癌症的药物组合物，其包含上述的白头翁提取物和药学上可接受的任意辅料。
其中，药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、注射剂、口服液或贴剂。
进一步地，本发明提供了一种白头翁提取物的制备方法，其包括如下步骤：将白头翁药材，打碎成粗粉，用20-95%乙醇6-12倍量回流提取2-3次，每次1-3h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用碱调节维持pH至10-13，煮沸保温，碱水解反应2-8小时后，放冷过夜；用酸调节pH至4-7，加水稀释2-4倍，上大孔树脂柱，依次用水、10-50%乙醇、60-95%乙醇洗脱；收集60-95%乙醇洗脱液，浓缩，干燥即得。
优选地，所述白头翁提取物的制备方法包括如下步骤：将白头翁药材，打碎成粗粉，用50-80%乙醇6-10倍量回流提取2-3次，每次1-2h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用NaOH调节维持pH至10-13，煮沸保温，碱水解反应3-6小时后，放冷过夜；用盐酸调节pH至5-6，加水稀释2-3倍，上D101大孔树脂柱，依次用水、30-50%乙醇、80-95%乙醇洗脱；收集80-95%乙醇洗脱液，浓缩，微波干燥即得。
在上述的制备过程中，白头翁皂苷水溶液用NaOH调节pH11-12，煮沸保温，每隔半小时补加NaOH以维持pH，从而保证碱水解反应。碱水解反应完成后，因水溶液显碱性，因此，白头翁皂苷的C-28酯苷变成羧酸钠盐。碱水解反应后，如果直接加盐酸调PH，把白头翁皂苷C-28位羧酸钠盐变成游离羧酸，因溶液仍处于沸腾高温状态，游离羧酸的同时，还容易发生酸水解反应，使白头翁皂苷C-3位苷键变成游离羟基，皂苷变成苷元，抗肿瘤活性失效，而室温状态下，酸水解反应不会发生。因此，调酸时要避免高温，碱水解反应后，溶液放冷过夜，再用盐酸调节PH值，使白头翁皂苷C-28位羧酸游离。
白头翁皂苷调酸后，通过大孔树脂吸附，用水、10-50%乙醇、60-95%乙醇洗脱，除去白头翁皂苷C-3位为六糖和五糖皂苷等无抗肿瘤活性的杂质。尽可能富集白头翁皂苷的C-3位为四糖、三糖及二糖皂苷。 通过碱水解反应和酸化，使无抗肿瘤作用的皂苷转化成具有抗肿瘤活性活性的皂苷，提高了白头翁中抗肿瘤有效成分的得率，节约了药材资源，同时提高了白头翁皂苷的抗肿瘤活性。
更进一步地，本发明提供了式I的化合物和上述白头翁提取物在制备治疗癌症的药物中的应用。
附图说明
图1是齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β- D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷（式I）的HR-ESI-MS谱。
图2是白头翁提取物的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1：齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β- D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(式I化合物)的制备
按照下述方法制备本发明的式I化合物：将白头翁药材，打碎成粗粉，用70%乙醇8倍量回流提取2次，每次1 h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用NaOH调节维持pH至12，煮沸保温，碱水解反应6小时后，放冷过夜；用盐酸调节pH 至6，加水稀释2倍，上D101大孔树脂柱，依次用水、40%乙醇、90%乙醇洗脱；收集90%乙醇洗脱液，浓缩，微波干燥，得白头翁提取物。
白头翁提取物经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，收集甲醇:水（8:2，V/V）的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇洗脱，并通过高效制备液相色谱仪，甲醇和水（7:3-9:1）进行制备，即得式I化合物。
实施例2：白头翁提取物的制备
按照下述方法制备本发明的白头翁提取物：将白头翁药材，打碎成粗粉，用70%乙醇8倍量回流提取2次，每次1 h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用NaOH调节维持pH至12，煮沸保温，碱水解反应6小时后，放冷过夜；用硫酸调节pH 至6，加水稀释3倍，上AB-8大孔树脂柱，依次用水、40%乙醇、90%乙醇洗脱；收集90%乙醇洗脱液，浓缩，微波干燥即得。
实施例3：白头翁提取物的制备
