CN117298124A - 灵芝酸t在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了灵芝酸T在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用。本发明还公开了一种用于治疗过敏性哮喘的药物，所述药物中含有灵芝酸T。本发明公开的灵芝酸T在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用具有以下有益效果：1、灵芝酸T对过敏性哮喘具有明显的治疗作用，且副作用小；2、灵芝酸T可用于过敏性哮喘的预防性治疗。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及灵芝酸T在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用。
背景技术
支气管哮喘在全球范围具有较高的发病率，是过敏原或其他因素引起的气道髙反应状态下出现的广泛而可逆的气道狭窄性疾病。
过敏性哮喘是支气管哮喘中最常见的亚型，占成人哮喘50%以上。过敏性哮喘长期反复发作可诱发慢性支气管炎及肺间质纤维化等。过敏性哮喘与免疫调节密切相关，免疫细胞在过敏性哮喘的发展过程中起着关键作用，提高免疫力有助于减少疾病引起的哮喘。Th1（辅助型T细胞1）/Th2（辅助型T细胞2）细胞因子是两种主要的T细胞分泌物质，它们在免疫应答中起着关键作用，其免疫功能失衡在过敏性哮喘发病机制中一直占据主导地位。Th2细胞因子主要参与体液免疫应答，对于抵御体液内病原体（如寄生虫等）感染起着重要作用，过敏性哮喘是Th2细胞过度分化所导致的疾病。
目前治疗过敏性哮喘的一线药物仍以糖皮质激素为主，此类药物虽可以相对较好地控制哮喘症状，但该类药物治疗周期长，对于高血压、高血糖等病人会加重其风险,长期使用可引起多种副作用（如骨质疏松、口腔真菌感染、声音嘶哑等）。此外，仍有约40%的哮喘患者对糖皮质激素治疗不敏感，因此临床治疗亟需研发出一种安全有效的用于治疗过敏性哮喘的药物。
发明内容
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了灵芝酸T在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用。
技术方案：灵芝酸T在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用。
进一步地，所述药物由灵芝酸T和药学上能够接受的辅料组成。
进一步地，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶型、霜剂、酊剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。
一种用于治疗过敏性哮喘的药物，所述药物中含有灵芝酸T。
有益效果：本发明公开的灵芝酸T在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用具有以下有益效果：
1、灵芝酸T对过敏性哮喘具有明显的治疗作用，且副作用小；
2、灵芝酸T可用于过敏性哮喘的预防性治疗。
附图说明
图1为哮喘模型的建立流程图。
图2为实施例3中小鼠血清中IgE水平的示意图。
图3为实施例4中小鼠的肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞水平的示意图。
图4A为实施例4中小鼠的气道的H＆E 染色结果的示意图。
图4B为实施例4中小鼠的气道的H＆E 染色结果的评分示意图。
图5A为实施例4中小鼠的气道的PAS染色结果示意图。
图5B为实施例4中小鼠的气道的PAS染色结果的评分示意图。
图6A为实施例5中小鼠血清中炎症因子IL-5水平的示意图。
图6B为实施例5中小鼠血清中炎症因子IL-4水平的示意图。
图6C为实施例5中小鼠血清中炎症因子IL-17A水平的示意图。
图7A为实施例6中小鼠肺部细胞中Th1/Th2细胞的比例统计示意图。
图7B为实施例6中小鼠肺部细胞中Th1/Th2细胞的比例统计示意图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
本申请中的施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
为了附图的简单明了，本申请中将“灵芝酸T低剂量组”简写成“灵芝酸T低”，将“灵芝酸T中剂量组”简写成“灵芝酸T中”，将“灵芝酸T高剂量组”简写成“灵芝酸T高”。
实验材料
8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，购买后预适应3天，随机分成对照组、模型组、灵芝酸T低剂量组、灵芝酸T中剂量组、灵芝酸T高剂量组，每组10只。
实验方法
1、哮喘模型的建立及给药
哮喘模型的建立：如图1所示，哮喘模型分为两个阶段：
第一阶段为致敏阶段：模型组、灵芝酸T低剂量组、灵芝酸T中剂量组、灵芝酸T高剂量组在第0、14天皮下注射致敏，用10μg 卵清蛋白（OVA）及10mg 氢氧化铝佐剂制成混合乳剂（0.2mL/只）进行致敏，对照组注射相同剂量的生理盐水（NS）作为阴性对照；
第二阶段为激发阶段：在21-28天将模型组及给药组（灵芝酸T低剂量组、灵芝酸T中剂量组、灵芝酸T高剂量组）小鼠放置于雾化箱中，在雾化器的帮助下，将2% OVA溶液连续雾化7天，而对照组用NS作为空白对照，每天雾化30min。
给药及称重：雾化激发前1h进行灌胃给药，灵芝酸T低剂量组、灵芝酸T中剂量组、灵芝酸T高剂量组（5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg）连续灌胃给药28天，对照组和模型组灌胃等量的NS。第0、7、14、21、28天对小鼠分别进行称重。
