CN107582628A - 丹参花提取物在制备治疗短暂脑缺血综合症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明之目的是提供一种丹参花提取物在制备治疗短暂脑缺血综合症药物中的应用,将干丹参花粉碎成粗粉,先加石油醚回流提取1h,脱脂,弃去石油醚提取液;丹参花药渣挥干石油醚,加乙醇浸泡,回流提取,过滤两次,合并两次滤液,减压回收乙醇至无醇味,加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/mL的分散液,分散液上AB‑8型大孔吸附树脂,先用蒸馏水洗脱,弃去水液;继用乙醇洗脱,弃去洗脱液;再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇至无醇味,冷冻干燥,粉碎;本发明提取物原料丰富,制备方法简单,成本低,丹参花提取物作为唯一活性成分,可有效用于治疗短暂性脑缺血,开拓了丹参花的药用价值,有良好的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及药物,特别是一种丹参花提取物在制备治疗短暂脑缺血综合症(TIA)药物中的应用。
背景技术
短暂性脑缺血发作(TIA)是颈动脉或椎-基底动脉系统发生短暂性血液供应不足,引起局灶性脑缺血导致突发的、短暂性、可逆性神经功能障碍;
丹参:1、心血管系统的作用:①强心加强心肌收缩力、改善心脏功能,不增加心肌耗氧量;②对血管作用扩张冠脉,增加心肌血流量;扩张外周血管,血流增加;脑血流量下降;③抗血栓形成提高纤溶酶活性;延长出、凝血时间;抑制血小板聚集(提高血小板内cAMP水平抑制TXA2合成);改善血液流变学特性(血粘度降低、红细胞电泳时间缩短);④改善微循环;2、促进组织的修复与再生作用3、保肝改善肝微循环。4、抗菌;但至今未见有泡桐花提取物在用于治疗短暂性脑缺血的公开报道。
发明内容
针对上述情况,为克服现有技术之缺陷,本发明之目的是提供一种丹参花提取物在制备治疗短暂脑缺血综合症(TIA)药物中的应用,丹参花提取物作为唯一活性成分,可有效解决治疗短暂性脑缺血的用药问题。
本发明解决的技术方案是,所述的丹参花提取物是,将干丹参花粉碎成粗粉,先加石油醚回流提取1h,脱脂,弃去石油醚提取液;丹参花药渣挥干石油醚,加乙醇浸泡,回流提取,过滤两次,合并两次滤液,减压回收乙醇至无醇味,加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/mL的分散液,分散液上AB-8型大孔吸附树脂,先用2倍柱体积蒸馏水洗脱,弃去水液;继用4倍柱体积的、质量浓度10%乙醇洗脱,弃去洗脱液;再用6倍柱体积的、质量浓度80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压回收乙醇至无醇味,冷冻干燥,粉碎,得丹参花提取物。
本发明提取物原料丰富,制备方法简单,成本低,丹参花提取物作为唯一活性成分,可有效用于治疗短暂性脑缺血,开拓了丹参花的药用价值,有良好的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做详细说明。
本发明一种作为唯一活性成分的丹参花提取物在制备治疗短暂脑缺血综合症(TIA)药物中的应用,该提取物是,将干丹参花粉碎成过20-30目筛的粗粉,先加干丹参花10倍重量的石油醚30-60℃,回流提取1h,脱脂,弃去石油醚提取液;丹参花药渣挥干石油醚,加丹参花10倍重量的、质量浓度80%乙醇浸泡0.5h,回流提取1h,过滤,得第一次滤液;药渣再加丹参花10倍重量的、质量浓度80%乙醇,回流提取1h,过滤,得第二次滤液,合并两次滤液,减压回收乙醇至无醇味,加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/mL的分散液,分散液上AB-8型大孔吸附树脂,先用2倍柱体积蒸馏水洗脱,弃去水液;继用4倍柱体积的、质量浓度10%乙醇洗脱,弃去洗脱液;再用6倍柱体积的、质量浓度80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压回收乙醇至无醇味,冷冻干燥,粉碎,得丹参花提取物。
本发明原料丰富,制备方法简单,易生产,成本低,丹参花提取物作为唯一活性成分,可用于有效制备治疗短暂性脑缺血的药物,并经试验取得了非常好的有益技术效果。
有关试验资料如下:
一、动物试验:
1.实验材料
1.1实验药物及试剂