按照下述方法制备本发明的白头翁提取物：将白头翁药材，打碎成粗粉，用40%乙醇8倍量回流提取2次，每次1 h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用NaOH调节pH至10，煮沸保温，碱水解反应5小时后，放冷过夜；用盐酸调节pH 至5，加水稀释2倍，上HPD100大孔树脂柱，依次用水、50%乙醇、70%乙醇洗脱；收集70%乙醇洗脱液，浓缩，真空干燥即得。
实施例4：白头翁提取物的制备
按照下述方法制备本发明的白头翁提取物：
将白头翁药材，打碎成粗粉，用80%乙醇8倍量回流提取2次，每次1 h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用NaOH调节pH至13，煮沸保温，每隔半小时补加NaOH维持pH至13，碱水解反应5小时后，放冷过夜；用盐酸调节pH 至7，加水稀释1倍，上D101大孔树脂柱，依次用水、40%乙醇、80%乙醇洗脱；收集80%乙醇洗脱液，浓缩，微波干燥即得。
实施例5：白头翁提取物的高效液相色谱图
色谱条件：色谱柱: Cosmosil C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm, 5μm)；流动相: 甲醇-水梯度洗脱(甲醇：0 min为70% ，30 min为100%)；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；进样量20ml；ELSD检测器：Altech 2000型检测器；检测温度：80℃；ELSD载气：高纯氮气；载气流速：2.1L/min。
样品：将实施例1得到的白头翁提取物用流动相适当稀释后进样。所得高效液相色谱图见图2。
实施例6：单体化合物对SGC-7901和A549细胞增殖的影响
本实验测定了四种单体化合物对SGC-7901（胃癌）和A549（肺癌）肿瘤细胞增殖的影响。结果见表3。
表3 四种单体化合物对SGC-7901和A549细胞增殖的影响
| SGC-7901细胞IC50（μg/ml） | A549细胞IC50（μg/ml） | |
式 |
8.62±1.74 | 11.91±0.21 |
| 式II化合物 | 8.16±1.61 | 6.87±2.22 |
式 |
3.40±0.81 | 5.21±1.66 |
式 |
7.54±0.81 | 7.75±1.00 |
结果表明，式至式
结构的化合物对SGC-7901和A549肿瘤细胞具均有较好的抗肿瘤活性。
实施例7：白头翁提取物对各种受试细胞生长的半效抑制浓度
采用MTT法，选择12种人肿瘤细胞系，考察不同浓度的白头翁提取物（用实施例1的方法制备得到）对人肿瘤细胞增殖的影响。收集对数期各肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度至1×106个/mL，于96孔板每孔加入100 μL，置于5% CO2，37℃孵箱中孵育24 h后，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物（1.5625、3.125、6.25、12.5、25 μg/mL），每个浓度设5个复孔。待药物与细胞作用48 h后，计算药物对细胞生长的抑制率。结果见表4。
表4 白头翁提取物对各种受试细胞生长的半效抑制浓度（IC50，μg/mL）
| 细胞株 | IC50（μg/mL） |
| 肺癌A549 | 3.01 |
| 肺癌NCI-H460 | 2.42 |
| 人胶质瘤细胞SHG-44 | 1.05 |
| 人肝细胞性肝癌BEL-7402 | 6.38 |
| 人肝细胞性肝癌SMMC-7721 | 4.18 |
| 人胶质瘤细胞U251 | 1.35 |
| 人红白血病细胞K-562 | 1.47 |
| 人乳腺癌SK-BR-3 | 6.12 |
| 人低分化胃腺BGC-823 | 3.16 |
| 人结肠腺癌HCT-116 | 2.59 |
| 人结肠腺癌HT-29 | 3.65 |
| 小鼠黑色素瘤B-16 | 1.32 |
结果表明，本发明的白头翁提取物对多种肿瘤细胞的生长都具有显著的抑制作用。
实施例8：白头翁提取物的体内抗肿瘤活性研究
① 利用小鼠移植性肿瘤模型研究白头翁提取物对结肠癌皮下移植瘤的影响
将CT26.WT细胞培养于含10%FBS的RPMI-1640培养基中，待细胞长至80%融合时，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化液将其消化下来，吹散，用无血清的1640悬浮，调整细胞浓度为5×106/ml，接种于BALB/c小鼠右侧腋窝皮下，0.2ml/只。小鼠接种24 h后开始给药，正常组及荷瘤模型组每天灌服双蒸水 0.5ml/只；阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，隔日1次；以本发明实施例1的白头翁提取物（50，100，200mg/kg，i.g）分别连续给药14天。最后一次给药后24 h，剥离肿瘤组织称重。结果见表5。
