CN110801460A - 具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法 - Google Patents

具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，该方法以石榴皮提取物的大孔树脂纯化物为原料，利用非线性反相色谱技术，纯化得到得到安石榴苷含量高达60.6%的石榴皮有效组分，通过考察分析柱在不同上样量下所得石榴皮有效组分中安石榴苷的含量、回收率及制备效率，从而得到了具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分。该方法工艺稳定，非常适合进一步的工业化生产。为基于石榴皮有效组分为原料药的新药研发打下坚实基础。

Description

具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分 的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法。
背景技术
石榴，又称安石榴，是一种在我国尤其是新疆地区(古称“西域”)有着广泛种植的水果。皮酸、涩、温，具有涩肠止泻，止血，驱虫等功能。现代研究表明，石榴皮中含有丰富的鞣质类化合物，具有广泛的生物活性。而其中又以安石榴苷和鞣花酸为代表。特别是安石榴苷，其在石榴皮药材中的含量约为6％，远高于石榴皮鞣素、没食子酸和鞣花酸。安石榴苷具有典型的多酚的抗氧化活性，此外还有广泛的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性。基于石榴皮提取物为原料，纯化得到具有抗氧化抗菌活性较好的有效组分，对于石榴皮的新药研发具有十分重要的意义。
由于安石榴苷属于鞣质，具有鞣质的特殊性质，即在正相硅胶、凝胶、聚酰胺等填料上的不可逆吸附较强，因此能用来富集纯化的填料种类较少，主要集中在适合富集多酚的大孔树脂和反相硅胶上。目前主流的石榴皮提取物工艺采用适用多酚富集的大孔树脂(如HPD系列)来处理石榴皮提取物，用水洗去其中的多糖和植物蛋白，再用高浓度的乙醇进行洗脱，所得部位浓缩干燥，是为石榴皮提取物的大孔树脂纯化物。已报道的文献指出石榴皮提取物的大孔树脂纯化物中安石榴苷含量通常可达15％至35％之间，安石榴苷回收率达到在90％以上，且可达到产业化水准，即工艺稳定地提供富含安石榴苷的有效组分。亦有报道文献将大孔树脂纯化法和其他方法联合起来使用，将MCI树脂柱层析甚至逆流等技术联合起来，即用另外一种方法如使用MCI柱层析或者逆流色谱的方法继续富集纯化石榴皮提取物的大孔树脂纯化物，从而使安石榴苷在有效组分中的含量达到80％-90％。然而，上述方法的产量规模很小，级别往往是百毫克或克级，距离工业化生产的技术转化，存在很大的距离。因此，研发一种抗氧化和金黄色葡萄球菌抑制活性较好的、稳定可放大至工业化生产的安石榴苷含量较高的石榴皮有效组分的制备方法意义重大。
如上所述，除大孔树脂外反相色谱填料较合适于纯化多酚类化合物。反相色谱主要利用疏水效应对不同极性的化合物进行选择性吸附分配，从而使化合物达到较好程度的分离。反相色谱的种类很多，通常是基于单分散的硅胶键合上不同碳原子数的疏水性烷基链，而其中最为通用且典型的即十八烷基链键合，即常用的C18。将填料填充于色谱柱管中装载成色谱柱使用，是目前主流的做法。而色谱法根据上样量再吸附等温线的线性或非线性部位区分可以分为线性色谱和非线性色谱，又称为过载色谱。线性色谱即上样量处于吸附等温线的线性区域，峰型为高斯对称分布，通常用于样品分析领域。而非线性色谱则是上样量处于吸附等温线的非线性领域，其峰型通常成不对称的三角形，通常可用于样品的纯化精制。非线性色谱由于上样量高，再加上近年来其理论研究逐渐成熟，慢慢在纯化领域占据了重要的地位。因此，基于非线性反相色谱对已产业化的石榴皮提取物的大孔树脂纯化物进而二次纯化精制，以生产并实现中试甚至生产级别的工艺开发，可使其中安石榴苷的含量达到高水准。通过分析型色谱优化非线性色谱的上样量、安石榴苷回收率、生产效率以及所得有效部位中安石榴苷的含量，得出最佳工艺，再放大到对应的中试色谱柱上，得到具有较强抗氧化、抗菌活性的高安石榴苷含量的石榴皮有效组分。整套工艺属于对石榴皮提取物大孔树脂纯化物的二次再开发，其中安石榴苷含量高于60.6％。所得石榴皮有效组分具有很强的抗氧化和金黄色葡萄球菌抑制活性，且中试放大工艺稳定，具有很高的产业化价值。
发明内容
本发明的目的在于，提供出一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，该方法以石榴皮提取物的大孔树脂纯化物为原料，利用非线性反相色谱技术，纯化得到得到安石榴苷含量高达60.6％的石榴皮有效组分，通过考察分析柱在不同上样量下所得石榴皮有效部位中安石榴苷的含量、回收率及制备效率，确认对于C18色谱柱，上样量范围限定在石榴皮大孔树脂纯化物的质量与填料质量的比例为250mg/g-1250mg/g之间时制备出的石榴皮组分的抗氧化活性和金黄色葡萄球菌抑制活性较高。当该比例为500mg/g时，所得石榴皮有效部位安石榴苷含量高于60.6％，水溶性较纯化前大幅提高，制备效率较高，安石榴苷回收率亦高达73.2％，其抗氧化活性和金黄色葡萄球菌抑制活性仍维持在很高的水平。该方法工艺稳定，非常适合进一步的工业化生产。为基于石榴皮有效组分为原料药的新药研发打下坚实基础。
本发明所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，按下列步骤进行：
a、通过高效液相色谱仪，以甲醇或乙腈为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇含量范围在5％-45％之间，或流动相为乙腈-0.1％甲酸水混合物，其中乙腈含量在5％-30％之间，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡反相C18色谱柱，长度250mm，内径10mm，填充物粒径10μm，平衡至基线水平；