该丹参花提取物,用比色法测定其含量为60%;养血清脑颗粒,由天津天士力制药股份有限公司;氯化钠注射液,由郑州永和制药有限公司生产;水合氯醛,由上海山浦化工有限公司生产;甲醛溶液,由莱阳市双双有限公司生产;过氧化叔丁醇(t-BHP),由国药集团化学试剂有限公司生产;LD(Lactic acid)检测试剂盒,由南京建成生物工程研究所生产,批号;LDH(Lactate dehydrogenase)检测试剂盒,由南京建成生物工程研究所生产;ATP(Adenosine-triphosphate)检测试剂盒,由南京建成生物工程研究所生产;LPA(Lysophosphatidic acid)检测试剂盒,由R&D生产。
1.2实验仪器
UV-2000紫外可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司生产;TGL-16G台式离心机,上海安亭科学仪器厂生产;电子分析天平,奥豪斯(上海)公司生产;DZKW-4型电子恒温水浴锅,北京永光明医疗仪器厂生产;DY89-1型电动玻璃匀浆机,宁波新芝生物科技有限公司生产;可调式移液器,上海雷勃分析仪器有限公司生产。酶免仪,680 MicroplateReader,Bio-Rad Laboratories;
1.3 实验动物
Wistar大鼠,雄性,SPF级,体重300~310g,河北省实验动物中心提供,合格证号:911020
2 .实验方法
2.1造模与给药
取体重300~310 g的wistar雄性大鼠,随机均匀分为:空白对照组,模型组,养血清脑颗粒组,大、中、小剂量丹参花提取物组,每组14只。除空白组外,其余5组造大鼠TIA模型,给药组分别灌服大、中、小剂量丹参花提取物(0.4 g/kg、0.2g/kg、0.1 g/kg,)、养血清脑颗粒(1 g/kg),模型组、空白对照组灌服同体积生理盐水,给药体积均为2ml/100g。连续给药3天为1周期,每周期进行一次TIA诱发及行为学评分,共2个周期。(第1次诱发时,尾静脉注射0.11mol/L过氧化叔丁醇5.2 ml/kg10 min后,置于1L的密封广口瓶中,缺氧10min后取出,进行行为学评分。大鼠第2次诱发时,尾静脉注射0.154 mol/L过氧化叔丁醇5.2 ml/kg,10min后,置于1L的密封广口瓶中,缺氧10min后取出,进行行为学评分。)
2.2实验检测指标
行为学评分标准:正常 0;少动或轻度激惹1;激惹性亢进(跳或窜)2;四肢颤抖或僵直3;腹部贴地,不能站立,四肢瘫痪,全身细小震颤 4。
于第2次诱发TIA及评分后第二天给药1 h后,立即眼眶取血(用肝素抗凝管抗凝),离心,取血浆,-20℃低温保存,测定血浆中的溶血磷脂酸(LPA)含量。在冰盘中分离脑,把脑从矢状线分开成对称的脑,一半迅速放入倒有10%福尔马林溶液的瓶子中浸泡固定,做海马区组织病理切片;另一半放在滤纸上洗干净上面的血迹,然后用分析天平称量其重量,根据此重量计算应加入的冰冷的生理盐水的量,以脑组织(g):生理盐水(ml)=1∶9的比例在低温下用玻璃匀浆机进行匀浆。4℃,3000 r/min离心20 min。取上清液于-20℃以下低温保存。制成10%的脑匀浆按测试盒说明操作,分别测定脑组织 LD、LDH水平、ATP酶活力。
2.3统计学处理方法
数据分析用SPSS 13.0 for windows医用统计包进行数据资料的统计学处理,计量资料组间比较用方差分析,用平均数±标准差表示,等级资料采用Ridit检验。
3.结果与分析
3.1丹参花提取物对大鼠TIA模型行为学评分的影响
表1 丹参花提取物对大鼠TIA模型行为学评分的影响(±s,n=14)
组别 | 剂量(g/kg) | 第1次评分 | 第2次评分 |
空白组 | - | 0.0 ±0.0** | 0.0±0.0** |
模型组 | - | 2.6 ±0.6 | 2.7±0.6 |
养血清脑颗粒组 | 1 | 1.8 ±0.6** | 1.5±0.7** |
大剂量丹参花提取物组 | 0.3 | 1.6 ±0.5** | 1.4±0.4** |
中剂量丹参花提取物组 | 0.15 | 1.8 ±0.5* | 1.6±0.5** |
小剂量丹参花提取物组 | 0.075 | 2.0 ±0.6* | 1.8±0.5* |
*:表示与模型组相比P<0.05;**:表示与模型组相比P<0.01
从上表可看出,与空白组比较,模型组大鼠行为学评分显著升高(P<0.01),说明造模成功;与模型组比,丹参花提取物大剂量组、养血清脑颗粒组能显著降低TIA模型大鼠行为学评分(P<0.01);丹参花提取物中、小剂量组可明显降低TIA模型大鼠行为学评分(P<0.05)。表明丹参花提取物对大鼠TIA模型的行为学有明显的改善作用。