表5 白头翁提取物对结肠癌皮下移植瘤荷瘤鼠瘤重及抑瘤率的影响（n=10， ± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 对照组 | / | 1.78±0.89 | - |
| 白头翁提取物高剂量组 | 200 | 0.53±0.23** | 70.22% |
| 白头翁提取物中剂量组 | 100 | 0.69±0.32** | 61.24% |
| 白头翁提取物低剂量组 | 50 | 1.03±0.47* | 42.13% |
| CTX组 | 40 | 0.22±0.19** | 87.64% |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
实验结果提示，白头翁提取物（50，100，200mg/kg，i.g）能明显降低结肠癌皮下移植瘤小鼠瘤重，对小鼠结肠癌生长的抑制率分别为42.13% 、61.24%及70.22%。高剂量组（200mg/kg）抑制率高达70.22%。
②利用小鼠移植性肿瘤模型研究白头翁提取物对H22肝癌荷瘤的影响
无菌吸取传代H22瘤株且生长良好的小鼠腹水，用生理盐水稀释成5*106cells/ml，每鼠0.2ml接种于KM小鼠右侧腋窝皮下建立荷瘤小鼠模型。小鼠接种24 h后开始给药，正常组及荷瘤模型组每天灌服双蒸水 0.5ml/只;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，隔日1次；以本发明实施例1的白头翁提取物（50，100，200mg/kg，i.g）分别连续给药14天。最后一次给药后24 h，剥离肿瘤组织称重。结果见表6。
实验结果提示，白头翁提取物（50、100、200mg/kg， i.g）能明显降低H22肝癌小鼠瘤重，对H22肝癌生长的抑制率分别为47.84%、63.79%、71.89%。高剂量组（200mg/kg）抑制率高达71.89%。
表6 白头翁提取物对H22肝癌荷瘤鼠瘤重及抑瘤率的影响（n=10，
± s）
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率 |
| 对照组 | / | 2.32±1.02 | - |
| 白头翁提取物高剂量组 | 200 | 0.65±0.35** | 71.98% |
| 白头翁提取物中剂量组 | 100 | 0.84±0.44** | 63.79% |
| 白头翁提取物低剂量组 | 50 | 1.21±0.49* | 47.84% |
| CTX组 | 40 | 0.16±0.17** | 93.10% |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
③利用小鼠移植性肿瘤模型研究白头翁提取物对Lewis肺癌的影响
取接种Lewis肺癌瘤块14d且生长良好的C57BL/6小鼠，处死并无菌取出瘤块，去除坏死部分，剪成2mm小块，每只C57BL/6小鼠右侧腋窝皮下用套管针接种一小块。小鼠接种24 h后开始给药，正常组及荷瘤模型组每天灌服双蒸水0.5ml/只;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，隔日1次，以本发明实施例1的白头翁提取物（50，100，200mg/kg，i.g），分别连续给药14天。最后一次给药后24 h ，称量各组小鼠的体重、胸腺重量，剥离肿瘤组织称重。结果见表7。
表7 白头翁提取物对Lewis肺癌荷瘤鼠瘤重及抑瘤率的影响（n=10，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 对照组 | / | 1.45±0.68 | - |
| 白头翁提取物高剂量组 | 200 | 0.43±0.26** | 70.34% |
| 白头翁提取物中剂量组 | 100 | 0.56±0.33** | 61.38% |
| 白头翁提取物低剂量组 | 50 | 0.81±0.41* | 44.14% |
| CTX组 | 40 | 0.2±0.19** | 86.21% |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
实验结果提示，白头翁提取物（50，100，200mg/kg， i.g）能明显降低Lewis肺癌小鼠瘤重，对小鼠Lewis肺癌生长的抑制率分别为44.14%、61.38%和70.34%。高剂量组（200mg/kg）抑制率高达70.34%。
④利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察白头翁提取物对人肝癌Bel-7402的影响