b、分别称取500mg，750mg，1000mg，1500mg的石榴皮提取物大孔树脂纯化物，均溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，将样品分别进样至步骤a中平衡好的色谱柱中，进样后即开始接取组分，将所得组分溶液按每分钟一个的速率接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min的区间里，共计接取40个组分；
c、使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型反相C18色谱柱，长度250mm，内径4.6mm，填充物粒径10μm，柱温室温，流速1.0mL/min，监测波长254nm，对步骤b所得各组分样品，进样体积5微升，记下各样品中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图；
d、对于步骤b中，上样量为500mg时所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分1；或上样量为750mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分2；或上样量为1000mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分3；或上样量为1500mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分4，即得到具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分。
步骤a中使用的流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合溶液，甲醇含量在10％-30％之间；或流动相为乙腈-0.1％甲酸水混合溶液，乙腈含量在6％-20％之间。
步骤d中上样量为500mg时所得的一系列组分，合并11min至30min之间的组分；或上样量为750mg时所得的一系列组分，合并9min至26min之间的组分；或上样量为1000mg所得的一系列组分，合并8min至22min之间的组分；或上样量为1500mg时所得的一系列组分，合并8min至17min之间的组分。
对于C18色谱柱，上样量范围在石榴皮大孔树脂纯化物与所用C18填料质量比为250-1250mg/g之间。
本发明所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，该方法中的石榴皮提取物是由发明专利ZL201310648219.8《一种具有抗菌消炎脱臭的漱口液及其制备方法和用途》中获得，具体操作按下列步骤进行；
取石榴皮粉碎成粗粉，加10-20倍量浓度为40％乙醇，在温度71-85℃条件下提取1-3次，每次1-3小时，滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至每mL相当于生药0.15-0.2g的浓缩液；将浓缩液加入到已处理好的HPD300型大孔吸附树脂柱上，吸附3-12小时，先用去离子水冲洗至流出液颜色较淡时，再用2-5倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集含醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩并真空干燥，粉碎，过80-120目筛，得到石榴皮提取物大孔树脂纯化物。
本发明所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，该方法中：
a、通过高效液相色谱仪(配以紫外检测器)，取一根C18色谱柱，规格为长度250mm，内径10mm，填充颗粒粒径10μm，以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为15％甲醇-0.1％甲酸水溶液，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡色谱柱直至基线水平，称取1mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物粉末，溶于10mL水中，用0.45μm的有机滤头过滤，待用，取20μL样品溶液，通过进样器进样至色谱柱，记录所得色谱图上安石榴苷两个色谱峰的保留时间分别为21min和40min；
通过配有紫外检测器的高效液相色谱仪进行石榴皮提取物大孔树脂纯化物的上样量考察，即非线性反相色谱：
b、分别称取500mg，750mg，1000mg，1500mg的石榴皮提取物大孔树脂纯化物，均溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用；通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡步骤a中的C18色谱柱直至基线水平；待步骤a中色谱柱平衡至基线水平后，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，将步骤b中的500mg，750mg，1000mg，1500mg提取物至色谱柱中，进样后即开始接取组分，将所得组分溶液按每分钟一个的速率接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min的区间里，共计接取40个组分；
c、使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，柱温为室温，流速1.0mL/min，监测波长254nm，对所得一系列组分进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取步骤c中所得样品，进样体积5微升，记下各样品中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到；鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到；以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量500mg，750mg，1000mg，1500mg条件下在各组分中的分布情况；