取材前一天对各组小鼠进行症状评分和引喘潜伏期评价。
2.样本采集
血液收集：最后一次激发后，小鼠禁食过夜后，摘眼球取血放入采血管中，3000rpm离心30min，取上清，放入冰箱中-80℃保存，后续采用ELISA试剂盒检测血清中IgE的水平及炎症因子水平。
肺泡灌洗液（BALF）收集：小鼠取血后进行脱颈椎处死，将小鼠仰卧位固定在泡沫板上，手术剪剪开小鼠胸部皮毛，分离组织暴露出气管，气管插入插管连接的注射器，并将气管插管用手术线固定，注射器吸入1mL预冷的PBS，将注射器中的PBS推入肺中，反复进行灌洗，将灌洗液吸出得到肺泡灌洗液。取肺泡灌洗液，进行吉姆萨染色，对细胞进行分类计数。
分离肺组织：收集完肺泡灌洗液后，将半数小鼠肺部组织取下，放入4%多聚甲醛中固定保存，后续石蜡包埋后进行H＆E染色及PAS染色。半数小鼠用生理盐水灌注肺组织至变白，取下肺组织，用流式细胞仪进行免疫细胞分析。
3.实验操作
吉姆萨染色：取小鼠肺泡灌洗液进行吉姆萨染色。吉姆萨染色液由天青，伊红组成。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。对染色后的细胞进行分类计数。
H＆E染色：小鼠造模成功后，取肺部组织，固定在4%多聚甲醛中，制作石蜡切片，采用H＆E 染色观察灵芝酸T处理后气道的厚度。
PAS染色：小鼠造模成功后，取肺部组织，固定在4%多聚甲醛中，制作石蜡切片，采用PAS染色观察灵芝酸T处理组及其对照组气道附近呈紫红色的糖类物质。
流式细胞仪免疫细胞分析：小鼠最后一次雾化后24h进行安乐死，取肺组织采用组织研磨仪研磨成单个细胞，采用红细胞裂解液裂解红细胞，细胞悬液离心后用PBS缓冲液清洗2次，加入封闭抗体封闭30min后离心，弃去上清，在细胞沉淀中加入流式检测抗体（PE-γIFN/FITC-CD4/APC-IL-4）孵育30min后，离心后PBS缓冲液清洗2次，加入细胞固定液固定10min后离心弃去固定液，PBS缓冲液重悬细胞沉淀，流式上机检测肺组织中Th1/Th2细胞的比例。
实施例1
按照上述方法，对小鼠进行称重，结果如表1所示。从表1结果可知，相较于对照组的小鼠，模型组的小鼠体重受卵清蛋白（OVA）影响，增长缓慢，灵芝酸T低剂量组、灵芝酸T中剂量组、灵芝酸T高剂量组可以明显保护卵清蛋白（OVA）引起的小鼠体重降低。
表1各组小鼠体重变化
实施例2
取材前一天，分别对对照组、模型组、灵芝酸T低剂量组、灵芝酸T中剂量组、灵芝酸T高剂量组的小鼠进行症状评分和引喘潜伏期评价，结果见表2。从表2结果可知，与对照组的小鼠相比，模型组的小鼠在OVA雾化过程中表现出明显抓鼻、挠痒等症状，症状评分明显升高，而哮喘潜伏期明显缩短。与模型组的小鼠相比，灵芝酸T组的小鼠显著降低哮喘症状评分，并延长了引喘潜伏期。
表2灵芝酸T对哮喘小鼠的症状评分及潜伏期的影响
实施例3
按照上述方法，采用ELISA试剂盒检测各组小鼠的血清中的IgE的水平，具体结果见图2。从图2可以看出，模型组的小鼠血清的IgE明显提高，灵芝酸T组的小鼠血清中IgE的水平明显降低。
实施例4
按照上述方法，取小鼠肺泡灌洗液进行吉姆萨染色，对细胞进行计数，统计各组小鼠的嗜酸性粒细胞数量，具体结果如图3所示。从图3可以看出，模型组的小鼠肺泡灌洗液的嗜酸性粒细胞明显升高，而灵芝酸T可以有效的降低小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的水平。
采用H＆E染色观察对照组、模型组、灵芝酸T高剂量组的小鼠的气道的厚度，从而判断灵芝酸T对过敏性哮喘小鼠气道重塑中气道厚度的影响（结果如图4A所示），并对H＆E染色的结果进行评分（结果如图4B所示）。H＆E染色结果表明，模型组的小鼠支气管壁明显增厚，管腔狭窄，支气管和血管周围出现明显炎性细胞浸润，而灵芝酸T可显著减轻炎性细胞浸润，改善支气管壁增厚和管腔狭窄情况。
采用PAS染色观察对照组、模型组、灵芝酸T高剂量组的小鼠的气道附近呈紫红色的糖类物质，进而判断灵芝酸T对过敏性哮喘小鼠气道重塑中气道粘液分泌的影响（结果如图5A所示），并对PAS染色进行评分（结果如图5B所示）。PAS染色结果表明，模型组的小鼠气道附近糖类物质明显增多，可见大量杯状细胞增生，气道黏液分泌增加，而灵芝酸T高剂量组的小鼠气道组织杯状细胞数量明显减少，减少了气道粘液的分泌。
实施例5
按照上述方法，小鼠眼眶取血后，3000 rpm离心30min取上清即为血清，根据ELISA试剂盒说明书，检测血清中炎症因子IL-5、IL-4、IL-17A的表达变化。从图6A-图6C的结果可知，模型组小鼠的炎症因子水平明显提高，而灵芝酸T浓度依赖性的降低了炎症因子的表达水平，发挥了抗炎活性。
实施例6
按照上述方法，小鼠最后一次雾化后24h进行安乐死，取肺组织研磨成单个细胞，加入流式检测抗体（PE-γIFN/FITC-CD4/APC-IL-4）孵育后，流式细胞仪检测肺组织中Th1/Th2细胞的比例。从图7A和图7B的结果可知，相较于对照组，模型组的小鼠的Th2细胞比例显著升高，而灵芝酸T明显改善了Th2细胞免疫失衡情况。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (4)
1.灵芝酸T在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物由灵芝酸T和药学上能够接受的辅料组成。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶型、霜剂、酊剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。
4.一种用于治疗过敏性哮喘的药物，其特征在于，所述药物中含有灵芝酸T。
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