取人肝癌Bel-7402细胞裸鼠异体移植成瘤，并经瘤块传3代以上的Bel-7402荷瘤裸鼠，皮下无菌取出肿瘤块，用不含血清的RPMI-1640培养基冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约2 mm大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、本发明实施例1的白头翁提取物（50，100，200mg/kg，i.g）每组各10只。模型组、阳性药环磷酰胺组腹腔注射相应药液，采用游标卡尺测量瘤径，每隔1天测量一次，按照瘤体积=（1/2）×a×b2(a:长b:宽)计算瘤体积，画出肿瘤体积的生长曲线，计算相对肿瘤体积（RTV），相对肿瘤增殖率T/C（%），实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。结果见表8。
表8 白头翁提取物对人肝癌Bel-7402裸鼠瘤重及抑瘤率的影响（n=10，
± s）
| 组别 | 剂量 | 瘤重（g） | 抑瘤率（%） |
| 对照组 | / | 1.32±0.31 | - |
| 白头翁提取物高剂量组 | 200mg/kg | 0.46±0.25 | 65.15% |
| 白头翁提取物中剂量组 | 100mg/kg | 0.62±0.36 | 57.24% |
| 白头翁提取物低剂量组 | 50mg/kg | 0.88±0.51 | 39.31% |
| CTX组 | 40mg/kg | 0.43±0.25 | 70.34% |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
实验结果提示，白头翁提取物（50，100，200mg/kg，i.g）能明显降低Bel-7402裸鼠瘤重，抑瘤率分别为39.31%、57.24%和65.15%，高剂量组（200mg/kg）抑制率高达65.15%。
Claims (10)
1.一种治疗癌症的白头翁提取物，其特征在于包含齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷2-10重量％、常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷10-40重量%、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷5-30重量%和齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷5-30重量%，并且所述提取物的总皂苷大于65%。
2.如权利要求1所述的治疗癌症的白头翁提取物，其特征在于包含齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷3-8重量％、常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷20-35重量%、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷10-25重量%和齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷10-25重量%，并且所述提取物的总皂苷大于75%。
3.如权利要求1或2所述的治疗癌症的白头翁提取物，其特征在于提取物的制备方法包括如下步骤：将白头翁药材，打碎成粗粉，用20-95%乙醇6-12倍量回流提取2-3次，每次1-3h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用碱调节维持pH至10-13，煮沸保温，碱水解反应2-8小时后，放冷过夜；用酸调节pH至4-7，加水稀释2-4倍，上大孔树脂柱，依次用水、10-50%乙醇、60-95%乙醇洗脱；收集60-95%乙醇洗脱液，浓缩，干燥即得。
4.一种治疗癌症的药物组合物，其特征在于包含权利要求1或2的白头翁提取物和药学上可接受的任意辅料。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、注射剂、口服液或贴剂。
6.如权利要求1-3任一项所述的白头翁提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将白头翁药材，打碎成粗粉，用20-95%乙醇6-12倍量回流提取2-3次，每次1-3h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用碱调节维持pH至10-13，煮沸保温，碱水解反应2-8小时后，放冷过夜；用酸调节pH至4-7，加水稀释2-4倍，上大孔树脂柱，依次用水、10-50%乙醇、60-95%乙醇洗脱；收集60-95%乙醇洗脱液，浓缩，干燥即得。