d、对于上样量为500mg所得的一系列组分，合并11min至30min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分1；对于上样量为750mg所得的一系列组分，合并9min至26min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分2；对于上样量为1000mg所得的一系列组分，合并8min至22min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分3；对于上样量为1500mg所得的一系列组分，合并8min至17min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分4；即得到具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分；
含量检测：
分别称取1mg获得的石榴皮有效组分中的总质量为100.1mg的组分1，总质量为211mg的组分2，总质量为274mg的组分3，总质量为248mg的组分4，各加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，使用步骤d中的高效液相色谱法，进样10微升，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分1中安石榴苷的含量为83.2％，安石榴苷回收率为90.7％；组分2中安石榴苷的含量为77.9％，安石榴苷含量为90.6％；组分3中安石榴苷的含量为74.4％，安石榴苷含量为89.2％；组分4中安石榴苷的含量为67.4％，安石榴苷含量为72.6％，综合考虑安石榴苷含量、所得组分质量和回收率的关系，所采用的工艺，上中试反相色谱进一步放大；
放大试验：
通过中试反相C18色谱对本发明所述方法进行放大试验：
使用中试高效液相色谱仪(配以中试反相C18柱(规格为长度250mm，内径80mm)和双波长紫外检测器，操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过中试液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，柱温为室温，流速为180mL/min，平衡色谱柱直至基线水平，称取128g石榴皮大孔树脂纯化物(安石榴苷含量32％)进样至色谱柱，收集9min-17min间的组分，合并，温度50℃浓缩冷冻干燥，称重得到石榴皮有效组分26.7g；称取1mg所得石榴皮有效组分，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，使用步骤d中的高效液相色谱法，进样10微升，通过安石榴苷标准曲线测定所得石榴皮有效组分中安石榴苷的含量为60.6％，安石榴苷回收率为73.2％；
活性检测1
称取获得的石榴皮有效组分100mg，溶于1mL水配制成溶液，融化琼脂培养基，待其温度降至46±0.5℃，加入已培养好的金黄色葡萄球菌液，使试验菌悬液浓度为5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20min使其凝固，用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上，每孔加石榴皮有效组分溶液20μL，盖好平皿，置于温度37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径为14mm，因此判定石榴皮有效组分具有较强的抑制金黄色葡萄球菌活性；
活性检测2
h、称取获得的石榴皮有效组分100mg，溶于1mL水配制成溶液，采用DPPH法测石榴皮有效组分的抗氧化活性：配制10mL浓度为2mM的DPPH乙醇溶液，避光放置；将该溶液稀释10倍成2×10-4mol/L，调整使OD515nm约为A≒0.7为工作液，加石榴皮有效组分的溶液200微升反应测定，以维生素C为阳性对照，室温避光反应30min，测定515nm处的光吸收值，最终测定得到石榴皮有效组分的IC50值为2.54±0.09μg/mL，而其阳性对照维生素C的IC50值为5.34±0.42(μg/mL)；结果显示，所得石榴皮有效组分的抗氧化活性很强。
所用的流动相体系选择甲醇-0.1％甲酸水体系或乙腈-0.1％甲酸水体系，安石榴苷的两个色谱峰的保留时间，应分别控制在3-50min和30-100min之间。
本发明所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，以发明专利ZL201310648219.8石榴皮提取物的大孔树脂纯化物为原料，运用非线性色谱法，先通过色谱柱进行小试工艺方法开发，对不同上样量下的组分进行安石榴苷即前杂质的含量分布进行探索，最终进行选择性合并成若干组分，使用高效液相色谱法测定其中安石榴苷的含量，再通过综合考虑安石榴苷回收率、组分含量以及产量，得到最佳工艺，最终放大至中试色谱工艺。通过对放大后工艺的综合考察，得出放大过程与小试工艺高度匹配，显示出工艺的稳定性，为进一步的工业化生产提供了保障。
本发明所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，所得石榴皮有效组分中安石榴苷含量高达60.6％，安石榴苷回收率高达73.2％。水溶性较纯化前大幅提高，展现出了很强的抗氧化和金黄色葡萄球菌抑制活性，从而具有很高的成药价值。生产工艺稳定，可为基于安石榴苷的新药研发生产打下坚实基础。
附图说明
图1为本发明为石榴皮提取物大孔树脂纯化物在高效液相色谱仪上的色谱图，其中色谱条件：色谱柱反相C18柱(250mm×10mm)，流动相为A相和B相混合，其中A相占15％。流速2.4mL/min，检测波长为双通道254nm和366nm，柱温为室温；
图2为本发明为上样量为500mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物在半制备色谱仪上的非线性色谱图，其中色谱条件：色谱柱反相C18柱(250mm×10mm)，流动相为A相和B相混合，其中A相占15％。流速2.4mL/min，检测波长为双通道254nm和366nm，柱温为室温；