3.2丹参花提取物对大鼠TIA模型血浆LPA含量的影响
表2 丹参花提取物对大鼠TIA模型血浆LPA含量的影响(±s,n=14)
组别 | 剂量(g/kg) | LPA(μmol/L) |
空白组 | - | 365.2 ±86.7** |
模型组 | - | 604.6 ±87.2 |
养血清脑颗粒组 | 1 | 427.2 ±78.4** |
大剂量丹参花提取物组 | 0.3 | 398.3 ±72.7** |
中剂量丹参花提取物组 | 0.15 | 446.7 ±82.4** |
小剂量丹参花提取物组 | 0.075 | 510. 3±83.4* |
*:表示与模型组相比P<0.05;**:表示与模型组相比P<0.01
由表2可以看出,与空白组比较,模型组大鼠血浆LPA含量显著升高(P<0.01);与模型组比,丹参花提取物大、中剂量组能显著降低血浆LPA水平(P<0.01);丹参花提取物小剂量组可明显降低血浆LPA水平(P<0.05);养血清脑颗粒组可显著降低血浆LPA水平(P<0.01)。表明丹参花提取物对TIA模型大鼠的血浆LPA具有较好的清除作用。
3.3丹参花提取物对大鼠TIA模型脑组织LD、LDH水平的影响
表3 丹参花提取物对大鼠TIA模型脑组织LD、LDH水平的影响(±s)
组别 | 剂量(g/kg) | LD(mmol/gprot) | LDH(U/gprot) |
空白组 | - | 4.676±0.287** | 1567.4±189.5** |
模型组 | - | 6.863±0.342 | 1147.6±148.8 |
养血清脑颗粒组 | 1 | 5.417±0.732** | 1399.1±216.4** |
大剂量丹参花提取物组 | 0.3 | 5.137±0.629** | 1472.8±201.3** |
中剂量丹参花提取物组 | 0.15 | 5.422±0.546** | 1394.5±182.1** |
小剂量丹参花提取物组 | 0.075 | 5.518±0.612* | 1374.6±187.8* |
*:表示与模型组相比P<0.05;**:表示与模型组相比P<0.01
由表3可以看出,与空白组比较,模型组脑组织LD含量显著升高(P<0.01),LDH含量显著降低(P<0.01),说明造TIA模型成功;与模型组比,丹参花提取物大、中剂量组能显著降低LD水平(P<0.01)、升高LDH水平(P<0.01);养血清脑颗粒组可显著降低LD水平(P<0.01)、升高LDH水平(P<0.01);丹参花提取物小剂量组可明显降低LD水平(P<0.05)、升高LDH水平(P<0.05)。表明丹参花提取物对TIA模型大鼠脑组织LD水平、LDH水平有明显的调节作用。
3.4丹参花提取物对大鼠TIA模型脑组织Na+-K+-ATP酶、Ca++-ATP酶、Mg++-ATP酶活性的影响
表4 丹参花提取物对大鼠TIA模型脑组织Na+-K+-ATP酶、Ca++-ATP酶、Mg++-ATP酶活性的影响(±s,n=14)
*:表示与模型组相比P<0.05;**:表示与模型组相比P<0.01
从上表可看出,与空白组比较,模型组大鼠脑组织中的Na+-K+-ATP酶、Ca++-ATP酶、Mg++-ATP酶水平水平显著降低(P<0.01),说明造大鼠TIA模型成功;与模型组比,丹参花提取物大剂量组、养血清脑颗粒组能显著升高Na+-K+-ATP酶、Ca++-ATP酶、Mg++-ATP酶水平(P<0.01);丹参花提取物中剂量组可明显升高Na+-K+-ATP酶、Ca++-ATP酶、Mg++-ATP酶水平(P<0.05)。表明丹参花提取物对大鼠TIA模型脑组织中Na+-K+-ATP酶、Ca++-ATP酶、Mg++-ATP酶水平有较好的改善作用。
3.5丹参花提取物对大鼠TIA模型脑部海马区病理改变的影响 结果见附录1。
各组大鼠脑组织海马区组织形态的观察结果:空白组神经细胞核大,核内染色质蓬松,核仁清晰,海马区内的毛细血管和内皮细胞均正常;模型组神经细胞核水肿体积增大呈球形,核内染色质淡然而透明,核仁清晰,海马区内的毛细血管增粗和内皮细胞也发生水肿和淡然;丹参花提取物大剂量组神经细胞明显恢复核大,核内染色质蓬松,核仁清晰,海马区内的毛细血管和内皮细胞基本恢复正常;丹参花提取物中剂量组神经细胞核体积明显缩小,部分核内染色质已开始有所恢复,核仁清晰,海马区内的毛细血管有所扩张和内皮细胞恢复正常;丹参花提取物小剂量组大部分神经细胞核萎缩体积明显缩小,核内染色质固缩,核仁清晰数神经细胞仍然处于水肿状态,海马区内的毛细血管减少和内皮细胞水肿;养血清脑颗粒组缩小,核内染色质溶解而透明,核仁清晰,海马区内的毛细血管有所扩张,内皮细胞恢复正常。