7.如权利要求6所述的白头翁提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将白头翁药材，打碎成粗粉，用50-80%乙醇6-10倍量回流提取2-3次，每次1-2h，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液用NaOH调节维持pH至10-13，煮沸保温，碱水解反应3-6小时后，放冷过夜；用盐酸调节pH至5-6，加水稀释2-3倍，上D101大孔树脂柱，依次用水、30-50%乙醇、80-95%乙醇洗脱；收集80-95%乙醇洗脱液，浓缩，微波干燥即得。
8.一种从白头翁提取的皂苷类化合物，其特征在于该化合物的化学结构式如下：
上述式I结构的化合物的化学名称为齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。
9.如权利要求8所述的化合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
10.如权利要求1-3任一项所述的白头翁提取物在制备治疗癌症的药物中的应用。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1684660A (zh) * | 2002-09-23 | 2005-10-19 | 金钟硕 | 含有白头翁提取物作为主要成分并具有增白效果的化妆品组合物 |
| CN101010093A (zh) * | 2004-07-30 | 2007-08-01 | 金松培 | 一种提高白头翁抗癌效果的方法及该方法制备的组合物 |
| CN101137389A (zh) * | 2005-02-03 | 2008-03-05 | Sk化学株式会社 | 有效用于脑功能的白头翁属提取物 |
| CN102068509A (zh) * | 2010-04-30 | 2011-05-25 | 江西中医学院 | 白头翁活性组分的制备方法及其制剂的制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用 |
| CN102078359A (zh) * | 2009-11-27 | 2011-06-01 | 龙毅 | 太子参分散片 |
| CN102247393A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-11-23 | 江西本草天工科技有限责任公司 | 一种齐墩果酸皂苷类成分的制备方法及其用途 |
-
2012
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1684660A (zh) * | 2002-09-23 | 2005-10-19 | 金钟硕 | 含有白头翁提取物作为主要成分并具有增白效果的化妆品组合物 |
| CN101010093A (zh) * | 2004-07-30 | 2007-08-01 | 金松培 | 一种提高白头翁抗癌效果的方法及该方法制备的组合物 |
| CN101137389A (zh) * | 2005-02-03 | 2008-03-05 | Sk化学株式会社 | 有效用于脑功能的白头翁属提取物 |
| CN102078359A (zh) * | 2009-11-27 | 2011-06-01 | 龙毅 | 太子参分散片 |
| CN102068509A (zh) * | 2010-04-30 | 2011-05-25 | 江西中医学院 | 白头翁活性组分的制备方法及其制剂的制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用 |
| CN102247393A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-11-23 | 江西本草天工科技有限责任公司 | 一种齐墩果酸皂苷类成分的制备方法及其用途 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 付云明等.朝鲜白头翁化学成分的研究.《中草药》.2008,第39卷(第1期),26-29. |
| 图1. |
| 实施例1. |
| 朝鲜白头翁化学成分的研究;付云明等;《中草药》;20080131;第39卷(第1期);26-29 * |
| 西南白头翁不同提取物的抗肿瘤作用研究;黄芳等;《湖北中医学院学报》;20080930;第10卷(第3期);12-13 * |
| 说明书第2页，实验实施例1. |
| 说明书第4页 |
| 黄芳等.西南白头翁不同提取物的抗肿瘤作用研究.《湖北中医学院学报》.2008,第10卷(第3期),12-13. |
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| Publication number | Publication date |
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