图3为本发明为上样量为500mg时安石榴苷和安石榴苷前面总杂质在所得40个组分中的各自占比η(％)和α(％)分别针对组分序号作图；
图4为本发明为上样量为750mg时安石榴苷和安石榴苷前面总杂质在所得40个组分中的各自占比η(％)和α(％)分别针对组分序号作图；
图5为本发明为上样量为1000mg时时安石榴苷和安石榴苷前面总杂质在所得40个组分中的各自占比η(％)和α(％)分别针对组分序号作图；
图6为本发明为上样量为1500mg时安石榴苷和安石榴苷前面总杂质在所得40个组分中的各自占比η(％)和α(％)分别针对组分序号作图；
图7为本发明为上样量为96g石榴皮提取物大孔树脂纯化物在中试色谱仪上的非线性色谱图，其中色谱条件：色谱柱反相C18柱(250mm×80mm)，流动相为A相和B相混合，其中A相占15％。流速180.0mL/min，检测波长为双通道366nm，柱温为室温。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。
实施例1
通过高效液相色谱仪(配以紫外检测器)进行：取C18色谱柱，规格为长度250mm，内径10mm，以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为15％甲醇-0.1％甲酸水溶液，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡色谱柱直至基线水平；
称取1mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物粉末，溶于10mL水中，用0.45μm的有机滤头过滤，待用，取20μL样品溶液，通过进样器进样至色谱柱，记录所得色谱图上安石榴苷两个色谱峰的保留时间分别为21min和40min，其色谱图如图1所示；
称取500mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物(安石榴苷含量32％)，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用；取C18色谱柱，规格为长度250mm，内径10mm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡步骤a中的C18色谱柱直至基线水平，进样500mg至色谱柱中，其色谱图如图2所示；
从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪(配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm)，对所得40个样品进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得的40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到；以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图3所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量为500mg情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为500mg所得的一系列组分，合并11min-30min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分1，称重得其重量为100.1mg；称取1mg组分1加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，进样500mg至色谱柱中，取配制的组分1溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分1中安石榴苷的含量为83.2％，安石榴苷回收率为90.7％。
实施例2
称取750mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用，按实施例1中相同的色谱柱及色谱条件进样750mg至色谱柱中，从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪(配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，对所得一系列组分进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图4所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量为750mg情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为750mg所得的一系列组分，合并9min-26min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分2，称重得其重量为211mg，称取1mg组分2，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，取配制的组分2溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分2中安石榴苷的含量为77.9％，安石榴苷回收率为90.6％。
实施例3
称取1000mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用；按实施例1中相同的色谱柱及色谱条件进样1000mg至色谱柱中，从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，对所得一系列组分进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图5所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量在1000mg情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为1000mg所得的一系列组分，合并8min-22min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分3，称重得其重量为274mg。称取1mg组分3，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填料颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，取配制的组分3溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分3中安石榴苷的含量为74.4％，安石榴苷回收率为89.2％。