表5丹参花提取物对大鼠TIA模型脑组织海马区组织形态的影响
组别 | 剂量(g/kg) | - | + | ++ | +++ | P |
空白组 | - | 14 | 0 | 0 | 0 | <0.01 |
模型组 | - | 0 | 1 | 5 | 8 | |
养血清脑颗粒组 | 1 | 4 | 6 | 3 | 1 | <0.01 |
大剂量丹参花提取物组 | 0.3 | 7 | 4 | 3 | 0 | <0.01 |
中剂量丹参花提取物组 | 0.15 | 6 | 4 | 3 | 1 | <0.01 |
小剂量丹参花提取物组 | 0.075 | 4 | 4 | 3 | 3 |
根据实验各组的海马区神经细胞不同的病理改变,将其分为四级:
“-”海马区神经细胞正常,海马区内的毛细血管和内皮细胞均正常;“+”神经细胞核水肿体积增大、核内染色质淡然而透明,核仁清晰,毛细血管减少和内皮细胞水肿;“++”神经细胞体积增大,核内染色质溶解而透明,核仁消失,毛细血管增粗;“+++”神经细胞核水肿体积增大呈球形,核内染色质淡然而透明,核仁消失,毛细血管增粗和内皮细胞也发生水肿和淡然。
经Ridit检验,空白组与模型组有显著的统计学意义(P<0.01),说明造TIA模型成功。与模型组比较,丹参花提取物大、中剂量组和养血清脑颗粒组均有显著的统计学意义(P<0.01)。
二、临床资料:
在动物试验确保安全的基础上,并经临床试验取得了非常好的有益技术效果,有关临床资料如下:
丹参花提取物加氯吡格雷治疗短暂脑缺血综合症40例
选择符合全国第四次脑血管病学术会议制订的短暂脑缺血综合症诊断标准: 即为短暂的、可逆的、局部的脑血液循环障碍,可反复发作,少者1 ~ 2 次,多至数十次,每次发作持续时间通常在数分钟至1 h 左右,症状和体征应该在24 h 内完全消失。
ABCD2评分标准: 年龄> 60 岁( 1 分) ; 血压为收缩压> 140 mmHg 或舒张压> 90 mmHg ( 1 分) ; 临床症状为单侧无力( 2分) ,不伴无力的言语障碍( 1 分) ; 症状持续时间> 60min ( 2 分) ,10~59 min ( 1 分) ; 患有糖尿病( 1 分) 。危险分层:0~3 分为低危组; 4~5 分为中危组; 6~7 分为高危组。
选择ABCD2评分标准在低危层的患者40人,随机分为2组,对照组口服氯吡格雷(商品名为波立维,75 mg /片,法国赛诺菲公司) ,每次75 mg,1 d 1 次,首剂300 mg。治疗组除按对照组方法服用氯吡格雷外,加用丹参花提取物(丹参花民间可食用,其提取物每次0.6 g,每天 2 次冲服。以上两组均治疗30 d,治疗期间常规调控血压及血糖,停用其他能够影响凝血功能的药物。
氯吡格雷组与氯吡格雷加丹参花提取物组7 d 内短暂脑缺血发作终止的例数分别为13例(有效率65%)、16例(有效率80%), 7 d 后仍有发作的例数分别为7例、4例,30 d内短暂脑缺血加重的例数均为0例,发作终止的例数分别为为18例(有效率90%)、20例(有效率100%)。丹参花提取物加氯吡格雷对短暂脑缺血患者的总体疗效优于常规氯吡格雷治疗组。
经统计学处理,取得了良好的有益的治疗效果,开拓了治疗短暂性脑缺血药物的新途径,提高了丹参花的药用价值和商业价值,有良好的经济和社会效益。
Claims (1)
1.一种作为唯一活性成分的丹参花提取物在制备治疗短暂脑缺血综合症药物中的应用,该提取物是,将干丹参花粉碎成过20-30目筛的粗粉,先加干丹参花10倍重量的石油醚30-60℃,回流提取1h,脱脂,弃去石油醚提取液;药渣挥干石油醚,加丹参花10倍重量的、质量浓度80%的乙醇浸泡0.5h,回流提取1h,过滤,得第一次滤液;药渣再加丹参花10倍重量的、质量浓度80%乙醇,回流提取1h,过滤,得第二次滤液,合并两次滤液,减压回收乙醇至无醇味,加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/mL的分散液,分散液上AB-8型大孔吸附树脂,先用2倍柱体积蒸馏水洗脱,弃去水液;继用4倍柱体积的、质量浓度10%乙醇洗脱,弃去洗脱液;再用6倍柱体积的、质量浓度80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压回收乙醇至无醇味,冷冻干燥,粉碎,得丹参花提取物。
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