实施例4
称取1500mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用；按实施例1中相同的色谱柱及色谱条件进样1500mg至色谱柱中，从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，对所得一系列组分进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图6所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量为1500mg的情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为1500mg所得的一系列组分，合并8min-17min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分4，称重得其重量为348mg。称取1mg组分4，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测；取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，取配制的组分4溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分4中安石榴苷的含量为67.4％，安石榴苷回收率为72.6％。
实施例5
通过高效液相色谱仪(配以紫外检测器)进行：取C18色谱柱，规格为长度250mm，内径10mm，以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为15％甲醇-0.1％甲酸水溶液，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡色谱柱直至基线水平；
称取1mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物粉末，溶于10mL水中，用0.45μm的有机滤头过滤，待用，取20μL样品溶液，通过进样器进样至色谱柱，记录所得色谱图上安石榴苷两个色谱峰的保留时间分别为21min和40min，其色谱图如图1所示；
称取500mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物(安石榴苷含量32％)，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用；取C18色谱柱，规格为长度250mm，内径10mm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡步骤a中的C18色谱柱直至基线水平，进样500mg至色谱柱中，其色谱图如图2所示；
从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪(配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm)，对所得40个样品进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得的40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到；以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图3所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量为500mg情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为500mg所得的一系列组分，合并0min-40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分1，称重得其重量为100.1mg；称取1mg组分1加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，进样500mg至色谱柱中，取配制的组分1溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分1中安石榴苷的含量为63.3％，安石榴苷回收率为95.8％。
实施例6
称取750mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用，按实施例5中相同的色谱柱及色谱条件进样750mg至色谱柱中，从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪(配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，对所得一系列组分进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图4所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量为750mg情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为750mg所得的一系列组分，合并0min-40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分2，称重得其重量为211mg，称取1mg组分2，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，取配制的组分2溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分2中安石榴苷的含量为57.5％，安石榴苷回收率为97.5％。
实施例7
称取1000mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用；按实施例5中相同的色谱柱及色谱条件进样1000mg至色谱柱中，从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，对所得一系列组分进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图5所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量在1000mg情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为1000mg所得的一系列组分，合并0min-40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分3，称重得其重量为274mg。称取1mg组分3，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测，取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填料颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，取配制的组分3溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分3中安石榴苷的含量为54.0％，安石榴苷回收率为98.0％。
实施例8
称取1500mg石榴皮提取物大孔树脂纯化物，溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，待用；按实施例5中相同的色谱柱及色谱条件进样1500mg至色谱柱中，从进样完就开始接取样品，将所得组分溶液按每分钟接取一个接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min共40个样品；
使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型C18色谱柱，规格为长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，对所得一系列组分进行其中安石榴苷进行回收率分布进行跟踪分析：
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，平衡色谱柱直至基线水平，取所得40个样品，各进样5微升进行分析，记下每个样品产生的色谱图中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，各样品中安石榴苷的占比η(％)通过公式η(％)＝A/A0计算得到，此外，鉴于C18色谱柱上中安石榴苷色谱峰前的杂质较多，将其所有的色谱峰累积在一起得到面积B，所有前杂质的峰面积占比α(％)通过公式α(％)＝B/A0计算得到，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图(如图6所示)，以研究安石榴苷和前杂质分别在上样量为1500mg的情况下在各组分中的分布情况；
对于上样量为1500mg所得的一系列组分，合并0min-40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分4，称重得其重量为348mg，称取1mg组分4，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，待测；取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，取配制的组分4溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到组分4中安石榴苷的含量为48.5％，安石榴苷回收率为92.8％。
实施例9
通过中试反相C18色谱对该工艺进行放大：
使用中试高效液相色谱仪(配以中试反相C18柱(规格为长度250mm，内径80mm)和双波长紫外检测器；
操作方法：以甲醇为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过中试液相色谱的双泵调整A相和B相至A相占15％，B相占85％，柱温为室温，流速为180mL/min，平衡色谱柱直至基线水平，称取128g石榴皮大孔树脂纯化物，加500mL水溶解，离心除去沉淀，进样至色谱柱，色谱图如图7所示；收集9min-17min间的组分，合并，在温度50℃浓缩后，冷冻干燥，称重得到石榴皮有效组分26.7g；称取1mg所得石榴皮有效组分，加10mL水溶解，用0.45μm的有机滤头过滤，取C18色谱柱，规格长度250mm，内径4.6mm，填充颗粒粒径10μm，通过液相色谱的双泵调整流动相为A相占15％，B相占85％，流速控制为1.0mL/min，柱温室温，监测波长254nm，平衡C18色谱柱直至基线水平，取配制的石榴皮有效组分溶液，进样10μL，通过安石榴苷标准曲线测定得到石榴皮有效组分中安石榴苷的含量为60.6％，安石榴苷回收率为73.2％。实验结果表明，放大后安石榴苷含量和回收率与放大前吻合度很好，表明工艺放大成功。
实施例10
将实施例1-8获得的任意一种石榴皮有效组分100mg，溶于1mL水配制成溶液，融化琼脂培养基，待其温度降至46±0.5℃，加入已培养好的金黄色葡萄球菌液，使试验菌悬液浓度为5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20min使其凝固，用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm，每孔加获得的石榴皮有效组分溶液20μL，盖好平皿，置于温度37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径为14mm，因此判定石榴皮有效组分具有较强的抑制金黄色葡萄球菌活性。
实施例11
称取放大实验中获得的石榴皮有效组分100mg，溶于1mL水配制成溶液，融化琼脂培养基，待其温度降至46±0.5℃，加入已培养好的金黄色葡萄球菌液，使试验菌悬液浓度为5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20min使其凝固，用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。每孔加石榴皮有效组分溶液20μL，盖好平皿，置于温度37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径为14mm，因此判定石榴皮有效组分具有较强的抑制金黄色葡萄球菌活性。
实施例12
称取放大实验中获得的石榴皮有效组分100mg，溶于1mL水配制成溶液，采用DPPH法测石榴皮有效组分的抗氧化活性：配制10mL浓度为2mM的DPPH乙醇溶液，避光放置；将该溶液稀释10倍成2×10-4mol/L，调整使OD515nm约为A≒0.7为工作液，加石榴皮有效组分的溶液200微升反应测定，以维生素C为阳性对照，室温避光反应30min，测定515nm处的光吸收值，最终测定得到石榴皮有效组分的IC50值为2.54±0.09μg/mL，而其阳性对照维生素C的IC50值为5.34±0.42(μg/mL)；结果显示，所得石榴皮有效组分的抗氧化活性很强。
综上所述，随着上样量的增加，所得石榴皮安石榴苷含量和回收率都有所下降，但是生产速率也大幅提升。综合考虑安石榴苷含量、回收率、产率、以及所得石榴皮组分的抗氧化和金黄色葡萄球菌活性，确认对于C18色谱柱，上样量范围限定在石榴皮提取物的大孔树脂纯化物与填料质量占比范围在250mg/g-1250mg/g之间时，制备出的石榴皮组分的抗氧化活性和金黄色葡萄球菌抑制活性较高；放大至中试色谱的工艺稳定可靠，具有产业化价值。
此外，本发明中所用的流动相体系可选择甲醇-0.1％甲酸水体系，其中甲醇含量范围在5％-45％之间，或乙腈-0.1％甲酸水体系，乙腈含量在5％-30％之间，安石榴苷的两个色谱峰的保留时间，应分别控制在3min-50min和30-100min之间。

Claims (4)

1.一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、通过高效液相色谱仪，以甲醇或乙腈为有机相A相，0.1%甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为甲醇-0.1%甲酸水混合物，其中甲醇含量范围在5%-45%之间，或流动相为乙腈-0.1%甲酸水混合物，其中乙腈含量在5%-30%之间，流速控制为2.4 mL/min，柱温室温，平衡反相C18色谱柱，长度250 mm，内径10 mm，填充物粒径10 μm，平衡至基线水平；
b、分别称取500 mg，750 mg，1000 mg，1500 mg的石榴皮提取物大孔树脂纯化物，均溶于水中配制成浓度为500 mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，将样品分别进样至步骤a中平衡好的色谱柱中，进样后即开始接取组分，将所得组分溶液按每分钟一个的速率接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0 min-40 min的区间里，共计接取40个组分；
c、使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型反相C18色谱柱，长度250 mm，内径4.6 mm，填充物粒径10 μm，柱温室温，流速1.0 mL/min，监测波长254 nm，对步骤b所得各组分样品，进样体积5微升，记下各样品中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，以接下的各组分的序号数（x）为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η（%）-x和α（%）-x图；
d、将步骤b中上样量为500 mg时所得的一系列组分，合并0 min至40 min之间的组分，于温度50℃浓缩至5 mL，真空冷冻干燥得到组分1；或上样量为750 mg所得的一系列组分，合并0 min至40 min之间的组分，于温度50℃浓缩至5 mL，真空冷冻干燥得到组分2；或上样量为1000 mg所得的一系列组分，合并0 min至40 min之间的组分，于温度50℃浓缩至5 mL，真空冷冻干燥得到组分3；或上样量为1500 mg所得的一系列组分，合并0 min至40 min之间的组分，于温度50℃浓缩至5 mL，真空冷冻干燥得到组分4，即得到具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分。
2.如权利要求1所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，其特征在于步骤a中使用的流动相为甲醇-0.1%甲酸水混合溶液，甲醇含量在10%-30%之间；或流动相为乙腈-0.1%甲酸水混合溶液，乙腈含量在6%-20%之间。
3.如权利要求1所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，其特征在于步骤d中上样量为500 mg时所得的一系列组分，合并11 min至30min之间的组分；或上样量为750 mg时所得的一系列组分，合并9 min至26 min之间的组分；或上样量为1000 mg所得的一系列组分，合并8 min至22 min之间的组分；或上样量为1500mg时所得的一系列组分，合并8 min至17 min之间的组分。
4.如权利要求1所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，其特征在于对于C18色谱柱，上样量范围在石榴皮大孔树脂纯化物与所用C18填料质量比为250-1250 mg/g之间。
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